Biochem Lab Darb

VILNIAUS UNIVERSITETAS BIOCHEMIJOS IR BIOFIZIKOS KATEDRA
Lida Bagdonien, Vida Bendikien, Jurgis Kadziauskas, Danut Labeikyt, Arvydas Markuckas, Virginija Sabaliauskien, Zofija Sasnauskien, Vaida eputien
BIOCHEMIJOS
laboratoriniai darbai
VILNIAUS UNIVERSITETO LEIDYKLA

2006
Turinys
1.
SAUGAUS DARBO BIOCHEMIJOS LABORATORIJOJE PAGRINDINS TAISYKLS 1.1. Bendrosios taisykls 1.2. Pagrindins taisykls 1.3. Higienos reikalavimai 1.4. Saugos priemons 1.5. Laboratorijoje naudojami sveikatai kenksmingi reagentai ir darbo ypatumai 1.6. Pirmoji pagalba nelaiming atsitikim atveju TIRPALAI IR J RUOIMAS 2.1. Tirpal koncentracijos reikimo bdai 2.2. Tirpal ruoimas, darbas su tirpalais 2.3. Tirpal trio matavimo priemons 2.4. Darbas automatiniu dozatoriumi 2.4.1 Automatinio dozatoriaus darbo tikslumo vertinimas TIRPAL PH. BUFERINIAI TIRPALAI 3.1. Vandenilio jon koncentracijos reikimas 3.2. Vandenilio jon koncentracijos matavimas 3.3. Silpn rgi ir bazi jonizacija 3.4. Buferiniai tirpalai 3.5. Buferini tirpal ruoimas 3.5.1. Buferinio tirpalo gaminimas, buferins tirpalo talpos nustatymas AUDINI IR LSTELI ARDYMAS IR FRAKCIONAVIMAS 4.1. Lsteli ir audini suardymas. 4.2. Lsteli ir audini suardymas, nenaudojant detergent. 4.3. Lsteli ir audini ardymas, naudojant detergentus 4.4. Homogenizacijos tirpalo sudedamosios dalys 4.5. Lsteli ir/ar audini frakcionavimo bdai. Centrifugavimas. 4.5.1. Diferencinis centrifugavimas 4.5.2. Centrifugavimas tankio gradientu
2.
3.
4.
_________________________________
BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI
4.6. Nelstelinio ekstrakto frakcionavimo metodai 4.6.1. Baltym nusodinimas trichloracto rgtimi (TCA) 4.6.2. Baltym nusodinimas amonio sulfatu 4.6.3. Baltym nusodinimas etanoliu 4.6.4. Baltym nusodinimas pargtintu acetonu ir metanoliu 4.6.5. Dializ 4.7. Peramininimas 4.8. Alkoholio dehidrogenazs (ADH) iskyrimas i kepimo mieli 4.8.1. Alkoholio dehidrogenazs gryninimas 4.8.2. Baltymo kiekio nustatymas frakcijose 4.8.3. Fermento aktyvumo nustatymas 5. VIESOS SUGERTIS 5.1. viesos sugerties prigimtis 5.2. Kiekybiniai matavimai. Bero ir Lamberto dsnis 5.3. Kokybins aminorgi atpainimo reakcijos. 5.3.1. Ninhidrino reakcija 5.3.2. Reakcija su histidinu ir tirozinu (Paulio reakcija) 5.3.3. Biureto reakcija peptidiniams ryiams nustatyti 5.4. Kokybins angliavandeni nustatymo reakcijos 5.4.1. Selivanovo reakcija ketoheksozms nustatyti 5.4.2. Triomerio reakcija aldozms nustatyti 5.5. Baltym kiekio nustatymas 5.5.1. Baltym koncentracijos nustatymas, matuojant ultravioletins viesos sugert ties 280 nm. 5.5.2. Baltymo kiekio nustatymas Louri metodu 5.5.3. Baltymo kiekio nustatymas bisinchonins rgties (BCA) metodu 5.5.4. Baltym kiekio nustatymas biureto metodu BALTYM IR PEPTID MERKAPTOGRUPI NUSTATYMAS CHROMATOGRAFIJA 7.1 Chromatografijos pasiskirstymo koeficientas 7.2 Chromatografijos bdai 7.3 Kolonlin chromatografija 7.3.1. Kolonlins chromatografijos ranga 7.3.2. Nuostovioji faz upildas/ sorbentas/neiklis 7.3.3. Kolonls paruoimas ir eliucija
6. 7.
1. Saugaus darbo biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls ________________________
7.4. Plokioji (popieriaus ir plonasluoksn) chromatografija 7.4.1. Popieriaus chromatografija 7.4.2. Plonasluoksn chromatografija 7.5 Chromatografijos metodai 7.5.1. Adsorbcin chromatografija 7.5.2. Pasiskirstymo chromatografija 7.5.3. Jon main chromatografija 7.5.4. Molekuli iskyrimo chromatografija (gelchromatografija) 7.5.5. Giminingumo (afinin) chromatografija 7.6. Aminorgi ir nukleotid nustatymas 7.6.1. Plonasluoksn chromatografija 7.6.2. Ratin popieriaus chromatografija 7.6.3. Kylamoji chromatografija 7.7. Mlynojo dekstrano nudruskinimas gelchromatografijos metodu 7.7.1. Kolonls pildymas 7.7.2. Pavyzdio paruoimas ir upylimas ant kolonls 7.8. Hemoglobino molekulins mass nustatymas gelchromatografijos bdu 7.8.1 Sefadekso G-75-kolonls Vo nustatymas 7.8.2 Sefadekso G-75-kolonls Ve nustatymas 8. BALTYM ELEKTROFOREZ 8.1. Elektra ir elektroforez 8.2. Omo dsnis ir elektroforez 8.3. Vienkrypt staioji nutrkstamoji baltym gelelektroforez denatravimo slygomis (atsivelgiant Lemli) 8.3.1. Poliakrilamido gelio paruoimas 8.3.2. Baltym paruoimas elektroforezei ir j pilimas koncentruojamojo gelio ulinlius 8.3.3. Elektroforezs aparato jungimas elektros srovs altin 8.3.4. Elektroforezs aparato irinkimas po elektroforezs 8.3.5. Baltym daymas gelyje 8.4. Baltym nustatymas gelio elektroforezs metodu 8.4.1. Skiriamojo gelio paruoimas 8.4.2. Koncentruojamojo gelio paruoimas 8.4.3. Baltym preparat paruoimas elektroforezei ir j pylimas koncentruojamojo gelio ulinlius 8.4.4. Baltym daymas gelyje po elektroforezs
_________________________________
9.
NUKLEORGI GRYNINIMAS IR ANALIZ 9.1. DNR gryninimas 9.2. RNR gryninimas 9.3. DNR modifikuojantys fermentai 9.1.1. Restrikcijos endonukleazs 9.1.2. DNR polimerazs 9.1.3. Nukleazs 9.1.4. DNR ligazs 9.1.5. Fosfatazs ir kinazs 9.4. Nukleorgi elektroforez agaroziniame gelyje 9.5. Plazmidins DNR gryninimas ir analiz 9.5.1. Plazmidins pTZ19R DNR gryninimas 9.5.2. Fermentin pTZ19R DNR analiz 9.5.3. 1% agarozinio gelio paruoimas. 9.5.4. Fermentini reakcij produkt analiz agaroziniame gelyje. 9.6. Bakterij RNR gryninimas ir analiz 9.6.1. Bakterij RNR gryninimas 9.6.2. Bakterins RNR fermentin analiz 9.6.3. Formaldehidinio 1,5% agarozs gelio paruoimas 9.6.4. RNR analiz agaroziniame gelyje denatravimo slygomis 9.7. Nukleoprotein i mieli iskyrimas ir analiz 9.7.1. Nukleoprotein iskyrimas. 9.7.2. Nukleoproteininio komplekso nukleorgi analiz 9.7.3. Nukleoprotein komplekso peptid analiz 9.8. Chromosomins DNR iskyrimas i eukariotini lsteli TRIACILGLICEROLI HIDROLIZ
A.
10. PRADINIO FERMENTINS REAKCIJOS GREIIO NUSTATYMAS 10.1. Fermentai biologiniai katalizatoriai 10.2. Katalizs samprata 10.2.1. Ferment struktra ir veikimo ypatumai 10.3. Fermentini reakcij greiio priklausomumas nuo substrato koncentracijos 10.4. Alkoholio dehidrogenazs katalizuojamos reakcijos pradinio reakcijos greiio nustatymas 10.4.1. Pradinio reakcijos greiio priklausomumo nuo fermento kiekio nustatymas 10.4.2. Pradinio reakcijos greiio priklausomumas nuo etanolio koncentracijos
10.5. armins fosfatazs i E. coli pradinio reakcijos greiio nustatymas 134 10.5.1. Pradinio reakcijos greiio priklausomumo nuo fermento kiekio nustatymas 10.5.2. Pradinio reakcijos greiio priklausomumo nuo p-NPP koncentracijos nustatymas 11. PRIEDAI
_________________________________
1. Saugaus darbo biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls
1.1. Bendrosios taisykls

Prie pradedant dirbti biochemijos laboratorijoje, susipastama su saugaus darbo su cheminmis mediagomis, laboratoriniais prietaisais, darbo su mikroorganizmais ir bandomaisiais gyvnais taisyklmis. Darbo saugumas priklauso nuo mogaus, dirbanio laboratorijoje, asmenins atsakomybs. Studentai, supaindinti su saugaus darbo taisyklmis, pasirao Darbo saugos urnale. Prie praddami dirbti, studentai turi pasakyti dstytojui apie tam tikrus sveikatos sutrikimus, (pvz. alergij, astm). Ligos gali pamti, atliekant laboratorijoje tam tikrus bandymus.
2.
Pa g r i n d i n s t a i s y k l s
Laboratorijoje nedirbkite darb, tiesiogiai nesusijusi su atliekama uduotimi. Prie praddami bandymus, btinai isiaikinkite darbo atlikimo metodik ir pradkite darb tik dstytojui leidus. Nenaudokite chemini reagent, ant kuri pakuoi nra etikei. Darbo vietoje turi bti tik konkreiai uduoiai atlikti reikalingi reagentai ir prietaisai. Centrifuguokite tik sulygsvarintus mgintuvlius (rotoriuje vienas prie kit dedami lygaus svorio mgintuvliai ) ir udar centrifugos dangt. Nepalikite be prieiros deganio duj degiklio ir veikiani prietais. Atsargiai dirbkite elektroforezs (baltym ir nukleorgi) aparatais. jungti elektros tinkl galima tik udengus dangt; elektroforezs metu nepilkite buferinio tirpalo ir nelieskite. Negalima siurbti skysio pipet burna, reikia naudoti gumines kriaues arba specialius pipei antgalius. Visada naudokite maiausi kenksmingos mediagos kiek. Draudiama pilti kriaukles chemini reagent ir organini tirpikli atliekas, mikroorganizmams auginti panaudotos mitybins terps liekanas. iukli d negalima imesti naudot agarozs ir poliakrilamido geli, Petri lkteli su bakterij kolonijomis. ios atliekos pilamos arba sudedamos tam skirtus konteinerius.
10 _________________________________
3. Higienos reikalavimai Paltus ir striukes palikite drabuinje, o rankines, kuprines tvarkingai sudkite tam skirtoje vietoje. Pageidautina, kad apsivilktumte laboratorin chalat o ilgus plaukus suritumte. Laboratorijoje draudiama valgyti, gerti, rkyti. Negalima uostyti arba ragauti joki chemini mediag.Prisiminkite, kad beveik visos chemins mediagos yra nuodingos! Dirbti su ypa kenksmingomis ir skleidianiomis nemalon kvap mediagomis (pvz.,. fenoliu, chloroformu) reikia traukos spintoje ir btinai usimovus pirtines. Darbus, kuri metu gali bti paeistos akys, reikia atlikti su apsauginiais akiniais ar kaukmis.
4.
Saugos priemons
Visada prisiminkite, kad koncentruotos rgtys, jas skiediant, visada pilamos vanden, o ne atvirkiai! Bkite atsargs dirbdami su organiniais tirpikliais: beveik visi yra degs. J negalima kaitinti atvira liepsna, nes kilus gaisrui sunku ugesinti. Be to, tirpikliai yra laks ir nuodingi. Laboratorijose naudojami stikliniai cheminiai indai, todl reikia dirbti atsargiai, nes dtantys stiklai gali sualoti. Nenaudokite skilusi arba aplinjusiais kratais ind. Ypa atsargiai reikia naudoti stiklinius gyvsidabrio termometrus. Negalima termometr naudoti vietoje stiklins lazdels reakcijos miiniui maiyti. Suduus termometrui ir isipylus gyvsidabriui, reikia nedelsiant praneti laborantui arba dstytojui. Gyvsidabr btina surinkti. Kaitinant arba virinant skysius mgintuvliuose arba kolbose, j ang reikia nukreipti nuo savs ir alia dirbani koleg, o ind judinti, kol skystis tolygiai yla. Negalima irti kaitinamo indo turin i viraus. Saugokite akis! Neliesti elektros prietais lapiomis rankomis.
5.
Laboratorijoje naudojami sveikatai kenksmingi reagentai ir darbo ypatumai:

Akrilamidas neurotoksinas, pateks pro od, kaupiasi organizme. Sverti reikia labai atsargiai, usidjus kauk ir mvint pirtines. Poliakrilamido geliai nra pavojingi. Aktinomicinas D antibiotikas, kancerogenas, gali sukelti alergij. Sverti ir tirpinti tik usimovus pirtines, saugoti akis.
11
Ditiotreitolis (DTT ) neurotoksinas. Etidio bromidas mutagenas, nuodingas. Su tirpalais, turiniais etidio bromido, dirbti tik mvint pirtines. Beta-merkaptoetanolis neurotoksinas. reagent pilstyti tik traukos spintoje. altame kambaryje reagent reikia pilti labai atidiai ir greitai (skleidia nemalon kvap). Fenolis labai agresyvus, grauia, gali sukelti sunkius nudegimus. Dirbti tik mvint pirtines ir su apsauginiais akiniais. kvpus fenolio gar, gerti stipri kav arba arbat, kvpuoti 2% sodos tirpal. NDS (natrio dodecilsulfatas) alergenas, sverti NDS tik usidjus kauk ir usimovus pirtines (labai lengvai dulka, pavojinga kvpti). Trichloracto ir trifluoracto rgtys agresyvios organins rgtys, dirbti usimovus pirtines ir su apsauginiais akiniais.
6.
Pirmoji pagalba nelaiming atsitikim atveju

Prireikus naudotis pirmosios medicinins pagalbos vaistinle. sipjovus ar susieidus stiklo ukmis, atsargiai paalinti i aizdos stiklo gabaliukus, o pjaut viet patepti spiritiniu jodo tirpalu ir apriti. Apsideginus, od aldyti vandeniu, vliau paeist viet plauti 5% kalio permanganato tirpalu ir patepti tepalu nuo nudegimo. Chemini nudegim atveju paeist viet gerai nuplauti alto vandens srove, o apsideginus rgtimis plauti 2% NaHCO3 tirpalu. Patekus rgtims akis, taip pat skalauti 2% NaHCO3 tirpalu, o vliau labai atidiai skalauti vandeniu. Nedelsiant reikia kreiptis gydytoj! Nusideginus armais, paeist viet skalauti tekania vandens srove, o vliau plauti 2% acto arba boro rgties tirpalu. armai ypa pavojingi akims. Patekus armams akis, reikia vandens srove 510 min. plauti ak, vliau skalauti 2% boro rgties tirpalu. Nedelsiant reikia kreiptis gydytoj ! Patekus ant odos fenoliui, trifluoracto, trichloracto rgtims ar kitoms agresyvioms, mediagoms, paeist viet nuplauti 40% etanoliu, patepti tepalu nuo nudegim ir apriti.
12 _________________________________
2 . Tirpalai ir j ruoimas
2.1. Tirpal koncentracijos reikimo bdai

Tirpalas yra homogenika sistema, sudaryta i tirpiklio (pvz., vandens) ir tirpinio. Tirpal savybs priklauso nuo tirpiklio ir tirpinio santykio bei j savybi. Labai danai reikia nustatyti tirpalo koncentracij, t. y. paruoti tam tikros sudties tirpal arba nustatyti itirpusios mediagos kiek tirpale. Remiantis SI sistema, itirpusios mediagos koncentracija reikiama mol m3, dimensija m3. Tiesa, laboratorijoje is koncentracijos reikimo bdas naudojamas retai. Daugiau prasta vartoti nesisteminius koncentracijos reikimo vienetus.
2 . 1 . l e n t e l . Nesisteminiai koncentracijos reikimo bdai
ymjimas Cm C CN T w w%
Pavadinimas ir paaikinimas Molialin koncentracija tirpinio moli kiekis 1000 g tirpiklio Molin koncentracija tirpinio moli kiekis viename litre tirpalo Molin ekvivalent koncentracija tirpinio ekvivalent moli kiekis viename litre tirpalo Titras tirpinio mas gramais, esanti 1 ml tirpalo Mass dalis (w/w) tirpinio ir tirpalo masi santykis Mass dalies procentai (%w/w) procentin koncentracija tirpinio mas gramais, esanti 100 g tirpalo
Daniausiai tirpalo koncentracija reikiama C , CN ir w bdais. Molin koncentracija , C (mol l1) vartojama bene daniausiai, ymima paprastais skliaustais ir raide C (pvz., C(NaCl)) arba lautiniais skliaustais (pvz.[NaCl]). Molis bedimensis mediagos kiekio matavimo vienetas. Tai mediagos kiekis, kuriame yra 6,0221023 (Avogadro konstanta) tos mediagos molekuli. Sutarta kalbant apie mediagos kiek, ymti mol (bedimensis dydis). Raant M, turima galvoje ne mediagos kiekis, o koncentracija molis/litre. M dimensija [l1]. Taigi M = mol/l. Naudotis molins koncentracijos reikimo bdu paprasta tik inant tirpinio molin mas, t. y. 6.031023 tirpinio molekuli mas. Mediagos molin mas ymima Mm ir matuojama gramais. Kartais ji pateikiama kaip santykin molin mas Mr . Mr bedimensis dydis, kurio skaitin reikm lygi Mm.
2. Tirpalai darbo biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls ________________________ 1. Saugaus ir j paruoimas _________________________________________________________ 13
P a v y z d y s . Koks kiekis ir kokia mas(m) KCl yra 5 ml 5M KCl tirpalo?
1 litre 5M KCl tirpalo yra itirpusios 5 mol druskos, t. y. 1 ml 5 mmol druskos. Tai yra 5 ml tirpalo yra itirpusios n = 5 5=25 mmol KCl druskos. Mr (KCl) =74,54. m (KCl) = n Mm =0,025 74,54 = 0,11g. Molin ekvivalent koncentracija (ekv l1). Itirpusios mediagos ekvivalent moli skaiius viename litre tirpalo. Ekvivalent molio mas elemento arba mediagos mas gramais, skaitine reikme lygi ekvivalentui. Rgties ekvivalentas skaitine reikme lygus molinei rgties masei, padalytai i vandenilio atom skaiiaus rgties molekulje, bazs molinei bazs masei, padalytai i metalo valentingumo, druskos molinei druskos masei, padalytai i metalo atom saiiaus ir metalo valentingumo sandaugos. HClvienproton rgtis, HCl g-ekv=Mm(HCl). Taigi 1 litre tirpalo yra 1 molis HCl, o 1 ml 1N HCl tirpale yra 1 mmol HCl . H2SO4 dviproton rgtis, H2SO4 g-ekv = Mm (H2SO4)/2 . Taigi 1 litre tirpalo yra 0,5 molio H2SO4 , o 1 ml 1N H2SO4 tirpalo yra 0,5 mmol H2SO4. Mass dalies (procentiniai) tirpalai. Mass dalis gali bti ireikta vieneto dalimis (ymima w/w) arba procentais (ymima % %w/w):
P a v y z d y s . Koks kiekis HCl ir H2SO4 yra 1ml i rgi 1N tirpaluose?
ia w% mass dalis (iuo atveju procentais). Tirpinio mass dal ireikti procentais daugiau prasta nei vieneto dalimis. Procentai rodo, kiek dali sudaro tirpinys, jeigu visas tirpalas sudaro 100 dali.
P a v y z d y s . Kiek grynos acto rgties yra 400 g tirpalo, kuriame acto
rgties mass dalis yra 9%? m (CH3COOH) = 9% 400 g/100% = 36 g t. y. grynos acto rgties 36 g. Norint paruoti 5% NaCl tirpal, reikia 5 g druskos itirpinti 95 g vandens. Galima pasverti 95 g vandens ir tirpinti drusk arba paprasiausiai 5 g druskos tirpinti 95 ml vandens (distiliuoto vandens tankis 1g/cm3, taigi /v / = /w /, ia v vandens tris, w mas). Kartais 5% NaCl tirpalas ruoiamas kitaip 5 g NaCl itirpinama maame vandens tryje (pvz., 80 ml), o vliau matavimo kolboje ar menzroje tirpalo tris papildomas iki 100 ml. Taip paruotas tirpalas skiriasi nuo pirmuoju bdu pagaminto. Susitarta, kad pirmuoju bdu pagaminti tirpalai ymimi w/w, o antruoju bdu w/v. Tai yra tirpalai, kuri koncentracija ireikta mass dalies procentais, atsivelgiant paruoimo bd, turt bti ymimi %w/w arba %w/v. Kartais uraas %v/v rodo skysto
14 _________________________________
tirpinio procentin trio dal. Taigi, jei ruoiate tirpal, kurio koncentracija ireikta tirpalo mass arba trio dalimis, nurodykite w/w, w/v arba v/v t. y. paaikinkite, kaip pagaminote tirpal. Jei ant tirpalo etikets nra i enkl, daniausiai daroma prielaida (ne visada teisinga), kad tirpalo koncentracija %w/w.
P a v y z d y s . Kaip pagaminti 10% w/w akrilamido (100g) , 10% w/v sacharozs (100 ml) ir 10% v/v glicerolio (100 ml) tirpalus. 10% w/w akrilamido tirpalas ruoiamas 10 g akrilamido itirpinus 90 g (90ml) vandens. 10% w/v sacharozs tirpalas ruoiamas 10 g sacharozs tirpinant vandenyje, vliau tirpalo tris papildomas iki 100 ml. 10% v/v glicerolio tirpalas ruoiamas 10 ml glicerolio tr praskiediant iki 100 ml.
Kartais naudojami kiti nesisteminiai (w/v) koncentracijos reikimo bdai. ppm (angl. parts per million) milijonins dalys, ppb (angl. parts per billion) milijardins dalys. ppm ekvivalentikas uraui g ml 1 (106g ml1), t. y. 1,0 ppm tirpalo average koncentracija g ml1 (1,0 106g ml1). Analogikai, ppb milijardin dalis, uraas ekvivalentikas ng ml1 (109 g ml1), t.y 1,0 ppb tirpalo koncentracija ng ml1 (1,0 109 g ml1). ie vienetai daniausiai taikomi liepsnos fotometrijai, atominei absorbcinei spektroskopijai, duj chromatografijai apibdinant labai praskiestus tirpalus. Tirpal skiedimas. Skiediant tirpalus, labai patogu atsiminti priklausomyb: [C 1 ]V 1 =[C 2]V 2 ; ia C 1 ir C 2 pradinio ir galutinio (praskiesto) tirpal koncentracijos, ireiktos tais paiais vienetais, V1 ir V2 i tirpal triai.
P a v y z d y s . Kaip i 0,5 M NaCl 200 ml tirpalo pagaminti 0,1M NaCl tirpal? 0,5 M 200 ml = 0,1 M V2; V2 = 1000 ml. Tai yra reikia 200 ml 0,5 M NaCl tirpal atskiesti iki 1000 ml, kad jo koncentracija bt 0,1 M.
Pradiniai tirpalai (angl. stock solutions). Danai tirpalai gaminami i koncentruotesni tirpal, juos tinkamai praskiediant. Tai patogu, nereikia kiekvien kart i naujo ruoti tirpal.
Pavyzdys. Atliekant PAGE-NDS elektroforez, tiriami pavyzdiai turi bti itirpinti tirpale, vadinamame baltym denatravimo (pavyzdio) buferiu. Pavyzdio buferio sudtis 62,5 mM TRIS-HCl, pH 6,8; 2% NDS, 10% glicerolio, 5% -merkaptoetanolio ir 0,001% bromfenolio mlynojo. Praktikai ruoiami 2 , 3 ,...,6 koncentruotesni pavyzdio buferiniai tirpalai, kuriuose vis tirpalo sand (TRIS, NDS, glicerolio, -merkaptoetanolio) koncentracija yra 2 , 3 ,...,6 didesn.
Kokiu santykiu pavyzdio buferis turi bti sumaiytas su tiriamu mginiu, jeigu vartosite 2 , 3 ir 6 koncentruotesnius baltym pavyzdio buferinius tirpalus? Naudojant 2 pavyzdio bufer sumaioma 1:1 santykiu, t. y. imama viena dalis pavyzdio buferio ir viena dalis tiriamo tirpalo, naudojant 3 bufer sumaioma santykiu 1:2 (imama viena dalis pavyzdio buferio ir dvi dalys tiriamo mginio), naudojant 6 pavyzdio bufer sumaioma 1:5 santykiu (imama viena dalis pavyzdio buferio ir penkios dalys tiriamo tirpalo).
2.2 Tirpal ruoimas, darbas su tirpalais

Ruodami tirpal, pasidomkite tirpinamos mediagos savybmis. Neatsargiai dirbdami su tam tikromis mediagomis, galite pakenkti sveikatai. Bendra taisykl vis mediag tirpalai potencialiai kenksmingi dirbkite atidiai ir susikaup. Ruodami tirpalus laikykits i pagrindini taisykli: vis mediag tirpalus ruokite i turim reagent pasirink geriausios kokybs, variausi reagent; tirpalus gaminkite naudodami aukiausios kokybs vanden, patartina dukart distiliuot ir dejonizuot; esant galimybei, visi tirpalai sterilizuojami (autoklavuojama, jei tirpalo sandai stabils kaitinant arba filtruojama pro 0,22 mm filtr). Gaminant tirpalus, tenka sverti norim reagento ar tirpiklio kiek. Laboratorins svarstykls skiriasi savo svrimo tikslumu ir svrimo riba. Svarstykls, kuri svrimo tikslumas 0,0001 g, svrimo riba 60 g, naudojamos sverti maiems mediagos kiekiams, daniausiai iki 100 mg. Sveriant didesnius mediagos kiekius, naudojamos svarstykls, kuri svrimo tikslumas yra 0,001 g, svrimo riba 100 g. Retsykiais, kai reikia pasverti didesnius mediag kiekius kaip 100 g arba maesnius kaip 0,0001 g, kreipkits laborant ar dstytoj. Sveriant X g mediagos reikia: padti ant svarstykli tui talp, kurioje bus sveriamas reagentas. nustatyti 0". mentele (varia ir ikaitinta) berti X g reagento. Sunkumai sveriant : reagentas susiguljo: Ukimus reagento butel ir stipriai supurius, kartais pavyksta paalinti sunkumus. Mentele (varia ir ikaitinta) susmulkinamas susiguljs reagentas.
16 _________________________________
reikia sverti lakias (NDS, bakterij kultivavimo terps) mediagas. Sverti traukos slygomis. Sverti usidjus apsaugin kauk. svrimo metu reagentas ibarstytas ant svarstykli lktels. negalima bandyti surinkti reagento atgal talp. Toks ibarstytas reagentas atsargiai numus svarstykli lktel imetamas. Svarstykli lktel atsargiai nuvaloma. Draudiama bandyti nupsti ibarstyt reagent. Tai utikrintas bdas ma problem padaryti didiule.
2.3. Tirpal trio matavimo priemons

Dirbant su inomos koncentracijos tirpalais, svarbu tiksliai pamatuoti tirpal tr. Tirpal triui matuoti priemons pateiktos 2.2 lentelje.
2.2 lentel. Laboratorijoje naudojamos tirpal trio matavimo priemons
Trio dozavimo priemon Kolba, stiklin Matavimo cilindras Matavimo kolba Pipet Automatinis trio dozatorius (pipetmanas)1 virktas Mikrovirktas Svrimas2,3
Tirpalo tris, kur galima dozuoti 255000 ml 52000 ml 251000 ml 1100ml 0,55000l 0,520 ml 0,550l Bet koks
Tikslumas Maas Vidutinis Labai didelis Didelis Labai didelis Vidutinis Labai didelis Labai didelis3
Ar tinka kartotiniam dozavimui, ( + / ) + + + + + + +
1 tikslumas labai didelis, jei dozuoti parinktas tinkamas prietaisas, taip pat jei jis tinkamai naudojamas 2 inant tirpalo tank (mediag tankiai nesunkiai randami inynuose ir/ar kataloguose), galima apskaiiuoti tirpalo tr (m= V, kur tirpalo tankis, m tirpalo mas, V tirpalo tris) 3 naudojant tinkamas svarstykles
Laboratorijoje naudojamos 3 ri pipets, pavaizduotos 2.1 pav. A. Atkreipkite dmes a) ir b) skirtumus. Pipets (a) trio gradavimas nuo virutins yms iki apatins padalos, pipet (b) kalibruota nuo apaios iki virutins yms. Skystis pipetes siurbiamas kriaumis ir siurbliukais. Venkite traukti burna tai nesaugu. Siurbliukai gaminami keli spalv. Geltonu siurbliuku daugiausia galima siurbti 0,2 ml, mlynu 2 ml, aliu 10 ml, raudonu 25 ml skysio. Persuktas siurbliuko sraigtas yra daniausia i patogi ranki limo prieastis.
(a)
(b) A
(c) B C
2.1 pav. Laboratorijoje skysi triui paimti ir matuoti naudojami rankiai. A pipets: a) tris graduojamas nuo pipets viraus, baigiasi apatine padala; b) serologin pipet graduoti pradedama nuo pipets apaios baigiama virutine padala; c) nustatyto trio pipet tr rodo pipets ym. B skysiui imti naudojamos kriaus ir C siurbliukai.
iuo metu laboratorijose daniausiai dirbant su vandeniniais tirpalais naudojami automatiniai dozatoriai (pipetmanai).
Atsiminkite: su automatiniais dozatoriais negalima dozuoti koncentruot rgi ir arm tirpal; naudokite automatinius dozatorius, ant kuri yra udti pakeiiamieji plastikiniai antgaliai; visi dozatoriai turi didiausi leistin dozuoti tr (jis paymtas ant kiekvieno prietaiso korpuso). Negalima, reguliuojant dozatori, bandyti nustatyti didesn tr nei didiausias leistinas (taip galima sulauyti prietais); maiausias leistinas dozuoti tris ne visada bna paymtas ant prietaiso korpuso. Negalima, reguliuojant dozatori, bandyti nustatyti maesn tr, nei leistinas maiausias (jei jis nepaymtas ant prietaiso korpuso 1020 % didiausio leistino), nes taip galima sulauyti prietais; trauk prietaiso korpuso ertm (ne plastikin antgal) bet kurio skysio, nedelsdami apie tai pasakykite laborantui ar dstytojui; baigus darb, automatiniai dozatoriai statomi stov.
18 _________________________________
2.3 lentel. Automatiniai keiiamo trio dozatoriai Keiiamasis tris, l 02 010 020 0100 0200 01000 05000 010.000 Rekomenduojama dozuoti l 0,12 0,510 220 10100 50200 1001000 5005000 1 ml10 ml Maiausia padala, l 0,002 0,02 0,02 0,2 0,2 2,0 2,0 20,0
2.4. Darbas automatiniu dozatoriumi

1. Parinkite tinkam prietais tam tikram triui dozuoti. Dozatori modeliai yra dviej ri: keiiamojo trio ir nekeiiamojo (fiksuoto) trio. Fiksuoto trio dozatoriui galima paimti tik tam tikr, ant prietaiso korpuso urayt tirpalo tr. Ant vis keiiamojo trio prietais korpus uraytas didiausias siurbiamo skysio tris. Keiiamojo trio dozatoriai yra keleto tip (r.lentel 3): 2, 10 l, 20 l,100 l, 200 l, 1000 l, 5 ml ir 10 ml didiausiems triams siurbti. Jeigu jums reikia siurbti, pvz. 67 l, js galite naudoti 100 l arba 200 l keiiamojo trio dozatorius.
1 3 2
2.2 pav. Automatiniai dozatoriai. A 1 dozatoriaus stmoklis; 2 plastikinio antgalio numetimo stmoklis; 3 sraigtas, kur sukant nustatomas dozuojamas tris; 4 rankov numetanti antgal; 5 keiiamasis plastikinis antgalis. B dozatoriaus stmoklio darbas siurbiant tam tikr tr; C dozatoriaus stmoklio darbas ipilant paimt tirpal
2. Sraigtu (2.2 pav., A) nustatykite norim paimti tr. 3. Umaukite tinkam plastikin antgal. Antgaliai yra plastikinse dutse, kartais yra svarbu, kad jie bt sterils. 4. Tirpalo siurbimas. Laikydami dozatori staiai, nuspauskite stmokl iki prieinimosi (2.2 pav., B pirmoji padtis STOP). Laikydami nykt ant stmoklio tokia padtimi, plastikin antgal merkite tirpal. Palengva atleiskite pirt nuo stmoklio tirpalas traukiamas plastikin antgal. Palaukite kelet sekundi svarbu, kad nebt traukta oro burbuliuk. Itraukite antgal i tirpalo. Daniausia pradedanij naudotis automatiniais dozatoriais klaida per greitas stmoklio atleidimas, tokiu bdu traukiama oro, netiksliai dozuojamas tirpalo tris. 5. Tirpalo ipylimas. Antgalis priglaudiamas prie indo, kur ipilamas dozuojamas tirpalas, sienels 1015 kampu nuo vertikalios padties (r. pav. 2.2. C). Stmoklis nuspaudiamas iki galo antrosios STOP padties (2.2 pav. C). Kelet sekundi palaukiame, leidiame visam skysiui itekti i plastikinio antgalio. Su nuspaustu iki galo stmokliu (neatleid pirto nuo stmoklio), dozatori iimame i indo. Atleidiame stmokl 6. Antgalio numimas. Daugelis dozatori turi special stmokl antgaliams nuimti (2.2 pav. A). Tuo atveju paprasiausiai nuspaudiame stmokl ir paaliname naudot antgal. Atsivelgiant naudotas mediagas (nuodingos mediagos, prasti tirpalai) naudoti antgaliai surenkami atskirus konteinerius. Dozatoriaus neturinio antgali stmoklio naudot antgal atsargai nuimame pirtais, laikydami u virutins antgalio dalies. 7. Dozatori statome stov. 2.4.1. Automatinio dozatoriaus darbo tikslumo vertinimas Tikslas: Imokti naudotis automatiniu dozatoriumi ir svarstyklmis. vertinti dozavimo paklaidas. Automatinio dozatoriaus darbo tikslumas vertinamas gravimetrijos bdu. Paimami distiliuoto vandens mginiai ir pasveriami. Distiliuoto vandens tankis 1 g/cm3, todl /vi / = /wi / , kur vi i-tojo mginio tris, wi io mginio mas. Pasvrus kartotinai imamus mginius, galima statistikai vertinti dozavimo paklaidas. Tikrosios matuojamo dydio verts veriu laikomas matavimo rezultat aritmetinis vidurkis. Matavimai yra vienodo tikslumo, todl aritmetinis vidurkis nustatomas taip:
= i=1 n
wi
;
ia n matavim skaiius, wi i-tojo matavimo metu gauta matuojamo dydio vert.
20 _________________________________
Absoliuioji paklaida (E):
E% =
v0 v0
100;
ia vo dozuojamas tris, aritmetinis vidurkis. Santykin matavimo rezultat paklaida (E%):

E% = |v0 | 100; v0
Standartin paklaida:
s=
i=1
(v0 w i )2
n 1 .
Apskaiiav santykin paklaid, galime vertinti prietaiso tikslum dozuojamo trio atitikim pasirinkt reikm. Standartin paklaida rodo kartojimsi, t. y. mogaus, kuris atlieka dozavimo operacij, atidum. Mediagos ir prietaisai: 1. Automatiniai keiiamojo trio dozatoriai. 2. Svarstykls. 3. Distiliuotas vanduo. Darbo eiga: 1. Pasirenkamas tinkamas prietaisas dstytojo pasilytam triui dozuoti. 2. Dozatoriumi paimti distiliuoto vandens mginiai (n5) pasveriami. Sveriant vandens mginius [210] ml naudoti svarstykles, kuri tikslumas 0,0001 g, kitais atvejais svarstykles, kuri tikslumas 0,001 g. 3. Apskaiiuojamas dozuojamo trio aritmetinis vidurkis, santykin ir standartin mgini dozavimo paklaidos. Kontroliniai klausimai. 1. Skiriant ribosomas i kviei daigeli, naudojamas tirpalas, kurio sudtis : 90 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1 mM Mg(CH3COO) 2, 6 mM KHCO3. Kaip paruoti 100 ml tokio tirpalo? Molins mass (Mr) : 74,55 (KCl); 219 (CaCl26H2O); 214,46 (Mg(CH3COO)24H2O); 100,1 (KHCO3). 2. vertinkite automatini dozatori tikslum. Trim dozatoriais (A, B ir C) buvo kartotinai imamas 1000 ml vandens bandinys. ie bandiniai pasverti. Nustatyti
2. Saugaus ir j paruoimas _________________________________________________________ 21 1. Tirpalai darbo biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls ________________________
rezultatai (g). Kuris prietaisas geriausiai kalibruotas. Kuriuo atveju studentas dozuodamas dar daugiausia klaid? a. 0,986; 0,971; 0,993; 0,964; 0,983; 0,996; 0,977; 0,969; 0,982; 0,974; b. 1,013; 1,011; 1,010; 1,009; 1,011; 1,010; 1,011; 1,009; 1,011; 1,012; c. 0,985; 1,022; 1,051; 1,067; 0,973; 0,982; 0,894; 1,045; 1,062; 0,928. 1. Praktikuokits paruoti tirpalus i koncentruot pradini (stock) tirpal. Tarkime, js turite iuos pradinius tirpalus : 0,1 M NaCl, 0,2 M KCl, 0,16 M CaCl2; 0,005 M gliukoz. Kaip paruoti tirpalus, kuri sudtis: a. 1ml 0,001 M KCl tirpalo; b. 50 ml 0,0025 M NaCl ir 0,0005 M gliukozs tirpalo ; c. 100 ml 0,005M NaCl; 0,0025 M KCl; 0,040 M CaCl2; 0,0025 M gliukoz; d. 10 ml tirpalo, kuriame NaCl, KCl ir CaCl2 bt po 20,0 mmol ml1; e. 25 ml tirpalo, kuriame CaCl2 bt 0,008 M, KCl 0,05 M, gliukozs 20,0 nmol ml1.
Literatra: 1. http: www.chemnetbase.com 2. Boyer R. (2000) Modern Experimental Biochemistry, 3rd edn, Benjamin Cummings, San Francisco.
22 _________________________________
3 . Tirpal pH. Buferiniai tirpalai
3.1. Vandenilio jon koncentracijos reikimas

pH yra neigiamas deimtainis vandenilio jon koncentracijos logaritmas.
pH =log10 C(H + ), arba pH =lg[H + ].
Nuo pH priklauso visos biologins sistemos aktyvumas, daugelio biomolekuli tirpumas. Gyv organizm vidini skysi pH beveik nekinta. Tai sudaro palankias slygas veikti tam tikriems fermentams. Vandenini tirpal pH priklauso nuo : Vandens molekuli jonizacijos. Vanduo silpnas elektrolitas. Dalis vandens molekuli tirpale yra jonizuotos : H2O H+ + OH . Rgi jonizacijos HA H+ + A . ia HA rgties molekul, A rgties anijonas. Jonizuojantis rgtims, daugja H+ jon, t. y. tirpalo pH maja. Bazi jonizacijos XOH X+ + OH . ia XOH bazs molekul, X+ metalo jonas. Jonizuojantis bazms, vandeninio tirpalo pH didja. Daugeliui mediag bdingos bazins ar rgtins savybs. Stipri bazi ir rgi vandeniniai tirpalai yra beveik visikai jonizuoti, o silpnos rgtys ar bazs vandeniniame tirpale yra i dalies jonizuotos. Lygtis H2O H+ +OH suprastintai vaizduoja vandens jonizacijos proces. i savaimin jonizacija apraoma pusiausvyros konstanta Kc. Bandymais 24C nustatyta Kc lygi 1,81016.
Kc =
C(H + ) x.C(OH ) =1,81016 . C(H 2 O)
inodami, kad vandens koncentracija 55,55 M, galime parayti:

