Professional Documents
Culture Documents
Rekombinant Dna Teknolojisi
Rekombinant Dna Teknolojisi
Do.Dr.Mustafa ERAYMAN
Mustafa Kemal niversitesi FEF BYOLOJ
TERMNOLOJ
Rekombinant DNA: Doal olarak bir arada bulunmas mmkn olmayan DNA molekllerinin birletirilerek yeni bir kombinasyonun oluturulmasdr. Krosover ilemi ile de rekombinant DNA oluturulsa da rekombinant DNA ok farkl biyolojik kaynaklardan elde edilen DNA molekllerinin birletirlimesi anlamnda kullanlr.
Genetik Deiimler
nsanlar binlerce yldr dier canllarn genetiini deitirmilerdir.
Bitki ve hayvanlarn yapay seleksiyonu
Doal proses
Mutasyon, crossing over
Genetik Mhendislii
Rekombinant DNA teknolojisi bakteri ve virslerle yaplan almalarda gelitirilen genetik teknikleri ve nkleik asit biyokimyas metotlarn birlikte kullanr. Rekombinant DNA teknolojisi bir genin snrsz miktarda izolasyonu iin gl bir aratr. Bu teknikteki temel ilemler:
1. Doku ya da hcrelerden DNA izole edilir. 2. DNA molekllerini zgl dizilerinden tanyp kesen Restriksiyon endonkleazlar ya da Restriksiyon Enzimleri (RE) ile kesilir. 3. RE ile kesilip oluturulan DNA paralar vektr ya da tayc molekl ile dier DNA molekl birletirilir. DNA paras yerletirilmi vektr bir Rekombinant DNA molekldr. 4. Oluturulan rekombinant DNA molekl bir konak hcreye aktarlr. Bu sayede binlerce kopya (klon) retilir. 5. Konak hcre kendisini elerken yabanc DNA molekln de oaltarak yavru hcrelere aktarr ve koloniler oluturulur. 6. Klonlanm DNA konak hcrelerden izole edilerek incelenebilir. 7. Potansiyel olarak klonlanm DNA transkripsiyona urayabilir, mRNAs translasyona ynlendirilebilir, gen rn izole edilebilir ve aratrma iin ya da ticari olarak satlabilir.
Genetik Mhendislii
Genler izole edilir, modifiye edilir ve bir organizmaya yerletirilir. Rekombinant teknoloji ile mmkn olur.
DNA kesilir ve paralar birletirilir Modifiye edilen paralar oaltlr
RESTRKSYON ENZMLER
Hamilton Smith Haemophilus influenzaenn bakteriyofajlardan kendilerini nasl savunduklarn almlardr. Viral DNAy paralayan bir enzime sahip olan bakteriler kefedilmitir. Bugne kadar 200den fazla RE enzimi tanmlanmtr. RE enzimleri zgl DNA dizilerini tanyarak keser.
RE enzimleri DNAy 4 - 12 sayda nkleotid dizisini spesifik olarak tanyp keser. Bu kesim ileminde baz enzimler kt ulu DNA paralar olutururken, bazlar da yapkan ulu DNA paralar olutururlar.
Rekombinant DNA transformasyon yoluyla konuku hcrelere aktarlr, Konuku iinde vektr kendi kopyasn oluturur, Yabanc DNAnn da kopyas oluturulmu olur, Ayn klondan binlerce koloni oluturularak byk miktarlarda rekombinant DNA oaltlm olur.
Vektrler tayc DNA moleklleridirler, bu nedenle vektr olarak grev yapabilmesi iin baz zellikleri tamas gerekmektedir.
1. Kendini ve tad DNA molekln bamsz olarak replike edebilmelidir. 2. Vektr zerinde pek ok RE enzimin sadece bir krlma blgesi olmaldr. Bu blge RE ile kesilerek, ayn enzimle kesilen baka bir DNA parasnn bu blgeye sokulmas iin kullanlr. 3. zerinde seilebilir bir belirleyici tamaldr. Belirleyici, vektr tayan konak hcreleri vektr tamayan konak hcrelerden ayrmak iin kullanlr. 4. Konakdan kolayca izole edilebilir olmaldr.
Origin dizisi
Kozmit Vektrler
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Lambda ile plazmit kromozomlarnn birletirilmesiyle elde edilmitir. Doal yollarla meydana gelmezler. Daireseldir. Antibiyotik diren geni ierirler. (ampR) Orijin (ori) blgesi bulunur. Kesim enzimleri iin bir blge bulunur. Lambda fajnn, faj protein klfna paketlenmesi iin gerekli olan cos dizileri ierirler. Yabanc DNAy bulunduran kozmitler lambda protein ba iine paketlenir ve enfekte edici faj paracklar oluur. 50 kblik DNA tayabilirler.
Mekik Vektrler
Birden fazla konak hcrede replike olabilirler. Kendiliinden replike olur veya konak replike olunca kendini oaltabilir. Bir organizmadan baka bir organizmaya genleri tamak iin yaygn olarak kullanlr.
rnein; Ate bceinin luciferase geni plazmide yerletirilir ve Agrobacteriuma aktarlr. Agrobacteriumda oaltlr ve ttn enfekte ederek gen aktarm ilemi tamamlanm olur.
http://cwx.prenhall.com/bookbind/pubbooks/horton 3/medialib/media_portfolio/23.html
Byk DNA paralarnn klonlanmasnda kullanlan nispeten yeni bir vektr tipi bakteri yapay kromozomlardr. BAClar 100-500 kb DNA tayabilirler. allmalar daha kolaydr. Antibiyotik diren genleri, RE blgeleri ve F faktr genlerini iermektedirler. Kromozomal DNAnn byk miktarlarnn sekanslanmasnda ve genom sekanslama projelerinde kullanlmaktadr.
