TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK

Predava: Prof. dr Zoran Stanimirovi

TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK - SEKVENCIONIRANJE DNK Metode relativno jednostavnog i brzog odreivanja redosleda nukleotida (priamrne strukture) u DNK razvijene su krajem sedamdesetih godina prolog veka. Zahvaljujui razvoju metoda sekvencioniranja DNK odreen je redosled baznih parova kod desetina hiljada razliitih gena, dok je kod nekih organizama sekvencioniran ceo genom. Nedavno je kompletirana sekvenca humanog genoma i ispostavilo se da postoji oko 30 000 gena u jedarnom genomu. Koliina informacija dobijena sekvencioniranjem humanog i ostalih do sada obraenih genoma toliko je velika da se obrauje najmonijim kompjuterima.

Vrsta

Stanite

Veliina genoma (103 baznih parova)

Broj gena (proteina)

EUBACTERIA

Mycoplasma genitalium Eschericihia coli Helicobacter pylori Bacillus subtilis

Genitalni trakt oveka Crevo oveka eludac oveka Zemljite

580 4639 1667 4214

468 4289 1590 4099

Mycobacterium tuberculosis Treponema pallidum

Tkiva oveka Tkiva oveka

4447 1138

4402 1041

Vrsta

Stanite

Veliina genoma (103 baznih parova) 1111

Broj gena (proteina) 834

Rikettsia prowazekii ARCHAEA

Vai, ovek (intracelularno)

Metahnococcus jannaschii Archaeoglobus fulgidus EUCARYOTA

Hidrotermalni izvori Hidrotermalni izvori

1664 2178

1750 2493

Saccharomyces cerevisiae (pivski ili pekarski kvasac)

Kora groa, pivo

12 069

~6300

Arabidopsis thaliana (via biljka) Caeborhabditis elegans (obli crv) Drosophila melanogaster (vona muica) Homo sapiens (ovek)

Zemljite i vazduh

142 000

~26 000

Zemljite Prezrelo voe

97 000 137 000

~19 000 ~14 000

Stanovi

3 200 000

~30 000

 SEKVENCIONIRANJE

DNK

Jedan od metoda sekvencioniranja je tzv. dideoksi metod, u kome se pri sintezi DNK u in vitro uslovima pored normalnih prekursora (nukleotid trifostata) nalaze i dideoksi ribonukleozid trifostati. S obzirom da dideoksi nukleotidi u pentoznom eeru nemaju hidroksilne grupe na pozicijama 2 i 3, kada se ugrade u polinukleotidni lanac na tom mestu se dalja sinteza zaustavlja (nema slobodne OH grupe na poziciji 3 gde bi se vezao sledei nukleotid).

 SEKVENCIONIRANJE

DNK

Za svaki dideoksi nukleozid trifostfat koristi se posebna reakciona smea. Prema tome, potrebne su etiri odvojene. inkubacione smee, za svaki nukleotid po jedna. Tako pri sintezi DNK u prisustvu dideoksi adenozin trifosfata (ddATP) do prekida sinteze dolazi na svakom mestu gde bi se ugradio adeninski nukleotid. Na taj nain u inkubacionoj smei sa ddATP dobija set lanaca DNK razliite duine. Produkti sve etiri reakcije se rastavljaju u paralelnim putanjama elektroforezom u poliakrilamidnim gelovima.

S obzirom da elektroforetska pokretljivost direktno zavisi od duine molekula DNK, oitavanjem traka od dna gela ka vrhu odreuje se sekvenca nukleotida u analiziranom molekulu DNK .

Mada su i metode koje su danas u upotrebi u osnovi sline sa prikazanim dideoksi metodom, uveden je niz poboljanja koji znatno ubrzavaju proces sekvencioniranja. Danas je sekvencioniranje DNK potpuno automatizovano. Robotizovani ureaji meaju reagense za sekvencioniranje, postavljaju elektroforezu i oitavaju redosled dobijenih fragmenata u gelovima.