K w = K c.C(H 2 O) = C(H + ). C(OH ) =1,8 1016 55,55=1014
Konstanta Kw vadinama vandens sandauga ir lygi 1014 . Nesant vandenyje kit jungini, C(H+) = C(OH) = 107. 1909 metais S.Siorensenas (S.Srensen) pasil vandenilio ir hidroksilo jon koncentracijas reikti neigiamais deimtainiais logaritmais : pH ir pOH (nuo potentio Hydrogenii).
3. Tirpal darbo biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls ________________________ 1. SaugauspH. Buferiniai tirpalai _____________________________________________________ 23
Tada pKw = pH +pOH = 14. Stipri rgi tirpal pH = 0 2, silpn rgi 3 6. Neutrali tirpal pH lygus 7. Silpn bazi tirpal pH = 8 11, o arm tirpalams bdinga pH = 12 14.
3.2. Vandenilio jon koncentracijos matavimas

Tirpal pH kiekybikai vertinamas pH-metru (3.1 pav.) arba indikatoriniais daais. Indikatoriniai daai (lentel priedas 5) daniausiai turi silpn rgi savybes. Keiiantis pH, tokios mediagos keiia spalv. djus maus i mediag kiekius tirpal, pasikeitus tirpalo spalvai, apytikriai (paklaida daniausiai 12 pH vienetai) galima daryti ivad apie tokio tirpalo pH. Indikatoriniuose popierliuose sujungtos keleto indikatorini da savybes tokiu bdu maja nustatomo tirpalo pH vertinimo paklaida. Indikatoriniai popierliai naudojami apytiksliai vertinant tirpalo pH. Tiksliai tirpalo pH galima pamatuoti pH-metru.
potenciometras
Ag/ AgCl elektrodas Sotusis KCL tirpalas Kamtis HCl tirpalas palyginamasis kalomelio elektrodas H+ jautrus stiklo elektrodas tiriamasis tirpalas 3.1 pav. pH - metro schema.
pH-metru vandenilio jon koncentracija matuojama elektrodu, jautriu vandenilio jon koncentracijai, prijungtu prie potenciometro. pH elektrodas sudarytas i dviej atskir sistem : H+ jautraus stiklo elektrodo ir palyginamojo elektrodo (kalomelio elektrodas). Elektrod merkus tiriam tirpal, ant stiklo elekrodo atsiranda potencial skirtumas, kuris pamatuojamas potenciometru.
24 _________________________________
3.3. Silpn rgi ir bazi jonizacija

Rgtys junginiai, kurie tirpale jonizuojasi ir iskiria proton. Rgties HA jonizacijos lygtis: HA A + H+. i grtamoji reakcija apraoma pusiausvyros konstanta Ka, vadinama rgties jonizacijos konstanta:
Ka =
C(H + ) x.C(A ) . C(HA)
Silpn rgi jonizacijos konstantos labai mai dydiai. Pavyzdiui, acto rgties jonizacijos konstanta 24C lygi 1,75105. Patogiau naudotis jonizacijos konstant neigiamaisiais logaritmais pKa. pKa= lg Ka. Pavyzdiui, acto rgties pKa lygus 4,75. inodami pKa, galime numatyti, kokios formos (molekulins ar jonizuotos) tirpale bus junginys. Kai tirpalo pH yra maesn u pK, tirpale vyrauja nejonizuota junginio forma. Jei pK lygi pH, pus junginio molekuli yra jonizuotos. Jei pH > pKa, vyrauja jonizuota junginio forma (3.2 pav.). Stiprios rgtys, pvz., HCl, jonizuojasi (iskiria protonus), esant maoms pH reikmms, o silpnos rgtys jonizuojasi esant didesnms pH reikmms, kartais pH >7. Pavyzdiui, aminorgties tirozino funkcins grups fenilo (labai silpnos rgties), pKa10. Bendra taisykl juo stipresn rgtis, tuo jos pKa maesnis.
1.0
CH3COO
(1.0) (0.75)
Bazs ekvivalent skaiius

0.5 (0.5) (0.25) 0.0 2 3 4 5 6 7 8
Rgties molekuls krvis CH3COOH

0.0
pH=pKa
3.2 pav. Acto rgties titravimo kreiv. Molekuls krvis (deinioji ordinat) acto rgties disocijuot ir nedisocijuot molekuli krvio vidurkis
Pavyzdys. Apskaiiuokite 0,01M acto rgties tirpalo pH ir jonizacijos laipsn, jei acto rgties Ka lygus 1,75105. Acto rgties jonizacijos lygtis: CH3COOH CH3COO + H+.
C(H + ). x C(CH3COO ) =1,75 x105 . C(CH3COOH) Paymkime x = C(H+). Tada acetato koncentracija taip pat bus lygi x, o Ka =
nejonizuotos rgties koncentracija lygi (0,01x). Taigi Po akivaizdi lygties pertvarkym gauname lygt 1,75107 1,75105 x =x2.
(x)(x) =1,75 x105 . 0,01 x
i kvadratin lygt nesunkiai galime isprsti prastu bdu, arba, pastebjus, kad lygties dmuo 1,75105x labai maas, paprasiau jo nepaisyti. Tada x2 = 1,75107. x = C(H+) = 4,18104M. pH = lgC(H+) = 3,38. Jonizacijos laipsnis skaiius, rodantis, kuri itirpusi molekuli dalis yra jon pavidalo. Acto rgties jonizacijos laipsnis:
4,18 x 10 4 = 4,18x102 arba 4,18 %. 0,01 C(CH3COO )+C(CH3COOH) =
C(CH3COO )
T. y. tiktai 4% acto rgties molekuli yra jonizuotos. Bazs junginiai, kurie tirpale jonizuojasi ir iskiria OH jon. Amino grupes turintiems junginiams (pirminiams, antriniams, tretiniams aminams) bdingos silpn bazi savybs. Amin (RNH2) jonizacija uraoma lygtimi: RNH2 + H2O RNH3+ + OH.
i grtama jonizacija apraoma pusiausvyros konstanta Kb, vadinama bazs jonizacijos konstanta:
Kb =
+ C(RNH3 ). x C(OH )
C(RNH 2 ). x C(H 2 O)
Kaip ir rgi aveju, daniau vartojami jonizacijos konstant neigiamieji logaritmai pKb = lgKb. i konstanta (panaiai, kaip Ka rgi atveju) yra kiekybinis bazs stiprumo matas. Bendra taisykl juo stipresn baz, juo jos pKb didesnis. Daugiausia bazi pKb reikms yra didesns u 7, pvz., etanolamino pKb =9,5. Vadinasi, tirpale, kurio pH=9,5, pus etanolamino molekuli yra jonizuotos
26 _________________________________
3.4. Buferiniai tirpalai

Buferiniu tirpalu, arba tiesiog buferiu, vadinamas tirpalas, kurio pH nesikeiia arba keiiasi maai, tirpal skiediant arba pridjus nedidel kiek tiek stiprios rgties ar armo. Buferiniai tirpalai yra keli ri: 1. Tirpalai, turintys silpn rgt ir ios rgties stiprios bazs druskos (pvz., CH3COOH + CH3COONa). Tai vadinamieji rgtiniai buferiai. 2. Tirpalai, turintys silpn baz ir drusk, sudaryt i tos bazs ir stiprios rgties anijono (pvz., NH4OH + NH4Cl). Tai vadinamieji baziniai buferiai. Buferinis silpnos rgties ir jos druskos (pvz., CH3COOH +CH3COONa) veikimas: djus tok tirpal iek tiek armo, pvz., NaOH, vyksta procesas :
HA +OH A + H 2 O , ( CH3COOH + Na + +OH - CH3COO + Na + + H 2 O). )
armas suria silpnos rgties HA protonus H+ ir susidaro silpnas elektrolitas H2O. Aiku, didja silpnos rgties anijono A koncentracija. djus tok tirpal iek tiek stiprios rgties, pvz., HCl, didja silpnos rgties koncentracija:
H + + A HA,
( H + +Cl +CH3COO + Na + Na + + Cl + CH 3COOH ). Tai yra stiprios rgties protonai H+ susiria su druskos anijonu A, susidaro silpna rgtis. Buferiniam tirpalui, sudarytam i silpnos rgties HA ir jos druskos D (pvz., CH3COOH + CH3COONa), paraykime lygt, siejani tokio tirpalo pH ir silpnos rgties ir jos druskos koncentracijas (C(HA), C (A)). Silpnos rgties HA jonizacijos pusiausvyros konstanta Ka:
C(H + ) .x C(A ) . C(HA) Esant tirpale vienvardi druskos anijon (A ), rgties jonizacija vyks daug liau. Praktikai silpnos rgties koncentracija po jonizacijos bus lygi pradinei rgties koncentracijai C(HA). Druskos anijon (A) koncentracija bus lygi druskos koncentracijai C(D). Ka =
K x C(HA) C(H + ) = a . C(A )
Taigi pH = pK a +lg
C(A ) arba C(HA)
(1). Lygtis (1) vadinama Hendersono irHaselbacho (HandersonHasselbach) lygtimi. I (1) lygties matome, kad pakeit santyk pvz.,10 kart, santykio de-
imtainis logaritmas (kartu ir pH) pasikeis tik per vienet. Skiediant buferinius tirpalus, vandenilio jon koncentracija (vadinasi, ir pH) nesikeia, nes nekinta santykis .
Buferinio tirpalo veikimas, jo sugebjimas suriti vandenilio ar hidroksilo jonus parodytas 3.3 paveiksle. pH pK2 pK1
Nebuferinis tirpalas
pK+3 pK+2 pK+1 pK pK1 pK2 pK3
Nebuferinis tirpalas
lg 2 1 0 1 2
pK pK+1 pK+2
3.3 pav. Buferinio tirpalo veikimas
Pavyzdys. Kaip pakis buferinio tirpalo, sudaryto i 0,1M acto rgties ir 0,1M natrio acetato, pH, tirpal neus 0,05M NaOH? Acto rgties Ka lygus 1,75105.Kaip is kiekis armo pakeist vandens pH?
Hendersono irHeselbacho lygtis acetatiniam buferiui:
pH = pK a +lg
C(A ) 0,1+0,05 = 4,76+0,48 =5,24. , pH = 4,46+lg 0,10,05 C(HA)
Vandens pH =7. djus vanden 0,05 M NaOH, tirpalo pH = pKw pOH =14 1,31= 12,69. Tai yra buferinio tirpalo pH, djus 0,05M NaOH pakito per 0,78 pH, o vandens per 5,69 pH .
28 _________________________________
Analogiki procesai bus stebimi NH4OH/NH4Cl buferinje sistemoje (bazinis buferinis tirpalas). ioms sistemoms Hendersono ir Haselbacho lygtis:
pH = pK w pK b +lg C(B) C(B) =14 pK b + lg . C(D) C(D)
ia Kb silpnos bazs disociacijos konstanta, Kw vandens disociacijos konstanta; C(B) = [B] silpnos bazs B koncentracija, C(D) = [BH+ ] silpnos bazs katijono BH+ koncentracija. Buferinis veikimas bdingas ir drusk miiniams. Druskoms hidrolizuojantis viena i drusk sukelia labiau rgtin, kita labiau bazin reakcij. Pavyzdiui, NaH2PO4 +Na2HPO4, NaHCO3 +Na2CO3. ios buferins sistemos labai svarbios mogaus organizmo gyvybikai svarbi sistem pastoviam pH palaikyti. Buferinio tirpalo veikimo srit lemia silpnos rgties ar bazs pK reikm. Laikoma, kad buferines savybes sistema turi intervale pK 1. Buferiniai tirpalai skiriasi savo gebjimu palaikyti nekintam pH. Jei vieno tirpalo pH pakito maiau, pvz., djus iek tiek HCl, negu kito buferinio tirpalo, sakome, kad pirmajam tirpalui bdinga didesn buferin talpa. Buferin talp galime vertinti kiekybikai. Tai armo ar rgties kiekis (ekvivalentais), kur dj 1 l tirpalo, io pH pasikeiia vienetu. Buferin talpa visada yra teigiamas dydis, todl (2) lygtis galioja armo atveju, o (3) rgties atveju :
= d[B] dpH d[B] dpH
(2); (3);
Buferin talpa gali bti apskaiiuota teorikai. Buferio, kurio sudt eina silpna rgtis, buferin talpa, kai pH = pK, gali bti apskaiiuota taip (4):
max = 2,303 C 4
(4),
C bendra silpnos rgties HA ir jos druskos A koncentracija Visiems buferiniams tirpalams yra bdingas taip vadinamasis temperatros efektas. Daugumos buferi pH silpnai kinta, pakitus temperatrai. Taiau tam tikr buferini tirpal nustatyta kambario temperatros slygomis pH gali skirtis nuo darbins tirpalo pH reikms. 0,05 M TRIS/HCl tirpalo, kurio pH yra 7,05 temperatr sumainus nuo 370C iki 230C, tirpalo pH padidja iki 7,20. Tokie vandenilio jon koncentracijos pokyiai gali turti takos tiriamam procesui ir j nepaisyti negalima. iuo konkreiu
atveju pH pasikeitim per 0,15 pH vieneto, atitinkantis [H+] skiriasi net 41%. Populiariems buferiams nustatyti vadinamieji temperatros koeficientai. Pvz., TRISo atveju temperatros koeficientas 0,028 / 0C. Jei gaminate 0,05 M TRISHCl pH 7,4 bufer kambario (23C) temperatros slygomis, o naudosite j 40C, praktikai reikia ruoti 6,86 pH tirpal. Esant 400C temperatrai, io tirpalo pH bus 7,4. Aiku, daugumos buferini tirpal temperatros koeficientas daug maesnis ir didels takos i tirpal pH neturi.
3.5. Buferini tirpal ruoimas

Buferiniai tirpalai ruoiami dvejopai: sumaiant silpn rgt ir jos drusk (rgtiniams buferiams) arba silpn baz ir jos drusk (baziniams buferiams) tam tikru santykiu. inant pKa arba pKb galima paruoti norimo pH tirpal. Sudedamj dali santyk nesunkiai galima apskaiiuoti i Hendersono ir Haselbacho lygties. tirpalai ruoiami i silpnos rgties ar silpnos bazs, palengva pridedama armo ar stiprios rgties iki norimo pH (tirpalo pH pokyiai stebimi pHmetru).
Pavyzdys. Kaip paruoti litr 0,05 M TRIS-HCl pH 8,2 tirpalo?
Mr(TRIS)=121,1. Litre 0,05 M tirpalo yra 50 mmol, t. y. 6,055 g TRISo bazs. Pasvr mediagos kiek, itirpiname maesniame nei galutinis dejonizuoto vandens tryje (pvz., 600 ml). Maomis porcijomis dedame tirpal HCl, pH-metru stebime pH kitim iki reikiamos pH 8,2. Gaut tirpal (pH = 8,2) atskiediame iki 1l. 6 lentelje (r. priedas) pateikti danai laboratorijoje naudojami buferiai. Parinkdami buferin sistem atsivelgiame: darbin , t. y. rekomenduojam naudoti tirpalo pH srit. Tinkamiausia laikoma ta buferin sistema, kurios pK ariausias tirpalo pH. Jei pH = pK, tirpalo buferin talpa didiausia. ar kitos tirpalo sudedamosios dalys nereaguoja su buferiu. Pavyzdiui, tiriant Zn2+ ir Pb+ tak tam tikram mediag apykaitos procesui, nepatartina naudoti karbonatinio buferio.
30 _________________________________
3.5.1. Buferinio tirpalo gaminimas, buferins tirpalo talpos nustatymas Naudojantis Hendersono ir Haselbacho lygtimi, apskaiiuoti fosfato buferins sistemos sudedamj dali santyk, ruoiant tam tikro pH tirpalus. Paruoti tokius tirpalus ir itirti i tirpal buferines savybes. Biochemijos darb metu danai naudojamas fosfatinis buferis. i buferin sistem sudaro H2PO4(silpna rgtis) ir HPO42 (silpnos rgties anijonas, konjuguotoji baz). KH2PO4 (silpnos rgties) pKa=6,8. HPO42 /H2PO4 buferinei sistemai Hendersono ir Haselbacho lygtis:
pH = pK a +lg
[HPO2 ] 4
[H 2 PO ] 4
[HPO2 ] 4
kai
[H 2 PO ] 4
=1, t. y. [HPO
]= [H2PO ], pH = pKa = 6,8.

4
Cheminiai reagentai: 1. 0,05 M K2HPO4 ir 0,05M K H2PO4 tirpalai. 2. 0,1 N NaOH ir 0,1 N HCl. 3. KH2PO4 4. 0,1N KOH. Darbo eiga: 1. Naudojant 0,05 M K2HPO4 ir 0,05M KH2PO4 tirpalus, paruoti po 20 ml tirpal, kuri pH bt 5,8; 6,8; 7,8. Sudedamj dali santyk, reikaling nurodytam tirpalui ruoti, apskaiiuokite vartodami Hendersono ir Haselbacho lygt. 5. 6. 7. 8.
H 2 PO4 HPO42 +H + . Rgties pKa lygus 6,8. Patikrinkite gaut tirpal pH, naudodami pH-metr. Paimkite po 5 ml i pagamint tirpal (pH 5,8, 6,8 ir 7,8). Atskieskite iuos mginius vandeniu deimt kart. pH-metru pamatuokite deimt kart praskiest tirpal pH. Nustatykite tirpal, kuri pH 5,8 ir 6,8 buferin talp pagal rgt ir arm. Buferin talp apytikriai galime vertinti tokiu bdu. Prie 10 ml tam tikro pH tirpalo pridedame 1,0 ml 0,1 N NaOH arba 0,1N HCl ir pamatuojamas tirpalo pH. Buferin tirpalo talp apskaiiuojame i formuls: NV1 ; (pH1 pH 0 )V0
2 4
kur pH1 pH0 = pH pH-metro rodmen skirtumas, djus NaOH arba HCl, N dedamos rgties ar armo ekvivalent moliai, V1 dedamos rgties ar armo tris, V0 pradinis tirpalo tris.
9. Nustatykite deimt kart atskiest tirpal, kuri pH 6,8 ir 5,8 buferin talp pagal rgt ir arm. 10. Palyginkite nustatyt buferins talpos reikm pH = pK = 6,8 su teorikai apskaiiuota atsivelgiant (4). 11. Paruokite 100 ml 0,05 M fosfatin bufer, kurio pH bt 6,8, antruoju bdu, t. y. titruodami KH2PO4 tirpal 0,1N KOH iki reikiamo pH: apskaiiuokite, koks kiekis KH2PO4 turi bti pasvertas, norint paruoti 0,05M tirpal; itirpinkite drusk maame tryje vandens (60ml); maomis porcijomis priddami 0,1 N KOH, pasiekite, kad tirpalo pH bt 6,8 tirpalo tr menzroje papildykite iki 100 ml. Kontroliniai klausimai : 1. Buferiniai tirpalai. Hendersono ir Haselbacho lygtis buferiniams tirpalams, kuri sudt eina silpna rgtis ir tirpalams, kuri sudt eina silpna baz. 2. Tarp daugybs buferini sistem, kurios dalyvauja palaikant vidulstelini organizmo skysi pastov pH [6,8; 7,8], labai svarbios yra HCO3H2CO3 (pKa=8,3) ir HPO42 H2PO4 (pKa=6,8) sistemos. Paraykite lygtis, kaip i buferini sistem sudedamosios dalys reaguoja su rgtimis ir bazmis. 3. Kokios aminorgtys pasiymi buferinmis savybmis fiziologinse (t. y. pH [6,8; 7,8]), slygose? 4. Glicino -COOH grups pKa=2,34, NH2 grups pKa= 9,60. Nubrkite glicino titravimo kreiv. Kuriais pH intervalais glicino tirpalas turi buferini savybi? Koks glicino pI? 5. Tribazs fosforo rgties pKa reikms yra 2,2; 7,2; 12,3. Paraykite kokios formos H3PO4 molekul bus pH 0, pH 4, pH 9 ir pH14. Koks tirpalo, sudaryto i 0,1 M NaH2PO4 ir Na2HPO4 pH?
Literatra: 1. Rilbe H.(1996) pH and Buffer Theory a new Approach, Wiley, New York. 2. Reed R., Holmes D., Weyers J., Jones A. (2003) Practical skills in Biomolecular sciences, Pearson Educated Limited.
32 _________________________________
4 . Audini ir lsteli ardymas ir frakcionavimas
Ardymas vyksmas, kurio metu struktrikai suardoma lsteli ir/ar audini struktr vientisumas. Suard lsteles ir audinius, toliau mes juos frakcionuojame, t. y. dalijame daug atskir sudtini dali (frakcij), nordami igryninti pavyzdius tyrimui. Lsteli suspensijos ir audiniai gali bti frakcionuojami daugybe bd, atsivelgiant dalis, kurias norime igryninti (pvz., mitochondrijas, plazmines membranas, DNR, RNR, tirpius baltymus). Labai svarbu, kad kitas eksperimentatorius, nordamas pakartoti js frakcionavim, inot, kiek pradins mediagos jis/ji turt paimti. Dokumentuojant lsteli/ audini frakcionavimo eig, reikia vertinti gryninamos mediagos kiek kiekvienoje frakcijoje. Tai vadinama ieigos skaiiavimu. Skaiiuojant ieig, reikia inoti vis frakcij tr ir gryninamos mediagos koncentracij frakcijoje: ieiga = [frakcijos tris ] [gryninamos mediagos kiekis frakcijoje]. Dauguma audini ir lsteli ardymo ir frakcionavimo metod buvo sukurti arba bent pasilyti iki 1960 1970 met. iuolaikiniai laimjimai daniausiai susij su i metod optimizavimu ir automatizavimu. iandien yra sukurti nuodugns protokolai tam tikriems produktams iskirti ir igryninti i vairiausios biologins mediagos: Current Protocols in Protein Science (CPPS, Coliegen et al, 1998), Current Protocols in Molecular biology (CPMB, Ausubel F. M. et al, 1999). ie protokolai silo strategij tam tikro objekto sudtini dali gryninimui. Pavyzdiui, strategija skirsis ir priklausys nuo to, ar tikslinis produktas yra lstelje, ar nelstelinje frakcijoje. Pastaruoju atveju tereikia atskirti terp nuo lsteli. Gali bti, kad tikslin dalis yra tam tikroje lstels organelje. Tada tikslinga produkt skirti ne i viso lstels lizato, o pirmiausia iskirti i lstels organeli frakcij. Protokol pasilyta strategija turi bti optimizuota: patikslinta frakcionavimo buferi sudedamj dali santykis ir koncentracijos.
4.1. Lsteli ir audini suardymas

altinis (mikroorganizmai, augalai, gyvnai, augal ir gyvn audiniai), i kurio skiriamas produktas (baltymai, fermentai, nukleorgtys, lipidai, lstels organels), labai danai lemia ardymo bd. Vis i objekt lstels turi plazmin membran. Gyvn lstelse tai vienintel utvara, skirianti lstels turin nuo iorins aplinkos. i utvara gana lengvai suardoma. Bakterij ir augal plazmin membrana apsupta tvirtos lstels sienels. Lsteli sienel pagrindin klitis ardant lsteles ir audinius. Bakterij sienels pagrindin sudedamoji
4. Audini darbo biochemijos frakcionavimas __________________________________________ 1. Saugaus ir lsteli ardymas ir laboratorijoje pagrindins taisykls ________________________ 33
mikroorganizmai
augalai
gyvnai
lsteli suardymas
lsteli suardymas
lsteli suardymas
fenoli paalinimas
centrifugavimas ulstelinis ekstraktas
nelstelinis ekstraktas
pradinis frakcionavimas (nusodinimas druskomis, nusodinimas organiniais tirpikliais) antrinis frakcionavimas (jon main, hidrofobin, giminingumo chromatografijos, kiti metodai)
4.1 pav. Bendra altinio frakcionavimo schema
Gram
iorin membrana peptidoglikanas periplazmin ertm plazmin membrana
Gram+
peptidoglikanas plazmin membrana
4.2 pav. Gramneigiamj ir gramteigiamj bakterij sienels sandara
dalis peptidoglikanas (4.2 pav.). is peptidoglikano sluoksnis ypa gramteigiamj bakterij gali bti suardomas veikiant fermentu lizocimu. Iorin gramneigiamj bakterij membrana apsaugo bakterij nuo lizocimo poveikio. Dl ios prieasties gramneigiamosios bakterijos prie veikiant su lizocimu inkubuojamos tirpale, turiniame EDTA (EDTA suria Ca2+ ir taip destabilizuoja iorin membran). Ypa tvirtos gryb ir mieli lsteli sienels, turinios daugiau kaip 90% polisacharid (pvz., chitino, manano). Augal lsteli sienels sudarytos i daugelio celiuliozs sluoksni,
34 _________________________________
turini lignino ir hemiceliuliozs intarp. Aiku, ios iorins lsteli utvaros suteikia lstelms ne tik form, bet ir atsparum suardymui. Ypa atsparios suardymui yra augal lstels. Vadinasi, visada turime parinkti tinkam lsteli suardymo metod ir homogenizacijos bufer. Suard lsteles ir/ar audinius gauname homogenat. Homogenatas lsteli ar audini ekstraktas, sudarytas i vairaus dydio molekuli (baltym, lipid, nukleorgi ir t. t.), lstels organeli, nesuardyt lsteli. Jei homogenizacijos metodas ir homogenizacijos buferis parinkti teisingai suardomos lsteli sienels ir plazmins membranos, o lstels organeli membranos lieka nepaeistos. Suardius lstels organeli membranas, paskleidiamos mediagos (pvz., fenoliai, peptidazs), kurios toliau ardo organeles ir biomolekules (4.1 pav.). Ardant audinius ir lsteles isiskiria daug ilumos, todl skyrimo procedros metu baltymai ir kitos biomolekuls gali denatruoti ir sulipti (agreguotis). Siekiant to ivengti homogenizavimo procedros atliekamos kaip galima greiiau ir esant 04 0C temperatrai, visi darbui reikalingi rankiai ir tirpalai prie darb turi bti ataldyti.
4.2 Lsteli ir audini suardymas, nenaudojant detergent.

Literatroje prasta lsteli ir audini ardymo metodus skirti dvi grupes, t. y. metodus, kuri metu naudojami detergentai ir metodus, kuri metu detergentai nenaudojami. Nenaudojant detergent lstels sienels ir membranos suardomos mechanikai, taip pat fizikiniais ir cheminiais bdais (r. 4.1 lentel). Daniausiai frakcionavimo protokoluose abu ie bdai (mechaninis suardymas ir suardymas, naudojant detergentus) taikomi kartu, traukiant detergent homogenizacijos buferio sudt.
4.3. Lsteli ir audini ardymas, naudojant detergentus

Naudojant detergentus, lsteles ir audinius galima suardyti lengviau ir velnesnmis slygomis. Detergentai vairios chemins sudties (r. 4.5 pav.) junginiai, turintys hidrofobines ir hidrofilines sritis. Detergentai savo hidrofobine dalimi siterpia baltymo hidrofobin srit ar membranos fosfolipidin dvisluoksn ir suardo baltymo ar membranos vientisum. Detergentai tirpina membran lipidus ir baltymus, be to, suardo lipidlipid, baltymbaltym, baltymlipid sveikas. Panaiai kaip lipidai, detergentai patys gali jungtis ir sudaryti miceles (4.5 pav.). Detergentai skiriami joninius (Pav.4.5 B ir E), cviterjoninius (pav.4.5 C) ir nejoninius (pav.4.5A ir D). Nejoniniai ir cviterjoniniai detergentai maiau denatruoja baltymus, negu joniniai detergentai.
4.1 lentel. Audini ir lsteli suardymo bdai Suardymo bdas Mechaninis Priemons Lktel ir grstuvlis Voringo (Waring) homogenizatorius Daunco (Dounce) homogenizatorius PotterElvehjem homogenizatorius French presas Ultragarsinio bdu Ataldymas/ suildymas Cheminis Ultragarso dezintegratorius aldiklis, kartais skystas ledas/etanolis Organiniai tirpikliai. Daniausiai naudojamas fenolis arba chloroformo ir metanolio miiniai Chaotropiniai junginiai (kalio tiocianatas, kalio bromidas, liio dijodsalicilatas ir kt). Chitinazs, pektinazs, lipazs, peptidazs, celiuliazs, lizocimas arba ferment miiniai Suardymo apibdinimas Lstels ar audiniai (labai danai augalai) sutrinami, danai prie tai ataldius skystu azotu Sukdamiesi peiliai susmulkina ir sutrina lsteles ir audinius (4.4 C pav.) Lstels ar audiniai, naudojant slg, sutrinami (4.4 B pav.) Lstels ar audiniai, naudojant slg, sutrinami (4.4 D pav.) Lstels ar audiniai, naudojant slg, perspaudiant pro siaur ang ar ply Aukto danio garsas suardo lsteli sieneles Susidaro ledo kristalai ir kartotini ataldymo/suildymo ciklai suardo lsteles Tirpinami membran lipidai ir suardomos membranos Destabilizuojami membran lipidai, membranos lengviau suardomos Suardius fermentais lstels sienel gaunami protoplastai, kurie lengvai homogenizuojami
Fermentinis
4.4 Homogenizacijos tirpalo sudedamosios dalys

homogenizacijos tirpalo btinieji sandai buferinis tirpalas ir druskos, lemianios homogenizacijos tirpalo osmosines savybes. Lstels citozolio pH 7,5, taigi homogenizacijos tirpalo pH irgi turt bti silpnai arminis pH 78 . Audiniams ir lstelms homogenizuoti naudojami fosfato, TRIS, HEPES ar kiti organiniai buferiai, kuri pH tarp 7 ir 8 (pK = 7 8). Lsteli ar audinio ris, audinio ir homogenizavimo tirpalo santykis lemia buferio koncentracij. Daniausiai homogenizacijos tirpalo buferio koncentracija 2050 mM. Lsteli membran ir sieneli suardymui labai svarbios homogenizacijos tirpalo osmosins savybs. Lsteli irimas palengvinamas, vartojant hipotonin homogenizavimo tirpal. Tokiu bdu lsteles ibriksta, fizikinis ardomasis poveikis sustiprinamas. Daniausiai homogenizacijos tirpaluose drusk koncentracija 50150 mM. Joninei tirpal jgai palaikyti naudojamos NaCl, KCl, (NH4)2SO4 druskos. Skiriant induoli
36 _________________________________
4.3 pav. Audini ir lsteli suardymas
4.4 pav. Prietaisai audiniams ir lstelms ardyti. Aultragarsinis dezintegratorius; B Daunco homogenizatorius; C Voringo (Waring) homogenizatorius, D Porterio homogenizatorius
mitochondrijas daniausiai vartojami homogenizacijos tirpalai, turintys 0,15 M KCl arba 0,25 0,3 M sacharozs, skiriant augal mitochondrijas, naudojami tirpalai, turintys 0,20,5 M sacharozs arba manitolio. Toki tirpal osmotikumas panaus citozolio, taigi skiriam mitochondrij membrana nepaeidiama. homogenizacijos tirpalo sudt danai eina ir kiti junginiai. Metalus chelatuojantys junginiai. Daniausiai homogenizacijos tirpaluose yra EDTA (suria dvivalenius metal jonus, ypa Ca2+ ir Mg2+) ar EGTA (atrankiai suria Ca2+). i metal jonai proteolitini ferment aktyvikliai. Daniausiai EGTA ir EDTA koncentracija homogenizavimo tirpale 1 mM. Taigi EDTA ar EGTA homogenizacijos tirpale suria metal jonus, maina oksidacines paaidas ir baltym agregacij. Gliukoz, sacharoz ar manitolis (250500 mM). Stabilizuoja mitochondrij ir lizosom membranas, stabdo proteazi isiskyrim.
4.5 pav. Detergentai. Nonidet-NP-40 (A), natrio dodecilsulfatas (NDS) (B); sulfobetainas (SB12) (C); n-oktilgliukozidas (D); deoksicholatas (E)
Glicerolis (510%). Glicerolis stabilizuoja baltymus. Detergentai (pvz., deoksicholatas, Triton X-100). Detergentai didina maai tirpi baltym tirpum, ardo membranines struktras. Daniausiai detergent koncentracija 0,11%. Ligandai, metal jonai (Mg2+, ATP, GTP). Daniausiai naudojamos 110 mM ligand koncentracijos stabilizuoja gryninamus baltymus. Peptidazi slopikliai (inhibitoriai) (pvz., aprotininas, benzamidinas, PMSF, EDTA, EGTA). Proteazi slopikli sudtis priklauso nuo altinio, i kurio skiriamas produktas. Pavyzdiui, frakcionuojant E.coli, proteazs neaktyvios, jei homogenizacijos tirpale yra 1 mM EDTA ir 1 mM PMSF, dirbant su mielmis frakcionavimo tirpaluose daniausiai be 1 mM EDTA ir 1mM PMSF yra ir 1 g/ml leupeptino bei 1 g/ml pepstatino A. Proteazi inhibitoriai labai retai naudojami vienu metu. Antioksidantai (redukuojantys junginiai). Tai ditiotreitolas (DTT), - merkaptoetanolis (-ME), askorbo rgtis ir kt. Daniausiai homogenizacijos tirpale i jungini koncentracija 110 mM (0,05%). Antioksidantai maina baltym sufhidrilini grupi oksidacij, kartu didina j stabilum. Jauio serumo albuminas (BSA). io baltymo daniausiai dedama homogenizacijos tirpalus, skiriant mitochondrijas. BSA suria riebal rgtis
38 _________________________________
(BSA funkcija kraujo plazmoje), kurios susidaro fosfolipazms veikiant fosfolipidus, taip pat fenolius, kurie susidaro suirus vakuolms. Esant homogenizacijos tirpale BSA, maja frakcionuojam mitochondrij baltym paaidos (proteolitiniai fermentai naudoja alternatyv substrat, kurio koncentracija daug didesn nei kit baltym). Polivinilpirolidonas. Daniausiai io polimero dedama homogenizacijos tirpalus, ardant augal lsteles arba audinius. Polivinilpirolidonas suria fenolius. Nra vieno metodo, tinkamo visoms lstelms ir/ar audiniams homogenizuoti, nra buferio, kurio sudtis tinkama visoms lstelms ir/ar audiniams homogenizuoti. Frakcionuojant lsteles ir audinius danai reikia optimizuoti homogenizacijos tirpalo sudtini dali santykius. Kaip pradinis buferis, pvz., gali bti panaudotas buferis A (50 mM TRIS-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% glicerolis).
4.5. Lsteli ir/ar audini frakcionavimo bdai. Centrifugavimas.