Dorusal formdadr. Kendine ait sentromer ve her iki uta da telomerlerin bulunmas kromozom zellii katmaktadr. Kendini replike eden sekansa (ARS) sahip olduundan replikasyon olmaktadr. Her iki kolunda maya genleri iermektedir. RE kesim blgesi bulunmaktadr. 1 Mb (Megabaz) uzunluunda DNA tayabilirler. Maya hcrelerinde oalabilirler. nsan Genom Projesinde kullanlmaktadr.
2. Tamamlayc (Complementary) DNA (cDNA) library, hcrelerden izole edilen mRNAdan yaplan DNA kopyalarnn klonlarnn koleksiyonudur.
reverse transkriptaz (RNAya bal DNA polimeraz) RNA kalbndan DNA sentezi cDNA ktphaneleri hcrelerde ifade olan gen veya genleri yanstr.
3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.
radyoaktif etiketli
Probdaki tamamlayc DNA aradnz DNA sekasndan oluur, homolog sekans tahminen ktphanede de bulunur. Balanmayan prob DNAs filtreden uzaklatrlr. Probla DNAnn hibridize olup olmad X-ray filmi veya kemiluminasansla anlalr. X-Ray filmi zerinde numuneler grlr. Pozitif olan klonlar seilir ve daha fazla analiz iin izole edilirler.
cDNA Ktphanesi
1. 2. 3. cDNA olgun mRNAdan elde edilir, intronlar iermez. cDNA kodlanan blgeden daha az bilgi ierebilir. cDNA ktphanesi mRNAnn izole edildiin andaki bir hcrenin gen aktivitesini gstermektedir. (Zamanla ve dokudan dokuya gre eitlilik gsterir). mRNA hcreler ldkten sonra hzl bir ekilde paralnr, derhal izole edilir. cDNA ktphanesi oluturma:
1. 2. 3. mRNA izole edilir. cDNA sentezlenir. cDNA klonlanr.
4.
5.
cDNA sentezi
5-GATCCAGAC-3 GTCTG-5
41
PCR Teknolojisi;
Test edilecek organizmalardan saf olarak izole edilmi kalp DNAdan az miktarda (2-50ng) alnr ve PCR iin zel hazrlanan bir karma ( master mix: steril deiyonize su, PCR tamponu, Taq polimeraz enzimi, MgCl, dNTPs ve primerler) ilave edilir. Hazrlanan bu karm mikrosantrifj tpleri ierisinde otomatik DNA termocycler cihazna yerletirilir ve kalp DNA zerindeki baz spesifik blgeler yaklak 30 PCR dngs sonucu en az milyon kez oaltlr.
PCR dngs;
Kalp DNA zerindeki spesifik bir blgenin termocycler cihaz yardmyla tek bir defa sentezlenmesine bir PCR dngs denir. Herbir PCR dngs birbirini takip eden 3 farkl aamadan oluur: 1. DNA zincirlerinin ayrtrlmas(Denaturation) 2. Primerlerin balanmas(Annealing) 3. DNA sentezi(Extention)
100
Melting 94 oC
PCR
Extension Annealing Primers 50 oC 72 oC
Melting 94 oC
30x
Temperature
50
T i m e
3 3 5 3 5 3 5 5 3 5 5 5 5 3 3 5 5
5 5
5 3 5
Temperature
100
Melting 94 oC
PCR
50
T i m e
3 5
5 3
Temperature
100
Melting 94 oC
PCR
50
T i m e
3 5
Heat
5 3
Temperature
100
Melting 94 oC
PCR
50
T i m e
3 5
Heat
5 3
Temperature
100
Melting 94 oC
50
PCR
30x
T i m e
3 5
Heat
5 5
Heat
5 5 3
Temperature
100
Melting 94 oC
50
PCR
30x
T i m e
3 5 5 5 5
5 5
5 5 3
Temperature
100
Melting 94 oC
50
PCR
30x
0
3 5 5
T i m e
5
5 5 3
Heat
5 5
Heat
5
Temperature
100
Melting 94 oC
50
PCR
30x
0
3 5 5
T i m e
5 5 5 5
5 5 3
5 5
5 5
Temperature
100
Melting 94 oC
50
PCR
30x
0
3 5 5
T i m e
5 5 5
5 5 3
5 5
0 1 Cycles
55
4.
5. 6. 7.
kesilmemi
EcoRI
BamHI
5.0 kb
0.5
2.5
2.0
EcoRI
BamHI
USDA-ARS - RFLP (restriction fragment length polymorphism) analysis of PCR-amplified 16S rDNA sequences.
Bu tekniin basamaklar 1. Uygun restriksiyon enzimi ile DNA nn kesilmesi 2. Kesilen DNA nn agaroz jelde yrtlmesi 3. DNA nn denatre edilmesi 4. Denatre edilen DNA nn naylon veya nitroselloz membrana transfer edilmesi 5. Tek iplikikli DNA probu ile membrann muamelesi 6. Grntleme
Fig. 10.8, Southern Blot Components: (top to bottom) Weight Paper towels Membrane Gel Blotting paper Glass plate Tray with buffer
Northern Blot: Southern Blota benzerdir, fakat DNA deil RNAy iaretlemek iin kullanlr. mRNAnn bykln belirlemek iin kullanlabilir, rnein promotr ve terminatr vb. alanlarndaki farkllklar belirlemede kullanlabilir.
Example: Expression sybII gene at different life stages in the frog Xenopus laevis
http://www.xenbase.org/WWW/Marker_p ages/CNS/sybII.html
DNA paralar ddNTPnin DNA polimerazla eklendii eklendii noktalarda sadece sonlanr.
Carrot plant
Zebrafish
Rabbit
Teekkrler