DNK sekvencioner

Elektroforeogram PCR amplifikovane DNK pela (Stevanovi i Stanimirovi 2006)

Sekvencionirani genom dela mDNK pela (Stevanovi i Stanimirovi 2006)

TEST C2D

TEST C2D TEST C2D

C2D2 C2D C2D2 C2D

C2D2 C2D

C2D2 C2D C2D2 C2D C2D2 C2D

1 GTATTTTTAAACTTTTATTAAAATTTCCC-ACTTAATTCATATTAATTTAAAAATAAATT GTATTTTTAAACTTTTATTAAAATTTCCC-ACTTAATTCATATTAATTTAAAAATAAATT ***************************** ****************************** 2 3 AATAACAATTTTTAATAAAATAAATAATTAATTTTATTTTTATATTGAATTTTAAATTCA AATAACAATTTTTAATAAAATAAATAATTAATTTTATTTTTATATTGAATTTTAAATTCA ************************************************************ ATCTTAAAGATTTAATCTTTTTATTAAAATTAATAAATTAATATAAAATAAAACAAAATA ATCTTAAAGATTTAATCTTTTTATTAAAATTAATAAATTAATATAAAATAAAACAAAATA ************************************************************ 4 5 6 TAACAGAATATATTTATTAAAATTTAATTTATTAAAATTTCCACATGATTCATATTTATA TAACAGAATATATTTATAATAATTTAATTTATTAAAATTTCCACATGATTCATATTTATA ***************** * ****************************** ********* TTTCAAGAATCAAATTCATATTATGCTGATAATTTAATTTCATTTCATAATATAGTTATA TTTCAAGAATCAAATTCATATTATGCTGATAATTTAATTTCATTTCATAATATAGTTATA ************************************************************ 7 ATAATTATTATTATAATTTCAACATTAACTGTATATATTATTTTAGATTTATTTATAAAC ATAATTATTATTATAATTTCAACATTAACTGTATATATTATTTTAGATTT-TTTATAAAC ************************************************** ********* 8 AAATTTTCAAATTTATTTTTATTAAAAAATCATAATATTGAAATTATTTGAACAATTATT AAATTTTCAAATTTATTTTTATTAAAAAATCATAATATTGAAATTATTTGAACAATTATT ***** ****************************************************** CCAATTATTATTCTATTAATTATTTGTTTTCCATCATTAAAAATTTTATATTTAATTGAT CCAATTATTATTCTATTAATTATTTGTTTTCCATCATTAAAAATTTTATATTTAATTGAT ************************************************************ GAAATTGTA GAAATTGTA *********

59 59

119 119 179 179

239 229 299 399

359 358

419 418 479 478 534 487

Sekvencionirani genom dela mDNK (COI-COII region) pela crveno obeleeno predstavlja nukleotidne razlike izmeu pleka u Srbiji i Sloveniji. (Stevanovi i Stanimirovi 2006)

Previously described haplotypes of the C phylogenetic lineage C1 (Franck et all., 2001) C2A (Franck et all., 2001) C2B (Franck et all., 2001) C2C (Sunik et all. 2004) C2D (Sunik et all. 2004) Proposed haplotype desination C2D2

Polymorphic site 1 C 2 C A C C C 3 T T A T T 4 5 6 T C C T C 7 8 C T T C T

Nucleotides at five already described and three new variable positions of COI-COII mtDNA region, differentiating haplotypes of A. mellifera C phylogenetic lineage

TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK

- GENETIKI INENJERING I TRANSGENEZA -

Genetiko inenjerstvo izazvalo je revoluciju u biolokim naukama. Novi prodori uinjeni su na gotovo svim podrujima biolokih istraivanja. Primena tehnologije rekombinantne DNK i genetikog inenjerstva mogua je u sferi kako fundamentalnih, tako i primenjenih istraivanja.

Znaaj tehnologije rekombinantne DNK u fundamentalnim istraivanjima ogleda se u boljem sagledavanju strukture i funkcionisanja prokariotskih i eukariotskih genoma, kao i genoma virusa. Pri tome se ispituje regulacija aktivnosti gena, odreuje se primarna struktura kodirajuih i regulatornih sekvenci, mehanizmi interakcije genoma virusa i elije domaina, uloga mobilnih genetikih elemenata (npr. transpozona), poreenja primarne strukture gena iz razliitih vrsta itd.

GENETIKI INENJERING I TRANSGENEZA -

Izolacijom nekog gena postie se mogunost kontrolisane izmene nukleotida i praenje posledica koje takve izmene imaju po funkcionisanje datog gena (usmerena mutageneza, engl. site-directed mutagenesis). Praenjem koliine iRNK za neki protein moe se ispitivati tkivno-specifina i razvojno-specifina promena ekspresije odgovarajueg gena. esto je neophodno ispitivati proteinske produkte koji se u elijama nalaze u sasvim malim kolilinama, ali imaju izuzetno veliki znaaj za replikaciju i ekspresiju genoma (enzimi replikacije, transkripcije, regulatorni proteini). Hiperprodukcija ovih proteina pomou ekspresionih vektora (vektori koji se ispoljavaju do nivoa proteina) omoguuje prikupljanje dovoljne koliine proteina za detaljnije fizikohemijske i biohemijske analize.