Gravitacijos jg veikiamos didels dalels nusda. Nusdimo greitis priklauso nuo daleli parametr (mass, dydio, tankio), taip pat tirpalo, kuriame suspenduotos dalels, klampumo. Centrifugos prietaisai, kurie, sukdami dalel apie centrin a, sukuria didesn icentrin jg nei gravitacin ems jga, tuo labai pagreitinamas daleli nusdimas. Centrifugavimo metu atskiriamos daleles, kuri skiriasi mas, dydis ir tankis, nes j nusdimo greitis proporcingas icentrinei jgai (4.6 pav.). Frakcionavim (nuosdos/ nuopylos) lemia: daleli dydis, forma ir tankis. Juo didesni dalels mas, tankis, tris, juo ji nusda greiiau; tirpalo klampumas. Juo didesnis tirpalo, kuriame suspenduota dalel, tankis, juo liau i nusda; centrifugavimo jga. Juo didesn centrifugavimo jga (w2r), juo greiiau dalel nusda.
4.6 pav. Jgos, veikianios dalel centrifugavimo metu: Fc= m w2 r (icentrin jga). Ff = f v (trinties jga). Fb = mo w2 r (prieinimosi jga). ia m sedimentuojanios dalels mas, w kampinis greitis, r dalels nuotolis iki sukimosi aies; m o dalels istumto tirpalo mas, f trinties koeficientas, v dalels sedimentacijos greitis
Ff Fb r=0
Fc
4.7 pav. Lsteli homogenato centrifugavimas. Po centrifugavimo daniausiai yra dvi frakcijas nuopylos (supernatantas) ir nuosdos 4 . 2 l e n t e l . Centrifug rys ir j techniniai duomenys Centrifug rys Techniniai duomenys Greitis RPM (10 ) Didiausias RCF (103) aldymas Vakuumo sistema Taikymas frakcionuoti: Lsteles Branduolius Lstels organeles Membranos frakcijas Ribosomas/polisomas Makromolekules
3
Nedidelio greiio 26 8 Tam tikros neturi Taip Taip Tam tikras Ne Ne Ne
Didelio greiio 1830 100 Taip Turi Taip Taip Taip Tam tikras Tam tikras Tam tikras
Ultracentrifuga 35 120 700 Taip Turi Taip Taip Taip Taip Taip Taip
Dalels nusdimo (sedimentavimo) greitis icentrins jgos vienetui vadinamas
. Jai dalels mas ireikta g (gramais), o w 2r icentrin jga g/s (gramai/sekunds), makromolekuli sedimentacijos koeficiento
sedimentacijos koeficientu (s). s = kitimo intervalas 1013109 sekundi. Skaiius 1013sekundi vadinamas Svedbergo konstanta (S) arba tiesiog svedbergu. Pavyzdiui, hemoglobino sedimentacijos koeficientas yra 41013 sekundi arba 4S, prokariot rRNR sedimentacijos koeficientas 16S arba 161013 sekundi. Sedimentacijos koeficientas S didja, didjant dalels masei, taiau priklauso ir nuo dalels dydio bei formos. Laboratorini darb metu centrifugos nepakeiiami rankiai frakcionuojant lsteli ir audini ekstraktus. Centrifug techniniai duomenys labai skirtingi. J techniniai duomenys pateikti 4.2 lentelje. Apraant frakcionavim centrifuguojant, reikia nurodyti, kokiu pagreiiu (pagreitis ymimas RCF arba g) buvo veikiama dalel centrifugavimo metu. RCF rodo, kiek kart didesn nei gravitacin ems jga (g = 9,8 m s2) buvo veikiama dalel centrifugavimo metu (RCF = .g). i jga priklauso nuo :
40 _________________________________
4.8 pav. Centrifugos, turinios nustatyto kampo rotori, schema
rotoriaus apsisukim skaiiaus per minut (ym. RPM arba n) apsisukimo spindulio R (pateikiami centrifugos techniniame pase). Kartais frakcionavimas apraomas, nurodant centrifugos apsisukim per minut skaii. Centrifug labai skiriasi techniniai duomenys, rotoriaus spindulys, todl is dydis nerodo, kokia jga dalel buvo veikiama centrifugavimo metu. Norint gauti atsikartojanius frakcionavimo duomenis, reikia inoti, kokiu pagreiiu (RCF = .g) buvo veikiama dalel centrifugavimo metu. RCF ir RPM lengva perskaiiuoti, inant centrifugos rotoriaus spindul. iuolaikins centrifugos automatikai atlieka perskaiiavim. Taiau turint senesnio modelio prietais, iuos skaiiavimus nesunku atlikti patiems: RCF = 1,118 10-5 .R n2, arba RCF = 1,118 10-5 R (RPM)2 , taigi RPM =
RCF 1,118 10
5
= 945,7
RCF . R
ia R centrifugos rotoriaus spindulys (cm), n centrifugos apsisukim skaiius per minut (RPM). Suspenduotos centrifuginiuose mgintuveliuose dalels dedamos centrifugos rotori. Atsivelgiant centrifugos rotoriuje esani mgintuvli padt, rotoriai skiriami vertikalius, nustatyto kampo ir nenustatyto kampo (swing-out) rotorius. Daniausiai naudojamos centrifugos, turinios nustatyto kampo ir nenustatyto kampo (swing-out) rotorius (4.8, 4.9 pav.). Atkreipkite dmes (4.6 pav.), kad, centrifuguojant nustatyto kampo rotoriumi, nuosdos susidaro ant centrifuginio mgintuvlio sienels, tuo tarpu po centrifugavimo nenustatyto kampo rotoriumi, nuosdos surenkamos centrifuginio mgintuvlio dugne.
4.9 pav. Nenustatyto kampo (swing-arm) rotorius
4.5.1. Diferencinis centrifugavimas Dalels frakcionuojamos, atsivelgiant dyd ir tank. Keiiant centrifugos apsisukim skaii, rotoriaus spindul, terps tank, galima iskirti atskiras lstels organeles.
4.10 pav. Diferencinio centrifugavimo bdu galima frakcionuoti lstels organeles
42 _________________________________
4.5.2.
Centrifugavimas tankio gradientu
Suspendavimo terps klampumas lemia dalels sedimentavimo greit (4.6 pav.). Gradientas formuojamas i CsCl, sacharozs, Ficol, Percol ir kit mediag. Gradient formuojanios mediagos tankis turi bti maesnis u sedimentuojani daleli tank. Gradientas gali bti tolygus arba laiptinis. Tolygus gradientas savaime susidaro, centrifuguojant klamp tirpal arba specialiai supylant komponentus. Maiausias tirpalo tankis mgintuvlio viruje, didiausias mgintuvlio dugne. Laiptinis gradientas mginys sudaromas atsargiai vienas ant kito ltai sedicentrifugavmas ulainant skirtingo tankio tirpalus. mentuojanti greitai sediKartais taikoma vieno laiptelio tankio mentuojanti utvara vienos ries dalelms atskirti. Centrifuguojant tankio gradientu gauname 4.11. Centrifugavimas tankio atskiras zonas (4.11 pav.). gradientu Zoninis centrifgavimas. Centrifuguojama daniausiai mau (520 %) sacharozs ar CsCl tankio gradientu. Mginys atsargiai ulainamas ant suformuoto gradiento. Vienodo dydio ir formos dalels po centrifugavimo sudaro zon, jos sustoja, kai yra pusiausviros su terpe. Po centrifugavimo susidaro daug juost, turini skirtingos mass ir dydio daleles. Po centrifugavimo mgintuvlio dugnas praduriamas ir atsargiai surenkamos frakcijos. Vienodo tankio (izopikninis) centrifugavimas. Centrifuguojama dideliame sacharozs arba CsCl tankio gradiente (2070 %). Frakcionuojama atsivelgiant dalels tank (daleli mas ir forma atskyrimui neturi takos). Mginys atsargiai ulainamas ant suformuoto gradiento. To paties tankio (buoyant density) dalels po centrifugavimo sudaro zon, dalels sustoja, kai yra pusiausviros su gradientu. Po centrifugavimo susidaro daug juost, turini skirtingo tankio daleli. Po centrifugavimo mgintuvlio dugnas praduriamas ir atsargiai surenkamos frakcijos. Centrifuginiai mgintuvliai Centrifuguojant frakcionuojama mediaga bna suspenduota centrifuginiuose mgintuveliuose. Labai svarbios centrifugini mgintuvli savybs mgintuvli talpa ir mediaga, i kurios pagaminti mgintuvliai. Mgintuvli talpa lemia didiausi tirpalo tr, kur galima mgintuvliuose centrifuguoti. Mediaga, i kurios pagaminti mgintuvliai, riboja centrifugavimo greit ir taip pat centrifuguojamos mediagos chemin sudt. Yra keletas taisykli, kurias inant garantuojamas saugus darbas.
Paprasto stiklo (Pyrex) mgintuvlai nerekomenduojami centrifuguojant didesniais nei 2,000 g pagreiiais. Corex stikliniai mgintuvliai tinkami naudoti iki 15,000 18,000 g. Praktikesni, nors ir maiau inertiki, yra plastikiniai (polipropileno, polistireno) ir nitroceliulioziniai mgintuvliai. Polipropileniniuose mgintuvliuose galima saugiai centrifuguoti iki 20,000 g. Dauguma ultracentrifugini mgintuvli pagaminti i nitroceliuliozs. Jie nelabai brangs ir gamintojai iuos mgintuvlius silo naudoti kaip vienkartinius. Lentelje XX pateikti duomenys apie plastikini mgintuvli tinkamum centrifuguoti tam tikros chemins sudties tirpalus. Saugaus darbo centrifugomis pagrindins taisykls: visi centrifugavimai didelio greiio centrifuga turi bti paymti centrifugos naudojimo urnale. Prie praddami darb perirkite urnalo raus ir sitikinkite, kad centrifugavimas duota centrifuga yra saugus nepaeistas rotorius, nra pastab apie gedimus; praddami centrifuguoti neinoma centrifuga, pasitarkite su laborantu ar dstytoju; centrifug junkite tik udar centrifugos dangt; centrifuguoti galima tik taisyklingai subalansavus centrifuginius mgintuvlius. Daniausiai tokio pat svorio centrifuginiai mgintuvliai dedami rotoriuje vienas prie kit . Bkite labai atids : 0,01g neatitiktis centrifuguojant 100000 g pagreiiu ekvivalentika 1 kg neatitikiai; centrifuguodami sulaukite, kol centrifuga pasieks nustatyt greit; po centrifugavimo iimkite rotori. Ivalykite.
4.6. Nelstelinio ekstrakto frakcionavimo metodai

Ilg laik vienintelis bdas ifrakcionuoti nelstelinius ekstraktus buvo nusodinti atskirus ekstrakto komponentus. iandien nusodinimas daniausiai taikomas norint sukoncentruoti labai praskiestus vandeninius baltym tirpalus.
Mginys
Nuosdos
Nuosdos Centrifugavimas
+
Nusodinimo veiksnys Tirpus ekstraktas
+
Nuopylos
44 _________________________________
4.12 pav. Baltym nusodinimas organiniais tirpikliais
4.13 pav. Baltym nusodinimas (NH4)2SO4
Veiksniai, kuri poveikyje atskiros ekstrakto sudtins dalys tampa maiau tirpios ir nusodinamos yra labai vairs: ataldymas, ekstrakto pH ir jonins jgos keitimas, organiniai tirpikliai, imunoprecipitacija ir kt. Daniausiai baltymai nusodinami organiniais tirpikliais (etanoliu, metanoliu, acetonu), druskomis (daniausiai amonio sulfatu) ir trichloracto rgtimi. Mechanizmai, kurie lemia baltym sulipim (agregacij) vandeniniuose organini tirpikli tirpaluose labai vairs. Didiausi tak turi tirpalo dielektrins konstantos sumajimas. nelstelin tirpal pylus organinio tirpiklio, sumaja tirpalo dielektrin konstanta (H2O dielektrin konstanta 78.5; metanolio 32.6; etanolio 24.3). Juo maesn tirpalo dielektrin konstanta, juo lengviau skirtingai krautos molekuls sveikauja viena su kita. Tokiu bdu molekuls sulimpa ir nusda. Su druskomis (pvz., (NH 4) 2SO 4) baltym nusodinimas vyksta pagal du mechanizmus. Pirmiausia, druskos anijonai baltymo molekul daro maiau tirpi dl sveikos su teigiamai krautomis aminorgi liekanomis. i sveika daug veiksmingesn, kai pH<pI. Antra, baltymo molekuls dehidratuojamos (4.6.2 pav). Pridtos baltymo tirpal druskos jonai hidratuojami. Maja laisvo vandens kiekis ir baltymo molekuls dehidratuodamos. Baltym paviriuje esanios ir anksiau udengtos hidrofobins salels gali tarpusavyje sveikauti. Todl baltymai sulimpa ir ikrenta nuosdomis isdomi. 4.6.1. Baltym nusodinimas trichloracto rgtimi (TCA) Metodas naudingas, kai reikia sukoncentruoti praskiestus baltymo tirpalus. Jis taikomas, jai pavyzdiuose baltymo koncentracija nemaesn, nei 5g/ml.
Darbo eiga: 1. baltymo tirpalo pilti 1/10 trio 100% CA. 2. Inkubuoti leduose 30 min. arba 15 min., esant 20oC temperatrai. 3. 5 min. centrifuguoti didiausiu greiiu ependorfiniuose megintuvliuose stalo centrifuga 4. .Pipete paalinti nuopylas (supernatant). 5. Gautas nuosdas galima: 6. Itirpinti 50 100 l 0,1 N NaOH. 7. Kelet kart praplauti nuosdas 1ml etanoliseteris miiniu (1:1 v/v) , norint visikai paalinti rgt, truput padiovinti ir itirpinti norimame buferyje. Trichloracto rgtis (TCA, CCl3COOH Mr=163.39) laikoma tamsiame inde traukos slygomis. Ruoiant 100 ml 100% (w/w) tirpalo reikia 68,78 gramus rgties itirpinti 31,22 ml distiliuoto vandens.
Remiantis Bollag, D.M., Edelstein, S.J. (1991). Protein Methods. Wiley-Liss, Inc., New York, p.72 -3.
4.6.2. Baltym nusodinimas amonio sulfatu Metodas taikomas daugiau kaip 130 met. Anksiau jis buvo vienas i plaiausiai naudojam baltym frakcionavimo bd. iuo metu metodas vertinamas kaip labai pigus baltym nusodinimo bdas. Nusodinant baltymus gaunamas ir gryninimo poveikis, t. y. nusodinant baltymus i lsteli ar audini ekstrakt amonio sulfatu galima tiktis gauti 210 kart daugiau sotintus tiksliniu baltymu ekstraktus. Amonio sulfato koncentracija tirpale reikiama sotumo laipsniais arba sotumo procentais. Pavyzdiui, 0,4 ir 0,6 atitinkamai 40% ir 60% yra santykiniai dydiai, laikant kad 1,0 ir 100% atitinka visik sotum. (NH4)2SO4, Mm=132,1 g/M, soiojo tirpalo koncentracija 4,1M (707 g l1). (NH4)2SO4 tirpumas beveik nesikeiia, keiiant temperatr nuo 0 iki 30 0C. Nors literatroje galima rasti duomen apie amonio sulfato koncentracijas, kurioms esant baltymai ikrenta nuosdomis, daniausiai kiekvienu konkreiu atveju bandym ir klaid metodu yra parenkamos slygos. 4.3 lentelje parodyti amonio sulfato kiekiai, reikalingi pasiekti 0100% sotumus. Amonio sulfato kiek, reikaling pasiekti atitinkam sotumo laipsn, galima apskaiiuoti i formuls
x= 0,515V1(Pr1 Pr2 ) , 1(0,272Pr2 )
kur x amonio sulfato kiekis (g), reikalingas norint pasiekti Pr2 sotumo laipsn, V1 pradinio tirpalo tris, Pr1 pradinio tirpalo sotumo amonio sulfatu laipsnis, Pr2 norimo tirpalo sotumo laipsnis.
46 _________________________________
4 . 3 l e n t e l . (NH 4)2SO 4 kiekis (g l -1) reikalingas norint pasiekti norim sotum (procentais)
Galutin koncentracija (%) Pradin koncentracija 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 20 30 40 50 60 70 Pridto amonio sulfato kiekis (g l-1) 107 54 166 111 56 229 171 115 57 295 236 177 119 59 366 305 244 184 122 61 442 379 316 253 190 127 63 80 523 458 392 328 262 197 131 66 90 611 545 476 408 340 272 204 136 68 100 707 636 565 495 424 353 283 212 141 71
Naudojant sotj amonio sulfato tirpal reikalingas druskos tirpalo kiekis apskaiiuojamas i formuls:
V1(Pr2 Pr1 ) , 1Pr2 kur V2 reikalingas soiojo amonio sulfato tirpalo tris (ml), V1 pradinis tirpalo tris (ml), Pr1 pradinis sotumo laipsnis, Pr2 galutinis sotumo laipsnis. ia Pr1 ir Pr2 sotumo laipsnis ireikiamas trupmeniniu sotumo laipsniu Sf = 0,4 = 40% V2 =
Darbo eiga: 1. inyne ar eksperimentikai nustatyti kurio sotumo laipsnio (NH4)2SO 4 nusodina tikslin baltym. 2. baltymo tirpal maais kiekiais, maiant dti reikiam kiek (NH4)2SO4. 3. Nusodinimas pradedamas nuo didiausios (NH4)2SO4 koncentracijos, kuriai esant tikslinis baltymas dar neisdomas. 4. Inkubuoti 30 min. nestipriai maiant, esant reikiamai temperatrai. 5. Nuosdas atskirti centrifuguojant. 6. Jei nusodinimas laiptinis nuopilas dti kit porcij (NH4)2SO4 ir pakartoti 34 sk.procedras. 7. Nupilti nuopilas. 8. Greitai centrifuguojant mgintuvlio dugne surinkti nuopil likuius ir paalinti pipete. 9. Tikslin baltym itirpinti reikiamame buferyje. Pastabos Daniausiai, kai amonio sulfato koncentracija maesn kaip 1 M (25% soiojo) nusda tik labai didels dalels, sulip arba labai dideli baltymai. Nusodinant
laiptikai daniausiai naudojama i amonio sulfato koncentracij serija : 0 M; 1 M (25% soiojo); 1,6M (40% soiojo); 2,4M (60% soiojo); 3,2M (80% soiojo). baltymo tirpal galima pridti kristalinio amonio sulfato arba pilti soiojo druskos tirpalo. Pirmasis bdas patogesnis, kai reikia pridti didelius kiekius amonio sulfato ir nenorima labai padidinti pavyzdio trio. Visais atvejais druska pridedama nepertraukiant maiymo, kad nesusidaryt sritys, turinios didel vietin druskos koncentracij. Juo didesn tirpalo temperatra, juo didesn tikimyb baltymams denatruoti. Daniausiai isdymas atliekamas 00C , taiau (NH4)2SO4 stabilizuoja baltymus ir stabdo bakterij augim, todl kai kada baltym isdymas atliekamas 250C. Atskiriant susidariusias nuosdas nuo likusio tirpalo daniausiai utenka 10 min 6000 g, 40C centrifugavimo. Isdant baltymus i daugiau praskiest tirpal ir naudojant didesnius druskos kiekius, kartais tenka centrifuguoti didesniu greiiu ir ilgesn laik. Kodl amonio sulfatas, o ne NaCl? Isdymo poveikis priklauso ne tik nuo druskos koncentracijos, bet ir nuo tirpalo jonins jgos. Dl ios prieasties, esant vienodai molinei koncentracijai, polivalentinai anijonai veiksmingesni nei monovalentiniai, o polivalentiniai katijonai trukdo isdymui. Taigi optimalus druskos derinys polivalentinis anijonas su monovalentiniais katijonais. Maa amonio sulfato kaina. Isdymo poveikis maja eilje : Citratas> Sulfatas> Fosfatas> Chloridas> Nitratas> Tiocianatas. ia tvarka maja drusk stabilizacinis poveikis ir didja chaotropins drusk savybs. Tuo bdu isdyti tinkamiausios druskos citratai ir sulfatai. Sulfatai yra tirpesni (pvz., kambario temperatros slygomis amonio citrato ir amonio sulfato sotieji tirpalai 2,5 ir 4,1 atitinkamai). NaCl tirpumas maas. Stabilizuojantis poveikis, kur druska (esant koncentracijai, didesnei kaip 0,5M) daro daugumai baltym. Sunkumai nusodinant baltymus amonio sulfatu. 1. Amonio jonai trukdo tiksliai vertinant nuosdose baltymo kiek Bredfordo, Louri metodais. 2. Isdomi ne tik baltymai, bet ir kitos mediagos, pvz., detergentai. Tween 20 ir Triton X100 pradeda nussti, kai amonio sulfato koncentracija iek tiek didesn kaip 1 M. Susidariusi agregat tankis maesnis nei druskos tirpalo, todl centrifuguojant ie agregatai pakyla, kartu nusinedami ir dal baltym.
48 _________________________________
3. Baltym, kuri veikimui reikalingas Ca2+, negalima nusodinti amonio sulfatu, nes kalcio sulfatas netirpus. 4.6.3. Baltym nusodinimas etanoliu
Metodas danai taikomas sukoncentruoti labai praskiestus vandeninius baltym tiraplus. 1. Dti 9 trius ataldyto 100 % etanolio 1 tr praskiesto baltymo tirpalo. 2. Sumaiyti tirpalus. 3. Palikti maiausiai 60 min. 20C (daniausiai tokie tirpalai paliekami per nakt). 4. Centrifuguoti 15 min. 4C didiausiu pagreiiu (15000 g) 5. Paalinti nuopilas, nusausinti nuosdas (apvertus mgintuvl ant filtravimo popieriaus). 6. Nuosdas perplauti 70 % ataldytu etanoliu (-20C). Sumaiyti, 5 min. centrifuguoti didiausiu pagreiiu (15 000 g). 7. Nuosdas padiovinti kambario temperatroje arba speed-vac centrifugoje. 8. Itirpinti nuosdas norimos sudties buferyje. 4.6.4. Baltym nusodinimas pargtintu acetonu ir metanoliu: 1. Paruoti pargtint aceton: sumaiyti 120 ml acetono ir 10 l HCl (HCl koncentracija 1 mM). 2. Paruoti nusodinimo reagent: sumaiyti lygius trius (1:1, v/v) pargtinto acetono ir metanolio. Laikyti 20C. 3. Sumaiyti 1 tr praskiesto baltyminio tirpalo su 4 triais nusodinimo reagento. 4. Palikti -20C bent valand. Galima laikyti per nakt. 5. Centrifuguoti 4C 15 min. didiausiu pagreiiu (15000 g). 6. Atsargiai nupilti nuopilas. Nusausinti mgintuvl ant filtravimo popieriaus. 7. Nuosdas padiovinti speed-vac centrifugoje arba kambario temperatros slygomis. 8. Itirpinti nuosdas norimos sudties buferyje.
4.6.5. Dializ
Po nusodinimo amonio sulfatu ir itirpinus pasirinktame buferyje i tirpal turi bti paalinta druska. Vienas i bd tai padaryti dializuoti tirpal prie bufer, kurio drusk koncentracija maa. Dializuojant tirpalus galima : sumainti druskos koncentracij tirpale; gauti kitos sudties baltym tirpal; i dializuojam tirpal paalinti detergentus, polisacharidus.
4.14 pav. Dializs schema
Koncentruotas baltym tirpalas dializs maielyje (dializs maielio membranos poros neleidia baltymams pasklisti tirpale) dedamas didel tr buferio, kurio drusk koncentracija maa ir maiant laikomas ilg laik (16 24 val) (4.12 pav.). Per laik tirpalas dializs maielyje susilygsvarina su buferiu druskos koncentracija tirpale sumaja. Kai is pusiausvirinimo procesas pakartojamas kelet kart pakeiiant pusiasvirinimo bufer pasiekiamas dializs tikslas sumainama druskos konentracija baltymo tirpale. Kartais dializs metu dalis baltym ikrenta nuosdomis. Dl ios prieasties dializuotas tirpalas daniausiai centrifuguojamas, paalinamos nuosdos, kad jos netrukdyt vlesnmis frakcionavimo stadijomis. Pastabos Dializs maielio parinkimas. Dializs maieliai tai cilindrikos portos membranos. i por dydis lemia molekuli, kurios pereina membran dyd. Daniausiai gaminamos membranos, kuri poros praleidia molekules, maesnms u 5 kDa, 10 kDa, 30 kDa, 100 kDa. Taigi, dializei parinkus membran pralaidi molekulms maesnms u 30 kDa, visos nedidels molekuls, tame tarpe ir mai baltymai, pasklis dializs buferyje maielyje liks baltymai ir molekuls, kuri dydis didesnis kaip 30 kDa. Tinkamo dydio dializs maielio parinkimas. Maielis parenkamas tokio dydio, kad madaug tredalis maielio trio likt nepripildyta dializuojamo tirpalo. Dializuojant didels druskos koncentracijos tirpalus ir naudojant nedidels jonins jgos pusiausvirinimo tirpalus, esant netinkamam maielio dydiui, osmosins jgos gali suplyti maiel.
50 _________________________________
. Maielio vienas galas uspaudiamas spaustuku (arba uriamas silu), atsargiai pripildomas dializuojamo tirpalo (vengiama leisti oro burbuliuk), spaustuku udaromas kitas maielio galas (arba uriamas silu) ir dializs maielis dedamas pusiausvirinimo bufer. . Pusiausvirinamojo buferio tris turi bti bent 100 kart didesnis u dializuojamo tirpalo tr. Dializ daniausiai atliekama 40C, taigi buferis prie darb irgi turi bti ataldytas. Ltai maiant dializ atliekama 12 16 val. kelet kart pakeiiant bufer. Po dializs maielis atsargiai iimamas, atidarius vien maielio gal atsargiai turinys perkeliamas centrifugin mgintuvl. Parduodami dvejopi dializs maieliai: sausi ar dti tirpal, dniausiai 25 % etanolio. Sausos membranos prie darb turi bti paruotos. Dializs maieli paruoimas Ivirinti maielius dideliame tryje 2% (w/v) natrio karbonato ir 1 mM EDTA pH 8,0 tirpalo. Gerai praplauti distiliuotu vandeniu. Virinti 10 min 1mM EDTA (pH 8,0). Ataldyti tirpal. Perkelti maielius 25% EtOH ir laikyti 4C iki prireiks. Prie naudojim gerai praplauti distiliuotu vandeniu.
4.7. Peramininimas
Peramininimo reakcija plaiai paplitusi audiniuose. Beveik visos aminorgtys traukiamos ias reakcijas. Ypa greitai peramininimo reakcijos vyksta dalyvaujant dikarboksiaminorgtims (glutamo ir asparto) arba jas atitinkanioms -ketonorgtims (-ketoglutaro ir oksalatacto). Azoto apykaitos procesuosams didiausi tak turi peramininimo reakcija - aminorgi sintezs ir skilimo reakcija. Oksidazs, katalizuojanios oksidacin aminorgi deamininim iki amoniako ir -keto rgi, fiziologinmis slygomis labai neaktyvios. i ferment pH optimumas yra arminis. Todl aminorgtys, patekusios organizm su maistu ir nesunaudotos baltym ir kit mediag sintezei, deamininamos netiesioginiu bdu. I pradi jos dalyvauja peramininimo reakcijoje su -ketoglutaro rgtimi. Susidariusi glutamo rgtis, veikiant labai aktyviam fermentui glutamato dehidrogenzei, netenka amoniako ir virsta ketoglutaro rgtimi. is procesas yra grtamas, todl amoniakas induoli audiniuose gali virsti aminorgtimis. Veikiant glutamato dehidrogenzei, vyksta atvirktin reakcija -ketoglutaro rgties amininimas. Susidariusi glutamo rgtis peramininimo metu perduoda azot kitoms aminorgtims. Btent peramininimo metu ir susidaro tam tikros aminorgtys, esant organizme pakankamam atitinkam -ketonorgi kiekiui, bei paruoiamas aminorgi anglies griauiai skaidyti.
Substratais peramininimo reakcijos metu gali bti ne tik dikarboksiaminorgtys arba dikarboksiketonorgtys. Galimos peramininimo reakcijos ir tarp monokarboksiaminorgi, ir monokarboksiketonorgi. Peramininimo reakcija yra grtamoji fermentin reakcija, kurios metu aminorgties aminogrup perneama ant ketonorgties. Fermentai, katalizuojantys i reakcij, vadinami aminotransferazmis, arba transaminazmis. Tai sudtingi baltymai, turintys kovalentiniu ryiu, prie aminorgties lizino -aminogrups prijungt koferment piridoksalfosfat. Piridoksalfosfatas fermentins reakcijos metu reaguoja su aminorgtimi ir virsta piridoksaminofosfatu, kuris atiduoda aminogrup ketonorgiai, o pats vl virsta piridoksalfosfatu. io proceso schema:
Piridoksalfosfatas
Aminorgtis
ketonorgtis
Piridoksamino fosfatas
52 _________________________________
Piridoksaminofosfatas
ketonorgtis
Piridoksalfosfatas
Aminorgtis
Piridoksalfosfatas ne tik aminotransferazi, bet ir daugelio kit ferment (dekarboksilazi), katalizuojani tam tikrus aminorgi katabolizmo procesus, kofermentus. Reakcij krypt ir ferment veikimo savitum visada lemia baltymin fermento dalis. Su peramininimo procesu galima susipainti, nagrinjant glutamo ir piruvo rgi peramininim, dalyvaujant raumen aminotransferazei.
glutamo rgtis
piruvo rgtis
ketoglutaro rgtis
alaninas
Piruvatas
ketoglutaratas
Glutamatas
Alaninas
Apie reakcijos intensyvum galima sprsti i alanino daugjimo ar glutamo rgties kiekio majimo. ie pokyiai kokybikai matomi atliekant popieriaus chromatografij. Kad nevykt glikoliz, reakcijos miin dedama monobromacto rgties. Mediagos ir reagentai: 1. Triuio raumenys (triuio raumenys 1,5 2,0 g) susmulkinami irklmis ir/arba skalpeliu, po to sutrinami porceliano lktelje, pridedant nedidel kiek smlio). 2. 1,0 % glutamo rgties tirpalas. 3. 1,0 % alanino tirpalas. 4. 1,0 % piruvo rgties tirpalas. 5. 0,025 % monobromacto rgties tirpalas. 6. 0,1 % KHCO3 tirpalas. 7. 10,0 % trichloracto rgties tirpalas. Darbo eiga: 1. du mgintuvlius pilama po 0,5 ml glutamo rgties ir po 0,5 ml piruvo rgties. kiekvien i i mgintuvl pridedama po 1 ml 0,1% KHCO3 (pH optimumui sudaryti) ir po 0,25 ml 0,025% monobromacto rgties (glikolizei sustabdyti). 2. pirmj mgintuvl (kontrolinis mgintuvlis), pilama 2 ml 10% trichloracto rgties. 3. abu mgintuvlius pridedama po 500 mg triuio raumen tyrels. 4.. Abu mgintuvliai inkubuojami 0,5 val. termostate (37C). 5. Po 0,5 val inkubacijos antrj mgintuvl dedama 2 ml trichloracto rgties (fermentams inaktyvinti). 6. Abiej mgintuvli turiniai filtruojami ir filtratai tiriami popieriaus chromatografijos metodu. Chromatografijos eiga 1. Ant chromatografinio popieriaus starto linijos viename take ulainama keletas la i pirmojo mgintuvlio (kontrol), kitame - i antrojo mgintuvlio. Starto linijoje ulainami ir kontrolini aminorgi alanino ir glutamo rgties tirpalai.
54 _________________________________
2. Kylamosios popieriaus chromatografijos sistema: izopropilo alkoholis: amoniakas: vanduo (7:1:2) 15 18 val (per nakt). 3. Chromatograma idiovinama, apipurkiama 0,1% ninhidrino tirpalu acetone ir diovinama 50C temperatroje. Aminorgi vietos chromatogramoje nusidao violetine spalva. 4. Apskaiiuojamas kiekvienos aminorgties pasiskirstymo koeficientas ir sprendiama apie peramininimo reakcijos eig. Kontroliniai klausimai : 1. Pakeiiamosios ir nepakeiiamosios aminorgtys. 2. Amoniako paalinimo keliai. 3. Piridoksalfosfato veikimo mechanizmas.
4.8. Alkoholio dehidrogenazs (ADH) iskyrimas i kepimo mieli

Tikslas: igryninti alkoholio dehidrogenaz i kepimo mieli ir nustatyti tam tikras fermento charakteristikas Alkoholio dehidrogenaz (ADH) katalizuoja i reakcij:
C2H5OH + NAD+
ADH
CH3CHO + NADH + H+
Alkoholio dehidrogenaz (EC 1.1.1.1) yra oksidoreduktaz (katalizuoja oksidacijosredukcijos reakcijas). Mieli ADH molekulin mas yra 141 kDa. Fermento molekul sudaryta i 4 subvienet, ji turi 4 tvirtai suritus Zn atomus. Kiekvienas fermento subvienetas turi po dvi SH- grupes. inoma, kad aktyviame fermento centre yra histidino liekana. Mieli lstelse reakcijos pusiausvyra yra nukreipta acetaldehido redukcijos iki etanolio kryptimi. pH optimumas: etanolio oksidacija optimaliai vyksta pH 8,69,0. Fermento aktyvikliai: merkaptoetanolis, ditiotreitolis, sunkiuosius metalus suriantys junginiai.
Substratinis savitumas: pirminiai alkoholiai daug geresni substratai nei antriniai ar akotosios grandins aktyviame fermento centre yra His liekana. Mieli lstelse reakcijos pusiausvyra yra nukreipta acetaldehido redukcijos iki etanolio kryptimi. Inhibitoriai (slopikliai): sunkieji metalai ir SH junginiai. Stabilizatoriai: praskiesti fermento preparatai stabilizuojami pridedant serumo albumino, elatinos ir/ar cisteino arba glutationo. Koncentruoti fermento tirpalai net vandenyje stabils kelet dien 50C . Jei pH maesnis kaip 6,0, taip pat jei pH didesnis u 8,5, fermentas labai nestabilus. Liofilizuoti fermento preparatai laikomi 28 C, ilieka stabils 612 mnesi. Reakcijos greitis nustatomas matuojant NADH koncentracijos didjim. Tai patogu atlikti matuojant spektrofotometrijos bdu viesos sugert (absorbcij) esant viesos bangos ilgiui = 340 nm. Mediagos ir reagentai: 1. Diovintos kepimo miels, 100g. 2. 0,066 M K2HPO4 300 ml. 3. 1 mM kalio fosfatinis buferis (pH 7,5) 1000 ml. 4.8.1. Alkoholio dehidrogenazs gryninimas 1. Diovintos kepimo miels upilamos 300 ml 0,066 M K2HPO4 tirpalu ir maiant inkubuojamos 2 val. 370C. Vyksta lsteli autoliz. 2. Suspensija paliekama stovti 3 val. kambario temperatros slygomis. Taip baltymai itirpsta. 3. 30 min. centrifuguojama 600 g 40C. 4. Nuosdos imetamos, o nuopilos (supernatantas) vandens vonioje pakaitinamos 15 min. 550C. 5. Suspensija staigiai ataldoma leduose iki 0 40C. 6. Suspensija centrifuguojama 20 min. 6000 g 40C. 7. Nuosdos imetamos, o nuopilos altame kambaryje ar aldytuve (40C) gali bti paliekamos per nakt. Padedame 100 l io tirpalo fermento aktyvumo ir baltym kiekiui nustatyti (I frakcija). 8. gaut nuopil maomis porcijomis, maiant, pilamas ataldytas (-10150C) acetonas. Nuopil ir acetono tri santykis 1:0,5. Svarbu, kad suspensijos temperatra bt ne didesn, kaip - 20C. 9. Miinys centrifuguojamas 15 min. 6000 g 00C. 10. Nuosdos imetamos, o nuopilas dar pilama ataldyto atsetono. Nuopil ir acetono tri santykis 1:0,6.
56 _________________________________
11. Miinys centrifuguojamas 15 min. 6000 g 00C. 12. Nuopilos paalinamas, o nuosdos suspenduojamos 25 ml 1 mM kalio fosfatiniame buferyje, pH 7,5. Padedame 100 l io tirpalo fermento aktyvumui ir baltym kiekiui nustatyti (II frakcija). 13. Suspensija dializuojama 3 val. 40C prie 0,5 litro 1 mM kalio fosfatinio buferio (pH 7,5), kas valand keiiamas buferis. 14. Dializuota suspensija centrifuguojama 15 min. 15000 g 40C. 15. Nuosdos paalinamos, o nuopilas (III frakcija), ltai maiant 40C, dedama amonio sulfato. (Prie tai atidedame 100 l III frakcijos tirpalo fermento aktyvumui ir baltym kiekiui nustatyti). 10 ml nuopil dedama 3,6 g amonio sulfato. 16. Po 20 min. inkubacijos centrifuguojama 20 min. 15000 g 40C. 17. Nuosdos tirpinamos 5 ml dejonizuoto vandens (IV frakcija: padedame 100 l io tirpalo fermento aktyvumui ir baltym kiekiui nustatyti), pridedama 1g amonio sulfato. 18. Po 20 min. inkubacijos centrifuguojama 20 min. 15000 g 40C. 19. nuopylas (V frakcija : atidedame 100 l io tirpalo fermento aktyvumo ir baltymo kiekio nustatymui), ltai maiant dedama amonio sulfato iki 0,6 soties. 20. Po 20 min. inkubacijos centrifuguojama 20 min. 15000 g 40C. 21. Nuosdos tirpinamos 1 ml dejonizuoto vandens (VI frakcija). Pamatuojamas kiekvienos frakcijos tris, pamatuojama baltymo koncentracija, nustatomas fermentinis aktyvumas.
4.8.2. Baltymo kiekio nustatymas frakcijose Visose frakcijose pamatuojame baltymo koncentracij. Baltym koncentracijos nustatymas Bredfordo metodu apraytas 5.5.2. skyriuje. 4.8.3. Fermento aktyvumo nustatymas Pamatavus viesos sugert tam tikru laiko momentu, galima apskaiiuoti NADH koncentracij reakcijos miinyje tuo laiko momentu. Atsivelgiant BeroLamberto dsn, sugert su mediagos koncentracija sieja i priklausomyb: A = M c l, kur A sugertis, esant = 340 nm, M molins ekstinkcijos koeficientas (M-1 cm-1), c koncentracija (M), l viesos nueitas kelias tirpale (cm).
NADH atveju M = 6220 M-1 cm-1. Taigi NADH koncentracija apskaiiuojama pagal formul: c = A / M l Alkoholio dehidrogenazs aktyvumo vienetas fermento kiekis, kuris redukuoja 1mol NAD+ per 1 min. prastinmis slygomis. Savitasis fermento aktyvumas ireikiamas aktyvumo vienetais vienam mg baltymo (U/mg). Reagentai: 1. 100 mM TRIS-HCl buferis, pH 8,8 . 2. 25 mM kalio fosfato buferis pH 7,5. 3. 1 mg/ml NAD+ (tirpinama 25 mM kalio fosfato buferyje, pH 7,5. 4. 3 M etanolis. Darbo eiga: 1. spektrofotometro kiuvet pilama: 2,8 ml TRIS-HCl buferio pH 8,8 ; 0,1 ml (100 l) 3 M etanolio ir 0,1 ml (100 l) NAD+ ir gerai imaioma. 2. Kiuvet dedama spektrofotometro ulinl ir prietaisas kalibruojamas taip, kad rodyt optin tank, lyg 0 , esant bangos ilgiui = 340 nm . 3. pilama 10 50l fermento tirpalo (IVI frakcijos ) ir imatuojamas optinio tankio pokytis kas 30 sek 2min. laikotarpiui. 4. vertinamas pradinis fermentins reakcijos greitis ir apskaiiuojamas savitasis aktyvumas. 5. Savitasis aktyvumas ireikiamas susidariusio per 1 min. NADH kiekio mikromoliais, skaiiuojant mg baltymo:
vnt/mgbaltymo = A340/min 6,22 mgbaltymo/ml
.
Fermento gryninimo rezultatai pateikiami lentelje (4.4 lentel)

4.4 lentel. Alkoholio dehidrogenazs gryninimo eiga
Eils Nr. 1 2 3 4 5 6 Gryninimo Stadija I frakcija II frakcija III frakcija IV frakcija V frakcija VI frakcija Bendras tris /ml/ Bendras baltymo kiekis /g/ Savitasis aktyvumas vnt/mg Bendras aktyvumas Igryni- Fermento nimas ieiga
58 _________________________________
Kontroliniai klausimai : 1. Alkoholio dehidrogenazs savitumas. 2. Alkoholio dehidrogenazs struktra. 3. Ferment aktyvumo vienetai. 4. Ferment gryninimo metodai.
5. Saugaus darbo biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls ________________________ 1. viesos sugertis _________________________________________________________________ 59
5 . viesos sugertis
5.1. viesos sugerties prigimtis

viesos sugerties prigimt patogu aikinti remiantis kvantinmis viesos savybmis. Sklindant viesai mediaga prastinmis slygomis viesos intensyvumas maja, nes viesos kvantai (fotonai) sukelia mediag sudarani daleli uolius i maesns didesns energijos lygmenis. Po dalels sveikos su fotonu ji peroka auktesn energijos lygmen ir bna suadinta, o fotonas inyksta. Suadintos bsenos dalel gyvuoja neilgai. Ji atiduoda suadinimui ieikvotos energijos dal ir peroka emesn lygmen. Jeigu tokio uolio metu yra ispinduliuojamas fotonas, tai dalelei suadinti sunaudota energija vl virsta fotono energija. Taiau daniausiai suadinimo energija, dalelei perokant i auktesniojo lygmens emesnj, virsta kitomis energijos rimis, pavyzdiui, ilumine, dl to maja mediaga sklindanios viesos intensyvumas. viesos, sklindanios per mediag intensyvumo majimas, vadinamas viesos sugertimi. Jei sugeriama regimosios arba ultravioletins spektro dalies viesa, tai suadinami elektronai peroka auktesn lygmen, o vliau grta emesn lygmen. Mediagos nevienodai sugeria skirting bangos ilgi vies. Mediagos sugerties priklausomumas nuo bangos ilgio vadinamas mediagos sugerties spektru. Vanduo nesugeria nei regimosios, nei ultravioletins spektro dalies viesos. Daugelio mediag tirpalai (pvz. hemoglobino, citochromo c) yra spalvoti, nes j molekuls sugeria regimj vies. Pavyzdiui, redukuotas citochromas c yra geltonas, jo sugerties max yra 550 nm ir 420 nm tai lemia hemo prostetin grup, kuri yra chromoforas (spalvos neiklis). Kitos mediagos nukleorgtys, baltymai, NAD(H) sugeria ultravioletin vies. NADH ultravioletins viesos sugerties maksimumas yra ties 260 nm ir 340 nm, o NAD+ tik ties 260 nm. Ferment, pvz., nuo NAD priklausom dehidrogenazi aktyvumas gali bti vertinamas atsivelgiant viesos sugerties kitim ties 340 nm.
NAD+
Sugertis
NADH
220
240 260 280
300
320 340
360 380 bangos ilgis (nm)
5.1 pav. NAD+ ir NADH optinio tankio priklausomumas nuo bangos ilgio
60 _________________________________
Bangos ilgis ties kuriuo yra didiausias optinis tankis vadinamas max. Mediaga gali turti kelet sugerties maksimum. Tuomet ymime 1, 2, 3 ir t. t. Jungini sugerties spektrai gali bti vartojami jiems nustatyti.
5.2. Kiekybiniai matavimai. Bero ir Lamberto dsnis.

sivaizduokime NADH tirpal spektrofotometro kiuvetje (plotis 1 cm). Pro j yra leidiama 340 nm monochromatin ultravioletin viesa. Tegu krintanios viesos intensyvumas = Io, o prajusios viesos intensyvumas = I
viesos intensyvum mediagoje apibdina viesos pralaidumas T. Jis lygus pro mediag prajusios ir mediag kritusios viesos intensyvum santykiui:
I . I0 Danai viesos pralaidumas ireikiamas procentais: T= I 100% I0
T=
. viesos pralaidumas priklauso nuo kiuvetje esanio tirpalo koncentracijos, tirpalo sluoksnio storio ir viesos bang ilgio. viesos pralaidumui atvirktinio dydio deimtainis logaritmas vadinamas optiniu tankiu A: A=lg1/T=lg Io/I
5.1 lentel. viesos pralaidumo ir optinio tankio santykis

Krintanios viesos intensyvumas (Io) 100 100 100 100 Prajusios viesos intensyvumas (I) 100 50 10 1 Pralaidumas (T) procentais I/Io 100% 50% 10% 1% Optinis tankis (A) lg Io/I 0 0,3 1.0 2.0
Tirpalo optinis tankis yra tiesiog proporcingas mediagos, kuri sugeria vies, koncentracijai (pavyzdiui, optinis tankis yra tiesiog proporcinga NADH koncentracijai). Optinis tankis taip pat yra tiesiog proporcingas viesos nueitam keliui per mgin, t. y. spektrofotometro kiuvets ploiui. Ekstinkcijos koeficientas rodo tirpalo optinio tankio santyk su mediagos koncentracija ir tirpalo sluoksnio storiu (t. y. viesos nueitu pro tirpal keliu). Molinis ekstinkcijos koeficientas M. Jeigu mediagos koncentracija yra vienas molis/litre (molin), tuomet ekstinkcijos koeficientas vadinamas molinis ekstinkcijos koeficientas ir ymimas M. Tiriamos mediagos kiek tirpale galima nustatyti matuojant optintin tank ties max ir taikant Bero ir Lamberto dsn. A=Mcl; ia A c l M =optinis tankis, koncentracija (mol/litre), kelio ilgis (kiuvets plotis) (cm) molinis ekstinkcijos koeficientas. M vienetai yra M1 cm1(t. y. litrai mol1 cm1 ). NADH M reikm yra 6220 M1cm1. Bero ir Lamberto dsn galima pateikti grafikai kaip tiesin priklausomyb A nuo c.
A
Esant A>1, optinio tankio priklausomumas nuo koncentracijos pasikeiia, pasidaro nebe tiesinis. Kintant bangos ilgiui , molins ekstinkcijos koeficientas kinta, todl Bero ir Lamberto dsnis galioja tik monochromatinei viesai. Daugumos gamtini mediag M galima rasti inynuose arba juos galima nustatyti matuojant tikslios koncentracijos grynosios mediagos tirpalooptin tank. inant mediagos M, lengvai galima nustatyti jos koncentracij tirpale, matuojant tirpalo optin tank. Pavyzdiui, aminorgties triptofano tirpalo optinis tankis ties 280 nm 1 cm kiuvetje yra 0,167. Triptofano M ties 280 nm yra 5580 lmol1cm1: A= M c l Pertvarkius lygt gaunama: C = A/Ml
c
5.2. pav. Optinio tankio priklausomumas nuo mediagos koncentracijos
62 _________________________________
Taigi: C = 0,167/5580=3.0105 moll1 Mediag spektrines savybes keiiantys veiksniai. Tos paios mediagos max ir M gali skirtis tai priklauso nuo slyg tirpalo pH, tirpiklio poliaringumo ir kt. Tirpal optin tank galima pamatuoti spektrofotometru arba fotokolorimetru. Spektrofotometras yra naudojamas tirpalo optinio tankio matavimui ties tiksliu bangos ilgiu. Fotokolorimetras yra paprastesnis instrumentas. Naudojant viesos filtrus galima pamatuoti tirpalo optin tank platesnje spektro dalyje (t. y. alios, raudonos, mlynos regimosios viesos spektro srityse). Praktiki patarimai matuojant optin tank: 1. Spektrofotometro kiuvets bna pagamintos i stiklo (paprasto arba kvarcinio) arba plastiko. Matuojant tirpalo optin tank regimosios viesos srityje, galima naudoti vis ri kiuvetes. Taiau matuojant optin tank ultravioletinje viesoje, kai bangos ilgis trumpesnis kaip 300 nm, galima naudoti tik kiuvetes pagamintas i kvarcinio stiklo. Kiuvets turi bti gerai iplautos. Daugelis mediag (baltymai, nukleorgtys) adsorbuojasi ant vidinio kiuvei paviriaus ir sunkiai isiplauna. Kiuvei pavirius turi bti varus ir sausas. Galima liesti tik matin (neskaidr) kiuvei paviri. Btina inoti kiuvets plot (daniausiai 1cm). Kvarcins kiuvets yra trapios ir brangios, todl bkite atids. 2. Matuojant optin tank pirmiausia uraoma nulin sugertis, t. y. pamatuojama kontrolins kiuvets, kurioje yra tik tirpiklis, optinis tankis. Tai yra btina, nes dal viesos sugeria kiuvets mediaga ir tirpiklis. Atmetus kontrolins kiuvets optinio tankio reikmes (nusibrus nulin linij), galima pamatuoti tiriamo tirpalo tiksli optin tank. 3. Jeigu matuojant spektrofotometru tirpalo optinis tankis A>1, tirpal reikia praskiesti. Taiau matuojant tirpaloptin tank, kai spalva susidar sureagavus sandams (pvz., nustatant baltym, angliavandeni ir kit mediag kiekius), negalima skiesti tokio spalvoto tirpalo, nes tuomet praskiediama tiek tiriama mediaga, tiek reagentai.Tokiu atveju reikia praskiesti pradin mediagos tirpal ir atlikti reakcij.
Literatra 1. Wilson K., Walker J. (2003) Principles and techniques of practical biochemistry, 479485. 2. Reed R., Holmes D., Weyers J., Jones A. (2003) Practical skills in biomolecular sciences
5.3. Kokybins aminorgi atpainimo reakcijos.