Pankreas

Bakterijska elija sa plazmidima

Insulin produkujua elija

Izolovana DNK iz insulinelija

Plazmid prstenasta DNK iz genoma bakterije Plazmid sa prekidom

Insulin gen iseen iz DNK elije pankreasa Insulin gen slepljen sa DNK iz plazmida Ubaen hibridni plazmid u eliju bakterije Bakterija produkuje humani insulin

Fuzionisanjem kodirajuih sekvenci razliitih gena mogue je dobiti hibridni gen koji e produkovati fuzioni protein u kome su objedinjeni razliiti domeni iz dva proteinska molekula. Na taj nain olakana je analiza funkcije razliitih domena proteina.

TEHNOLOGIJA REKOMBINANTNE DNK

GENETIKI INENJERING I TRANSGENEZA -

Potrebno je, meutim, istai da ispitivanje izolovanih gena ili grupe gena predstavlja pojednostavljenje realne bioloke situacije u kompleksnom eukariotskom organizmu. Posebni postpuci manipulacije genima omoguavaju prenoenje gena jedne u genom druge bioloke vrste obuhvaeni su zajednikim imenom transgeneza. Transgene ivotinje su permanentno reinenjerisane putem trajne insercije, delecije ili zamene gena u svom genomu. Idealno bi bilo zameniti normalni gen sa izmenjenim i zatim ispitati njegovo funkcionisanje u odstustvu normalnog proteina.

Kada se DNK ubacuje u eliju sisara, nije mogue kontrolisati kako i gde se ona integrie u hromozom. Ukoliko, na primer, DNK sa mutiranim genom mia unesemo u eliju mia, ona e se obino ugraditi u hromozome nasumice, ali otprilike jednom u hiljadu puta zamene jednu od dve kopije normalnog gena putem homologe rekombinacije. Uprkos svim tehnikim potekoama, ovakvom zamenom gena moe da se postigne inaktivacija ili promena bilo kog gena u jedru mia ili druge ivotinje.

Transgeneza

Transgeni mi (levo) sa unetim himernim genom za hormon rasta oveka dvostruko je vei od normalnog ma (desno).

GENETIKI INENJERING I TRANSGENEZA -

Jedna od moguih tehnika za dobijanje transgenih mieva prikazana je na slic. Najpre se DNK fragment sa eljenim mutiranim genom (ili DNK fragment koji treba da narui funkciju ciljnog gena), ubacuje u vektor i uvodi u posebnu liniju embrionskih stem elija. Embrionske stem elije se uzgajaju u posebnim hranljivim medijumima, a s obzirom da vode poreklo iz ranog embriona mia one su u stanju da produkuju veliki broj razliitih tipova elija.

Nakon perioda proliferacije embrionskih stem elija, identifikuju se i izoluju retke kolonije elija u kojima se gen zamenio putem homologe rekombinacije. U sledeem koraku, elije sa zamenjenim genom unose se finom mikropipetom u rani embrion mia. Unete elije zajedno sa pristunim elijama embriona razvie se u mieve koje su himere. Himerni mievi sa transgenom u germinativnim elijama ukrtaju se i produkuju potomke meu kojima postoje hetrozigoti za zamenjeni gen. Ukrtanjem dva heterozigota javie se 25% potomaka homozigotnih za zamenjeni gen. Ukoliko se zamenom gena vrila inaktivacija normalnog alela, prouavanjem ovih homozigota moe se utvrditi kakva je uloga zamenjenog gena u individualnom razviu ili fiziologiji.

Postupak dobijanja transgenog mia. a) Izmenjena verzija gena uvodi se u embrionalne stem (ES) elije. Samo u nekim ES elijama normalna kopija gena e da se zameni izmenjenim genom. b) Izmenjene ES elije injiciraju se u rani embrion mia. Dobie se mozaici sastavljeni iz normalnih elija i elija sa izmenjenim genom (predstavljene oseneno). Kod nekih mieva izmenjeni gen se nalazi u gametima, te se moe iskoristiti da se ukrtanjima stvori transgeni mi koji na oba hromozoma ima izmenjenu verziju gena

Transgeneza
Mikroprojektilni pitolj za ispaljivanje peletirane DNK

- GENETIKI INENJERING I TRANSGENEZA Za unoenje DNK u drugu eliju koriste se razliite tehnike kao to su: mikroinjekcioni postupak (ubacivanje DNK u jedro oploene jajne elije), elektroporacija (promena propustljivost elijske membrane pomou elektrine energije ime se omoguava prolazak molekula DNK), virusni vektori (imaju najveu primenu u humanoj genskoj terapiji), mikroprojektilni pitolj (ispaljivanje peletirane DNK), Lipozomi (tvorevine fosfolipidnog dvosloja koje u unutranjosti sadre DNK, lako se fuzioniu sa membranom elije) .