5.3.1. Ninhidrino reakcija
Visos aminorgtys, turinios laisv aminogrup, reaguoja su ninhidrinu ir sudaro mlynos spalvos kompleksus. Prolinas ir hidroksiprolinas su ninhidrinu sudaro geltonos spalvos kompleksus. Veikiant ninhidrinui, aminorgtys oksiduojasi ir suskyla iki amoniako, aldehido ir angliargts. Redukuotas ninhidrinas jungiasi su kita ninhidrino molekule ir amoniaku, susidaro sudtingos struktros spalvotas junginys. Analogikai su ninhidrinu reaguoja laisvas aminogrupes turintys peptidai ir baltymai.
Reagentai 1. 0,1% aminorgties tirpalas. 2. 1,0% baltymo tirpalas. 3. 0,1% ninhidrino tirpalas.
64 _________________________________
Darbo eiga 1. vien kgin mgintuvl pilama 0,2 ml 0,1% aminorgties, kit mgintuvl 0,2 ml 1% baltymo tirpalo. treij (kontrolin) mgintuvl vietoje aminorgties lainama 0,2 ml vandens. 2. visus mgintuvlius pilama po 0,1 ml 0,1% ninhidrino tirpalo ir uvirinama. Po 1 2 minui tirpalai, kuriuose buvo aminorgtys, nusidao melsvai. Laikant spalva rykja. 5.3.2. Reakcija su histidinu ir tirozinu (Paulio reakcija) armin histidino, tirozino arba baltymo tirpal pridjus diazoreagento, tirpalas gauna oranin spalv. Reakcijoje dalyvauja aminorgtys tirozinas ir histidinas, kurios, reaguodamos su diazobenzensulfonrgtimi, sudaro oranins spalvos azodaikl.
Azodaiklio spalvos rykumas priklauso nuo histidino ir tirozino kiekio. I vis baltym sudt einani aminorgi Pauli reakcija vyksta tik su histidinu ir tirozinu. Reagentai 1. 1,0% sulfanilo rgties tirpalas 2% druskos rgtyje. 2. 5,0% natrio nitrito tirpalas. 3. 10,0% natrio karbonato tirpalas. 4. 0,1% alanino tirpalas. 5. 1,0% kiauinio baltymo tirpalas.
Darbo eiga 1. tris mgintuvlius pilama po 0,1 ml 1,0% sulfanilo rgties tirpalo ir 0,1 ml 5,0% natrio nitrito tirpalo. Reakcijos miinys suplakamas. 2. pirmj mgintuvl pilama 0,2 ml 0,1% histidino, antrj mgintuvl 0,2 ml 1% kiauinio baltymo, treij mgintuvl 0,2 ml 0,1% alanino tirpal. 3. visus mgintuvlius pilama po 0,2 ml 10,0% natrio karbonato tirpalo. Reakcijos miinys pirmuose dviejuose mgintuvliuose nusidao rausvai oranine spalva. 5.3.3. Biureto reakcija peptidiniams ryiams nustatyti
Labai arminje aplinkoje Cu2+ jonai, reaguodami su biuretu (H2NCONHCO NH2), oksamidu (H2NCOCONH2), peptidais ar baltymais, sudaro mlynai violetinius ar raudonai violetinius kompleksus. Biureto reakcij lemia peptidini ryi buvimas. Kad susidaryt spalvotas kompleksas reikalingi maiausiai du peptidiniai ryiai. Manomo Cu2+ ir peptido komplekso struktra parodyta 5.4 pav.
5.4 pav. Manomas Cu2+ ir peptidinio ryio kompleksas
Biureto komplekso spalva priklauso nuo vario druskos kiekio tirpale ir nuo mediagos struktros. Baltym irimo produktai peptonai sudaro rausvos spalvos kompleksus. Magnio sulfatas ir amonio sulfatas tirpale trukdo biureto reakcijai. Esant amonio druskoms, reikia imti didel armo pertekli. Reagentai 1. 1,0% kviei baltymas. 2. 1,0% kiauinio baltymas. 3. 0,1% aminorgi tirpalas. 4. 10,0% natrio hidroksidas. 5. 0,1% vario sulfatas.
66 _________________________________
Darbo eiga 1. vien mgintuvl pilama 0,2ml 1,0% kviei baltymo, antrj mgintuvl 0,2 ml 1% kiauinio baltymo, treij mgintuvl 0,2ml 0,1% aminorgties tirpalo. 2. visus mgintuvlius pilama po 0,2 ml 10,0% natrio hidroksido bei 1 2 laus 0,1% vario sulfato tirpalo ir sumaioma. Reakcijos miinys pirmuosiuose dviejuose mgintuvliuose nusidao violetine spalva. Kontroliniai klausimai 1. Kurios aminorgtys dalyvauja Pauli reakcijoje? Uraykite j struktr. 2. Kodl alaninas su vario jonais arminje aplinkoje nesudaro spalvoto junginio? 3. Kurio metalo jonai dalyvauja susidarant kompleksiniam junginiui biureto reakcijoje? 4. Kurios baltym ir aminorgi funkcins grups reaguoja su ninhidrinu? 5. Ar reaguoja su ninhidrinu js odos baltymai?
5.4. Kokybins angliavandeni nustatymo reakcijos

5.4.1. Selivanovo reakcija ketoheksozms nustatyti Selivanovo reakcija atliekama ketozms painti. Fruktoz veikiant druskos rgtimi, susidaro oksimetilfurfurolas, kuris su rezorcinoliu sudaro raudonos spalvos kondensacijos produkt. ia reakcija galima atskirti gliukoz nuo fruktozs. Selivanovo reakcija vyksta su disacharidais (pvz., sacharoze), kuri sudt eina fruktoz. Rgtins hidrolizs metu isiskiria fruktoz, kuri ir nusidao. Gliukozs tirpalas nusidao silpna rausva spalva tik po ilgo virinimo su rezorcinoliu. Reagentai 1. Tolenso reagentas (1,0% rezorcinolio tirpalas koncentruotoje druskos rgtyje). 2. 1,0% sacharozs tirpalas. 3. 1,0% gliukozs tirpalas. 4. 1,0% fruktozs tirpalas. Darbo eiga 1. tris kginius mgintuvlius pilama po 300 l sacharozs, fruktozs ir gliukozs tirpal atitinkamai. 2. visus mgintuvlius pilama po 100l Tolenso reagento. 3. Ltai ildant, tirpalas, kuriame itirpinta fruktoz ir sacharoz, nusidao raudona spalva. Reakcijos miinys, kuriame yra gliukoz, spalvoto junginio su Tolenso reagentu nesudaro.
5.4.2. Triomerio reakcija aldozms nustatyti Aldozs arminje terpje redukuoja dvivalenio vario hidroksid iki vienvalenio. Susidars vienvalenio vario hidroksidas ir jo skilimo produktas vario oksidas yra spalvoti junginiai. Reakcijos metu vyksta gliukozs oksidacija ir dvivalenio vario hidroksido redukcija.
Reagentai 1. 1,0% sacharozs tirpalas. 2. 1,0% gliukozs tirpalas. 3. 10,0% natrio hidroksidas. 4. 2,0% vario sulfatas. Darbo eiga 1. mgintuvl pilama 0,5 ml gliukozs tirpalo ir 0,15 ml 10,0% natrio hidroksido tirpalo. 2. Vliau atsargiai lainamas 2,0% vario sulfato tirpalas (2040l) tol, kol susidars melsvas drumstumas, purtant mgintuvl, neinyksta. 3. Tirpalas paildomas. Esant gliukozei, i pradi susidariusios geltonos vienvalenio vario hidroksido nuosdos virsta raudonomis vienvalenio vario oksido nuosdomis. 4. Analogikai, kaip ir 1 3 punktuose, atliekama reakcija su sacharozs tirpalu.
68 _________________________________
5.5. Baltym kiekio nustatymas

Baltym kiekiui tirpale nustatyti plaiausiai taikomi kolorimetrijos metodai. Baltymo tirpal veikiant atitinkamu reagentu susidaro spalvotas junginys, kurio viesos sugertis nustatoma spektrofotometrijos bdu. Baltymo kiekis proporcingas spalvos rykumui ir nustatomas i kalibravimo kreivs. Kalibravimo kreivs daniausiai paruoiamos su jauio serumo albuminu. Taiau spalvos rykumas priklauso nuo baltymo aminorgi sudties, prostetini grupi buvimo. Baltym koncentracijai tiriamajame mginyje nustatyti taikomi keli metodai: viesos sugerties matavimas ultravioletinje spektro dalyje, Bredfordo, Louri, bisinchonins rgties, biureto metodai. 5.5.1. Baltym koncentracijos nustatymas, matuojant ultravioletins viesos sugert ties 280 nm.
Aromatini aminorgi triptofano ir tirozino liekanos baltymuose sugeria vies ties 280 nm. Metodas gana jautrus. Galima pamatuoti 10g/ml 1mg/ml baltym koncentracijas. Patogu, kad pamatavus sugert, baltym tirpalus galima toliau naudoti. Metodas plaiai taikomas baltym, prajusi pro chromatografines kolonles, koncentracijoms nustatyti. Tam tikr baltym sugerties koeficientai skiriasi, taiau, apytikriai, baltym tirpalo, kurio sugertis A280=1, koncentracija yra lygi 1mg/ml, jeigu kiuvets plotis lygus 1 cm. Baltym tirpaluose bna ir kit mediag (pvz. nukleorgi), kurios sugeria vies ties 280 nm ir trukdo tiksliai nustatyti baltym kiek tirpale. Matuojant baltymini tirpal sugert ties 260 nm ir 280 nm, galima patikslinti baltym koncentracij. Nustatyta, kad: Baltymas (mg/ml) = 1,45 A280 0,74 A260 Peptidiniai baltym ryiai sugeria vies ties 190 nm. Praktikai baltym sugertis (pvz., frakcionavimo metu) matuojama ties 210 nm. Jei baltymo koncentracija lygi 1 g/ml, tirpalo sugertis A210 = 20. is metodas taikomas retai, nes matuojant sugert ties 210 nm labai didel tak turi alutini mediag sugertis. Norint tiksliai nustatyti baltymo koncentracij daniausiai taikomi Bredfordo ir Louri pasilyti metodai. 5.5.2. Baltymo kiekio nustatymas Bredfordo metodu.
Baltymai jungiasi su Kumasi briliantinio mlio daikliu ir matuojamas susidariusio komplekso spalvos intensyvumas. Gryno daiklio katijonin forma sugeria vies ties 470 nm ir 650 nm, o susijungusi su baltymo arginino ir aromatinmis aminorgtimis anijonin daiklio forma sugeria vies ties 595 nm. is metodas yra paprastas, greitesnis
negu Louri. Spalvotas junginys susidaro greitai ir yra stabilus. Galima nustatyti 1 10 g/ml baltym koncentracijas. Taiau susidariusio komplekso spalvos rykumas priklauso nuo baltymo sudties. Glicerolis, detergentai, -merkaptoetanolis, acto rgtis, amonio sulfatas, TRIS ir tam tikri arminiai buferiai taip pat turi takos spalvotam kompleksiniui junginiui susidaryti. Daiklis gana tvirtai prilimpa prie kvarcini kiuvei paviriaus ir sunkiai nusiplauna. Reagentai 1. 0,5 mg/ml jauio serumo albumino tirpalas 2 ml. Laikyti 200C temperatros slygomis. 2. 0,15M NaCl tirpalas, 50 ml. 3. Kumasi briliantinio mlio G250 daiklio tirpalas: 50 mg Kumasi briliantinio mlio G250 itirpinama 25 ml 95% etanolio ir pilama 50 ml 85% fosforo rgties. pilama vandens iki 0,5 litro. Filtruojama. Laikoma 40C temperatros slygomis. Darbo eiga Visiems kalibravimo kreivs takams nustatyti procedra atliekama po 2 kartus. 1. 8 mgintuvlius pilama atitinkamai po 10, 20, 30, ir 40 l jauio serumo albumino tirpalo ir visus pilama iki 100 l 0,15 M NaCl tirpalo. kontrolinius (9,10) mgintuvlius pilama tik po 100 l 0,15 M NaCl tirpalo. 2. visus mgintuvlius pilama po 1,0 ml Kumasi briliantinio mlio G 250 tirpalo ir sumaioma. 3. Laikoma 2 min. kambario temperatros slygomis. 4. Spektrofotometru pamatuojama sugertis ties = 595 nm (A595 ) ir braioma kalibravimo kreiv. Ant ordinai aies paymima sugertis (A595), o ant abscisi baltymo kiekis (g). 5. 50 l neinomos koncentracijos baltymo tirpal pilama iki 100 l 0,15 M NaCl tirpalo, 1,0 ml Kumasi briliantinio mlio G 250 tirpalo ir sumaioma. Laikoma 2 min. kambario temperatros slygomis. Spektrofotometru pamatuojama A595, baltymo kiekis nustatomas i kalibravimo kreivs. Jeigu matuojamojo baltymo sugertis yra didel ir nustatyti duomenys nepatenka kalibravimo kreivs ribas, tada neinomos koncentracijos baltymas praskiediamas ir matavimas kartojamas. Susidarius spalvotam junginiui tirpalo skiesti negalima.
70 _________________________________
5.5.3.
Baltymo kiekio nustatymas Louri metodu
Tai jautrus, anksiau plaiai taikytas metodas, kuriuo galima nustatyti 1 20 g/ml baltym koncentracijas. Reaguojant Folino ir iokateu reagentui (miinys natrio tartrato, molibdato ir fosfato kartu su vario sulfato tirpalu) su peptidiniais baltym ryiais ir tirozino aminorgi liekanomis, susidaro spalvoti kompleksiniai junginiai, kuri sugertis matuojama ties 750 nm. Jautrumas skirtingiems baltymams beveik nesiskiria. Taiau yra daug mediag, kurios turi takos spalvotam kompleksiniam junginiui susidaryti. Tokios mediagos yra detergentai, denatruojantys veiksniai, tam tikri buferiai(TRIS, Pipes, Hepes) ir sieros turintys junginiai. Baltymo nusodinimas deoksicholatu/trichloracto rgtimi, padeda ivengti dalies mediag neigiamos takos. Susidars spalvotas kompleksinis junginys yra stabilus (A750 maja 1 2% laikant 1 valand kambario temperatros slygomis). Reagentai 1. 0,5 mg/ml jauio serumo albumino tirpalas 2ml. Laikyti 200C temperatros slygomis. 2. 0,8 M NaOH. 3. 10,0% natrio dodecilsulfato tirpalas. 4. Vario tartrato/karbonato (CTC) tirpalas. a) CTC pradinis tirpalas: 50 ml 0,2% CuSO4H2O, 0,2% kalio tartrato tirpal ltai pilama, stipriai maiant, 50 ml 20% natrio karbonato tirpalo. CTC pradinis tirpalas yra tinkamas naudoti 8 savaites, laikant kambario temperatros slygomis. b) CTC darbinis tirpalas: vienodais triais sumaiomas CTC pradinis tirpalas, 0,8 M NaOH, 10% natrio dodecilsulfato tirpalas ir vanduo. is reagentas yra stabilus kambario temperatros slygomis 1 2 savaites. 5. Folino ir iokateu reagentas. Reagento paruoimas: apvaliadugnje kolboje 700ml vandens itirpinama 100 g Na2WO42H2O ir 25 g Na2MoO42H2O. Pilama 50ml 85% fosfato rgties ir 100 ml koncentruotos druskos rgties. Prijungiamas Lybigo kondensatorius ir miinys 10 valand virinamas. Dedama 150 g liio sulfato, 50 ml vandens ir keli bromo laai. Numus Libicho aldytuv, 15 min. virinama traukos spintoje. Tokiu bdu paalinamas bromo perteklius. Tirpalas atauinamas ir pripilama vandens iki 1 litro. Filtruojama pro stiklo filtr. Vis io reagento ruoimo stadij metu tirpalo spalva turi bti geltona. Jei miinys turi alsv atspalv, vadinasi, is reagentas buvo ruoiamas i nevari mediag. Daniausiai tai vyksta dl tam tikr katijon priemai druskos rgtyje. Paruotas Folino ir iokateu reagentas titruojamas 1 M armo tirpalu ir nustatoma jo koncentracija. Folino ir iokateu reagentas laikomas tamsaus stiklo butelyje.
Darbo eiga Visiems kalibravimo kreivs takams nustatyti procedra atliekama po 2 kartus. 1. 8 mgintuvlius pilama atitinkamai 10, 20, 30, ir 40 l jauio serumo albumino tirpalo ir kiekvien vandens iki 200 l. kontrolinius (9, 10 mgintuvlius) pilama tik 200 l vandens. 2. visus mgintuvlius pilama po 200 l CTC darbinio tirpalo ir sumaioma. 3. Mgintuvliai laikomi 10 min. kambario temperatros slygomis. 4. Pilama 100 l 0,4 N Folino ir iokateu reagento ir nedelsiant sumaioma. Mgintuvliai laikomi 30 min. kambario temperatros slygomis. 5. Fotoelektrokolorimetru pamatuojama sugertis ties 750 nm (A750) ir braioma kalibravimo kreiv. Ant ordinai aies paymima sugertis (A750), o ant abscisi baltymo kiekis (g). 6. du mgintuvlius, turinius po 50 l neinomos koncentracijos baltymo tirpalo, pilama vandens iki 200 l, 200 l CTC darbinio tirpalo ir sumaioma. Laikoma 10 min. kambario temperatros slygomis. pilama 100 l 0,4 N Folino ir iokateu reagento, nedelsiant sumaioma. Laikoma 30 min. kambario temperatros slygomis. Fotoelektrokalorimetru pamatuojama A750. Baltymo kiekis nustatomas i kalibravimo kreivs. Jeigu matuojamojo baltymo sugertis yra didel ir nustatyti duomenys nepatenka kalibravimo kreivs ribas, tada neinomos koncentracijos baltymas praskiediamas ir matavimas kartojamas. Susidarius spalvotam tirpalui negalima skiesti tirpalo. 5.5.4. Baltymo kiekio nustatymas bisinchonins rgties (BCA) metodu
is metodas panaus Louri metod, taiau jautresnis. Juo galima nustatyti 0,5 g/ml baltym koncentracijas. Bisinchonins rgties natrio druska gerai tirpsta vandenyje, yra stabili, arminje aplinkoje sudaro su Cu1+ jonais kompleksin, rykiai raudonos spalvos jungin. djus baltymo tirpalo susidaro naujas kompleksinis junginys su Cu2+ jonais, kurio spalvos rykumas yra susijs su baltymo koncentracija tirpale. Tirpalo viesos sugertis matuojama ties 562 nm. BCA metodas maiau jautresnis vairioms priemaioms negu Louri metodas. Reagentai 1. 0,5 mg/ml jauio serumo albumino tirpalas 2 ml. Laikomas 20 0C temperatros slygomis. 2. Reagentas A 200 ml (stabilus kambario temperatros slygomis ilg laik). Tirpalo sudtis:1% BCANa2, 2% Na2CO3, 0,16% Na2 tartratas, 0,4% NaOH, 0,95% NaHCO3. Itirpinus reagentus apytikriai 150 ml vandens, koncentruotu NaOH tirpalu pasiekiamas pH 11,25 (BCA optimumas), vliau dejonizuotu
72 _________________________________
H2O tirpalas praskiediamas iki 200 ml. 3. Reagentas B 5 ml (stabilus kambario temperatros slygomis ilg laik). 4% CuSO45H2O. 4. Standartinis darbinis reagentas (S-DR) S-DR = 100 tri A + 2 triai B. Ruoiamas kas savait. Spalva alsva. Darbo eiga Visiems kalibravimo kreivs takams nustatyti procedra atliekama po 2 kartus. 1. 8 mgintuvlius pilama atitinkamai 10, 20, 30, ir 40 l jauio serumo albumino tirpalo ir kiekvien vandens iki 50 l. kontrolinius mgintuvlius (9,10) pripilama tik 50 l dejonizuoto vandens. 2. visus mgintuvlius pilama 950l S-DR tirpalo ir sumaioma. 3. Laikoma 30 min., 37C temperatros slygomis. 4. Atvsinama iki kambario temperatros, palaikant mgintuvlius 5 min. kambario temperatros slygomis. 5. Tirpal sugertis matuojama spektrofotometru ties =562 nm, i gaut duomen braioma kalibravimo kreiv. Ant ordinai aies atidedama sugertis (A562), o ant abscisi baltymo kiekis (g). 6. mgintuvl pilama 50l tiriamo baltymo tirpalo ir 950l S-DR tirpalo. Sumaiius turi atsirasti rausva spalva. Laikoma 30min, 370C temperatroje. Atvsinama iki kambario temperatros, palaikant mgintuvlius 10 min. kambario temperatroje. Tirpal sugertis matuojama spektrofotometru ties =562nm. Tiriamo baltymo kiekis nustatomas i kalibravimo kreivs. Jeigu matuojamojo baltymo sugertis yra didel ir gautas rezultatas nepatenka kalibracins kreivs ribas, tada neinomos koncentracijos baltymas praskiediamas ir matavimas pakartojamas. Negalima skiesti tirpalo, kai jau susidar spalvotas junginys. 5.5.5. Baltym kiekio nustatymas biureto metodu Reaguojant vario jonams su peptidiniu ryiu, susidaro violetins spalvos kompleksinis junginys. i spalvin reakcija taikoma baltym kiekiui nustatyti. Reakcija su biureto reagentu yra maiau jautri, negu su Folino reagentu arba BCA. Taiau, j atliekant, galima nustatyti didesnius baltymo kiekius. Amonio jonai, TRIS, sacharoz, glicerolis trukdo reakcijai, nes keiia kompleksinio junginio spalv. Lipidai ir detergentai gali sudrumsti tirpalus. Reagentai 1. 0,5mg/ml jauio serumo albumino tirpalas 2 ml. Laikyti 200C temperatros slygomis.
2. Biureto reagentas 250 ml. 2,25 g NaK tartrato, 0,75 g CuSO45H2O, 1,25 g KJ paeiliui itirpinami 100 ml 0,2 M NaOH. pilama vandens iki 250 ml. Jeigu susidaro juodos nuosdos, nufiltruojama. Reagentas laikomas polietileniniame inde. Darbo eiga Visiems kalibravimo kreivs takams nustatyti procedra atliekama po 2 kartus. 1. 8 mgintuvlius pilama 20, 50, 100 ir 200 l jauio serumo albumino tirpalo ir kiekvien pilama vandens iki 200 l. kontrolinius (9, 10 mgintuvlius) pilama tik 200 l vandens. 2. visus mgintuvlius pilama po 800 l biureto reagento ir sumaioma. 3. Tirpalai laikomi kambario temperatros slygomis 15 min. 4. Tirpal sugertis matuojama spektrofotometru ties ? 650 nm, i gaut duomen braioma kalibravimo kreiv. Ant ordinai aies paymima sugertis (A540), o ant abscisi baltymo kiekis (g). 5. mgintuvl pilama 50 l tiriamo baltymo tirpalo, 150 l vandens ir 800 l Biureto reagento. Mginys laikomas kambario temperatros slygomis 15 min. ir sugertis matuojama spektrofotometru ties = 540 nm arba kalorimetru ties 540650 nm. Tiriamo baltymo kiekis nustatomas i kalibravimo kreivs. Jeigu matuojamo baltymo tirpalo sugertis yra didel ir nustatyti duomenys nepatenka kalibravimo kreivs ribas, tada neinomos koncentracijos baltymo tirpalas yra praskiediamas ir matavimas kartojamas. Susidarius spalvotam junginiui, negalima skiesti tirpalo.
Literatra 1. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., V.193, p.265275. 2. Cadman E., Bostwick J.R., Eichberg J. (1979). Determination of protein by a modified Lowry procedure in the presence of some commonly used detergents. Anal. Biochem., V.96, p.2123. 3. Peterson G.L. (1979). Review of the Folin phenol protein quantitation method of Lowry, Rosebrough, Farr and Randall. Anal. Biochem., V.100, p.201220. 4. Bradford M.M.(1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., V. p.248254 5. Smith P.K et al. (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry V.150, p.7685. 6. Wilson K., Walker J. (2003) Principles and techniques of practical biochemistry, 479485.
74 _________________________________
Kontroliniai klausimai: 1. Kurios mediagos trukdo baltymo kiek nustatyti Bredfordo metodu? 2. Kaip spektrines mediag savybes lemia terps rgtingumas? 3. Tirpalo koncentracijos priklausomumas nuo viesos sugerties. Bero ir Lamberto dsnis. 4. Kurios aminorgtys sugeria vies ties 280 nm ? 5. Kurios mediagos danai trukdo matuoti baltym sugert ultravioletinje srityje? 6. Kokio bangos ilgio vies sugeria peptidiniai ryiai ?
6. Saugaus darbo biochemijos laboratorijoje __________________________________________ 1. Baltym ir peptid merkaptogrupi nustatymaspagrindins taisykls ________________________ 75
6 . Baltym ir peptid merkaptogrupi nustatymas
Biologinis baltym aktyvumas ir makromolekulin j struktra pasikeiia, oksiduojant arba blokuojant baltym merkaptogrupes (SH). ios grups gali eiti aktyv fermento centr ir dalyvauti katalizje. Jos sudaro disulfidinius ryius ir palaiko baltymo tretin struktr. Daugelio ferment aktyvumas yra slopinamas oksiduojant SH grupes ar blokuojant jas tam tikrais veiksniais. Merkaptogrups traukiamos tam tikras chemines reakcijas (acilinimo, oksidacijos, alkilinimo, toliat susidarymo). Be to SH grups sudaro vandenilinius ryius. Merkaptogrupms nustatyti taikomi ie metodai: 1) amperometrinis titravimas, naudojant sidabro nitrat; 2) spektrofotometrinis titravimas su p-chlormerkurabenzoatu (pCMB) arba 5,5ditiobis(2nitrobenzenkarboksirgtimi) Elmano reagentu.
6.1. Merkaptogrupi nustatymas baltymuose arba peptiduose titruojant su p-chlormerkurabenzoatu

p-chlormerkurabenzoatas su laisvomis baltym ar peptid SH grupmis sudaro toliato kompleks, kurio viesos sugerties maksimumas yra ties 250 nm. Matuojant viesos sugert ties 250 nm galima nustatyti SH grupi kiek tenkant 1 moliui baltymo.
6.1.1.
p-chlormerkurabenzoato tirpalo paruoimas ir jo koncentracijos nustatymas spektrofotometrijos bdu
Norint nustatyti baltym SH grupi skaii, reikia inoti tiksli p-chlormerkurabenzoato tirpalo koncentracij. p-chlormerkurabenzoato viesos sugerties maksimumas yra ties 232 nm. pCMB molins ekstinkcijos koeficientas M=1,69104 M1cm1. Pamatavus p-chlormerkurabenzoato tirpalo viesos sugert ties 232 nm, atsivelgiant Bero ir Lamberto dsn, galima apskaiiuoti p-chlormerkurabenzoato tirpalo koncentracij. Reagentai: 1. 5104 M p-chlormerkurabenzoato tirpalas, 10 ml. 2. 0,5 M KCl tirpalas (pH 7,6), 25 ml. 3. 2,0 M KOH tirpalas, 5ml. 4. 0,5 M HCl tirpalas, 5ml.
76 _________________________________
Darbo eiga: 1. Pasvertas p-chlormerkurabenzoatas suberiamas 10 ml kolbut, pilama 5 ml distiliuoto vandens, paarminto 2 M KOH iki pH 11(matuojama su indikatoriniu popierliu). 2. p-chlormerkurabenzoato tirpal maiant pamau lainamas 0,5 M HCl tirpalas, kol pasiekiama pH reikm lygi 7,6 (matuojama pH metru). lainus per daug rgties ikrenta pCMB nuosdos ir tirpalas susidrumsia. Paruous skaidr pH 7,6 tirpal, pilamas distiliuotas vanduo iki 10 ml. 3. dvi spektrofotometro kiuvetes pilama po 2,8 ml KCl tirpalo. 4. vien kiuvet (antroji yra kontrolin) pilama 0,05 ml p-chlormerkurabenzoato tirpalo ir kruopiai sumaioma. 5. Pamatuojama tirpalo viesos sugertis ties 232 nm. 6. kiuvet dar tris kartus pilama po 0,05 ml p-chlormerkurabenzoato tirpalo, kruopiai sumaioma ir kiekvien kart pamatuojama tirpalo viesos sugertis ties 232 nm. 7. pCMB tirpalo koncentracij apskaiiuojama po kiekvieno p-chlormerkurabenzoato tirpalo pridjimo:
CpCMB
A232 (2,8 + V) 1,69 104 V
ia A232 viesos sugertis, V pridto pCMB tirpalo tris. 6.1.2. Glutationo merkaptogrupi nustatymas Reagentai: 1. 1103 M redukuoto glutationo tirpalas, 2 ml. 2. 5104 M p-chlormerkurabenzoato tirpalas, 1 ml. 3. 0,5 M KCl tirpalas (pH 7,6), 25 ml. Darbo eiga: 1. spektrofotometro kiuvet pilama 0,1 ml 1103M redukuoto glutationo tirpalo ir 2,7 ml 0,5M KCl tirpalo. 2. kontrolin kiuvet pilama 2,8 ml 0,5 M KCl tirpalo. 3. abi kiuvetes pilama po 0,04 ml p-chlormerkurabenzoato tirpalo ir kruopiai sumaioma. 4. Po 2 min. matuojama viesos sugertis ties 250 nm. 5. Tris kartus abi kiuvetes pilama po 0,04 ml p-chlormerkurabenzoato tirpalo, kruopiai sumaioma.
6. Saugaus darbo biochemijos laboratorijoje __________________________________________ 1. Baltym ir peptid merkaptogrupi nustatymaspagrindins taisykls ________________________ 77
6. Po 2 min. matuojama viesos sugertis ties 250 nm. 7. p-chlormerkurabenzoato tirpalo pried tris sumainamas iki 0,02 ml, o po dviej kart iki 0,01 ml. 8. Po 2 min. matuojama viesos sugertis ties 250 nm. Matavimai baigiami, kai po naujos p-chlor6.1 pav. Merkaptogrupi merkurabenzoato tirpalo porcijos pridjimo titravimo kreiv tirpalo viesos sugertis nebesikeiia. 9. Nubriamas viesos sugerties A250 priklausomumo nuo pridto p-chlormerkurabenzoato tirpalo trio grafikas. Nustatomas pchlormerkurabenzoato tirpalo tris, atitinkantis kreivs lio tak. Ekvivalentiniame take yra susijungusios visos SH grups. Atsivelgiant sunaudoto p-chlormerkurabenzoato kiek galima apskaiiuoti SH grupi kiek, esant 1 mol redukuoto glutationo: , n C1 V1 C2 V2 merkaptogrupi kiekis, esantis 1 mol glutationo. tiriamos mediagos (glutationo) pradin koncentracija. tiriamo tirpalo tris. pradin pCMB koncentracija. pridto pCMB tirpalo tris ekvivalentiniame take.
6.1.3. Merkaptogrupi nustatymas baltymuose Reagentai: 1. 1 mg albumino, itirpinto 1 ml 0,5 M KCl, 10ml. 2. 5104 p-chlormerkuribenzoato tirpalas, 1ml. 3. 0,5 M KCl tirpalas (pH 7,6), 25 ml. Darbo eiga: 1. vien spektrofotometro kiuvet pilama 2,8 ml baltymo tirpalo, o kit, kontrolin 2,8 ml 0,5M KCl tirpalo. 2. Po to abi kiuvetes pilama po 0,04 ml 5104 p-chlormerkurabenzoato tirpalo, gerai imaioma. 3. Po 2 min. pamatuojama viesos sugertis ties 250 nm. 4. Analogikai glutationui nustatomas SH grupi kiekis albumine. Nubriama SH grupi titravimo kreiv, nustatomas ekvivalentinis takas, apskaiiuojamas merkaptogrupi kiekis, tenkantis vienam moliui baltymo.
78 _________________________________
6.1.4.
lapalo poveikis SH grupi kiekiui baltymo molekulje.
Darbo eiga 1. tris mgintuvlius pilama po 1,5 ml baltymo tirpalo ir 1,5 ml 2M, 4M, 6M lapalo tirpal atitinkamai. 2. Inkubuojama 5 min. kambario temperatros slygomis. 3. Po inkubacijos nustatomas merkaptogrupi kiekis visuose trijuose mgintuvliuose. 4. Nubraiomas grafikas, atspindintis SH grupi kiekio priklausomum nuo lapalo koncentracijos.
7. Saugaus darbo ________________________________________________________________ 1. Chromatografija biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls ________________________ 79
7 . Chromatografija
Chromatografija jungini iskyrimo i miini, j gryninimo ir analizs metodas. Chromatografijos pradininkas yra rus botanikas Michailas Cvetas. Tai pirmasis mokslininkas, kuris 1903 m. skmingai iskyr kelis augal pigmentus, miin praleisdamas pro kalcio karbonato kolonl. Jis rod, kad chlorofilas nra vienintelis augal pigmentas. iuo metu chromatografijos technika yra labai tobula. Naudojamos automatizuotos sistemos, padedanios igryninti ne tik tam tikros struktros cheminius junginius, atskirti enantiomerus (stereoizomerus izomerus), bet analizuoti biologikai aktyvias, labilias mediagas fermentus, nukleorgtis Chromatografija gali bti analizin, taikoma junginiams nustatyti, struktrai analizuoti, arba preparatyvin iskiriant ir gryninant didelius mediag kiekius
7.1. Chromatografijos pasiskirstymo koeficientas

Bendru atveju visos chromatografins sistemos susideda i dviej sand nuostoviosios (stacionariosios) fazs, kuri gali bti kieta, skysta arba gelis, ir i judriosios fazs , kuri bna skysta (skysi chromatografija) arba dujin (duj chromatografija). Judrioji faz teka (juda) pro nuostovi faz. Chromatografijos specialistai vartoja tokius terminus: nuostovioji faz danai vadinama sorbentu arba neikliu, o judrioji faz eliuentu (tirpiklis arba buferis). Eliuentas, turintis itirpusi iskiriam mediag, vadinamas eliuatu. Nuostovioji ir judrioji fazs yra parenkamos tokios, kad iskiriamos i miinio mediagos tarp fazi pasiskirstyt skirtingai, t. y. turt skirting pasiskirstymo koeficient Rf. Pasiskirstymo koeficientas apibria, kaip mediagos kiekis (koncentracija) pasiskirsto tarp dviej nesimaiani fazi A ir B. Iskiriamos mediagos pasiskirstymo koeficientas yra nekintamas dydis, esant toms paioms fazms A ir B, pastoviai temperatrai ir kitoms chromatografavimo slygoms. Pasiskirstymo koeficientas ireikiamas lygtimi:
judriosios fazs A mediagos koncentracija nuostoviosios fazs B medaigos koncentracija
= Rf
Chromatografija veiksminga, jei visas iskiriamos i miinio mediagos kiekis yra vienoje i fazi (A arba B). Tai pasiekiama parenkant chromatografijos bd pagal nuostoviosios ir judriosios fazi sveikos mechanizm: adsorbcin chromatografija hidrofobins sveikos chromatografija adsorbcijos pusiausvyra tarp nuostoviosios kietos ir judriosios skystos fazs;
80 _________________________________
pasiskirstymo chromatografija chromatografijos bdas, kai nuostovioji ir judrioji fazs yra nesimaiantys arba i dalies susimaiantys skysiai, o chromatografuojama mediaga pasiskirsto tarp fazi pagal giminingum (tirpum); jon main chromatografija, chromatofokusavimas jon pusiausvyra tarp joninio neiklio ir judriosios fazs buferio ar elektrolito; giminingumo (afinin), imunoafinin, metalochelatoafinin chromatografija pusiausvyra tarp nuostoviosios fazs imobilizuoto (tverto ligando ir skystos judriosios fazs; molekuli iskyrimo chromatografija, gelchromatografija kai molekuls atskiriamos pagal dyd ar form sieto principu, leidiant tekti pro portus neiklius.
7.2. Chromatografijos bdai

Mediagoms atskirti taikomi du pagrindiniai chromatografijos bdai: kolonlin chromatografija nuostovioji faz (sorbentas/neiklis) yra dedama stiklo, plastiko ar metalin kolonl, o judrioji faz teka pro kolonl dl skysio lygio skirtumo arba stumiama siurbliuku. Tai daniausiai naudojamas chromatografijos bdas. plokioji (plonasluoksn, popieriaus) chromatografija nuostovioji faz tai plonu neiklio sluoksniu padengta stiklo, plastiko ar metalo folijos ploktel arba chromatografinio popieriaus celiuliozs pluotas. Judrioji faz (tirpikli sistema) kapiliarinio veikimo principu teka pro plon neiklio sluoksn ar chromatografin popieri. Naudojant chromatografijos bd, vienu metu galima analizuoti daug mgini. Plonasluoksns chromatografijos procesas yra greitas. Jam reikia mao tiriamos mediagos kiekio, todl danai naudojamas kokybiniams bandymams arba chemins sintezs metu stebint reakcijos kinetik.
7.3. Kolonlin chromatografija

7.3.1. Kolonlins chromatografijos ranga Normalaus slgio kolonlinei chromatografijai naudojamos stiklins ar plastikins cilindro formos vairaus skersmens ir aukio kolonls. Kolonls dugne turi bti porta membrana, sulaikanti kolonlje sorbent, ir praledianti judrij faz (eliucijos bufer ir chromatografuojamas mediagas). Komercinms kolonlms sandarinti naudojamos porto stiklo ploktels, pritvirtintos prie speciali nailonini antgali, leidiani reguliuoti kolonls tr. Laboratoriniams darbams danai naudojamos kolonls, ukimtos stiklo plau kamiais. Kolonl plastikiniais vamzdeliais
Indas su eliuentu
Indas su eliuentu Stklin kolonl
Reguliuojamas stmoklis
Nailoniniai diskai Neiklis Reguliuojamas stmoklis Stiklo vata
Eliuatas, tekanis detektori ir frakcij kolektori
7.1 pav. Chromatografins kolonls: a laboratorin kolonl, b komercin kolonl
sujungiama su detektoriumi ir/ar frakcij kolektoriumi (7.1 pav.) iuolaikinius aukto slgio chromatografus dedamos plienins kolonls, atlaikanios aukt slg ir labai greitai iskirianios mediagas 7.3.2. Nuostovioji faz upildas/ sorbentas/neiklis Upildu vadinama nuostovij faz sudaranti pagrindin mediaga. Ji, chemikai modifikavus ar prijungus tam tikras funkcines grupes, vadinama sorbentu arba neikliu. Upildo parinkimas svarbus skmingai chromatografijai. upildas turi bti mechanikai ir chemikai atsparus, neukimti kolonls, lengvai praleisti judrij faz (eliuent). Be to, upildas turi turti funkcines grupes, kurias modifikujant galima bt gauti skirting savybi neiklius. Pagrindiniai upildai: Agaroz polisacharidas, sudarytas i pasikartojani agarobiozs fragment. Agarobioz yra disacharidas, sudarytas i Dgalaktozs ir 3,6anhidrogalaktozs liekan. Taip gaunamas skirtingo poringumo, stabilus pH pokyiams agarozs gelis.
82 _________________________________
Komerciniai agarozs preparatai Sepharose ir BioGel A.
Agarobioz
Celiulioz polisacharidas, sudarytas i (1>4)glikozidiniais ryiais susijungusi gliukozs liekan. Naudojant epichlorhidrin, gaunama celiulioz, kurios linijins molekuls sujungiamos skersiniais ryiais. Celiulioz gaminama grdeliais arba plauin, yra hidrofilika ir stabili rgtinje bei arminje terpse. Dekstranas polisacharidas, sudarytas i (1>6)glikozidiniais ryiais susijungusi gliukozs liekan. Skersiniams ryiams sudaryti naudojamas epichlorhidrinas. Dekstranas, kaip upidas, maiau stabilus nei celiulioz. Komercinis preparatas Sephadex Poliakrilamidas akrilamido polimeras, susitas N,N,N,Nmetilenbisakrilamidu. Tai labai patvarus polimeras. Komercinis preparatas Bio Gel P
CH2 CHCONH2 Akrilamidas
+
Radikalin kataliz
CH2 (NHCOHC CH2)2 N,N,N,Nmetilenbisakrilamidas
Polistirenas stireno polimeras, susitas divinilbenzenu. Polistirenas, naudojamas kaip upildas jon main chromatografijoje, yra stabilus rgi ir arm poveikiui. Silikagelis polimeras, sudarytas i silicio rgties (techn. SiO2 nH2O, gelio pavidalo mediaga). is polimeras labai hidrofilikas, todl silanolio OH grupi perteklius yra blokuojamas, veikiant trichlormetilsilanu.
7.3.3. Kolonls paruoimas ir eliucija Chromatografijos skm labai priklauso nuo taisyklingo kolonls paruoimo. Sorbentas (neiklis) yra suspenduojamas ir brinkinamas buferyje. Suspensija, velniai maiant, ltai pilama kolonl. Reikia nuolatos stebti, kad buferio sluoksnis visada bt vir neiklio ir nepatekt oro burbuliukai. Pripildyta reikalingo sorbento kiekiu, kolonl sandariai udaroma, kad neidit. Chromatografijai paruotas mediag miinys atsargiai plonu sluoksniu upilamas ant neiklio paviriaus tokiu bdu, kad jis susigert virutin sorbento sluoksn. Vliau atliekama chromatografija. Pro kolonl leidiama judrioji faz (buferis ar tirpiklis). itas procesas vadinamas eliucija Pro kolonl juddamos skirtingos mediagos atsiskiria ir i kolonls iteka su skirtingu buferio (eliuato) triu. Judriosios fazs tris, kuris reikalingas tam tikrai mediagai iplauti (eliuoti) i kolonls, yra vadinamas eliucijos triu. Tekantis i kolonls buferis eliuatas paprastai prateka detekcijos kiuvet, kur yra nuolat matuojama sugertis, esant atitinkamam bangos ilgiui. Registracijos sistema saviraiu urao pratekanio tirpalo sugert ir braio eliucijos profil, kuriame eliuojamos individualios mediagos uraomos tam tikrais pikais. Baltym chromatografijos atveju matuojama sugertis, kai = 280 nm, nukleorgi, kai = 250 260 nm. Pratekjs detekcijos kiuvet, eliuatas maais triais, frakcijomis, surenkamas automatiniu frakcij kolektoriumi. Eliucijos bdas priklauso nuo chromatografijos metodo: jon main chromatografijos metu daniausiai naudojama gradientin eliucija: kai keiiama buferio jonin jga arba keiiamas buferio pH; gelchromatografijos metu eliuojama vienu pasirinktu buferiu, nekeiiant buferio pH ar koncentracijos
7.4 Plokioji (popieriaus ir plonasluoksn) chromatografija

7.4.1. Popieriaus chromatografija Vietoje kolonls, kurioje neiklis yra celiulioz, gali bti naudojamas specialiai paruotas chromatografinis popierius. Popieriaus chromatografijos metodu galima atskirti vienus nuo kit ir identifikuoti daugel chemini jungini, pvz., nukleozidus, nukleotidus bei aminorgtis. Popieriaus chromatografijai reikalingas chromatografinis popierius, chromatografinis cilindras ir tirpikli sistema. chromatografijos cilindr pilama paruota tirpikli sistema, vliau merkiamas ritin susuktas ir susegtas chromatografinio popieriaus laktas, su ulaintos tiriamos mediagos. Daniausiai ulainamos inomos struktros mediagos kaip ymenys (kontroliniai takai) alia tiriamos mediagos. Chromatografijos procesas vyksta 1520 val.: chromatografiniu popieriumi kyla tirpiklis (popierius pamau drgsta), ir kartu nea ulaintas ant popieriaus mediagas. Tiriam
84 _________________________________
mediag isidstymas chromatogramoje priklauso nuo chemins j prigimties ir tirpumo judriojoje bei nuostoviojoje chromatografins sistemos fazse. iuo atveju nuostoviosios fazs vaidmen atlieka popieriaus lakt sudarantis celiuliozs pluotas ir jame suritas vanduo. Chromatografin popieri gamina vairios komercins kompanijos, popieriaus savybs skiriasi. Atsivelgiant celiuliozinio pluoto tank, chromatografinis popierius skirstomas greit, vidutinio greiio ir ltj, nes skirtingu greiiu juo teka chromatografin sistema. Popieriaus celiulioz yra higroskopika, jos sudt eina suritas vanduo, nors ir skrupulingai idiovinta. Mediag pasiskirstymas chromatografuojant popieriaus chromatografijos bdu vyksta tarp nuostoviosios fazs (celiuliozs surito vandens) ir judrios fazs organinio tirpiklio. Chromatografijai naudojamose tirpikli sistemose taip pat yra vandens. Judriosios fazs funkcij atlieka vairs organiniai tirpikliai (izopropilo alkoholis, npropanolis, nbutanolis, tretinis butanolis, etanolis), einantys chromatografines sistemas. Juo didesnis mediag tirpumas judriojoje fazje (hidrofobins mediagos) ir juo maesnis nuostoviojoje (hidrofilins mediagos), tuo greiiau tos mediagos juda kartu su organiniu tirpikliu. Ant chromatogramos (popieriaus lakto) isiskyrusios mediagos nustatomos panaudojant vairiais bdais. Chromatografuojamos spalvotos mediagos nustatomos i pasiskirsiusi spalvot dmi, nespalvotas mediagas galima rykinti savitaisiais reagentais. Aminorgtys ar peptidai rykinami apipurkiant ninhidrinu. Vietos, kuriose yra ios mediagos, nusidao violetine spalva. Nukleozidai, nukleotidai ar kitos mediagos, sugerianios UV vies, nustatomos chromatoskopu.. i mediag susitelkimo vietose matomos tamsios dms. Atsivelgiant judriosios fazs judjimo krypt popieriaus chromatografija skirstoma tris pagrindines ris ratin, kylani ir nusileidiani. 7.4.2. Plonasluoksn chromatografija Plonasluoksnei chromatografijai vietoje chromatografinio popieriaus naudojamos aliuminio, plastiko ar stiklo ploktels, padengtos neorganinmis mediagomis silikageliu (silicio oksidu), aliuminio oksidu, magnio silikatu, ar organins prigimties mediagomis celiulioze, polietileno ar kito polimero milteliais. Serbento, dengianio plokteles, sluoksnis bna 0,20,5 mm storio. iuo metu komercins kompanijos gamina vairaus dydio ir skirtingais neikliais padengtas plokteles, kurias pagal poreikius galima panaudoti vairioms mediagoms atskirti ar identifikuoti. UVvies sugeriani mediag (pvz., nukleotid) chromatografijai skirtos ploktels yra padengtos neikliu, sumaiytu su savitu UV viesoje vytiniu dau. Chromatogramos vietos, kuriose yra nukleotidins prigimties mediagos, apvietus UV viesa, yra tamsios, o chromatografins ploktels fonas vyti. Aminorgtys ant chromatografini plokteli
rykinamos ninhidrinu. Chromatografijos principas naudojant plokteles yra panaus popieriaus chromatografij, tik neiklis i dalies atlieka ir sorbento funkcijas. Plonasluoksn chromatografija yra daug greitesn ir reikia labai maai tiriamos mediagos. i chromatografija vyksta tik 12 val., nes tirpikli sistema ploktelmis kyla labai greitai.
7.5. Chromatografijos metodai

7.5.1. Adsorbcin chromatografija i chromatografija grindiama adsorbcijos principu: kai netirpios mediagos neikliai/ absorbentai ant savo paviriaus sugeba sulaikyti itirpusias molekules. Tai adsorbcijos prosesas, paremtas silpnais tarpmolekuliniais ryiais van der Valso sveika, vandeniliniais ryiais, bet ne joniniais ar kovalentiniais ryiais. Adsorbcin chromatografija daniau naudojama maos molekulins mass mediagoms atskirti.. ios chromatografijos principas taikomas ne tik kolonlinei, bet ir plonasluoksnei chromatografijai. Adsorbcinei chromatografijai daniausiai naudojami neikliai pateikti 7.1 lentelje.
7.1 lentel. Adsorbcins chromatografijos neikliai
Neiklis/sorbentas Aliuminio oksidas Silikagelis Aktyvintosios anglys Kalcio fosfatinis gelis Hidroksiapatitas Atskiriamos mediagos Maos molekulins mass organins mediagos, peptidai Aminorgtys, nukleotidai, steroidai Angliavandeniai, aminorgtys, peptidai Baltymai, polinukleotidai Nukleorgtys, oligonukleotidai
7.5.2
Pasiskirstymo chromatografija
is chromatografijos bdas dar vadinamas skysi chromatografija, nes nuostovioji ir judrioji fazs yra skysiai. Mediag pasiskirstymas tarp nuostoviosios ir judriosios fazi grindiamas giminingumo (tirpumo) skirtumu. Didiausia chromatografuojamos mediagos koncentracija bus tame skystyje, kuriame ji geriausiai tirpsta. Nuostoviosios fazs skystis gali bti porto neiklio grdeliuose, panaiai kaip gelchromatografijos atveju (sk. 3.4.), gali bti suritas su neiklio pluoto, kuriuo pripildyta kolonl, arba gali plonu sluoksniu padengti nuostoviosios fazs neiklio grdelius. Hidrofiliniai neikliai celiulioz, poliakrilamidas, deksranas brinkdami suria daug vandens, kuris atlieka nuostoviosios fazes funkcij.. Judrioji faz iuo atveju yra organini tirpikli miinys.
86 _________________________________
Nuostovioji faz popieriaus chromatografijoje taip pat yra vanduo, suritas su chromatografinio popieriaus celiuliozs pluotu, o judrioji faz organini tirpikli miinys. Chromatografuojam mediag pasiskirstymas priklauso nuo j hidrofobikumo. Atliekant popieriaus chromatografij, geriau organiniuose tirpikliuose tirpstanios mediagos visada juda toliau su tirpikli miiniu, o hidrofilins mediagos atsilieka, nes yra giminingesns vandeninei fazei. Kai kada pasiskirstymo chromatografijos fazs parenkamos atvirkiai, t. y., prie neiklio plonu sluoksniu adsorbuojamas ar cheminiais ryiais prijungiamas organinis tirpiklis, o judrioji faz yra vandenis tirpalas. is bdas vadinamas atvirktins fazs chromatografija (reversed phase chromatography). 7.5.3. Jon main chromatografija i chromatografija grindiamai sveika tarp skirtingus krvius turini molekuli. Daugelis biologikai aktyvi jungini baltymai, nukleorgtys turi funkcines grupes, kurios vandeniniuose tirpaluose gali jonizuotis, t. y. gyti teigiam arba neigiam krv. Krvis priklauso nuo funkcini grupi pK a ir nuo buferio pH. Jon main chromatografijai naudojami jon main neikliai turintys galiniais jonizuotis funkcines grupes. ie neikliai bna katijoniniai arba anijoniniai. Katijon main neikli neigiamj krv turinios funkcins grups sveikauja su chromatografuojam mediag katijoninmis grupmis. ie neikliai dar vadinami rgtiniais jon main neikliais, nes neigiamas j krvis priklauso nuo rgtini funkcini grupi jonizacijos. Anijon main neikliai turi teigiamj krv, jie vadinami baziniais neikliais, nes teigiamj krv generuoja proton prisijungusios bazins funkcins grups. Jon mainai vyksta keliais etapais, jon pasikeitimas yra pusiausvirasis procesas: Katijon mainai: RSO3 ..Na+ + +NH3R/
Neiklis Chromatuografuojama mediaga
RSO3.....+NH3R/ + Na+
Neiklio ir chromat. med. sveika
Anijon mainai: (R)4N+ .....Cl + OOCR/

Chromatuografuojama mediaga sveika
Neiklis
( R)4N+ OOCR/ + Cl Neiklio ir chromat. med.
Pagrindiniai jon main chromatografijoje naudojami neikliai pateikiami 7.2 lentelje.
7.2 lentel. Pagrindiniai jon main neikliai

Neiklio ris Upildas Funkcin grup COO CH2COOSO3 CH2SO3 CH2CH2CH2SO3 CH2CH2N+H3 CH2CH2N+H(CH2CH3)2 CH2N+(CH3)3 CH2CH2N+( CH2CH3)3 Funkcins grups pavadinimas KarboksiKatrboksimetilSulfoSulfometilSulfopropilAminoetilDietilaminoetilTrimetilaminometilTrietilaminoetil-
Katijon main Agaroz (silpnai rgtinis Celiulioz Dekstranas Poliakrilatas Katijon main Celiulioz (stipriai rgtinis Dekstranas Polistirenas Anijon main Agaroz (silpnai bazinis) Celiulioz Dekstranas Polistirenas Anijon mian Celiulioz (stipriai bazinis) Dekstranas Polistirenas
Visus joninius neiklius charakterizuoja bendroji jonin talpa, kuri apibria galim pakeisti jon miliekvivalent skaiius vienam gramui sausojo neiklio arba hidratuoto neiklio vienam trio vienetui. Parenkant chromatografijai neikl, atsivelgiama tiriamo pavyzdio sand stabilum, santykin molekulin mas ir savituosius atskyrimo poreikius. Biologikai aktyvios mediagos, ypa baltyma ir fermentai, yra stabils tik siaurame pH intervale. Todl baltym chromatografijai parenkami jon main neikliai atranks tame pH intervale. Eliucijai parenkami tokie buferiai, kad pH bt artimas chromatografuojamo miinio izoelektriniam takui. Eliucijai naudojami to paties pH, bet skirtingos jon koncentracijos buferiai (gradientin eliucija), arba keiiamas buferio pH. 7.5.4. Molekuli iskyrimo chromatografija (gelchromatografija) Molekuli atskyrimas pagal j dyd ir form grindiamas molekulinio sieto principu: molekuls atskiriamos tam tikro skersmens (dydio) poras turiniais neikliais. Chromatografijos bdas, kai naudojamos gelins polimerins mediagos, vadinamas gelchromatografija arba gelfiltracija. is chromatografijos principas yra labai paprastas. Kolonl pripildoma porto stiklo ar gelio maj grdeli (mikrogranulmis), suspenduot judriosios fazs buferyje. Ant kolonls upilamas skirtingo dydio molekuli miinys. Didels molekuls i kolonls eliuojamos pirmiausia, nes jos nepatenka neiklio poras ir i kolonls istumiamos. Maesns molekuls pasiskirsto atitinkamo dydio gelio porose ir i kolonls eliuojamos, isisijoja pagal dyd viena paskui kit, 7.2 pav.
88 _________________________________
Judrioji faz
Judrioji faz
Granuls Didels tirpinio molekuls Maos tirpinio molekuls
Eliuatas
Eliuatas
7.2 pav.. Skirtingo dydio molekuli atskyrimas gelchromatografijos bdu
Gelchromatografijai naudojami neikliai pateikti 7.3 lentelje.

7.3 lentel. Pagrindiniai gelchromatografijos neikliai
Polimeras Dekstranas Prekybinis pavadinimas Sefadeksas (Sephadex) Atskiriam mediag molekulin mas1) Mm10-3 <0,7 1,05 1,430 380 4150 5600 5-250 101500 208000 104000 6020 000 7040 000 105000 4015000 10050 000 1000150 000 0,10,8 16 2,540 5100 60400
Dekstranas Agaroz Agaroz
Sefakrilas (Sephacryl) Sefaroz (Sepharose) Biogelis (Bio-Gel) Biogelis (Bio-Gel)
Poliakrilamidas
G-10 G-25 G-50 G-75 G-100 G-200 S-200 S-300 S-400 6B 4B 2B A5m A15m A50m A150m P2 P6 P30 P100 P300
1) nustatyta globuliniams baltymams, apytikriai vienoda viengrandms nuklorgtims bet maesn fibriliniams baltymams ir dvigrandms DNR
Gelchromatografijos taikymas: Gryninimas. Biologinms makromolekulms grynininti, atskirti nuo maesni ar didesni molekuli. Naudojant vairias porto stiklo grdelius ar skirtingus gelinius neiklius galima iskirti ir igryninti virusus, baltymus, fermentus, nukleorgtis, polisacharidus, antiknus. Molekulinei masei nustatyti. Globulini baltym eliucijos buferio tris priklauso nuo baltymo molekulins mass. Praleidus pro kolonl inomos molekulins mass baltymus ir imatavus j eliuato tr, galima sudaryti kalibrvimo kreiv nustatyti santykin neinomo baltymo molekulin mas. Tirpal koncentravimas Didels molekulins mass molekuli praskiesti tirpalai (pvz.. aktyvaus igryninto fermento preparatas) gali bti sukoncentruotas pridjus sauso, biraus sefadekso G25. Vanden ir maos molekulins mass molekules sugers sefadekso grdeliai, o didels molekuls liks tirpale Vliau gel paalinti centrifuguojant. Nudruskinimas Panaudojant sefadekso G10 ar G25 kolonles galima atskirti didels molekulins mass molekules nuo drusk, ir maos molekulins mass irimo (degradacijos) produkt. Nudruskinimo metodas yra daug greitesnis ir veiksmingesnis negu dializ. Taikant metod, galima paalinti fenolio priemaias i nukleorgi preparat, amonio sulfat po baltym isodinimo arba drusk pertekli po jon main chromatografijos. 7.5.5. Giminingumo (afinin) chromatografija is chromatografijos metodas buvo sukurtas fermentams i gamtini altini iskirti ir gryninti. Naudojant giminingumo chromatografij, galima gauti ypa. grynus fermento preparatus. Vliau is metodas pritaikytas nukleorgtims, imunoglobulinams, biologini membran receptoriams, atskiroms lstelms iskirti ir gryninti. Naudojant chromatografijos bd, reikia, kad iskiriamas i baltym miinio fermentas savitai susijungt su neiklio ligandu*. Eliuojant buferiu, i kolonls pirmiausia iteka visi neprisijung baltymai ar peptidai, t. y. nesavitos ligandui mediagos. Prisijungs prie ligando fermentas i kolonls iplaunamas keiiant eliucijos slygas. Naudojant nespecifin (nesavitj) eliucij, didinama buferio jonin jga arba keiiamas pH. Specifins (giminingumo) eliucijos atveju, eliucijos bufer dedama substrato arba fermento slopiklio (grtamojo), kurio giminingumas fermentui yra didesnis negu ligando. Tokiomis eliucijos slygomis nutraukiamas ligando ir fermento ryys, ir grynas fermentas iplaunamas nuo kolonls. (7.3. pav.)
*
Ligandas tai prie pildo prijungtas (imobilizuotas) junginys, savitai sveikaujantis su iskiriama makromolekule ar kita mediaga (7.3 pav.)
90 _________________________________
Imobilizuotas ligandas
Neiklis
Fermentas Afinin eliucija arba
Prie ligado prisijungs fermentas Nespecifin eliucija
Neiklis
Dializ
Optimali slyg atstatymas Igrynintas fermentas
7.3 pav. Fermento gryninimo schema naudojant giminingumo chromatografij
Giminingumo chromatografijai yra labai svarbu pasirinkti tinkam ligand. Reikia inoti iskiriamos mediagos savybes, t. y. su kokios chemins struktros junginiais ji sudaro savituosius ryius. Jei iskiriama mediaga sveikauja tik su vieninteliu ligandu, tai vadinama giminingumo (biospecifine) sveika, pvz., fermentas su kofermentu. Daniausiai naudojami ligandai giminingumo chromatografijai pateikiami 7.4 lentelje.
7 4 lentel. Giminingumo chromatografijos ligandai
Ligandas 5-AMP 25-ADP Kalmodulinas Avidinas Riebal rgtys Heparinas Baltymai A arba G Konkanavalinas A Soj lektinas Fenilboronatas PoliA Lizinas Cibachrono mlynasis F3G-A Giminingumas Nuo NAD+ priklausomos dehidrogenazs, kai kurios kinazs Nuo NADP+ priklausomos dehidrogenazs Kalmodulin prisijungiantys baltymai Baltymai, turintys biotino Baltymai, prisijungiantys riebal rgtis Lipoproteinai, lipazs, DNR polimerazs, augimo faktoriai, serino proteazi (peptidazi) slopikliai Imunoglobulinai Glikoproteinai, turintys a-D-gliukopiranozilo liekanas Glikoproteinai, turintys N-acetil--( arba )galaktopiranozilo liekanas Glikoproteinai RNR saviti baltymai arba RNR, turinios poli U sekas rRNR Baltymai, prisijungiantys nukleotidus, koaguliacijos veiksniai
7.6. Aminorgi ir nukleotid nustatymas

7.6.1. Plonasluoksn chromatografija
Reagentai ir mediagos 1. Plonasluoksn chromatografin ploktel. 2. Aminorgi tirpalai ( 1% , po 1 ml.). 3. Nukleozid ir nukleotid tirpalai ( 1% , po 1 ml.). 4. mikrovirktas arba stikliniai kapiliarai. 5. 0,1% ninhidrino tirpalas acetone. 6. Chromatografin tirpikli sistema izopropilo alkoholis: konc. amoniakas: H2O, v/v (7:1:2). 7. Chromatografinis cilindriukas. 8. Chromatoskopas (prietaisas, turintis UV lemp). Darbo eiga 1. Paimama chromatografin ploktel ir 0,51,0 cm atstumu nuo krato nubriama starto linija (7.4. pav.). 2. Ant jos 1 2 cm nuotoliu vienas nuo kito stikliniu kapiliaru arba mikrovirktu ( po 23 l) ulainami tiriam mediag mginiai. Tai gali bti aminorgtys, nukleotidai, nukleozidai ir neinoma mediaga. Palaukiama kol dms idista. 3. Chromatografin ploktel dedama chromatografin ind turint tirpikli sistem. Tirpiklio pilama chromatografinio indo dugn tik tiek, kad simerkt ploktels kratas, bet tirpiklis nesiekt starto linijos. 4. Chromatografija atliekama 11,5 val., paskui ploktel iimama, paymima fronto linija, t. y. vieta, iki kurios sudrkusi ploktel. Ploktel idiovinama traukos spintoje. 5. Ploktelse aminorgi susitelkimo vietos nustatomos, apipurkiant 0,1-0,2% acetoniniu ninhidrino tirpalu. Nukleozidai ir nukleotidai nustatomi apvieiant chromatogratografin ploktel UV viesa. ie junginiai sugeria UV vies, todl chromatogramoje nukleozid ar nukleotid susitelkimo vietose matomos tamsios dms. 6. Imatuojami a ir b nuotoliai (cm) ir apskaiiuojami pasiskirstymo koeficientai Rf. Pasiskirstymo koeficientas, tai : a. Rf= a/b Atstumas a nuo starto linijos iki dms centro Atstumas bnuo starto linijos iki fronto linijos
92 _________________________________
frontas
startas
7.4 pav. Plonasluoksns chromatografins ploktels paruoimas
7. Palyginus inom ir tiriam mediag pasiskirstymo koeficientus, sprendiama, kokios neinomos mediagos buvo paimtos. 7.6.2. Ratin popieriaus chromatografija Reagentai ir prietaisai 1. Chromatografinis popierius. 2. Aminorgi tirpalai (1% , po 1 ml.). 3. Nukleozid ir nukleotid tirpalai (1% , po 1 ml.). 4. 0,1% ninhidrino tirpalas acetone. 5. Petri lktel. 6. Mikrovirktas arba stikliniai kapiliarai. 7. Chromatografin sistema izopropilo alkoholis: konc. amoniakas : H2O, v/v (7:1:2). Darbo eiga 1. Ant chromatografinio popieriaus udedama Petri lktel, aplink j pietuku apibriamas skritulys ir ikerpamas. io skritulio centre pietuku nubriamas 1 cm spindulio apskritimas ir nuo skritulio krato iki jo centro kerpama 1 cm ploio juosta (7.5 pav.). Ji naudojama kaip dagtis, merkti chromatografin sistem. 2. Centrinis apskritimas yra starto linija, ant kurios vienodu nuotoliu viena nuo kitos kapiliaru arba mikrovirktu ulainamos aminorgtys (kontrolinai takai) ir alia tiriama mediaga. Kiekvienos mediagos lainama po 2-3 l tak. Btina ulainti ypa maais laeliais ir palaukti, kol tos mediagos laelis idius.
3. Ulainus visus mginius, chromatografinio popieriaus skritulys udedamas ant Petri lktels, kuri pilta chromatografins tirpikli sistemos. Skritulys turi laikytis ant Petri lktels krat, o dagtis mirkti chromatografin sistem. 4. Taip paruota chromatograma udengiama dangteliu ir paliekama 1,5-2 val., kol tirpiklio frontas pasiekia popieriaus 7.5 pav. Ratins chromatogramos krat. paruoimas 5. Tada chromatograma iimama, paymima fronto linija (sudrkusios chromatogramos krato linija), idiovinama traukos spintoje ir apipurkiama 0,1-0,2% ninhidrino tirpalu (jei ulaintos aminorgtys). Ninhidrin reikia purkti atsargiai, geriausiai usimovus gumines pirtines, nes ninhidrinas irykins ne tik ant chromatogramos esanias aminorgtis, bet ir pirtus nudays violetine spalva. 6. Apipurkta chromatograma palaikoma 10 min. diovinimo spintoje, aminorgi susitelkimo vietose irykja violetins dms. 7. Pamatuojami a ir b nuotoliai (cm) ir apskaiiuojami pasiskirstymo koeficientai Rf. Pasiskirstymo koeficientas, tai: Rf= a/b Nuotolis a nuo starto linijos iki dms centro Nuotolis bnuo starto linijos iki fronto linijos is koeficientas taip pat apskaiiuojamas ir neinomos aminorgties. Palyginus visus koeficientus, sprendiama, kokios buvo neinomos aminorgtys. 7.6.3. Kylamoji chromatografija Reagentai ir prietaisai 1. Chromatografinis popierius. 2. Tam tikr aminorgi tirpalai ( 1% , po 1 ml). 3. Nukleozid ir nukleotid tirpalai ( 1% , po 1 ml). 4. Mikrovirktas arba stikliniai kapiliarai. 5. 0,1% ninhidrino tirpalas acetone. 6. Chromatografin sistema izopropilo alkoholis: konc. amoniakas : H2O, v/v (7:1:2).
94 _________________________________
7. Chromatografinis cilindras. 8. Chromatoskopas (prietaisas turintis UV lemp). Darbo eiga 17. Kylamoji popieriaus chromatograma paruoiama panaiai kaip chromatografin ploktel, tik naudojamas chromatografinis popierius. a. Ant chromatografinio popieriaus lapo (3030cm) 3 cm nuotoliu nuo krato nubriama starto linija. b. Ant jos 2 5cm atstumu viena po kitos stikliniu kapiliaru arba mikrovirktu (5 10l) ulainama tiriam mediag tirpal. Tai gali bti aminorgtys, nukleotidai, nukleozidai ir neinoma mediaga. c. Palaukiama kol dms idista, vliau chromatografinis popierius susukamas ir susegamas cilindr, dedamas chromatografin ind, turint tirpikli sistem. Tirpiklio pilama indo dugn tik tiek, kad simerkt chromatografinio popieriaus kratas, bet tirpiklis nesiekt starto linijos. d. Chromatografija atliekama 12-18 val., paskui chromatograma iimama, paymima fronto linija, idiovinama kambario temperatroje traukos spintoje. e. Popieriaus chromatogramose aminorgi susitelkimo vietos nustatomos, apipurkiant chromatogram 0,1% acetoniniu ninhidrino tirpalu. Nukleozidai ir nukleotidai chromatogramoje nustatomi apvieiant chromatogram UV viesa, nes ie junginiai sugeria UV vies, todl chromatogramoje nukleozid ar nukleotid susitelkimo vietose yra tamsios dms. f. Apskaiiuojami Rf pasiskirstymo koeficientai. i. Rf= a/b Nuotolis a nuo starto linijos iki dms centro Nuotolis b nuo starto linijos iki fronto linijos Palyginus inom ir tiriam mediag pasiskirstymo koeficientus, sprendiama, kokios neinomos mediagos buvo ulaintos ant popieriaus chromatogramos. Skirting aminorgi, nukleotid ar nukleozid pasiskirstymo koeficientas Rf, nra vienodas Jis priklauso nuo tiriam mediag struktros ir chromatografijos slyg: tirpikli sistemos, temperatros, popieriaus ries. Nusileidiamoji chromatografija yra analogika kylamajai, tik popieriaus laktas chromatografiniame inde dedamas emyn galva, t. y. pritvirtinamas taip, kad tirpiklis popieriumi teka emyn, o ne kyla vir. i chromatografija vyksta iek tiek greiiau, nei kylamoji, bet mediag pasiskirstymo principas yra toks pat.
7.7. Mlynojo dekstrano nudruskinimas gelchromatografijos metodu

Gelchromatografija grindiamai molekuli isijojimo pricipu, kuriam naudojamos polimerins gelins mediagos, turinios skirtingo dydio poras (7.5.4.sk). Darbo tikslas: gelchromatografijos bdu nudruskinti mlynojo dekstrano preparat. Reagentai ir prietaisai: 1. Ibrinkintas sefadeksas G10, G25 ar kitas gelfiltracijai tinkamas neiklis. 2. K2Cr2O7 (druska). 3. Mlynasis dekstranas (polisacharidas, kurio molekulin mas 2106 Da.). 4. Kolonl. 5. Mgintuvliai. 6. Fotoelektrokolorimetras arba spektrofotometras. Darbo eiga 7.7.1. Kolonls pildymas 1. Apatinis kolonls galas (jei nra stiklo tarpins) ukemamas stiklo vatos gumulliu taip, kad pro j galt tekti vanduo, bet nepraleist maj sorbento grdeli. 2. Kolonl tiksliai staiai tvirtinama stove, ir atsargiai pilant ibrinkinto neiklio suspensij pripildoma (7.6 pav.).
Vanduo arba buferis
0,5 cm
12 cm
Sefadekas
Vatos arba stiklo pluoto kamtis Kolonls spaustuka
7.6 pav. Gelchromatografijos (gelfiltracijos) kolonl
96 _________________________________
3. Pilant neiklio suspensij, kolonls spaustuvas turi bti atidarytas, kad pratekt vanduo., taiau reikia stebti, kad vir neiklio kolonlje visada bt apie 0,5 cm vandens sluoksnis (kolonlje neiklis negali bti sausas). 4. Pripildius kolonl, spaustukas uspaudiamas. 7.7.2. Pavyzdio paruoimas ir upylimas ant kolonls 1. Paruoiamas tokios sudties tirpalas: 1 ml 5% K2Cr2O7, kuriame itirpinamas mlynasis dekstranas. Dekstrano koncentracija miinyje turi bti 0,5% (gaunamas spalvotas miinys). 2. Prie lainant mediag miin ant kolonls, reikia kolonls spaustuv ltai atsukti, kad vanduo nuo neiklio pavirius nutekt ir likt tik minimalus sluoksnis. 3. Tada, ant neiklio paviriaus pagal kolonls sienel automatine pipete upilama 1 ml paruoto spalvoto mediag miinio (nesuplakti ir nepaeisti neiklio sluoksnio). is miinys turi susigerti neikl. Neleiskite iditi kolonlei! 4. Chromatografuojamam miiniui susigrus, ant kolonls atsargai pilamas vanduo. ioje chromatografijoje vanduo (judrioji faz), tekdamas pro neikl (nuostovioji faz) eliuoja upiltas mediagas. 5. Pratekant tirpal, maais triais frakcijomis (po 2 3 ml) galima surinkti atskirus graduotus mgintuvlius ir pamatuoti frakcij sugert fotoelektrokolorimetru (FEK) arba spektrofotometru. 6. Frakcijas, kuriose yra K2Cr2O7 (geltonos/oranins spalvos ) matuojamos Nr.4 filtru, o mlynos spalvos (dekstrano ) frakcijos Nr.7.filtru Spektrofotometru matuojama, atitinkamai, kai 440 nm ir 590 nm. 7. Remiantis matavim duomenis, nubraiomas sugerties priklausomumo nuo pratekjusio vandens trio grafikas.
7.8. Hemoglobino molekulins mass nustatymas gelchromatografijos bdu