GENETIKI INENJERING I TRANSGENEZA -

Prve transgene ivotinje bili su mievi dobijeni 1980. godine. Postupak transgenze prvi put je sproveden na domaim ivotinjama 1985. godine, kada su proizvedene transgene svinje i ovce sa genom za faktor rasta oveka. Od tog vremena, dobijen je veliki broj transgenih ivotinja, ukljuujui ribe, ivinu, koze, ovce i goveda

Transgena telad

Transgeneza

Transgeni mi (levo) sa unetim himernim genom za hormon rasta oveka dvostruko je vei od normalnog ma (desno).

Transgeneza

Transgene ovce

Upakovana genska konstrukcija Nucleus

Transgeneza

Virus-vektor

Genom vektora Infekcija i kontrola kulture elije Vezane vektorske partikule Injekcija genetiki izmenjenih jedara u perivitelinski prostor oploene jajne elije

Oploena jajna elija

Transgeno jagnje otporno na infekcije

Postupak dobijanja transgrnog transgenog jagnjeta

Transgeno jagnje

Transgeneza

Transgena prasad

Transgeneza kod goveda

Izolovana jajna elija Donor embriona

Enukleacija jajne elije elektrofuzija

Selekcija najboljih embrio elija

Majkainkubator

Novi EMT embrion

Transfer embriona u recepijent

Transgeneza Transgena telad

Transgena koka nosilja, koja nosi jaja bez holesterol, a sa poveanom koliinom nezasienih masnih kiselina

Transgeneza

Transgena telad

Transgeneza kodujuih sekvenci moe znaiti uvoenje novih alela ili ve postojeih gena u genom odreene vrste. Tako su, u genomu enki ivotinja, ve prisutni geni koji koduju sintezu enzima, aktivnih u laktogenezi. Postupkom transgeneze, mogue je dobiti enke koje e proizvoditi mleko sa niskim sadrajem laktoze. Ovakve ivotinje u svom genomu sadre transgen, tj. gensku konstrukciju, ija kodujua sekvenca kontrolie sintezu enzima koji uestvuju u stvaranju mlenog eera, tj. Laktoze.

Genska terapija

Posebnu panju zasluuju transgene ivotinje koje slue za proizvodnju humanih proteina u terapeutske svrhe, kao to su npr. faktori koagulacije krvi ili alfa-1-antitripsin. Tako, mogu da se dobiju transgene ovce za genske sekvence koje koduju sintezu faktora koagulacije krvi kod oveka. Obino se, u ovom postupku, kodujue sekvence humanog genoma za faktore koagulacije krvi insertuju u molekul DNK, neposredno iza promotorne sekvence gena koji koduju sintezu proteina mleka, kao to je npr. promotorna sekvenca gena za beta-laktoalbumin

elijska multiplikacija i diferencijacija Injektiranje modifikovanih elija u telo pacijenta Genetika modifikacija

Pacijent
Odabrane ispravne genetiki modifikovane elije

Genska terapija

Tada se u organizmu transgenih ovaca, proizvode faktori koagulacije krvi oveka, izluuju se u mleku, a iz mleka se mogu jednostavno izolovati u istom obliku. Razmatra se upotreba transgenih ivotinja za proizvodnju tkiva ili organa, namenjenih za transplantaciju kod oveka. Tako mogu da se dobiju transgene svinje za gene koji koduju sintezu polipeptida, a koji se nalaze na povrini elija tkiva i organa kod oveka i da, na taj nain, pri transplantaciji bude onemoguena reakcija odbacivanja transplantanata.

Genska terapija

Oduvek je ovekova elja bila da utie na kvantitativne, tj. proizvodne karakteristike domaih ivotinja. Meutim, rani eksperimenti u proizvodnji transgenih ivotinja sa brim i veim prirastom, ostali su bez uspeha. Transgene svinje za gen koji koduje sintezu hormona rasta sa brim i veim prirastom, bile su podlone nizu kotano-zglobnih oboljenja, koja su upravo bila posledica abnormalnog prirasta

Genska terapija
Transgeno prase sa izmenjenim genom za hormonom rasta

Pankreas

Bakterijska elija sa plazmidima

GENETIKI INENJERING I TRANSGENEZA

Insulin produkujua elija

Plazmid prstenasta DNK iz genoma bakterije

Izolovana DNK iz insulinelija

Plazmid sa prekidom

Insulin gen iseen iz DNK elije pankreasa Insulin gen slepljen sa DNK iz plazmida Ubaen hibridni plazmid u eliju bakterije Bakterija produkuje humani insulin

Danas je mogue sintetisati pojedine proteine koji se koriste u terapeutske svrhe (insulin, somatostatin, interferon) ubacivanjem humanih gena u prokariotske sisteme. Humani insulin sintetisan u Escherichia coli puten je na trite 1982. god.