Biochemini tyrim metu molekulin baltym mas galima nustatyti gelchromatografijos (7.5.4. sk), NDSPAGE elektroforezs ( xxx sk.) ir ultracentrifugavimo tankio gradientu metodais. Gelchromatografijos metodu baltym molekuls frakcionuojamos atsivelgiant dyd, todel galima nustatyti apytikri molekulin mas. Oligomeriniai baltymai gelchromatografijoje neisiskiria atskirus subvienetus, todl nustatoma bendra oligomerinio baltymo molekulin mas. NDS elektroforezs (elektroforez denatravimo slygomis) bdu frakcionuojant baltymus, oligomeriniai baltymai denatruoja ir gelyje matomi atskiri polipeptidai (baltymo subvienetai).
io darbo metu, naudojant sefadekso G75 kolonl nustatoma molekulin hemoglobino mas. Molekulin mas apskaiiuojama i (1) formuls: lgM = 5,624 0,752 Ve/Vo, (1)
M molekulin mas; Ve eliuato tris, kuriame i kolonls iteka hemoglobinas; Vo tarpgrdelinis arba laisvasis kolonls tris. Konstantos 5,624 ir 0,752 nustatytos bandymais. Norint nustatyti Vo, kolonl pilamas maas kiekis didels molekulins mass mediagos tirpalo. Vliau kolonle leidiamas eliuentas. Eliuato tris, kuriame i kolonls iteka didels molekulins mass mediaga, ir yra tarpgrdelinis tris Vo. iam tikslui daniausiai yra naudojamas mlynasis dekstranas, kurio molekulin mas 2106 Da. Reagentai ir prietaisai 1. 0,1 M NaCl turinti 0,02% NaN3 500 ml. 2. 1% hemoglobino tirpalas 0,1 M NaCl, turintis 0,02% NaN3 1 ml. Prie naudojim tirpal centrifuguoti 5 min staline centrifuga. 3. 1% mlynojo dekstrano tirpalas 0,1 M NaCl, turinio 0,02% NaN3 1 ml. Prie naudojim tirpal centrifuguoti 5 min. staline centrifuga. 4. 13,5 cm3 trio kolonl, pripildyta sefadekso G75 ir praplauta 0,1M NaCl tirpalu turiniu 0,02% NaN3. Darbo eiga: 7.8.1. Sefadekso G75kolonls V o nustatymas: 1. Atspaudiamas kolonls spaustukas ir nuleidiamas i kolonls tirpalas, esantis vir neiklio taip, kad pavirius nebt sausas.. Vliau spaustukas uspaudiamas. 2. Ant gelio paviriaus atsargiai pagal kolonls sienel pilama 0,2 0,5 ml centrifuguoto mlynojo dekstrano tirpalo ir atspaudimas kolonls spaustukas; leidiama mlynajam dekstrano tirpalui susigerti kolonlje esant neikl. 3. Kai tik mlynasis dekstranas siskverbia neikl, atsargiai pipete pagal kolonls sienel pilamas eliucijos tirpalas (0,1 M NaCl su 0,02% NaN3) tokiu bdu i kolonls eliuojamas dekstranas. Itekantis i kolonls nespalvotas eliuatas surenkamas 10 ml trio matavimo cilindr arba graduot mgintuvl. Kai eliucijos metu i kolonls pradeda tekti mlynas tirpalas, jis surenkamas atskirus mgintuvlius labai maomis frakcijomis po 5 laus. 4. Eliuatas i i mgintuvli (pradedant nuo pirmosios frakcijos ir baigiant mgintuvliu , turiniu pai rykiausi spalv (spalvos rykum galima nustatyti matuojant spektrofotometru, 670 nm)*, supilamas matavimo cilindr,
*
Matavimui mginiai paruoiami tokiu bdu: i mgintuvli, kuri eliuato spalvos rykumas bus matuojamas, paimama po 100 l eliuato, supilama atskirus mgintuvlius ir pridedama po 1ml vandens. Matuoti esant 670 nm arba 440 nm.
98 _________________________________
kur yra surinktas nespalvotas eliuatas. Tos eliuato frakcijos, kuri spalvos rykumas pradeda silpnti, neskaitomos. Eliuato tris ml, kuris surinktas nuo eliucijos pradios iki rykiausios frakcijos, ir yra tarpgrdelinis arba laisvasis kolonls tris Vo. 7.8.2. Sefadekso G75kolonls V e nustatymas: 1. Kartojamas Vo nustatymo atveju apraytas bandymas, tik vietoje mlynojo dekstrano kolonl pilama 0,5 ml centrifuguoto 1% hemoglobino tirpalo. Eliuato tris, surinktas nuo bandymo pradios iki frakcijos, turinios rykiausi roin spalv, yra Ve. (Spalvos rykum galima nustatyti matuojant spektrofotometru, 440 nm)x 2. Apskaiiuojama hemoglobino molekulin mas i (1) formuls. 3. Baigus darb, kolonl plaunama 0,1 M NaCl, turiniu 0,02% NaN3 tirpalo ir saugoma uspaudus spaustuk. Vir neiklio paviriaus turi bti apie 1 cm aukio skysio stulpelis. Literatra
1. Principles and Techniques of Practical Biochemistry, (2003), Cambridge Univ. press, p.619689 2. .. , (1985), , , p.145154.
Matavimui mginiai paruoiami tokiu bdu: i mgintuvli, kuri eliuato spalvos rykumas bus matuojamas, paimama po 100 l eliuato, supilama atskirus mgintuvlius ir pridedama po 1ml vandens. Matuoti esant 670 nm arba 440 nm.
8. Saugaus darbo biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls ________________________ 1. Baltym elektroforez ____________________________________________________________ 99
8 . Baltym elektroforez
Elektroforezs metu krautos molekuls juda elektriniame lauke. is metodas labai plaiai taikomas biomolekulms atskirti ir apibdinti. kraut molekuli judrumas elektriniame lauke priklauso nuo j dydio ir formos, krvio ir chemins prigimties. Biologini makromolekuli (baltym, nukleorgi) elektroforez daniausiai yra atliekama buferiais prisotintuose geliuose (poliakrilamido, agarozs). Molekuli judrumas tokiuose geliuose priklauso nuo elektrinio lauko stiprumo ir gelio por dydio. Elektroforezs metu galima frakcionuoti molekuli miinius, nustatyti tiriamos mediagos grynum, suinoti molekulines baltym mases. Elektroforez galima atlikti gulsiose arba staiose geli ploktelse. Ji bna vienkrypt ir dvikrypt. Dvikrypts elektroforezs metu i pradi baltymai yra atskiriami izoelektrinio fokusavimo bdu.Toliau toje paioje gelio ploktelje, statmenai pirmai krypiai, atliekama elektroforez. Atliekant dvikrypt elektroforez, galima suinoti ne tik baltym molekuli dyd, bet ir j krv. Dvikrypt elektroforez yra galingas metodas sudtingiems baltym miiniams frakcionuoti ir plaiai taikomas proteomikoje. Atlikus vienkrypt ar dvikrypt baltym elektroforez ir elektroeliucijos ar elektroperneimo bdais perklus juos ant polibrenu (heksadimetrinbromidas) aptraukt stiklo pluoto lapeli arba polivinilidendifluorido (PVDF) membranini filtr, galima nustatyti norim baltym aminorgi sekas. ie metodai yra suderinami su aminorgi sek nustatymu dujins fazs baltym sekoskaiiais (sekvenatoriais). Baltym elektroforez gali bti nenutrkstamoji ir nutrkstamoji. Nenutrkstamosios elektroforezs metu elektriniame lauke nagrinjamos molekuls juda gelyje, prisotintame tam tikros koncentracijos ir pH buferio. Baltymams atskirti daniausiai taikomas nutrkstamas gelelektroforezs metodas, 1970 m. apraytas Lemli.
Elektrodas Virutin talpykla
ulinliai baltymams pilti
Elektrodas
Atrama Apatin stiklams talpykla
Tarpins
8.1 pav. Statusis baltym elektroforezs aparatas
100 _________________________________
Nutrkstamos elektroforezs metu baltym molekuls i pradi juda koncentruojamuoju geliu, turiniu dideles poras ir vliau pereina gel, turint daug maesnes poras. Nutrkstamos elektroforezs metu baltym miinys yra sukoncentruojamas siaur juostel, todl ulinlius galima pilti ir daugiau praskiestus baltym tirpalus negu nenutrkstamos elektroforezs atveju. Koncentruojamasis ir skiriamasis geliai yra prisotinami skirtingos koncentracijos ir pH buferiais. iuose geliuose gaunamas ir skirtingas tampos gradientas. Koncentruojamajame gelyje esaniame buferyje yra chloro jon (pagrindiniai), kuri elektroforezinis judris yra daug didesnis u baltym molekuli judr. Elektroforezs buferyje yra glicino jon (atsiliekantieji), kuri elektroforezinis judris yra maesnis u baltym molekuli judr. Elektroforezs metu greitai judantys jonai palieka mao laidumo srit, esani tarp j pai ir judani baltym molekuli, ir ioje srityje padidjusi tampa veria baltym molekules greiiau judti. Tokiu bdu srityje tarp pagrindini ir atsiliekanij jon, judani baltym molekuls yra sukoncentruojamos siaur juostel, kuria eina skiriamj gel. Palyginti su koncentruojamuoju geliu, skiriamojo gelio poros yra maos, ten esanio buferio koncentracija ir pH reikm yra didesn. iame gelyje glicino (atsiliekantieji) jonai juda tuoj pat u baltym molekuli ir baltym judrumas gelyje priklauso tik nuo j molekuli dydio (denatravimo slygomis) arba molekuli formos, dydio ir krvio (nedenatravimo slygomis). Nedenatruojantys geliai yra naudojami gimtiems baltymams iskirti ir tirti. Prie elektroforez denatravimo slygomis baltymai veikiami maos molekulins mass merkapto junginiais (2-merkaptoetanoliu ar ditiotreitoliu) ir natrio dodecilsulfatu (NDS), kaitinant verdanio vandens vonioje. Merkapto junginiai redukuoja disulfidinius tiltelius, esanius baltymo molekulje. Dl hidrofobins sveikos natrio dodecilsulfatas prisijungia prie denatravusi polipeptid. Daugumai baltym 1,4 mg natrio dodecilsulfato prisijungia prie 1 mg baltymo. Disociavusi sulfogrupi perteklius suteikia polipeptidams didel neigiamj krv. Daugumai baltym neigiamo krvio dydio ir baltymo mass santykis yra pastovus. Dl atostmio jg tarp neigiamai kraut disociavusi dodecilsulfato liekan polipeptido grandin gauna elipsoido form. io elipsoido dydis priklauso nuo polipeptido grandins ilgio. Elektroforezs metu dodecilsulfato ir polipeptid kompleks judjimo greiiai poliakrilamido gelyje priklauso tik nuo j dydi. Baltym molekuls atsiskiria poliakrilamido gelyje, turiniame 515 % akrilamido ir 0,20,5 % N,N- metilenbisakrilamido. iomis slygomis yra stebima tiesin priklausomyb tarp santykinio baltym molekuli elektroforezinio judrio ir j molekulini masi logaritmo (8.2 pav.).
8. Saugaus darbo biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls ________________________ 1. Baltym elektroforez ___________________________________________________________ 101
Molekulin mas (103)
Santykinis judris (Rf)
8.2 pav. Tipikas kalibracinis grafikas, nubrtas atlikus inomos molekulins mass prastini baltym nutrkstam elektroforez denatravimo slygomis. (A)-7 % poliakrilamido gelis, (B)-11 % poliakrilamido gelis.
8.1. Elektra ir elektroforez

Reikia inoti, kad elektros srovs stiprumas ir tampa, kuri yra sukuriama elektroforezs metu, yra pavojinga mogaus gyvybei. Taigi dirbant privalu laikytis saugaus darbo taisykli: 1. Elektroforezs aparato apsaugin dangtel galima udti arba nuimti tik tuomet, kai maitinimo altinis yra ijungtas. Niekada abiejomis rankomis neudkite ir nenuimkite elektroforezs aparato apsauginio dangtelio, nes gali susidaryti potencialiai mirtina elektros grandin (per abi rankas krtins lsta ir irdis susijungia su neizoliuotais laidais). Prie darb patikrinkite visus laidus ir jungtis. Atspurusius ir paeistus laidus pakeiskite naujais. 2. sitikinkite, kad prie elektroforez maitinimo altinio miliampermetras ir voltmetras nustatyti ties nulinmis padalomis. Pradedant elektroforez, nustatoma reikiama tampa, srovs stiprumas ar elektrinio lauko galia. Baigus elektroforez, maitinimo altinio miliampermetras ir voltmetras vl nustatomi ties nulinmis padalomis ir tik tuomet jis ijungiamas ir nuimamas apsauginis elektroforezs aparato dangtelis. Dmesio! Niekada po elektroforezs neatjunkite aparato nuo maitinimo altinio prie tai jo neijung, nes tuomet ijungtame maitinimo altinyje ilg laik pasilieka gana dideli kiekiai elektros krvi. Prisilietus prie tokio ijungto maitinimo altinio ijimo lizd galima gauti elektros smg.
102 _________________________________
8.2. Omo dsnis ir elektroforez

Norint suprasti, kaip veikia gelelektroforezs aparatas, reikia prisiminti Omo dsn: tampa (V) = srovs stiprumas (I) vara (R), arba V = IR. Elektros grandinje poliakrilamido gel galima vertinti kaip tam tikr var, o maitinimo altin kaip elektros srovs tiektuv. Dauguma maitinimo altini elektroforezs metu gali palaikyti grandinje arba pastov elektros srovs stiprum, arba tamp. Kai kurie altiniai gali palaikyti pastov elektrinio lauko galingum: galingumas = tampa srovs stiprumas, arba VI = I2R. Vienkryptje staioje gelelektroforezs sistemoje daniausiai katodas dedamas virutinje elektrodinio buferio talpykloje, o anodas apatinje. Tai vadinamoji anijonin sistema, kurioje neigiamai krautos baltym ar nukleorgi molekuls juda anodo link, esanio apatinje elektrodinio buferio talpykloje. Baltym NDS-poliakrilamidin gelelektroforez (NDS-PAGE) yra anijonin sistema, nes natrio dodecilsulfatas turi neigiamj krv ir sudaro junginius su baltymais. Kartais baltym elektroforez yra atliekama katijoninje sistemoje. ioje sistemoje baltym molekuls krautos teigiamai. Tai pasiekiama naudojant rgtinius buferius (pvz. acto rgties/karbamido buferiai histonams atskirti) arba katijoninius ploviklius (pvz, cetiltrimetilamonio bromidas, CTAB). Katijonins elektroforezs sistemos elektrod padtis yra prieinga negu anijonins sistemos. Baltym NDS-PAGE daniausiai atliekama esant nekintamam elektros srovs stiprumui. Standartinje Lemli sistemoje NDS-PAGE metu gelio vara didja. Jeigu yra palaikomas nekintamas elektros srovs stiprumas, tuomet turi didti tampa. Danai maitinimo altiniai turi daugiau negu vien por ijimo lizd. ios lizd poros lygiagreiai sujungtos tarpusavyje. Jeigu daugiau negu vienas gelelektroforezs aparatas yra tiesiogiai prijungtas prie i lizd, tai geliai yra sujungti lygiagreiai (8.3 pav.). Tuomet tampa kiekviename gelyje yra vienoda. Kitais odiais tariant, jeigu maitinimo altinyje yra nustatyta 100 V tampa, tai ir kiekviename gelyje tarp elektrod yra 100 V. Taiau bendras elektros srovs stiprumas yra lygus sumai srovi stiprum, esani kiekviename gelyje. Kelis gelelektroforezs aparatus galima prijungti ir prie vienos maitinimo altinio ijimo lizd poros. Tuomet elektroforezs aparatai yra sujungiami tarpusavyje. Tam tikrus gelius galima sujungti lygiagreiai arba nuosekliai (8.3 pav.). Jeigu keli geliai yra prijungti prie tos paios ijimo lizdo poros nuosekliai, tai elektros srovs stiprumas kiekviename gelyje yra lygus bendram srovs stiprumui. Pavyzdiui, jeigu maitinimo altinio miliampermetras rodo 10 mA, tai kiekviename gelyje irgi teka 10 mA srov. Taiau iuo atveju bendra tampa yra lygi sumai tamp, esani kiekviename gelyje. Pavyzdiui, jeigu esant pastoviam elektros srovs stiprumui 10 mA viename gelyje yra 100 V tampa, tai du vienodi geliai, sujungti nuosekliai, sukels 200 V (100 V kiekvienas).
8.3 pav. Gelelektroforezs aparat prijungimo prie maitinimo altinio bdai
Jeigu turime emosios tampos maitinimo altin, tai tampos dydis apibria galimyb sujungti nuosekliai daugiau gelelektroforezs aparat. Poliakrilamido gelio storis taip pat turi reikms santykiui tarp elektros srovs stiprumo ir tampos. 1,5 mm storio gel galima vertinti kaip du 0,75 mm storio gelius, sujungtus lygiagreiai. iuo atveju srovs stiprumas sumuojasi, todl norint pasiekti t pai pradin tamp ir elektroforezs laik, 0,75 mm storio geliui reiks perpus maesnio elektros srovs stiprumo negu 1,5 mm storio geliui. Jeigu gelio storis padvigubja, tai ir srovs stiprumas turi bti padvigubintas. Elektroforezei storuose geliuose yra reikalingos didels srovs. Dl ios prieasties elektroforezs metu geliai kaista. Isiskyrusi iluma blogina baltym elektroforezs skiriamj gali. Tokie gelelektroforezs aparatai privalo turti auinimo sistemas.
8.3. Vienkrypt staioji nutrkstamoji baltym gelelektroforez denatravimo slygomis (atsivelgiant Lemli)
Gelelektroforezs metu baltym molekuli judjimo greitis poliakrilamido gelyje priklauso nuo elektrinio lauko stiprumo ir gelio por dydio (didinant akrilamido koncentracij poros maja). Daniausiai nutrkstamoji baltym NDS-poliakrilamidin gelelektroforez yra atliekama taikant standartin Lemli pasilyt metodik. Yra ir kit alternatyvi elektroforezs metod, daniausiai taikom savitiems tikslams pasiekti (pvz., peptidams ar maiems baltymams atskirti). Vienkryptje gelelektroforezje denatravimo slygomis (esant 0,1 % natrio dodecilsulfato) baltym molekuls elektriniame lauke poliakrilamido gelyje juda anodo link ir atsiskiria tai priklauso nuo molekulins j mass (8.2 pav.). Nutrkstamosios baltym elektroforezs metu elektroforezs aparate
104 _________________________________
yra paruoiamas skiriamasis poliakrilamido gelis, ant kurio viraus polimerinamas koncentruojamasis poliakrilamido gelis, turintis ulinlius pavyzdiams pilti. Prie pilant baltymus ulinlius, jie denatruojami, pridjus mginius natrio dodecilsulfato ir 2-merkaptoetanolio arba ditiotreitolio ir laikant verdaniame vandenyje. Staioji baltym elektroforez yra atliekama tam tikro dydio poliakrilamido gelio ploktelse. Daniausiai jos bna apie 1414 cm dydio. Yra naudojamos ir maesns ploktels (68 cm). Tokie geliai vadinami minigeliais. Baltym atskyrimo geba minigeliuose yra maesn negu didesniuose geliuose, taiau elektroforezei reikia maiau reagent ir baltymus galima atskirti per trumpesn laik. 8.3.1. Poliakrilamido gelio paruoimas
Poliakrilamido gelis susidaro polimerizuojant akrilamid. Linijins poliakrilamido grandins yra skersai sujungiamos N,N/-metilenbisakrilamidu. Polimerizacijos reakcija sukeliama amonio peroksosulfatu, o TEMED (tetrametiletilendiaminas) yra ios reakcijos katalizatorius (8.3 pav.). Renkantis skiriamojo gelio akrilamido koncentracij atsivelgiama atskiriam baltym molekulini masi dyd. Rekomenduojamas 5 % gelis atskirti denatruotus baltymus 60200 kDa, 10 % gelis: 1670 kDa ir 15 % gelis: 1245 kDa (8.1 lentel).
8.3 pav. Akrilamido ir N,N-metilenbisakrilamido kopolimerizacijos reakcija
8.1 lentel. Skiriamojo poliakrilamido gelio paruoimas

5 30 % akrilamidas/0,8 % 2,5 metilenbisakrilamidas 4 TRISHCl/NDS buferis 3,75 pH 8,8 H2O 8,75 10 % (svoris/tris) amonio 0,05 peroksosulfatas TEMED
a b
Pradiniai tirpalai
6 3,00 3,75 8,25 0,05 0,01
Galutin akrilamido koncentracija skiriamajame gelyje (%) b 7 7,5 8 9 10 12 13 15 3,50 3,75 4,00 4,50 5,00 6,00 6,50 7,5 3,75 7,75 0,05 0,01 3,75 7,50 0,05 0,01 3,75 7,25 0,05 0,01 3,75 6,75 0,05 0,01 3,75 6,25 0,05 0,01 3,75 5,25 0,05 0,01 3,75 4,75 0,05 0,01 3,75 3,75 0,05 0,01
0,01
15 ml skiriamajam geliui paruoti (pakanka 0,75 mm 14 cm 14 cm gelio ploktelei). Lentelje nurodyti skaiiai reikia atitinkam tirpal trius, ireiktus ml. Akrilamido koncentracija skiriamajame gelyje pasirenkama atsivelgiant atskiriam baltym molekulini masi dyd.
Skiriamasis poliakrilamido gelis polimerinamas tarp stikl elektroforezs aparato gardelje. Polimerizacijos reakcija kambario temperatros slygomis atliekama per 3060 min. Ant susidariusio skiriamojo gelio viraus polimerinamas stambiaporis (34 %) koncentruojamasis poliakrilamido gelis. Jame padaromi ulinliai, baltym pavyzdiams pilti. Paruous skiriamj ir koncentruojamj gelius, stiklai su geliais statomi elektroforezs aparat. virutin ir apatin aparato talpyklas pripilama elektroforezs buferio. Buferis turi pripildyti koncentruojamajame gelyje esanius ulinlius (virutinje talpykloje) ir skalauti skiriamojo gelio apai (apatinje talpykloje). Reikia sitikinti, ar buferis neiteka i virutins talpyklos. 8.3.2. Baltym paruoimas elektroforezei ir j pilimas koncentruojamojo gelio ulinlius Baltymai denatruojami, pripilant natrio dodecilsulfato tirpalo ir 2-merkaptoetanolio ar ditiotreitolio. Miinys kaitinamas verdanio vandens vonioje. Jeigu po elektroforezs baltymai bus nustatomi daant Coomassie mliu, tai 0,8 cm ploio ulinl rekomenduojama pilti 2550 g baltymo < 20 l tryje (kai miinyje yra daug skirting baltym) ir 110 g (kai miinyje yra vienas arba keli skirtingi baltymai). Jeigu po elektroforezs bus daoma sidabru, tuomet ulinl reikia pilti 10100 kart maiau baltymo (0,015 g < 20 l tryje, atsivelgiant baltym miinio sudt). Rekomenduojama, prie pripilant denatruojamj agent, baltym tirpalus laikyti 0C temperatros slygomis ir denatruojamj agent tirpalus (kambario temperatros) pripilti leduose esant 1,5 ml plastikin mgintuvl, turint baltym miinio. Kad negaruot, mgintuvl reikia dengti dangteliu, miin sumaiyti skurine
106 _________________________________
purtykle ir nedelsiant dti 35 min. verdanio vandens voni. Negalima kambario temperatros slygomis ilgai laikyti baltym kartu su denatruojamaisiais agentais, nes prie kaitinim 1000C temperatra, tokioje terpje ypa aktyvios endogenins peptidazs, kurios gali suardyti miinyje esanius tiriamus baltymus. Be denatruojamj agent, tiriam baltym preparatuose dar yra glicerolio ~ 10 % (trio) ir bromfenolio mlynojo. virktu, turiniu tiesiai nupjaut adat, ulinlius pilami paruoti baltym pavyzdiai. Baltym pavyzdi tirpalai yra klamps, todl jie plonu sluoksniu usluoksniuojami ant ulinli dugno. nepanaudotus ulinlius pilama vien tik baltymus denatruojanio (pavyzdio) buferio. Tai apsaugo nuo baltym plitimo aplinkinius tuius (be baltym) ulinlius. kontrolinius ulinlius taip pat pilama denatruot standartini (inomos molekulins mass) baltym miinio (r. Pried). Jau paruotus standartini baltym miinius gamina komercins firmos. 8.3.3. Elektroforezs aparato jungimas elektros srovs altin Supylus ulinlius baltym pavyzdius, elektroforezs aparatas prijungiamas prie pastoviosios elektros srovs altinio 0,75 mm storio geliams nustatoma 10 mA stiprumo srov. Kai bromfenolio mlynojo daas eina skiriamj gel, srovs stiprumas padidinamas iki 15 mA. Dmesio! Standartiniame 16 cm ilgio ir 0,75 mm storio gelyje, esant 4 mA elektros srovs stiprumui, elektroforez vyksta ~ 15 val. Jei srovs stiprumas 15 mA ~ 45 val. Vienu aparatu atliekant dviej geli elektroforez, arba vieno 1,5 mm storio gelio, srovs stiprumas padvigubinamas. Atliekant 1,5 mm gelio storio elektroforez ir nustaius 30 mA srovs stiprum, 10o20oC temperatra turi bti palaikoma termostatu, cirkuliuojant pastoviosios temperatros vandeniui. Esant didelei temperatrai, gelyje judanios baltym sritys isipleia ir isikraipo. Negalima atlikti elektroforezs, esant < 5oC temperatrai, nes buferiniuose tirpaluose esantis natrio dodecilsulfatas ikrinta nuosdas. Kai judantis gelyje bromfenolio mlynasis pasiekia skiriamojo gelio apai, ijungiama elektros srov ir elektroforezs aparatas ijungiamas i srovs altinio. 8.3.4. Elektroforezs aparato irinkimas po elektroforezs I virutins talpyklos ipilamas elektroforezs buferis ir i aparato iimami stiklai, turintys gelius. Jie padedami ant filtravimo popieriaus lapo arba popierinio rankluosio. Atsargiai pastumiama priek viena tarpin, esanti tarp stikl, ir, naudojant j kaip svert, praskiriami stiklai. Nuimamas virutinis stiklas ir nupjaunamas maas gaballis gelio kampo tam, kad gelio daymo metu galtume inoti takeli padt bei kas ir kuriuos ulinlius buvo pilta.
8.3.5. Baltym daymas gelyje Po elektroforezs baltymus gelyje galima nustatyti daant juos Coomassie mliu arba sidabru. Daymas Coomassie mliu yra paprastesnis ir greitesnis. Daymo sidabru metodas yra jautresnis ir daniausiai taikomas maiems baltym kiekiams nustatyti. Coomassie mlis nesavitai jungiasi su baltym molekulmis. iuo dau galima nudayti 0,3 1,0 g baltymo, esanio vienoje juostelje. Baltymai gelyje yra tvirtinami izopropilo alkoholio ir acto rgties tirpalu ir nudaomi Coomassi mliu. Iplovus da i gelio, mlynos nudaytos baltym juostels yra aikiai matomos. Toks gelis gali bti laikomas acto rgties tirpale arba vandenyje, fotografuojamas arba idiovinamas. Daant baltymus sidabru, prie tam tikr baltymo molekulje esani chemini grupi (sulfhidrilini, karboksi) prisijungia sidabras. iuo metodu galima nudayti nuo 25 ng baltymo, esanio vienoje juostelje. Baltymai poliakrilamido gelyje yra tvirtinami metanolio ir formaldehido tirpalu. Po gelio ekspozicijos sidabro nitrato tirpale, jis yra pamerkiamas rykalus. Rykinimo metu pasiekus reikiam nudayt baltym juosteli rykum, gelis tvirtinamas. J galima fotografuoti, idiovinti.
8.4. Baltym nustatymas gelio elektroforezs metodu

Prietaisai ir mediagos 1. Elektroforezs aparatas, turintis spaustukus, stiklus, gelio paruoimo stovel ir elektroforezs buferio talpyklas. 2. 0,75 mm storio tarpins. 3. 0,75 mm storio politetrafluoretileno ukos, turinios 1, 3, 5, 10, 15 arba 20 dant. 4. Pastoviosios elektros srovs altinis. 5. 25 arba 100 l virktas, turintis tiesiai nupjaut adat. 6. 0,45 m por skersmens filtrai (naudojami pradiniams tirpalams ruoti). Tirpalai ir j ruoimas 1. 30 % akrilamido/0,8 % N,N-metilenbisakrilamido tirpalas. Itirpinama 30 g akrilamido ir 0,8 g N,N-metilenbisakrilamido ir pripilama H2O iki 100 ml. Tirpalas perfiltruojamas pro 0,45 m por dydio filtr ir laikomas tamsoje, esant 4C temperatrai. is tirpalas sunaudojamas per 30 dien, nes akrilamidas pamau hidrolizuojasi iki akrilo rgties ir amoniako. Dmesio! Akrilamido monomeras yra neurotoksikas. Sverti atsargiai. Dirbant su akrilamido tirpalais, mvti gumines pirtines ir nesiurbti burna pipetmis i tirpal. 2. 4 TRISHCl/NDS buferis pH 6,8 (0,5 M TRISHCl, 0,4 % NDS). 6,05 g TRIS itirpinama 40 ml H2O. gaut tirpal pilama 1 N HCl, kol tirpalo pH bus 6,8
108 _________________________________
ir pripilama H2O iki 100 ml. Tirpalas perfiltruojamas pro 0,45 m por dydio filtr ir pridedama 0,4 g NDS. Laikoma, esant 4C temperatrai, iki 1 mn. 3. 4 TRISHCl/NDS buferis pH 8,8 (1,5 M TRISHCl, 0,4 % NDS). 91 g TRIS itirpinama 300 ml H2O. gaut tirpal pilama 1 N HCl, kol tirpalo pH bus 8,8 ir pripilama H2O iki 500 ml. Tirpalas perfiltruojamas pro 0,45 m por dydio filtr ir pridedama 2 g NDS. Laikoma, esant 4C temperatrai, iki 1 mn. 4. 1 TRISHCl/NDS buferis pH 8,8 (praskiediamas 4 TRISHCl/NDS buferis pH 8,8). 5. 2 baltym denatravimo (pavyzdio) buferis (25 ml 4 TRISHCl/NDS buferio pH 6,8, 20 ml glicerolio, 4 g NDS, 2 ml 2-merkaptoetanolio arba 3,1 g ditiotreitolio, 1 mg bromfenolio mlynojo ir pripilama H2O iki 100 ml. Gerai imaioma ir, ipilsius po 1 ml, laikoma, esant 70C temperatrai). 6. 10 % amonio peroksosulfato [(NH4)2S2O8] tirpalas (svoris/tris). Tirpalas ruoiamas prie pat naudojim. 7. Tetrametiledilendiaminas (TEMED). 8. Elektroforezs buferis (3,02 g TRIS, 14,4 g glicino, 1 g NDS ir pripilama H2O iki 1000 ml. Laikoma, esant 04C temperatrai, iki 1 mn.). 9. Standartinis miinys baltym, turini inomas molekulines mases (r. Pried). 10. Tiriam baltym pavyzdiai. 11. Izobutilo alkoholis, prisotintas vandens. 12. Baltymams dayti Coomassie mliu: Baltym tvirtinimo tirpalas: [25 % (trio) izopropilo alkoholio, 10 % (trio) acto rgties ir 65 % vandens]. Laikoma kambario temperatros slygomis. Dao Coomassie mlio tirpalas: [10 % (trio) acto rgties, 0,006 % (svoris/ tris) Coomassie mlio G-250, 90 % vandens]. Laikoma kambario temperatros slygomis. 10 % (trio) acto rgtis. 13. Baltymams dayti sidabru: Baltym tvirtinimo tirpalas: [40 % (trio) metanolio, 0,5 ml 37 % formaldehido vienam litrui tirpalo, 60 % vandens]. Laikoma, esant kambario temperatrai, iki 1 mnesio. Natrio tiosulfato (Na2S2O3) tirpalas: 0,2 g/l. Rykinimo tirpalas: [3 % (svoris/tris) natrio karbonato, 0,0004 % (svoris/ tris) natrio tiosulfato, 0,5 ml 37 % formaldehido vienam litrui tirpalo (pripilama prie pat naudojim)]. Laikoma be formaldehido kambario temperatros slygomis. 0,1 % sidabro nitrato tirpalas. Laikoma tamsiame butelyje kambario temperatros slygomis iki 1 mn. 2,3 M citrin rgties tirpalas.
8.4.1. Skiriamojo gelio paruoimas 1. Naudojant du varius stiklus ir dvi tarpines ulinliai baltymams pilti surenkama elektroforezs aparato gardel, skirta pripildyti skiriamojo ir koncentruojamojo poliakrilamidini geli (8.5 pav.). Dmesio! Stiklus galite nuplauti Alconox arba RBS-35 (Pierce) tirpalais. 2. Stiklai suspaudiami spaustukais tarpusavyje. Gardel statoma pildymui skirt stovel. 3. stiklinait supilami tirpalai, reikalingi skiriamaTarpins jam geliui paruoti (1 lentel). Gerai imaioma. 4. Paruotu tirpalu pripildoma elektroforezs aparato 8.5 pav. Elektroforezs aparato gardel gardel. Tirpalas pilamas alia tarpins, esanios tarp stikl. Nuo stikl viraus koncentruojamajam geliui paliekamas ~ 3 cm tarpas. Dmesio! Paruot tirpal tarp stikl reikia supilti nedelsiant, nes kitaip polimerizacijos reakcija vyks paioje kolbutje. 5. Ant paviriaus tirpalo, esanio tarp stikl, pipete atsargiai usluoksniuojama izobutilo alkoholio, prisotinto H2O. Pilama palengva, i pradi alia vienos, vliau alia kitos tarpini, esani tarp stikl. Dmesio! Nesuardykite polimerinamo gelio paviriaus. Deguonis ltina polimerizacijos reakcij, o izobutilo alkoholio sluoksnis neleidia patekti deguoniui polimerizacijos miin. Be to, gaunamas lygus ir plokias poliakrilamido gelio pavirius. 6. Laukiama, kol vyks polimerizacijos reakcija (3060 min. kambario temperatros slygomis). 8.4.2. Koncentruojamojo gelio paruoimas 1. Nupilamas izobutilo alkoholis, prisotintas H2O, ir gelio pavirius kelis kartus praplaunamas 1 TRISCl/NDS buferiu pH 8,8. Dmesio! Izobutilo alkoholio likuiai sumaina skiriamj elektroforezs geb, todl jis turi bti visikai paalintas. Izobutilo alkoholio sluoksnis ant gelio paviriaus gali bti ne ilgiau kaip 2 valandas. 2. stiklinait pripilama 0,65 ml 30 % akrilamido/0,8 % N,N-metilenbisakrilamido tirpalo, 1,25 ml 4 TRISHCl/NDS buferio pH 6,8 ir 3,05 ml H2O. Pripilama 25 l 10 % amonio peroksosulfato tirpalo ir 5 l TEMED. Gerai imaioma. 3. Gautas tirpalas supilamas tarp stikl ant skiriamojo gelio. Dmesio! Paruot tirpal tarp stikl reikia supilti nedelsiant, nes kitaip polimerizacijos reakcija vyks
110 _________________________________
paioje kolbutje. Tarp stikl piltame koncentruojamajame gelyje neturi bti oro burbul. upilt koncentruojamojo gelio sluoksn statomos ukos ir, jeigu reikia, papildomas koncentruojamojo gelio sluoksnis. Laukiama, kol vyks polimerizacijos reakcija (30 45 min. kambario temperatros slygomis). 8.4.3. Baltym preparat paruoimas elektroforezei ir j pylimas koncentruojamojo gelio ulinlius 1. 1,5 ml plastikiniame mgintuvlyje dalis tiriamo baltym tirpalo praskiediama santykiu 1:1 su 2 baltymus denatruojaniu (pavyzdio) buferiu ir 3 5 min. miinys kaitinamas verdanio vandens vonioje. Rekomenduojami baltym kiekiai nurodyti teorinje io apraymo dalyje. 2. 1,5 ml plastikiniame mgintuvlyje paruoiamas reikiam etalonini baltym miinys (r. Pried): jie itirpinami 1 baltymus denatruojaniame (pavyzdio) buferyje ir 3 5 min. kaitinama verdanio vandens vonioje. Rekomenduojami baltym kiekiai nurodyti teorinje io apraymo dalyje. 3. Atsargiai iimamos ukos. 4. I pripildymui skirto stovelio iimama gardel ir statoma elektroforezs aparat. elektroforezs aparato talpyklas pripilama elektroforezs buferio. 5. virktu, turiniu tiesiai nupjaut adat, ulinlius pilami paruoti baltym pavyzdiai, atsargiai, plonu sluoksniu jie sluoksniuojami ant ulinli dugno. kontrolin ulinl pilamas etalonini baltym miinys. nepanaudotus ulinlius pilamas toks pat tris 1 baltymus denatruojanio (pavyzdio) buferio. 6. Elektroforezs aparatas prijungiamas prie pastoviosios elektros srovs altinio ir atliekama elektroforez (slygos nurodytos teorinje io darbo apraymo dalyje). 8.4.4. Baltym daymas gelyje po elektroforezs Daymas Coomassie mliu 1. Po elektroforezs poliakrilamido gelis dedamas plastikin ar stiklin vonel ir upilamas 3 5 gelio triais baltym tvirtinimo tirpalu. Vonel ltai sibuojama kambario temperatros slygomis 0,75 mm storio gel 10 15 min., 1,5 mm storio gel 30 60 min. 2. Ipilamas baltym tvirtinimo tirpalas ir upilama Coomassie mlio dao tirpalu. Vonel ltai sibuojama kambario temperatros slygomis, kol baltym juostels nusidays norimo rykumo mlyna spalva (1 12 val.). 3. Da tirpalas ipilamas ir upilama 10 % acto rgtimi. Vonel ltai sibuojama
kambario temperatros slygomis, kol i gelio isiplaus daas, nesusiris su baltymu ( 2 val.). Nuolatos pakeiiamas 10 % acto rgties tirpalas. Gelis laikomas 7 % acto rgties tirpale arba vandenyje. Daymas sidabru 1. Po elektroforezs poliakrilamido gelis dedamas plastikin vonel ir pripilama 50 ml baltym tvirtinimo tirpalo. Vonel 10 min. ltai sibuojama kambario temperatros slygomis. Dmesio! 10 min. laikas yra 0,75 mm 5,5 cm 8 cm dydio ir 12,5 % koncentracijos poliakrilamido geliui. Gelis dedamas 814 cm dydio vonel. 2. I vonels ipilamas baltym tvirtinimo tirpalas ir gelis du kartus praplaunamas vandeniu. Visais atvejais 5 min. vonel ltai sibuojama. 3. Ipilamas vanduo ir gelis pamerkiamas 1 min. 50 ml natrio tiosulfato tirpal. Vonel ltai sibuojama. 4. Ipilamas natrio tiosulfato tirpalas ir gelis du kartus po 20 sekundi praplaunamas vandeniu. 5. Ipilamas vanduo ir gelis 10 min. pamerkiamas 50 ml 0,1 % sidabro nitrato tirpal. Vonel ltai sibuojama. 6. Ipilamas sidabro nitrato tirpalas ir gelis praplaunamas vandeniu bei mau triu rykinimo tirpalu. 7. Gelis pamerkiamas 50 ml rykinimo tirpal ir vonel ltai sibuojama, kol bus reikiamas baltym juosteli spalvos rykumas (~ 1 min.). 8. Norint sustabdyti rykinim, vonel pilama 2,5 ml 2,3 M citrin rgties tirpalo ir vonel 10 min. ltai sibuojama. 9. Ipilamas tirpalas i vonels ir gelis upilamas vandeniu. Gelis plaunamas 10 min. ltai sibuojant vonel. Nudaytas gelis laikomas vandenyje. Pastabos Baltym elektroforezei reikia naudoti ypa varius cheminius reagentus. Jeigu poliakrilamido gelio paruoimo metu polimerizacijos reakcija vyksta ltai, tai tuomet reikia paruoti viei amonio peroksosulfato tirpal, arba vienu tredaliu padidinti jo koncentracij, naudoti kokybik TEMED. Koncentruojamasis gelis yra ruoiamas ir upilamas prie pat elektroforez. Prieingu atveju, dl difuzijos buferiai, esantys koncentruojamajame ir skiriamajame geliuose, susimaiys ir tai pablogins baltym atskyrim. Elektroforezs metu tekant elektros srovei, gelis kaista. Nevienodas gelio ilimas turi takos baltym judjimo greiiui. oniniuose poliakrilamido gelio takeliuose baltymai juda liau negu viduriniuose takeliuose (po elektroforezs nudaius baltymus gelis tarsi ypsosi). Tai galima paalinti elektroforezs metu auinant gel arba mainant elektros srovs stiprum.
112 _________________________________
Neprastas tam tikr baltym molekuli judrumas poliakrilamido gelyje. Daniausiai toks neprastas elektroforezinis judrumas bdingas sudtingiems baltymams (glikoproteinams, nukleoproteinams, fosfoproteinams ir pan.) bei turintiems daug bazini ir kit kraut aminorgi liekan. Po elektroforezs nekokybikos juostels. Jei signalinio bromfenolio mlynojo juostel elektroforezs metu yra difuzin, tuomet reikia paruoti naujus buferinius tirpalus ir monomero akrilamido tirpal. Jeigu po elektroforezs nudaytos baltym juostels yra difuzins, tuomet rekomenduojama 25 50 % padidinti elektros srovs stiprum bei naudoti didesns koncentracijos skiriamj gel. Stebti, ar nevyksta proteoliz, dl kurios gali inykti didels molekulins mass baltym juostels ir susidaryti irimo produkt lis gelio takeliuose. Jeigu po elektroforezs baltym juosteli kratai yra nelygs ir dantyti, tuomet reikia sumainti ulinl pilamo baltymo kiek arba 25 % sumainti elektros srovs stiprum. Kita prieastis toki staiai dantyt baltym juosteli gali bti ulinlius piltos neitirpusi baltym nuosdos, kurias galima paalinti centrifuguojant. Be to, kartais iuos sunkumus galim paalinti sumainus akrilamido koncentracij gelyje. Dl nekokybiko koncentruojamojo gelio (blogai vykusi polimerizacijos reakcija), baltym juostels turs nelygius dantytus kratus. Tai gali bti itaisoma nuorinant koncentruojamojo gelio polimerinimui paruot tirpal arba vienu tredaliu padidinant amonio peroksosulfato ir TEMED koncentracijas. Kita toki dantyt krat juosteli prieastis gali bti baltym pavyzdiuose esanios druskos, todl prie elektroforez patartina jas paalinti dializuojant arba gelchromatografijos bdu. Jeigu pavirius tarp skiriamojo ir koncentruojamojo geli yra nelygus, tuomet po elektroforezs susidaro kreivos baltym juostels. Norint to ivengti, reikia, ruoiant skiriamj gel, labai atsargiai upilti ant jo paviriaus izobutilo alkoholio prisotintu H2O. Kartais po elektroforezs matosi dvigubos baltym juostels. Prieastis gali bti dalin baltym oksidacija arba irimas. Oksidacij galima sumainti, padidinant 2-merkaptoetanolio koncentracij arba paruoiant baltym pavyzdius prie pat elektroforez. Jeigu po elektroforezs susidaro maiau juosteli negu tikimasi arba turt bti ir yra stebima plati baltymo juosta signalinio dao bromfenolio mlynojo judjimo zonoje, tuomet patariama padidinti akrilamido koncentracij skiriamajame gelyje. Didel reikm baltym elektroforezs kokybei turi tiriam baltym preparat paruoimas. Pagrindinis sunkumas yra baltym proteoliz endogeninmis peptidazmis, iskiriant juos i lsteli bei ruoiant elektroforezei. Dauguma endogenini peptidazi yra labai aktyvios buferiuose, turiniuose natrio dodecilsulfato. Todl patariama ruoiant baltym pavyzdius elektroforezei, baltym denatravimo (pavyzdio) buferio pripilti ir 3 min. 70100C temperatros slygomis pakaitinti. Juos reikia pakaitinti prie pat pavyzdius pilant poliakrilamido gelio ulinlius. Kai kuriais atvejais, esant 100C temperatrai, gali susidaryti netirpios baltym sankaupos, kurios elektroforezs metu visikai nejuda arba labai blogai juda gelyje. Todl po elektroforezs nudaius baltymus Coomassie
mliu, poliakrilamido gelio pradioje matomos toki baltym lis. Norint ivengti proteolizs ir baltym sankaup, esant didelei temperatrai, reikia baltym iskyrimo metu naudoti savituosius peptidazi slopiklius ir/arba mainti kaitinimo temperatr iki 7080C. Jeigu baltymai i ulinli greitai skverbiasi koncentruojamj gel, tuomet reikia kiek galima sutrumpinti laik tarp baltym pylimo ulinlius ir elektros srovs jungimo, be to, padidinti koncentruojamajame gelyje akrilamido koncentracij nuo 4 % iki 4,5 % ar 5 %. Norint ivengti baltym difuzijos koncentruojamajame gelyje, patartina 25 % padidinti elektros srovs stiprum. Jeigu elektroforez vyksta labai ilgai, prieastis gali bti didel naudojam buferi koncentracija arba maas tekanios elektros srovs stiprumas. Darbo trukm Skiriamojo ir koncentruojamojo poliakrilamido geli paruoimas trunka apie 23 val. 14 14 cm dydio, 0,75 mm storio gelyje elektroforez vyksta 45 valandas, esant 15 mA (70150 V) elektros srovs stiprumui, ir 34 valandas, jei elektros srovs stiprumas 20 mA (80200 V). 1,5 mm storio gelyje elektroforez vyksta 45 valandas, esant 30 mA elektros srovs stiprumui. 0,75 mm storio minigeliuose elektroforez vyksta apie 1 valand, esant 20 mA (100120 V) elektros srovs stiprumui. Daniausiai elektroforez atliekama 1520C temperatros slygomis. Oru auinamuose elektroforezs aparatuose rekomenduojama naudoti maesn elektros srovs stiprum. Literatra
1. Laemmli U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, vol. 227, pp. 680685. 2. Ausubel F. M., Brent R., Kingston R. E., Moore D. D., Seidman J. G., Smith J. A., Struhl K. (eds.). Current Protocols in Molecular Biology. Vol. 2. 2000, J. Wiley & Sons, Inc. 3. Hames B. D., Rickwood D.(eds.). Gel electrophoresis of proteins: a practical approach, 2nd ed. 1990, Oxford University Press, (New York).
4. . . . ( ). 1981, , (), 286 .
114 _________________________________
9 . Nukleorgi gryninimas ir analiz
9.1. DNR gryninimas

Siekiant atlikti DNR analiz arba naudoti j tolesnms procedroms, DNR turi bti igryninta, be RNR ir baltym priemai. Siekiant igryninti nefragmentuot ir maiausiai mechanikai paveikt DNR taikomi patys velniausi lsteli ardymo metodai. Idealiu atveju lsteli sienels turt bti suardomos fermentiniu metodu (pvz., bakterij apvalkalas lizocimu), o lsteli membrana suardoma detergentais. Taikant fizinius lsteli ardymo metodus, reikia turti omenyje, kad turt bti vengiama naudoti jgas, dl kuri DNR molekuls gali trkti. Lsteli suardymas ir visi kiti gryninimo etapai atliekami 40C temperatros slygmis. Daniausiai gryninimo metu naudojama EDTA (etilendiamintetraacto rgtis), surianti Mg2+ jonus, kurie yra reikalingi fermentams deoksiribonukleazms (DNazms), aktyvinti. Gryninama steriliais tirpalais, neturiniais DNazinio aktyvumo. Suardius lsteles, RNR priemaios gali bti paalinamos naudojant ribonukleazes (RNazes). Kartu isiskyr baltymai paalinami fenolins ekstrakcijos metu mgin pilama fenolio ir chloroformo miinio, kuris denatruoja baltymus. velniai supurius emulsija centrifuguojama. Dl to emulsija pasiskirsto dvi fazes: apatin organin ir virutin vandenin, kurioje yra skiriamoji DNR. Tarp i dviej fazi centrifugavimo metu nusistovi balta denatruot baltym plvel. Virutin vandenin faz yra surenkama, jos fenolin ekstrahavim daniausiai reikia kartoti 23 kartus, kol organins ir vandenins fazs slyio paviriuje nebepastebima denatruot baltym plvls. Galiausiai, paalinus baltymus, DNR isodinama i tirpalo etanoliu. Nuosdos nucentrifuguojamos ir idiovinus itirpinamos buferyje, turiniame EDTA (etilendiamintetraacto rgtis (EDTA) inaktyvina DNazes). DNR tirpalas gali bti laikomas esant +4oC temperatrai mnes arba ilgiau ualdius (20oC). Igryninant DNR i tam tikr organeli (pvz., mitochondrij), rekomenduojama pirmiausia igryninti organeles, o tik vliau DNR, nes igryninti organeli DNR i visos lsteli sumins DNR miinio daniausiai bna daug sudtingiau. Ypatingai gryna DNR gaunama po centrifugavimo tirpale, turiniame cezio chlorido gradient. Igryninus DNR visada reikia patikrinti DNR vientisum elektroforezs agaroziniame gelyje metu, ir nustatyti jos koncentracij pamatuoti DNR sugert UV srityje, esant =260 nm. Tai yra daugiausia paplits DNR koncentracijos nustatymo metodas. Yra inoma, kad prastomis slygomis DNR tirpalo, kuriame dvigrands DNR koncentracija yra 50 g/ml, sugertis yra 1,0. Taigi, pamatavus neinomos koncentracijos DNR tirpalo sugert, galima nesunkiai paskaiiuoti, kokia yra DNR koncentracija tirpale.
9. Nukleorgi gryninimas ir analiz ________________________________________________ 1. Saugaus darbo biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls ________________________ 115
is metodas turi ir daug trkum: pavieniai nukleotidai ir RNR priemaios taip pat sugeria UV ir tokiu bdu sustiprina signal. Taikant metod galima nustatyti tirpal koncentracij, kuriuose DNR yra ne maiau kaip 2 g/ml. Uraant DNR sugerties spektr UV srityje 200 300 nm galima ne tik nustatyti DNR koncentracij, bet ir itirti, ar preparate yra baltym priemai. Tam tikslui pamatuojama DNR tirpalo sugertis ties 280 nm, kuri lemia baltymai. Jeigu sugerties ties 260 nm santykis su sugertimi ties 280 nm yra daugiau kaip 1,8, laikoma, kad DNR tirpale nra baltym priemai (A260/A280>1,8).
9.2. RNR gryninimas

RNR gryninimo metodai yra labai panas aukiau aptartus DNR gryninimo metodus. RNR molekuls yra daug trumpesns negu DNR, todl jos nra taip lengvai paeidiamos. Todl gryninimo metu gali bti taikomi ir iurktesni lsteli suardymo metodai. RNR yra labai paeidiama RNazi (ribonukleazi), kuri didels koncentracijos yra lstelse, o taip pat egzogenini net ant mogaus pirt. Todl RNR gryninimo metu btina mvti gumines pirtines, o pradinmis stadijomis naudoti stiprius detergentus siekiant nedelsiant inaktyvinti RNazes. Vienas i daniausiai RNR gryninti naudojam reagent yra guanidino tiocianatas veiksmingas RNazi slopiklis ir baltym denatrantas. RNR danai yra stipriai susijungusi su baltymais, todl ypa svarbu kruopiai paalinti baltymus fenolins ekstrakcijos metu (kaip aprayta anksiau, 9.1 sk.). DNR priemaios paalinamos veikiant RNR mgin DNazmis. RNR i tirpalo isodinama kaip ir DNR etanoliu. Kai kada btina igryninti eukariotini lsteli mRNR, kuri sudaro tik 25% sumins visos lstels RNR. Tokiu atveju reikia taikyti giminingumo chromatografijos metod oligo(dT)-celiuliozs kolonles. Esant didelei drusk koncentracijai, mRNR, turinti poliA sekas, jungiasi prie komplementari oligo(dT) molekuli kolonlje, o kita lsteli RNR (rRNR, tRNR) nesijungia ir paalinama i kolonos plaunant didels koncentracijos drusk tirpalu. Galiausiai prijungtas mRNR molekules galima atkabinti ir isigryninti plaunant maos koncentracijos drusk tirpalu. Kaip ir DNR, igryninus RNR visada reikia patikrinti jos vientisum elektroforezs agaroziniame gelyje metu. Eukariot lstelse daugiausia yra dviej ri rRNR molekuli: t. y. 28S ir 18S rRNR, o prokariot atitinkamai 23S ir 16S rRNR. Po elektroforezs agaroziniame gelyje identifikavus ias rRNR juostas galima tiktis, kad ir kitos RNR molekuls (pvz., mRNR, tRNR) nebus paeistos RNazi. Taiau RNR elektroforez patartina atlikti denatruojaniomis slygomis (formaldehidiniame agaroziniame gelyje) tokiomis slygomis inaktyvinamas antrini struktr susidarymas RNR molekulse. RNR koncentracija nustatoma matuojant RNR tirpalo sugert UV srityje, esant =260 nm. Yra inoma, kad prastomis slygomis tirpalo, kuriame viengrands RNR
116 _________________________________
koncentracija yra 40 g/ml, sugertis yra 1,0. Taigi, pamatavus neinomos koncentracijos RNR tirpalo sugert, galima nesunkiai suskaiiuoti, kokia yra RNR koncentracija tirpale. Uraant RNR sugerties spektr UV srityje ties 200 300 nm galima nustatyti, ar mginyje yra baltym priemai. Tam tikslui pamatuojama RNR tirpalo sugertis ties 280 nm, kuri lemia baltymai. Jeigu sugerties ties 260 nm santykis su sugertimi ties 280 nm yra daugiau kaip 1,8, laikoma, kad RNR tirpale nra baltym priemai (A260/ A280>1,8).
9.3. DNR modifikuojantys fermentai

9.3.1.Restrikcijos endonukleazs DNR grandins hidroliz ir dviej skirting DNR fragment sujungimas buvo pirmieji molekulins biologijos metodai, atlikti laboratorijoje. Dabar jie yra vis rekombinantins DNR darb pagrindiniai etapai. iuo metu plaiai naudojamos vairios restrikcijos endonukleazs molekulins irkls, karpanios DNR molekules, DNR ligazs sujungianios DNR fragmentus ir kiti fermentai, modifikuojantys DNR. DNR restrikcijos endonukleazs yra bakterij fermentai. Jie prisijungia prie dvigrands DNR molekuli ir keliauja iilgai DNR grandins, kol randa savit DNR sek. ioje srityje susidaro papildomi cheminiai ryiai tarp baltymo ir DNR. Sveika sustiprja, pasikeiia fermento konformacija ir DNR grandin hidrolizuojama deoksiriboziniamefosfatiniame karkase. Tai yra hidrolizuojamas kovalentinis ryys tarp deoksirobozs ir fosfatins grups. Kiekvienas fermentas atpasta ir hidrolizuoja skirtingas DNR sekas (9.1 pav.). Tam tikri fermentai atpasta tik 4 bp ilgio DNR sekas, kiti ilgesnes. Taiau bendras restrikcijos endonukleazi atpastam sek bruoas sekos yra polindromins. Tai yra skaitant jas 5/?3/ ir 3/?5/ kryptimi sekos yra vienodos.
AluI buki galai HaeIII buki galai BamHI lipns galai HindIII lipns galai EcoRI lipns galai
9.1 pav. Tam tikr DNR restrikcijos endonukleazi atpastamos sekos ir kirpimo vietos. Daniausiai fermentai pavadinami atsivelgiant altinio, i kurio buvo igryninti, pavadinim. Pavyzdiui, EcoRI buvo igryninta i Escherichia coli RY13, o HindIII i Haemophilus influenzae.
Pirmoji restrikcijos endonukleaz HindII buvo igryninta ir apibdinta 1968 m. Nuo to laiko buvo igryninta daugiau kaip 900 restrikcijos ferment. Tam tikros restrikcijos endonukleazs kerpa simetrikai, ir palieka bukus galus (pvz., AluI), o kitos, pvz., EcoRI hidrolizuoja DNR grandin ir palieka isikiusius 5 arba 3 galus (9.1 pav.). Tokie DNR restrikcijos produktai vadinami lipniais. 9.1.2. DNR polimerazs Visos DNR polimerazs katalizuoja reakcij, kurios metu prie DNR molekuls 3/ galo hidroksiliekanos vienas po kito kovalentikai prijungiami deoksiribonukleotidai. DNR molekul sintezs metu ilgja 5/3/ kryptimi. Reakcijai yra reikalingi keturi deoksiribonukleotid trifosfatai (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), Mg2+ jonai bei DNR matrica, pagal kuri yra kopijuojama nauja sintetinama DNR molekul. E. coli DNR polimeraz I nuo DNR priklausoma DNR polimeraz, turinti 5/3/ polimerazin ir 3/5/ bei 5/3/ egzonukleazin aktyvum. Igryninta i bakterij praktikai E. coli DNR polimeraz I buvo naudojama radioaktyviam DNR ymjimui ir kDNR (kopijins DNR) sintezei. Aktyvumo centrai, atsakingi u fermento polimerazin ir egzonukleazin aktyvum, yra skirtinguose holofermento domenuose. Todl apdorojus baltym peptidazmis buvo galima gauti ferment, neturint vieno ar kito aktyvumo. Tad pamau DNR polimeraz I pakeit Klenovo fragmentas (angl. Klenow), kuris buvo gaunamas peptidaze subtilizinu apdorojus E. coli DNR polimeraz I. Tokiu bdu buvo paalinamas DNR procedroms nenaudingas 5/3/ egzonukleazinis aktyvumas. Praktikai Klenovo fragmentas yra naudojamas ymint radioktyvija yme DNR molekules, paalinant lipnius 3/ DNR galus, sintetinant dvigrand DNR nuo viengrands DNR. terpus mutacijas 3/5/ egzonukleaziniame Klenovo fragmento aktyvumo centre buvo gautas fermentas, turintis tik polimerazin aktyvum. Jis vadinamas exo- Klenovo fragmentu. Bakteriofago T4 DNR polimeraz yra panai E. coli DNR polimeraz I. Ji turi /3/ polimerazin ir 3/5/ egzonukleazin aktyvum. Taiau fermentas neturi 5/3/ 5 egzonukleazinio aktyvumo. T4 DNR polimeraz naudojama per tokius darbus, kaip ir Klenovo fragmentas, bet yra ir iskirtini praktini bruo. T4 DNR polimerazs 3/5/egzonukleazinis aktyvumas yra ~ 200 kart didesnis nei Klenovo fragmento. Todl is fermentas daugiau tinka darbams, kuri metu tenka paalinti isikiusius 3/ lipnius DNR galus. Bakteriofago T7 DNR polimeraz taip pat turi 5/?3/ polimerazin ir 3/ 5/ egzonukleazin aktyvum, bet neturi 5/3/ egzonukleazinio aktyvumo. is fermentas yra labai procesyvus, lyginant su Klenovo fragmentu ar T4 DNR polimeraze. Tai yra fermentas susintetina daug ilgesn DNR, kol disocijuoja nuo matricos. Todl T7 DNR polimeraz buvo plaiai naudojama DNR sekai nustatyti Sengerio metodu. Fermento
118 _________________________________
3/// egzonukleazinis aktyvumas buvo slopintas chemikai ar terpiant mutacijas. Tokios fermento formos Sekvenazs pavadinimu iandien plaiai naudojamos nustatant DNR sek. Pastarj deimtmet ypa danai naudojamos DNR polimerazs, igrynintos i termofilini mikroorganizm. Taq polimeraz i Thermus aquaticus buvo igryninta ir naudota anksiausiai. Su jos naudojimu prasidjo DNR dauginimo polimerazins grandinins reakcijos metodu era (angl. polymerase chain reaction, PCR). Termofilins polimerazs, kaip ir kitos polimerazs, turi 5/3/ polimerazin aktyvum, t. y. katalizuoja nukleotidtrifosfat prijungim prie DNR pradmens 3/OH grups. J veiklos optimali temperatra yra 7580oC. Vliau buvo igrynintos ir naudoti pritaikytos ir kitos termofilini bakterij polimerazs: Pfu , Vent (arba Tli) (9.1 lentel). Viena i svarbiausi termofilini DNR polimerazi charakteristik yra klaid, vykstani DNR sintezs metu, danis. Nesunku nuspti, kad polimerazms, neturinioms 3/?5/ egzonukleazinio aktyvumo, bdingasi didesnis klaid danis, nei polimerazms, turinioms 3/5/ egzonukleazin aktyvum. Taq polimerazs klaid danis yra didiausias 1 104 2 105 klaidos/bp. i Taq polimerazs savyb riboja jos naudojim polimerazinei grandininei reakcijai, kai yra btina ivengti klaid, dl kuri DNR sekoje gali atsirasti mutacijos. Pfu polimerazs yra tiksliausia 1,5 106 klaidos/bp. Iskirtini savybi turi revertazs, kurios funkcionuoja kaip nuo RNR priklausomos DNR polimerazs. J yra retrovirusuose (virusuose, kuri genome informacija yra koduojama RNR molekulse). Infekcijos eimininko lsteles metu ie fermentai sintetina kDNR molekules nuo viruso RNR genomo. Tokiu bdu viruso genomas, perkoduotas i RNR DNR, gali siterpti eimininko genom. Laboratorijoje is fermentas gali bti skmingai naudojamas DNR sintezei tiek nuo viengrands RNR, tiek nuo viengrands DNR matricos. Revertazms bdingas ir RNazsH aktyvumas, t. y. hidrolizuojamos RNR molekuls RNR-DNR hibridinse molekulse, kurios susidaro kDNR sintezs nuo RNR matricos metu. Visi retrovirusai turi revertazi, taiau praktikai daniausiai naudojamos yra dvi: Moloney peliuk leukemijos viruso (angl.
9.1 lentel. Termofilins DNR polimerazs

Polimeraz Taq Pfu Vent 3/5/egzonukleazinis aktyvumas nra yra yra altinis ir savybs Thermus aquaticus. Gyvavimo pusperiodis, esant 95 oC 1,6 val. Pyrococcus furiosus Maiausias klaid danis Thermococcus litoralis Gyvavimo pusperiodis esant 95 oC 7 val.
Moloney murine leukemia virus) ir pauki mieloblastozs viruso (angl. Avian myeloblastosis virus) revertazs. Pirmosios RNazinis aktyvumas yra daug silpnesnis nei pauki mieloblastozs viruso revertazs, todl ji tinkamesn ilgj kDNR molekuli sintezei. 9.1.3. Nukleazs Nukleazs danai yra laikomos pikiausiais tyrjo, kuris stengiasi isaugoti nepaeistus RNR ir DNR preparatus, prieais. Taiau kartais deoksiribonukleazs (DNazs) ir ribonukleazs (RNazs) yra ir nepamainomi pagalbininkai molekulins biologijos laboratorijose. iuo metu yra igryninta ir apibdinta tam tikr nukleazi, kurios skiriasi savitumu substratui, reikalingais kofaktoriais, ir yra endonukleazs (hidrolizuoja nukleorgtis molekuls viduje) ar egzonukleazs (hidrolizuoja nukleorgtis nuo molekuls gal). Plaiausiai naudojamos DNazI ir RNazA, abi igrynintos i jauio kasos lsteli. DNazI hidrolizuoja viengrand ir dvigrand DNR. Tai yra endonukleaz, skelianti DNR pirimidin (C ar T) susitelkimo vietose. Hidrolizs produktai yra 5' galuose fosforilinti monodeoksinukleotidai ir oligodeoksinukleotidai. Praktikai DNazI naudojama paalinti DNR priemaias i RNR preparat, per DNR baltym sveikos tyrimus DNazsI pirt atspaud metodu (angl. DNase footprinting) ar padaryti DNR trkius prie paymint j radioaktyvija yme (angl. radiolabeling by nick translation). RNazA yra endoribonukleaz, hidrolizuojanti viengrand RNR pirimidin 3/ galuose. Ji hidrolizuoja fosfodiesterin ry tarp vieno nukleotido 5/ ribozs ir greta esanio pirimidininio nukleotido 3/ ribozs fosfatins grups Hidrolizs produktai yra 3/ galuose fosforilinti mononukleotidai ir oligonukleotidai. Daniausiai RNazA yra naudojama paalinti RNR priemaias i DNR preparat. 9.1.4. DNR ligazs DNR ligazs katalizuoja fosfodiesterinio ryio tarp vienos DNR molekuls 5/ fosfato ir kitos (arba tos paios) molekuls 3/ hidroksiliekanos susidarym. is fermentas naudojamas kovalentikai sujungti dvi atskiras DNR molekules, daniausiai terpiant DNR fragment plazmidin klonavimo vektori. Tai yra pagrindinis metodas kuriant rekombinantines DNR. Plaiausiai naudojama bakteriofago T4 DNR ligaz, kuriai reikalingas kofaktorius ATP. E. coli DNR ligaz naudojama reiau, o jos kofaktorius yra NAD.
120 _________________________________
9.1.5. Fosfatazs ir kinazs Plaiausiai naudojamos armins fosfatazs, kuri optimalus veikimo pH yra arminis. ie fermentai paalina fosfatines grupes nuo DNR ir RNR 5/ gal. Praktikai naudojamos: bakterij armin fosfataz (angl. bacterial alkaline phosphatase, BAP), veriuko arnyno armin fosfataz (angl. calf intestinal alkaline phosphatase, CIP) ir krevei armin fosfataz (angl. shrimp alkaline phosphatase). armin bakterij fosfataz yra aktyviausias fermentas, taiau reakcijos pabaigoje sunkiausia j inaktyvinti. armin veriuko arnyno fosfataz yra maiau aktyvi nei bakterij fosfataz. Taiau ji daniau naudojama, nes pasibaigus reakcijai j lengviau inaktyvinti apdorojus reakcijos miin peptidazmis ar pakaitinus auktesne (75oC) temperatra. Fosfatazs praktikai naudojamos klonavimo metu. Prie terpiant DNR fragment plazmidin klonavimo vektori, vektoriaus 5/ gal fosfatins grups yra paalinamos defosforilinimo reakcijos metu. Tokiu bdu yra sumainama paties vektoriaus DNR gal susijungimo galimyb ligazs katalizuojamos reakcijos metu, o padaugja sujungt vektoriaus ir terpiamo DNR fragmento produkt. armins fosfatazs plaiai naudojamos DNR 5/ gal fosfatinei grupei paalinti prie prijungiant 5/ galuose radioaktyvija yme paymt fosfatin grup. Fosfatins grups prijungim prie DNR ir RNR 5/ galo hidroksiliekanos katalizuoja kinazs. Praktikai daniausiai naudojama polinukleotidkinaz, igryninta i bakteriofago T4. Fosfatin grup yra perneama nuo ATP molekuls. Tuo atveju, jeigu DNR ar RNR turi 5/ galuose fosfatines grupes, o reakcijos miinyje yra ADP perteklius, polinukleotidkinaz pirmiausia gali perneti fosfatus nuo nukleorgi ir prijugti prie ADP (P+ADP?ATP), o tada fosforilinti defosforilintus nukleorgi 5/ galus. Tai yra main reakcija (angl. exchange reaction). Taiau ios reakcijos metu fosforilinimo efektyvumas yra daug maesnis. Praktikai danai tenka fosforilinti DNR 5/ galus naudojant polinukleotidkinaz. Pavyzdiui, sintetinant 5/ galuose radioaktyvija fosfatine yme paymt DNR arba fosforilinti polimerazins grandinins reakcijos metu padaugintus DNR fragmentus prie terpiant juos plazmidinius ekspresijos vektorius klonavimo procedr metu.
9.4. Nukleorgi elektroforez agaroziniame gelyje

Nukleorgi elektroforezs agaroziniame gelyje metu DNR ar RNR molekuls yra atskiriamos pagal dyd. is metodas gali bti tiek kiekybinis, tiek kokybinis. Taikant modifikuot elektroforezs metod, vadinam pulsuojanio lauko gelio elektroforeze (angl. pulsed field gel electrophoresis, PFGE), pagal dyd iskiriami dideli DNR fragmentai (pvz., chromosomos). Lengviausias ir daugiausia paplits metodas yra nukleoelektroforez horizontaliame agaroziniame gelyje.
9.2 pav. Agarozs struktros vienetas agarobioz (14)-3,6-anhidro-a-L-galaktopiranozil (13)-b-D-galaktopirananas
9.3 pav. Agarozinio gelio ruoimas ir elektroforez. Ilydytas agarozs tirpalas supilamas speciali form, turini ukutes (A). Sustingus ukuts itraukiamos (B). Jos suformuoja mgini pilimo ulinlius. DNR mginiai frakcionuojami elektros lauke (C)
Agaroz yra linijinis angliavandeni polimeras (9.2 pav.), sudarytas i D-galaktozs ir 3,6-anhidro-L-galaktozs, sujungt (14) glikozidiniu ryiu ir gaunamas i jr dumbli. Ruoiant gel, buferinis agarozs tirpalas yra ilydomas ir supilamas speciali form (9.3 pav. A), leidiama jam atvsti ir sustingti (panaiai, kaip gaminama desertin el). Specialios ukuts, itraukiamos geliui sustingus (9.3 pav. B), suformuoja ulinlius DNR mginiams supilti. DNR mginiai uneami kartu su daais bromfenolio mlynuoju ir ksilencianoliu. Atsivelgiant juos stebima elektroforezs eiga, nes ie mlynos ir violetins spalvos daai juda elektros lauke. djus agarozin gel, turint piltus mginius, elektros lauke (9.3 pav. C), nukleorgtys, kurios yra neigiamai krautos, juda anodo link. Molekuli judjimo greitis priklauso nuo keli pagrindini parametr: a) nukleorgi molekuli dydio. Dvigrands linijins DNR molekuls juda gelyje greiiu, kuris yra atvirkiai proporcingas j molelulins mass logaritmui. Tai yra kuo molekul maesn, tuo greiiau ji juda gelyje; b) agarozs koncentracijos. To paties ilgio DNR fragmentas skirtingos koncentracijos geliuose juda skirtingu greiiu. Todl didesns koncentracijos agarozniai geliai yra naudojami trumpesniems, o maesns koncentracijos ilgesniems DNR fragmentams frakcionuoti; c) nukleorgi konformacijos. Pavyzdiui, to paties ilgio iedin, linijin ir iedin, turinti viengrand trk molekul, juda skirtingu greiiu. Daniausiai iedin DNR juda greiiau, nei tokio paties ilgio linijin DNR;
122 _________________________________
d) srovs stiprumo. Esant maai tampai, linijins DNR judjimas yra tiesiog proporcingas tampai. Taiau padidinus elektros lauko tamp didelio molekulinio svorio DNR fragment judrumas pasikeiia skirtingai, todl rekomenduojama elektroforezs tampa yra 5 V/cm. Agaroziniuose geliuose elektroforezs metu frakcionuotos nukleorgtys daomos etidio bromidu NH2 (9.4 pav.). is daas jungiasi prie DNR ir RNR ir siterpia tarp heterociklini bazi ploktum (is procesas vadi+ Br N namas interkaliacija), o apviestas UV fluorescuoja ryH2N CH 2CH 3 kiai oranikai rausva spalva. Taikant metod, galima detektuoti ~ 1ng DNR. Daniausiai nukleorgi elektroforezs agaro9.4 pav. Etidio bromidas ziniame gelyje metodas yra taikomas DNR ar RNR (2,7-diamino-10-etil-9-fenil- vientisumui patikrinti, nagrinti fermentini reakcij fenantrido bromidas) (pvz., restrikcijos endonukleazi, polimerazins grandinins reakcijos) produktus. Agaroziniuose geliuose galima frakcionuoti didesnius kaip 100 bp DNR fragmentus (9.5 pav.). Trumpesnms molekulms atskirti tinkamesnis elektroforezs poliakrilamidiniame gelyje metodas.
1031 900 800 700 600 500 400 300 200 100 80 M 1 2 3 4 5
9.5 pav. DNR elektroforezs 2% agaroziniame gelyje vaizdas. M takelyje DNR ilgio ymenys (1031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 80 bp). 1 takelyje 212 bp, 2 329 bp, 3 446 bp, 4 622 bp, 5 802 bp ilgio DNR fragmentai.
9.5. Plazmidins DNR gryninimas ir analiz

9.5.1. Plazmidins pTZ19R DNR gryninimas Mediagos ir reagentai: 1. LB terp (t. y. bakterij auginimo terp. Autorius Luria-Bertani) turinti ampicilino (100 g/ml). 2. STET buferis (8% sacharoz, 5% tritonas X-100, 50 mM EDTA, 50 mM TRISHCl, pH 8,0). 3. 5 mg/ml lizocimo vandeninis tirpalas. 4. TE buferis (10 mM TRIS-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). 5. Izopropilo alkoholis. 6. 70% etanolis Darbo eiga: 1. Bakterij, turini plazmid pTZ19R, kolonija suspenduojama 2 ml LB terps, turinios ampicilino (100 g/ml), ir auginama esant 37oC temperatrai 1416 val. 2. 1,5 ml lsteli kultros supilama mikrocentrifugin mgintuvl ir centrifuguojamos 10 min. 7000 g. Lstels suspenduojamos 350 l STET buferio, kuriame yra 30 g/ml lizocimo. 3. Inkubuojama 5 min. kambario temperatros slygomis. 4. Mginys perkeliamas verdanio vandens voni ir inkubuojamas 40 sek. 5. Centrifuguojama 10 min. 10000 g. 6. Po centrifugavimo mgintuvlio dugne matyti lsteli nuolau nuosdos. Vir j 2 3 mm klampus polisacharid sluoksnis. Tarp io sluoksnio ir virutinio vandeninio tirpalo, kuriame yra skiriamoji plazmid, matoma skiriamoji fazi riba. Atsargiai nusiurbkite vandenin virutin sluoksn var mikrocentrifugin mgintuvl, neliesdami klampaus sluoksnio mgintuvlio dugne. 7. supernatant pripilama 350 l TE buferio ir 800 l izopropilo alkoholio. Sumaioma purtykle ir inkubuojama kambario temperatros slygomis 30 min. 8. Centrifuguojama 10 min. 10000 g. 9. Supernatantas ipilamas, ant nuosd upilama 100 l 70% etanolio ir velniai supurtoma. 10. Centrifuguojama 10 min. 10000 g. Mgintuvlio dugne matyti nedidelis kiekis balt plazmidins DNR nuosd. 11. Supernatantas ipilamas, nuosdos idiovinamos palikus atvir mgintuvl kambario temperatros slygomis keleta valand ir itirpinamos 50 l TE buferio (pH 8,0).
124 _________________________________
9.5.2. Fermentin pTZ19R DNR analiz
9.6 pav. Plazmids pTZ19R schema (A) ir multiklonins srities (angl. multicloning site, MCS) DNR seka (B). Schemoje ir MCS paymtos restrikcijos endonukleazi kirpimo vietos
Mediagos ir reagentai: 1. Restrikcijos endonukleaz EcoRI (10 u/l). 2. DeoksiribonukleazI (DNazI 2 u/l). 3. RibonukleazA (RNazA 10 mg/ml). 4. 10 reakcijos buferis (R+ buferis, AB Fermentas (100 mM TRIS-HCl (pH 8,5), 100 mM MgCl2, 1M KCl, 1 mg/ml BSA). 5. Sterilus H2O Darbo eiga: Igryninta pTZ19R DNR bus veikiama: a) restrikcijos endonukleaze EcoRI. b) deoksiribonukleazeI (DNazI). c) ribonukleazeA (RNazA). d) kontrol fermentais neveikta DNR. 1. Paruoiami fermentini reakcij miiniai 4 mikrocentrifuginiuose mgintuvliuose. Pirmiausia pilama DNR tirpalo, vliau sterilaus H2O, paskui 10 reakcijos buferio, o galiausiai pripilama ferment.
DNR veikiama Reagentai Plazmidins DNR tirpalas Sterilus H2O 10 reakcijos buferis Fermentas Vt - bendras reakcijos tris A su EcoRI 10 l 7 l 2 l 1 l EcoRI 20 l B su DNazeI 10 l 7 l 2 l 1 l DNazI 20 l C su RNazeA 10 l 7 l 2 l 1 l RNazA 20 l D kontrol 10 l 8 l 2 l 20 l
Dmesio ferment tirpal nepalikite ant stalo kambario temperatros slygomis, o panaudoj mgintuvlius statykite atgal ledus ! 2. Reakcijos miiniai inkubuojami 1 val., esant 37oC temperatrai. 9.5.3. 1% agarozinio gelio paruoimas Mediagos ir reagentai: 1. Agaroz. 2. 10 TAE buferis (400 mM TRIS-acetato, 20 mM EDTA pH 8,0). 3. Etidio bromido tirpalas (5 mg/ml).
126 _________________________________
Darbo eiga: 1. Paruoiama 100 ml 1% agarozs tirpalo: 1g agarozs, 10 ml 10 TAE buferio, H2O iki 100 ml. 2. Tirpalas inkubuojamas mikrobang krosnelje arba verdanio vandens vonioje kelet minui, kol pasidaro skaidrus (agaroz isilydo). 3. Leidiama tirpalui atvsti iki ~ 60oC temperatros. Pripilama etidio bromido iki galutins koncentracijos 0,5 g/ml, t. y. 10 l ir gerai imaioma. 4. Tirpalas supilamas gelio formavimo sistem (r. 9.3 pav.). 5. Po ~30 min. agaroz sukietja. Iimamos ukuts ir gelis perkeliamas elektroforezs aparat ir upilamas 1 TAE buferiu. Dmesio etidio bromidas yra mutagenas. Todl mgintuvl, pripilt tirpalo, ir agarozin gel lieskite tik mvdami gumines pirtines! 9.5.4. Fermentini reakcij produkt analiz agaroziniame gelyje. Mediagos ir reagentai: 1. 6DNR mgini buferis (10 mM TRIS-HCl (pH 7,6), 0,03% bromfenolio mlynojo, 0,03% ksilencianolio, 60% glicerolio, 60 mM EDTA). 2. Reagentai elektroforezei 1% agarozinis gelis, 1 TAE elektroforezs buferis. 3. DNR ilgio ymenys (GeneRuler 1kb DNA Ladder, AB Fermentas). Darbo eiga: 1. Po inkubacijos reakcijos miiniai paruoiami elektroforezei: reakcijos miinius pilama po 5 l 6DNR mgini buferio. 2. Po 10 l paruot miini ir 10 l DNR ilgio ymens pilama agarozinio gelio ulinlius. 3. Atliekama DNR elektroforez naudojant
1 2 3 4 5 ulinlia ulinlis ulinlis ulinlis ulinlis DNR ilgio A B C D ymenys
1,0% agarose
0,5g/lane 8 cm length gel., 1TAE, 7V/Cm, 45 min
5 V/cm ~30 40 min. Jos eiga stebima atsivelgiant da, frakcionuojam kartu su DNR mginiais, judjim. Elektroforez
9.7 pav. DNR ilgio ymen (GeneRuler 1kb DNA Ladder, AB Fermentas) elektroforezs 1% agarozs gelyje vaizdas
atliekama, kol greiiau judantis daas bromfenolio mlynasis nueina du tredalius gelio ilgio. 4. Pasibaigus elektroforezei gelis iimamas ir DNR analizuojama apvietus UV. Dmesio agaroziniame gelyje yra etidio bromido, kuris yra mutagenas. Agarozin gel lieskite tik mvdami gumines pirtines!
9.6. Bakterij RNR gryninimas ir analiz