Posebno znaajna oblast primene u medicini je molekulska dijagnostika koja podrazumeva primenu hibridizacije nukleinskih kiselina radi dijagnostikovanja nekih naslednih bolesti ili otkrivanja uzronika infektivnih bolesti. Kod naslednih bolesti mogue je uzeti uzorak horionskih resica iz kojeg se izoluje DNK i zatim se ispituje na prisustvo bolesnog gena (prenatalna dijagnostika). U sluaju infektivnih bolesti uzorak tkiva ili periferne krvi ispituje se na prisustvo DNK sekvenci specifinih za izazivaa bolesti (tuberkuloza, AIDS itd.).

GENETIKI INENJERING I TRANSGENEZA Posebno su interesantna istraivanja u oblasti genske terapije, odnosno zamene bolesnih gena zdravim ime bi se kod monogenskih bolesti (prouzrokovanih jednim genom) postiglo trajno izleenje (genska hirurgija).

Za sada, genska terapija se radi samo eksperimentalno na ivotinjama pri emu se intenzivno ispituje uvoenje molekula DNK u elije ivotinja putem retrovirusa. Najvei problem je u injenici da se danas raspolae jo uvek primitivnim metodama za nasumino uvoenje DNK u eliju, bez mogunosti usmeravanja prema defektrnoj eliji i bez mogunosti odstranjivanja mutirane genetske informacije, kao i bez uspene metode za korekciju mutacije u oboleloj eliji. Sadanja istraivanja su usmerena na transplantaciju gena humanih elija .

Genska terapija kod psa sa mukopolisaharidozom VII koja je u osnovi Taj Sach sindroma (deficit b-glukuronidaze)

GENETIKI INENJERING I TRANSGENEZA Najpogodnije elije za ova istraivanja su elije kostne sri zbog svoje visoke proliferativne mogunosti. Punkcijom, kostna sr se izdvaja iz grudne kosti pacijenta obolelog od nekog hematolokog oboljenja i elije se stavljaju u medijum (kultura elija). U isti medijum se ubacuju retrovirusi kojima su ugraeni zdravi geni.

Retrovirusi kao vektori, pored svog genoma u eliju (limfocit) ugrauju i zdravi gen. Nakon vie mitotskih deoba ovako genetski izmenjene elije se vraaju u organizam obolele osobe. Meutim, ova metoda jo uvek nije dovoljno usavrena jer od velikog broja elija samo neke od njih su dobile zdravi gen na odgovarajuem mestu genoma.

NOBELOVA NAGRADA 2006

HEMIJA : ROGER D. KORNBERG: KORNBERG

MOLEKULARNA OSNOVA TRANSKRIPCIJE KOD EUKARIOTA

MEDICINA/ FIZIOLOGIJA: ANDREW Z. FIRE, CRAIG C. MELLO RNK INTERFERENCA

HEMIJA : ROGER D. KORNBERG

Kombinovao elektronsku mikroskopiju i kristalografiju X-zracima i dobio detaljnu sliku

MOLEKULARNE OSNOVE TRANSKRIPCIJE KOD EUKARIOTA

ZNAAJ :

SHVAEN JE MEHANIZAM I REGULACIJA TRANSKRIPCIJE

TRANSKRIPCIJA

3D SLIKA PROCESA

GENERALNI FAKTORI PROCESA

2D SLIKA PROCESA

MEDICINA/ FIZIOLOGIJA: ANDREW Z. FIRE, CRAIG C. MELLO RNK INTERFERENCA

ZNAAJ: - RNKi

TITI OD INFEKCIJE RNK VIRUSIMA (POSEBNO BILJKE I INVERTEBRATE)

-ODRAVA STABILNOST GENOMA UTIAVAJUI MOBILNE ELEMENTE -REPRESIJA SINTEZE PROTEINA I REGULACIJA RAZVOJA ORGANIZMA -ODRAVA HROMATIN KONDENZOVANIM I SUPRIMIRA TRANSKRIPCIJU -EKSPERIMENTALNO ORUE ZA REPRESIJU SPECIFINIH GENA -MOGUA PRIMENA U GENSKOJ TERAPIJI

MEHANIZAM RNKi