9.6.1. Bakterij RNR gryninimas Mediagos ir reagentai: 1. LB terp (t. y. Luria-Bertani bakterij auginimo terp). 2. Tirpalas A (10 mM TRIS HCl pH 7.3, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2). 3. Tirpalas B (20 mM TRIS HCl pH 7.9, 0,2 M NaCl, 40 mM EDTA, 1% SDS). 4. Vandens prisotintas fenolis (pH 5.5). 5. Chloroformas. 6. Etanolis. 7. Sterilus H2O (apdorotas DEPC- dietilpirokarbonatas inaktyvina RNazes). Darbo eiga: 1. Bakterij kolonija suspenduojama 20 ml LB terps ir auginama esant 37oC temperatrai 14 16 val. 2. Lstels centrifuguojamos 10 min. 7000 g ir suspenduojamos 1,5 ml alto tirpalo A. 3. Pripilama 1,5 ml tirpalo B. 4. 2 min. inkubuojama verdanio vandens vonioje. Ataldoma leduose. 5. mgin pilamas lygus tris (3,0 ml) vandens prisotinto karto (65oC) fenolio. Supurtoma putykle. 6. Centrifuguojama 15 min. 10000 g +4oC. 7. Virutin vandenin faz surenkama var mgintuvl, stengiantis nepaliesti denatruot baltym plvels, susidariusios organins (apatins) ir vandenins (virutins) fazi slyio paviriuje. 8. Virutins vandenins fazs fenolin ekstrakcija pakartojama antr kart (5 7 punktai). 9. Surinkus virutin vandenin faz po antrosios fenolins ekstrakcijos, mgin pilamas lygus tris (3,0 ml) chloroformo. 10. Centrifuguojama 15 min. 10000 g +4oC. 11. Virutin vandenin faz surenkama var mgintuvl ir RNR isodinama 2,5 triais etanolio.
128 _________________________________
12. Paliekama esant 20oC temperatrai per nakt (galima ir ilgiau). 13. Centrifuguojama 15 min. 10000 g. 14. Supernatantas ipilamas, ant nuosd upilama 100 l 70% etanolio ir velniai supurtoma. 15. Centrifuguojama 15 min. 10000 g. 16. Supernatantas ipilamas, nuosdos idiovinamos ir itirpinamos 50 l sterilaus H2O (apdoroto DEPC). 9.6.2. Bakterins RNR fermentin analiz Mediagos ir reagentai: 1. DeoksiribonukleazI (DNazI 1 u/l). 2. RibonukleazA (RNazA 10 mg/ml). 4. 10 reakcijos buferis (R+ buferis, AB Fermentas (100 mM TRIS HCl (pH 8,5), 100 mM MgCl2, 1 M KCl, 1 mg/ml BSA). 5. Sterilus H2O. Darbo eiga: Igryninta bakterin RNR bus veikiama: a) DeoksiribonukleazeI (DNazeI). b) RibonukleazeA (RNazeA). c) Kontrol fermentais neveikta DNR. 1. Paruoiami fermentini reakcij miiniai 3 mikrocentrifuginiuose mgintuvliuose. Pirmiausia pilama RNR tirpalo, vliau sterilaus H2O, paskui 10 reakcijos buferio, o galiausiai pripilama ferment.
RNR veikiama Reagentai RNR tirpalas Sterilus H2O 10 reakcijos buferis Fermentas Vt - bendras reakcijos tris A su DNazeI 10 l 7 l 2 l 1 l DNazI 20 l B su RNazeA 10 l 7 l 2 l 1 l RNazA 20 l C kontrol 10 l 8 l 2 l 20 l
Dmesio ferment tirpal nepalikite ant stalo kambario temperatros slygomis, o panaudoj statykite atgal ledus ! 2. Reakcijos miiniai inkubuojami 1 val., esant 37oC temperatrai.
9.6.3. Formaldehidinio 1,5% agarozs gelio paruoimas Mediagos ir reagentai: 1. Agaroz. 2. 10 elektroforezs MOPS/ EDTA buferis (0,2 M MOPS, 0,05 M CH3COONa, 0,01 M EDTA pH 7,0). 3. 37% formaldehido tirpalas. 4. Etidio bromido tripalas (5mg/ml). Darbo eiga: 1. Paruoiama 100 ml 1,5% agarozs: 1,5 g agarozs, 10 ml MOPS/ EDTA 10 buferio, 87 ml H2O. 2. Tirpalas inkubuojamas mikrobang krosnelje arba verdanio vandens vonioje kelet minui, kol pasidaro slaidrus (agaroz isilydo). 3. Leidiama tirpalui atvsti iki ~ 60oC temperatros. Pripilama 5,1 ml 37% formaldehido ir etidio bromido iki galutins koncentracijos 0,5 g/ml, t. y. 10 l. 4. Tirpalas gerai imaiomas ir supilamas gelio formavimo sistem. 5. Po ~30 min. agaroz sukietja. Iimamos ukuts ir gelis perkeliamas elektroforezs aparat ir upilamas 1 MOPS/ EDTA buferiu. Dmesio etidio bromidas ir formaldehidas yra mutagenai. Todl gelis ruoiamas traukos spintoje, o agarozin gel lieskite tik mvdami gumines pirtines! 9.6.4. RNR analiz agaroziniame gelyje denatravimo slygomis. Mediagos ir reagentai: 1. 6RNR mgini buferis, turintis da (1,5 ml: 0,75 ml dejonizuoto formamido, 0,15 ml 10 MOPS/EDTA buferio, 0,24 ml 37%formaldehido, 0,1 ml glicerolio, 0,1 ml H2O, 0,08 ml 10% bromfenolio mlio vandeninio tirpalo ir 0,08 ml 10% ksilencianolio vandeninio tirpalo). 2. Reagentai elektroforezei: 1,5% agarozinis formaldehidinis gelis, 1 elektroforezs MOPS/ EDTA buferis. 3. DNR ilgio ymenys. Darbo eiga: 1. Po inkubacijos reakcijos miiniai paruoiami elektroforezei: reakcijos miinius pilama 5 l 6RNR mgini buferio. 2. Mginiai 15 min. inkubuojami, esant 65C temperatrai ir ataldomi lede. 3. Po 10 l paruot miini ir 10 l DNR ilgio ymens uneama agarozinio gelio ulinlius.
1 ulinlis DNR ilgio ymenys 2 ulinlis A 3 ulinlis B 4 ulinlis C
130 _________________________________
4. Atliekama RNR elektroforez naudojant 5 V/cm ~30 40 min. Jos eiga stebima atsivelgiant da, frakcionuojam kartu su RNR mginiais judjim. Elektroforez atliekama, kol greiiau judantis daas bromfenolio mlynasis nueina du tredalius gelio ilgio. 5. Pasibaigus elektroforezei gelis iimamas ir RNR analizuojama apvietus UV. Dmesio agaroziniame gelyje yra etidio bromido ir formaldehido, kurie yra mutagenai. Todl elektroforez atliekama traukos spintoje, o agarozin gel lieskite tik mvdami gumines pirtines!
9.7. Nukleoprotein i mieli iskyrimas ir analiz

9.7.1. Nukleoprotein iskyrimas. Nukleoproteinai yra sudtingi kompleksai sudaryti i baltym ir nukleorgi. Atsivelgiant nukleoproteino sudt einanios nukleorgties, yra ribo ir deoksiribonukleoproteinai. Deoksiribonukleoproteinai daniausiai yra lstels branduolyje, eina chromatino struktr. Ribonukleoprotein daugiausia yra citozolyje. Ribosoma geriausiai itirtas ribonukleoproteinas. Mediagos: 1. Eteris. 2. Sterilus H2O. 3. Smlis. 4. 5% CH3COOH. Darbo eiga:
Miels 1. Trynimas smliu 2. Veikimas NaOH 3. Veikimas CH3COOH Nukleoprotinai, itirpinti TE buferyje
5. 0,4% NaOH. 6. 10% H2SO4. 7. TE buferis (10 mM TRIS HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0).
Nukleoprotin fenolin reakcija
Nukleoprotin peptid analiz
Nukleorgi fermentin analiz
9.8 pav. Nukleoprotein iskyrimo ir analizs schema: 1. porceliano lktel dedama 1 g diovint mieli, pilama 0,5 ml eterio, 0,5 ml sterilaus H2O ir 0,5 g sterilaus smlio. Miels trinamos grstuve 23 min. 2. Mikroskopu patikrinama, ar suardytos mieli lsteli sienels. 3. lktel pilama 4 ml 0,4% NaOH ir trinama dar 45 min. 4. Gautas miinys perkeliamas centrifugin mgintuvl ir centrifuguojamas 10 min. 3000 g. 5. Supernatantas perpilamas var centrifugin megintuvl ir atsargiai maiant pilama 1,5 ml 5% CH3COOH. Pargtinus susidaro nukleoprotein nuosdos. 6. Nuosdos atskiriamos centrifuguojant 10 min. 3000 g. 7. Nukleoprotein nuosdos suspenduojamos 0,5 ml TE buferio. Suspensija padalijama po 250 ml du mgintuvlius, i kuri vienas bus skirtas nukleorgtims, o kitas peptidams nagrinti.
9.7.2
Nukleoproteininio komplekso nukleorgi analiz.
Mediagos: 1. SS fenolis, (angl. salt saturated). Drusk tirpalu prisotintas fenolis Chloroformo fenolio miinys (lygiomis trio dalimis). 2. Chloroformas. 3. 3M CH3COONa pH 5,5. 4. Etanolis. 5. TE buferis (10 mM TRIS HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). 6. 0,1M MgSO4. 7. DeoksiribonukleazI (DNazI 1 u/l). 8. RibonukleazA (RNazA 10mg/ml). 9. 6DNR mgini buferis, turintis da (10mM TRIS HCl (pH 7,6) 0,03% bromfenolio mlynasis, 0,03% ksilencianolio, 60% glicerolio, 60 mM EDTA). 10. Reagentai elektroforezei 1% agaroziniame gelyje (r. 9.5.3 sk.). 11. DNR ilgio ymenys. Darbo eiga : I. Atliekama nukleoprotein fenolin ekstrakcija, kurios metu paalinami baltymai. 1. 250 l nukleoproteino, suspenduoto TE buferyje, pripilamas lygus tris (250 l) SS- fenolio ir gerai supurtoma. 2. Centrifuguojama 5 min. kambario temperatros slygomis 10000 g. 3. Virutin (vandenin) faz surenkama var mgintuvl ir pripilama 250 l fenolio chloroformo (lygiomis trio dalimis) miinio ir gerai supurtoma. 2. Centrifuguota 5 min. kambario temperatros slygomis 10000 g. 3. Virutin (vandenin) faz surenkama var mgintuvl ir pripilama 25 l (1/ 10 trio) 3M CH3COONa pH 5,5 ir 2 triai (550 l) etanolio. 4. Inkubuojama 2 val esant 20C temperatrai. 5. Centrifuguojama 15 min. 12000 g 4C temperatros slygomis. 6. Supernatantas paalinamas ir nuosdos idiovinamos kambario temperatros slygomis arba vakuminje centrifugoje. 7. Nuosdos itirpinamos 30 l TE buferio. 8. Pamatuojama gautos mediagos sugertis UV srityje, esant bangos ilgiui 260 ir 280 nm. Apytiksliai paskaiiuojama nukleorgi koncentracija. Apskaiiuojams tris, kuriame turt bti 25 g nukleorgi. II. Atliekama iskirt nukleoprotein nukleorgi fermentin hidroliz. Nukleorgtys bus veikiamos: a) deoksiribonukleazeI (DNazeI). b) ribonukleazeA (RNazeA). c) kontrol fermentais neveikta DNR.
132 _________________________________
1. Paruoiami fermentini reakcij miiniai 3 mikrocentrifuginiuose mgintuvliuose. Pirmiausia pilama nukleorgi tirpalo, vliau sterilaus H2O, paskui 0,1M MgSO4, o galiausiai pripilama ferment.
Nukleorgtys veikiamos Reagentai Nukleorgi tirpalas 25 g Sterilus H2O 0,1 M MgSO4 Fermentas Vt - bendras reakcijos tris A su DNazeI X l Iki 20 l 1l 2 l DNazI 20 l B su RNazeA X l Iki 20 l 1l 2 l RNazA 20 l C kontrol X l Iki 20 l 1l 20 l
Dmesio ferment tirpal nepalikite ant stalo kambario temperatros slygomis, o pasinaudoj statykite atgal ledus ! 2. Reakcijos miiniai inkubuojami 1 val. 37oC temperatros slygomis. Fermentins hidrolizs produktai analizuojami elektroforezs 1 % agarozs gelyje metodu. 1 % agarozs gelis paruoiamas kaip aprayta anksiau 9.5.3 sk. 1. Po inkubacijos reakcijos miiniai paruoiami elektroforezei: reakcijos miinius pilama 5 l 6DNR mgini buferio. 2. Po 10 l paruot miini ir 10 l DNR ilgio ymens uneama agarozinio gelio ulinlius. Mgini seka:
1 ulinlis DNR ilgio ymenys 2 ulinlis A 3 ulinlis B 4 ulinlis C
3. Atliekama elektroforez naudojant 5 V/cm ~30 40 min. Jos eiga stebima atsivelgiant da, frakcionuojam kartu su DNR mginiais, judjim. Elektroforez atliekama, kol greiiau judantis daas bromfenolio mlynasis nueina du tredalius gelio ilgio. 4. Pasibaigus elektroforezei gelis iimamas ir DNR analizuojama apvietus UV. Dmesio agaroziniame gelyje yra etidio bromido, kuris yra mutagenas. Agarozin gel lieskite tik mvdami gumines pirtines!
9.7.3. Nukleoprotein komplekso peptid analiz Mediagos: 1. Reagentai baltym elektroforezei denatravimo slygomis NDS (NDS natrio dodecilsulfatas) poliakrilamidiniame gelyje (r. laboratorinio darbo Baltym elektroforez apraym). 2. Baltym molekulins mass ymenys. 3. 2 baltym mgini buferis. Darbo eiga: III. Naudojantis baltym koncentracijos kalibracine kreive (Bredfordo metodas) apytiksliai vertinama iskirto nukleoprotein tirpalo baltym koncentracija (antrasis mginys, 9.7.1 sk). 1. Apskaiiuojama, kokiame nukleoprotein tirpalo tryje yra 100 g ir 150 g baltym. 2. Paruoiami 3 miiniai mikrocentrifuginiuose mgintuvliuose baltym elektroforezei:
1 Baltym molekulins mass ymenys 10 l baltym mgini buferis 10 l 2 100 g nukleoprotein X l baltym mgini buferis X l 3 150 g nukleoprotein Y l baltym mgini buferis Y l
1 baltym molekulins mass ymenys (kaip nurodyta lentelje), 2 ir 3 nukleoprotein baltymai. Pirmiausia pilama nukleoprotein tirpalo, kuriame yra 100 g ir 150 g baltym, vliau lygus tris 2 baltym mgini buferio.
3. Mginiai denatruojami verdanio vandens vonioje 4 min. 4. Atliekama baltym elektroforez denatravimo slygomis NDS poliakrilamidiniame gelyje (r. laboratorinio darbo Baltym elektroforez apraym).
9.8. Chromosomins DNR iskyrimas i eukariotini lsteli

Mediagos: 1. Homogenizavimo buferis (0,1 M NaCl, 0,2 M sacharoz, 0,01 M EDTA, 0,3M TRIS, pH 8,0). Laikyti esant 4C temperatrai. 2. 10% natrio dodecilsulfatas (NDS). 3. Chloroformas. 4. SS fenolis, (angl. salt saturated). Drusk tirpalu prisotintas fenolis. 5. 8 M kalio acetatas. 6. Etanolis.
134 _________________________________
Darbo eiga: 1. 10 ml polipropilenin mgintuvl dedama apie 100 mg audinio (pvz., iurks kepen), i kurio bus iskiriama DNR. 2. Pilama 2 ml homogenizavimo buferio. 3. Audiniai homogenizuojami tol, kol nelieka matom kiet daleli. 4. Pilama 125 l 10% natrio dodecilsulfato tirpalo ir sumaioma purtant. 5. Inkubuojama vandens vonioje 30 min. 65C temperatros slygomis. 6. Pilama 350 l 8 M kalio acetato tirpalo ir sumaioma purtant. Inkubuojama 60 min., esant 0C temperatrai. 7. Centrifuguojama 5000 g 10 min. 4C temperatros slygomis. 8. Supernatantas perpilamas var 10 ml mgintuvl. Nuosdos paalinamos. 9. Pilama 2 ml chloroformo ir 2 ml SS-fenolio. Sumaioma atsargiai vartant mgintuvl. Centrifuguojama 1500 g 10 min. 10. Virutin vandenin faz perpilama var mgintuvl. Apatin organin faz paalinama. vandenin faz pilama 2 ml chloroformo. Sumaioma atsargiai vartant mgintuvl. 11. Centrifuguojama 10000 g 15 min. Virutin vandenin faz perpilama nauj mgintuvl. Apatin chloroformo faz paalinama. 12. vandenin faz pilama 5 ml etanolio ir nusodinama DNR. Sumaioma atsargiai vartant mgintuvl. Centrifuguojama 1500 g 10 min. 13. Supernatantas paalinamas ir ant nuosd pilama 5 ml 80% etanolio. Sumaioma atsargiai vartant mgintuvl. 14. Centrifuguojama 1500 g 5 min. 15. Etanolis paalinamas ir nuosdos idiovinamos kambario temperatros slygomis, palikus atvir mgintuvl. 16. Nuosdos itirpinamos 300 l steriliaus TE buferio. DNR preparatas laikomas 20C temperatros slygomis. 17. DNR koncentracija nustatoma spektrofotometriniu metodu matuojama tirpalo sugertis ties 260 nm viesos bangos ilgiu. Jeigu DNR tirpalo optinis tankis 1,0, tai dvigrands DNR koncentracija yra 50 g/ml. 18. vertinamas DNR varumas. Tam tikslui pamatuojama DNR tirpalo sugertis ties 280 nm, kuri lemia baltymai. Jeigu sugerties ties 260 nm santykis su sugertimi ties 280 nm yra daugiau negu 1,8, laikoma, kad DNR tirpale nra baltym priemai. (A260/A280>1,8).
Literatra
1. Davis L.G., Dibner M.D., Battey J.F. 1986. Basic methods in molecular biology. Elsevier Science Publishing Co. Inc. 2. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G. Smith J.A., strukhl K (eds.). 2000. Current protocols in Molecular Biology. J. Wiley & Sons Inc.
a. Triacilgliceroli hidroliz
Lipidais vadinamos nepolins mediagos, kurios i organizm ekstrahuojamos organiniais tirpikliais pvz., chloroformu, etanoliu, eteriu, ir kurios blogai tirpsta vandenyje. Tai yra didel grup mediag, kurios skiriasi struktra, funkcijomis ir cheminmis savybmis. Riebalai, aliejai, vakai, membran lipidai, tam tikri vitaminai ir hormonai priklauso iai margai jungini grupei. Jie plaiai paplit gyvjame pasaulyje ir atlieka tam tikras funkcijas. Riebalai daugiausia kaupiasi riebalinse lstelse, riebal leli forma. Jie yra organizmo energijos altinis. Fosfolipidai, susijung su baltymais sudaro membranas, kurios apgaubia lstel ir organeles. Riebalai apsaugo organizm nuo termininio ir fizikinio poveikio. Augaluose vakai sudaro papildom apsaugin sluoksn. Bits i vako gamina korius. Lipidams priklauso cholesterolis, kuris labai svarbus membran struktrai palaikyti, i jo sintetinamas vitaminas D, tulies rgtys, lytiniai hormonai ( estrogenas, testosteronas) ir adrenokortikotropiniai hormonai. Terpenai, pvz., karotinoidai, reikalingi fotosintezs, regjimo procesams. Augal eterini aliej kvap lemia terpenai. Vieni i lipid atstov yra acilgliceroliai, kurie yra glicerolio ir riebal rgi esteriai. Vakai yra auktesnij alkoholi ir riebal rgi esteriai. Glicerofosfolipidai sudaryti i glicerolio, riebal rgi ir fosfato rgties, prie kurios gali bti prijungtas pakaitas cholinas, serinas, 2-aminoetanolis, ar kiti alkoholiai. Jeigu alkoholis yra ne glicerolis, o aminoalkoholis sfingozinas, susidaro sfingolipidai. Sfingolipidams priklauso sfingomielinai, cerebrozidai, gangliozidai. Sfingomielinai sudaryti i sfingozino, riebal rgi, fosfato rgties ir daniausiai cholino. cerebrozid sudt eina sfingozinas, riebal rgtys ir monosacharidai. Gangliozidai susidaro susijungus sfingozinui, riebal rgtims ir oligosacharidui. Prie pastarojo prisijungusi sialo rgtis suteikia gangliozidui neigiam krv. Lipidai, kuri sudt eina fosforo rgtis yra vadinami fosfolipidais, o turintys angliavandeni glikolipidais. Acilgliceroliai, nepolins, hidrofobins, vandenyje netirpios mediagos dar vadinamos trigliceridais, riebalais arba neutraliaisiais riebalais. Jie yra glicerolio ir riebal rgi esteriai.
Prie glicerolio gali bti prijungusios 1, 2 ir 3 riebal rgi liekanos , taigi sintetinami mono-, di- ir triacilgliceroliai. triacilgliceroli sudt einanios riebal rgtys gali bti vienodos, pavyzdiui tristearino ar trioleino rgtys. Gamtoje daniausiai bna skirtingo ilgio ir sotumo
136 _________________________________
laipsnio riebal rgtys. Svieste yra daug palmitino rgties, pagrindin smen aliejaus dal sudaro linoleno rgtis. Triacilgliceroli lydymosi temperatra priklauso nuo nesoij riebal rgi buvimo. Augaluose vyrauja nesoiosios riebal rgtys, todl i j gauti triacilgliceroliai kambario temperatros slygomis yra skysti ir vadinami aliejais. Triacilgliceroliai yra veiksminga energijos saugojimo forma. J dka, organizmui badaujant, galima apsirpinti energija 23 mnesiams. Glikogeno atsarg utenka tiktai vienai parai. Vakai yra esteriai, sudaryti i ilgj anglies grandini (C16 C30) alkoholi ir riebal rgi (C14 C36). vak sudt eina cetilo (C16), cerilo (C26), miricilo (C30) ir kiti alkoholiai bei soiosios ar nesoiosios, didelio lyginio anglies atom skaiiaus monokarboksirgtys. Bendra vak formul: CH3(CH2)nOCO(CH2)nCH3 Vakus iskiria augalai ir gyvnai. Vak funkcija yra sudaryti apsaugines dangas. Pauki plunksnos ir gyvuli kailis turi vakin apdangal, kuris apsaugo nuo sulapimo. Vakin lap ir vaisi danga maina vandens nuostolius, apsaugo nuo infekcijos. Pagrindinis bii vako sandas yra miricilpalmitatas, CH3(CH2)29OCO (CH2)14CH3. Riebal rgtys Daugumos lipid sudtyje randamos riebal rgtys. Riebal rgtys yra ilgos angliavandenilins grandins monokarboksirgtys. Gamtoje aptinkama apie 100 riebal rgi, turini 436 anglies atomus, jos retai bna laisvos, daniausiai yra esterifikuotos. Bendra riebal rgi formul yra i: CH3(CH2)nCH2CH2COOH. Gamtoje daniausiai sutinkamos riebal rgtys, kuri molekuls yra neakotos ir turi lygin anglies atom skaii. Riebal rgtys gali bti soiosios ir nesoiosios. Gali bti vienas ar keli dvigubieji ryiai. Labai svarbios organizmo vystymuisi yra polinesoiosios riebal rgtys (PUFA). Nesoiosiose riebal rgtyse dvigubieji ryiai nesudaro konjuguotos sistemos. Jie yra atskirti metileno (CH2) grupe CH=CH CH2CH=CH. Be to, nesoiosios riebal rgtys yra cis konfiguracijos. Dvigubojo ryio padtis ymima simboliu , skaiiais paymima tarp kuri C atom is ryys susidaro. Pavyzdiui, C18:19 reikia , kad riebal rgtis sudaryta i 18 anglies atom, turi vien dvigubj ry, kuris yra tarp 9 ir 10 anglies atom. Kartais vartojama alternatyvi terminologija: omega (). Nefermentin triacilgliceroli (riebal) hidroliz vyksta veikiant riebalus rgtimis, armais ir perkaitintais vandens garais. Hidrolizuojant riebalus, susidaro glicerolis ir
riebal rgtys. Veikiant armais, gaunamos riebal rgi druskos. Riebal rgtys netirpsta vandenyje. J ir armini metal druskos - tirpieji muilai. Riebal rgi ems armini ir sunkij metal druskos vandenyje netirpsta. Tirpieji muilai pavirinio aktyvumo mediagos. Darbo metu hidrolizuojami riebalai, esant spiritiniam kalio hidroksido tirpalui. Susidarantys kalio muilai gerai tirpsta vandenyje. Pargtinus j tirpal susidaro netirpios riebal rgtys. Reagentai 1. Riebalai, 0,5 g. 2. Spiritinis kalio armo tirpalas (5 g kalio hidroksido ildant itirpinami 10 ml vandens ir pilami 100 ml etanolio). 3. 10% druskos rgtis, 50 ml. 4. Eteris, 20 ml. 5. Etanolis, kuriame yra 1 ml 10% nario karbonato tirpalo ir 0,2 ml spiritinio fenolftaleino tirpalo, 50 ml. 6. 0,2 M CuSO4, 10ml. Darbo eiga a) riebal hidroliz 1. 0,5 g riebal dedama mgintuvl ir pilama 5 ml spiritinio kalio hidroksido tirpalo. Mgintuvlis ukemamas kamiu su statytu vamzdeliu (grtamasis aldytuvas). 2. Hidrolizuojama verdanio vandens vonioje 30 min. 3. Hidrolizei pasibaigus, skystis perpilamas porceliano lktel, pilama 10 ml vandens ir ildoma ant verdanio vandens vonios, kad igaruot spiritas. b) glicerolio nustatymas riebal hidrolizs produktuose 1. mgintuvl, kuriame yra 1 ml po riebal hidrolizs gauto vandeninio tirpalo (a bandymas), pilama 0,1ml 0,2 M CuSO4 tirpalo ir supurtoma. c) riebal rgi iskyrimas 1. gaut porceliano lktelje tirpal (a bandymas) pilama 10% HCl, kol nustos susidaryti nuosdos. Pilant HCl, skystis maiomas lazdele. 2. Riebal rgi nuosdos filtruojamos ir plaunamos ant filtro distiliuotu vandeniu, kad pasialint HCl. Filtratas neturi sukelti rgios reakcijos (nustatoma naudojant universalaus indikatoriaus popieriuk). 3. Riebal rgi nuosdos itirpinamos 1ml eterio, vliau pilama 1ml etanolio, kuriame yra natrio karbonato tirpalo ir fenolftaleino. Rausva etanolio spalva inyksta.
138 _________________________________
Kontroliniai klausimai: 1. 2. 3. 4. 5. I ko sudaryti glicerofosfolipidai? I ko sudaryti sfingolipidai, cerebrozidai, gangliozidai? Paraykite triacilgliceroli, diacilgliceroli ir monoacilgliceroli formules. Dl kieno poveikio hidrolizuojami riebalai? Kodl inyksta rausva etanolio spalva, pylus riebal rgi eterinio tirpalo?
10. Pradinio fermentins reakcijos greiio nustatymas ______________________________________ 1. Saugaus darbo biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls ________________________ 139
10.
Pradinio fermentins reakcijos greiio nustatymas
10.1. Fermentai biologiniai katalizatoriai

Gyvuose organizmuose chemins reakcijos vyksta labai greitai, nes jas katalizuoja baltymai, vadinami fermentais. Ferment katalizuojamos reakcijos tai procesai, kuri metu katalizikai aktyvs baltymai (fermentai) katalizuoja substrat virtim reakcijos produktais. Ferment savybs Fermentai yra saviti savo substratams , jie efektyviai veikia (t. y. pakanka labai ma j koncentracij) velniomis slygomis (atmosferos slgyje, reakcijos terps pH neutralus, temperatra nedidel). Katalizuodami reakcijas fermentai nesusinaudoja ir dl reakcijos nepakinta. Jie nepakeiia reakcijos pusiausvyros (katalizuoja ir tiesiogin ir atvirktin reakcijas), bet 1010 1016 kart padidina reakcijos pusiausvyros pasiekimo greit (palyginant su reakcijomis, vykstaniomis be katalizatoriaus). Atsivelgiant lstels ar organizmo poreikius, ferment veikla yra reguliuojama (ferment aktyvumas didinamas arba mainamas). Ferment aktyvumas reguliuojamas prijungiant tam tikrus reguliacinius baltymus, aktyviklius ar slopiklius (inhibitorius), alosterinius elektorius ir panaiai. Paprasiausia fermentin reakcija reaguojant vienam substratui apraoma lygtimi:
Substrato (S) molekul reaguoja su fermentu (E), susidaro fermento ir substrato (ES) kompleksas, kuris virsta produktu (P).
10.2. Katalizs samprata

Tarp sistemoje esani mediag vyksta chemin reakcija, jei i mediag molekuls yra suadinamos ir aktyvinamos. Energija reikalinga tam, kad molekuls pereit pereinamj bsen ir galt sveikauti, vadinama aktyvacijos energija EA . EA energijos kiekis, btinas , kad visos 1 molio mediagos molekuls, esant tam tikrai temperatrai, pasiekt pereinamj bsen.
140 _________________________________
Aktyvacijos barjeras Reakcijos greitis yra proporcingas molekuli, pasiekusi pereiNekatalizuojamos namj bsen, koncentracijai. reakcijos ????? Reakcijos greit galima padidinti ?? ???? dviem bdais: 1. Didinant temperatr Sistemos laisvosios suteikti papildomos enerenergijos pokytis gijos (t. y. didinti ilumin molekuli judjim, kartu vidin j energij). PadiReakcijos eiga dinus temperatr 10 oC reakcijos greitis padidja 10.1 pav. Nekatalizuojamos ir katalizuojamos apytikriai 23 kartus. Bioloreakcijos potencin kreiv ginms sistemoms is bdas nra veiksmingas, nes temperatros didinimo ribos yra gana maos. Fermentai yra baltymai, daugumos j denatracija prasideda, esant ~ 60oC temperatrai. 2. Mainant aktyvacijos energij.
Reaguojant substratui su fermentu, tarpinio fermento ir substrato komplekso (ES) susidarymo aktyvacijos energija yra daug maesn, negu tiesiogiai substrato molekulms virstant produktu. Taigi, fermentai pagreitina mediag virsmus sumaindami aktyvacijos energij. 10.2.1 Ferment struktra ir veikimo ypatumai Katalizinis ferment aktyvumas priklauso nuo natyvios baltymo struktros buvimo. Kaitinant, veikiant denatruojaniais reagentais, keiiant H+ koncentracij ar veikiant peptidazmis (fermentais skaidaniais baltymus), katalizinis aktyvumas sumaja arba visai panaikinamas. Baltymas yra katalizikai aktyvus, kai pirmin, antrin ir tretin jo struktros nepaeistos. Yra ferment, kurie sudaryti tik i aminorgi liekan ir neturi joki kit chemini grupi (pvz., kasos ribonukleaz). Taiau daugelio ferment aktyvumui pasireikti yra btini papildomi cheminiai sandai kofaktoriai. Tai gali bti metal jonai (Mg2+, Mn2+, Ca2+, Fe2+ , Cu2+, K+ ir kt.) ar sudting organini jungini molekuls, vadinamos kofermentais (danai kofermentais bna vitaminai ar j dariniai: tiamindifosfatas B1, piridoksalfosfatas B6 , nikotinamidiniai , flavininiai kofermentai ir kt.). Kofermentai tiesiogiai dalyvauja reakcijoje ir danai atlieka atom ar funkcini grupi neikli vaidmen. Daugelio ferment kataliziniam aktyvumui yra btinas tiek kofermentas, tiek metalo jonai. Baltymas (apofermentas) kartu su kofermentu yra vadinamas holofermentu.
Sistemos laisvoji energija
Nedidel, bet labai svarbi fermento molekuls dalis yra jos aktyvusis (katalizinis) centras, kur suformuoja baltym sudarani aminorgi liekan atitinkamos funkcins grups. Aktyvj centr sudaranios aminorgi liekanos gali bti gana nutolusios viena nuo kitos pirminje baltymo struktroje. Jos suartja dl polipeptidins grandins erdvinio isidstymo. 1894 m. Emilis Fieris (E. Fischer) pasil hipotez, kuria remiantis aktyvusis fermento centras turi atitikti substrato molekuls konformacij (spyna ir raktas modelis). Substrato molekul privalo turti du struktros elementus savitj chemin ry, kur atakuoja fermentas ir funkcines grupes, surianias substrat su aktyviuoju fermento centru taip, kad atakuojamas ryys bt tinkamu bdu orientuotas fermento katalizini grupi atvilgiu. Vieni fermentai yra visikai saviti konkreiam substratui, kiti sveikauja su vairi substrat konkreiomis vietomis. Pavyzdiui, aspartaz prijungia amoniak tik prie fumaro rgties dvigubojo ryio (susidaro L-aspartatas). io fermento substratu negali bti jokia kita nesoioji rgtis. Platesnio savitumo pavyzdys galt bti peptidazs, skaidanios peptid ir polipeptid peptidinius ryius. Daugelio ferment veikim galima nuslopinti paveikus tam tikrais cheminiais reagentais, vadinamais slopikliais (inhibitoriais). Slopikli veikimo tyrimai suteikia duomen apie ferment aktyviojo centro funkcines grupes, katalizs mechanizm, substratin ferment savitum ir lsteli mediag apykaitos kelius. Fermentui reaguojant su slopikliu (I) susidaro fermento slopiklio (EI) kompleksas. Atsivelgiant EI komplekso tvirtum, slopinimas gali bti grtamasis ir negrtamasis. Negrtamojo slopinimo atveju slopiklis stipriai susiria su fermento molekule ir EI kompleksas labai ltai skyla . Grtamojo slopinimo metu slopiklis silpnai susiria su fermentu ir, sumainus slopiklio koncentracij (dializuojant ar skiediant tirpal) fermento ir slopiklio kompleksas lengvai skyla laisv ferment ir slopikl, fermento aktyvumas atsinaujina. Grtamasis slopinimas skirstomas konkurencin, nekonkurencin, bekonkurencin, mirj ir kitus. Esant konkurenciniam slopinimui, slopiklis ir substratas jungiasi prie tos paios fermento vietos, prie aktyviojo fermento centro. Didels substrato koncentracijos maina slopiklio veikim. Substratas ir slopiklis turi panaias struktras ir konkuruoja vienas su kitu dl susiriimo su fermentu. Nekonkurencinio slopinimo atveju substratas ir slopiklis reaguoja ne su ta paia fermento vieta ir substrato perteklius nesumaina slopiklio poveikio. Nekonkurencinio slopinimo metu substratas ir slopiklis nekonkuruoja tarpusavyje. Bekonkurencinio slopinimo atveju slopiklis nesijungia su fermentu, kai reakcijos terpje nra substrato. Slopiklis susijungia su ES. Reakcija slopinama susidarius EIS kompleksui.
142 _________________________________
10.3. Fermentini reakcij greiio priklausomumas nuo substrato koncentracijos

Substrato koncentracija, reakcijos terps pH ir temperatra turi didels takos fermentini reakcij greiiui. Fermentins reakcijos greiio priklausomumas nuo substrato koncentracijos apraomas hiperbole ir pavaizduotas 10.2 pav. Esant maoms substrato koncentracijoms, reakcijos greitis tiesiogiai priklauso nuo substrato koncentracijos. Toliau didinant substrato koncentracij reakcijos greitis ltja ir asimptotikai artja prie Vmax, bet niekuomet jo nepasiekia. Paprasiausia fermentin reakcija yra apraoma tokia lygtimi:
10.2 pav. Fermentins reakcijos greiio priklausomumas nuo substrato koncentracijos
k+1 k 1 k+2
fermento ir substrato komplekso susidarymo reakcijos greiio konstanta fermento ir substrato komplekso skilimo substrat ir ferment reakcijos greiio konstanta fermento ir substrato komplekso skilimo produkt ir ferment reakcijos greiio konstanta
iuo atveju reakcija atliekama taip, kad susidariusio produkto koncentracija yra nedidel ir nevyksta grtamoji reakcija. Tokios reakcijos greitis priklauso nuo susidariusio fermento ir substrato komplekso koncentracijos ir jo skilimo produkt greiio. Tuo atveju, kai substrato koncentracija yra tiek didel, kad visas reakcijoje dalyvaujantis fermento kiekis sudaro fermento ir substrato kompleks, reakcija vyksta didiausiu greiiu Vmax. L. Michaelis ir M. Menten apskaiiavo fermentins reakcijos greiio priklausomum nuo substrato koncentracijos. Jie matavo pradin reakcijos greit (V0), kai susidariusio reakcijos produkto koncentracija yra labai maa. Fermentins reakcijos greiio priklausomumas nuo substrato koncentracijos ireikiamas lygtimi:
Vienas svarbiausi kinetini fermentins reakcijos parametr (rodikli) yra Michaelio konstanta KM, kuri yra tiesiogins ir atvirktins fermentins reakcijos greii konstant santykis:
KM yra ireikiama koncentracijos vienetais (M). Michaelio konstanta yra lygi substrato koncentracijai, kuriai esant reakcijos greitis yra lygus pusei didiausio (maksimalaus) greiio. KM galima nustatyti i grafiko paymjus reakcijos greiio priklausomum nuo substrato koncentracijos (10.2 pav.), taiau i reikm yra netiksli, nes nemanoma tiksliai nustatyti Vmax. Norint i bandymo duomen nustatyti KM ir Vmax reikmes, daniausiai vartojamos dvigubos atvirktins Lainuivero ir Berko (Lineweaver-Burk) koordinats paymima 1/V0 priklausomyb nuo 1/[S]. Paymjus bandymo metu gautus takus, per juos nubriama ties, kertanti koordinai ais. Abscisi ayje ties susikerta take, atitinkaniame 1/KM, o ordinai ayje take 1/Vmax. Tiess posvyrio kampas yra lygus KM/Vmax. Pastaba: Sudtingiems fermentams, turintiems ne tik aktyviuosius, bet ir reguliacinius (alosterinius) centrus, Michaelio ir Menten kinetikos dsningumai netaikomi. Pradinis reakcijos greitis yra matuojamas, esant pastoviam fermentins reakcijos greiiui, t. y. tada, kai tenkinamos stacionariosios (nuostoviosios) bsenos slygos. Juo ilgiau trunka nuostovusis vyksmas, tuo patogiau ir tiksliau galima imatuoti pradin reakcijos greit. 10.3 pav. Reakcijos greiio priklausoPradinio reakcijos greiio faz apibdina mumas nuo substrato koncentracijos Lainuivero-Berko koordinatse pastovus greitis, t. y. vienodai didjantis reakcijos produkto kiekis. Tai trunka kelet keliasdeimt sekundi po reagent sumaiymo ir priklauso nuo reakcijos slyg. Nubraiius fermentins reakcijos greiio priklausomumo nuo substrato koncentracijos grafik, ivedama liestin, einanti per koordinai pradios tak. Pradinis reakcijos greitis nustatomas i tiess posvyrio kampo: V0 = d[P]/dt = tg Kampo, kur sudaro liestin su abscisi aimi, tangent apskaiiuojame i staiojo trikampio statini santykio. Reakcijos greitis ireikiamas substrato koncentracijos pokyiu per minut.
144 _________________________________
10.4 pav. Pradinio reakcijos greiio nustatymas
10.4. Alkoholio dehidrogenazs katalizuojamos reakcijos pradinio reakcijos greiio nustatymas

Alkoholio dehidrogenaz (ADH) katalizuoja i reakcij:
Alkoholio dehidrogenaz (1.1.1.1) yra oksidoreduktaz (katalizuoja oksidacijos redukcijos reakcijas). Mieli ADH molekulin mas yra 141 kDa. Fermento molekul sudaryta i keturi subvienet, ji turi keturis tvirtai suritus Zn atomus. Mieli lstelse reakcijos pusiausvyra yra nukreipta acetaldehido redukcijos iki etanolio kryptimi. Tai paskutin alkoholins fermentacijos stadija. In vitro fermentas daniausiai tiriamas ir naudojamas arminje pH srityje, t. y. slygomis, kurios nukreipia reakcijos pusiausvyr etanolio oksidacijos kryptimi. Reakcijos greitis nustatomas matuojant NADH koncentracijos didjim. Tai patogu atlikti pamatuojant spektrofotometru optin tank, esant viesos bangos ilgiui = 340 nm. ia savybe pasinaudojama tiriant procesus, kuriuos katalizuoja nikotinamidinius kofermentus turinios dehidrogenazs. Vykstant oksidacijos redukcijos procesams labai patogu stebti vienos kofermento formos virtim kita, stebint NADH koncentracijos kitim (didjim ar majim) reakcijos miinyje. is metodas taikomas ir vadinamiesiems coupled assay sujungtiems (konjunguotiems) testams (pvz., heksokinazs ) aktyvumui vertinti, ATP koncentracijai nustatyti, kai sistemoje kaip pagalbinis fermentas naudojama gliukozs 6-fosfato dehidrogenaz.
Pamatavus optin tank tam tikru laiko momentu, galima apskaiiuoti NADH (NADPH) koncentracij reakcijos miinyje tuo laiko momentu. c = A/M l c matuojamos mediagos koncentracija (M), A optinis tankis (esant = 340 nm), M molins ekstinkcijos koeficientas (M1 cm1), l kiuvets plotis (cm). NADH molins ekstinkcijos koeficientas M = 6220 M1 cm1. Alkoholio dehidrogenazs aktyvumo vienetas fermento kiekis, kuris redukuoja 1 mol NAD+ per 1 min. standartinmis (grietai apibrtomis) slygomis. Savitasis fermento aktyvumas ireikiamas aktyvumo vienetais vienam mg baltymo (U/mg). Darbo tikslas: 1. Nustatyti pradinio reakcijos greiio priklausomum nuo fermento kiekio. 2. Itirti pradinio reakcijos greiio priklausomum nuo substrato (etanolio) koncentracijos. 3. vertinti tiriamos reakcijos kinetinius parametrus (KM, Vmax). 10.4.1. Pradinio reakcijos greiio priklausomumo nuo fermento kiekio nustatymas Reagentai: 1. 100 mM TRIS HCl buferis, pH 8,8 . 2. 25 mM kalio fosfato buferis pH 7,5. 3. 1 mg/ml NAD+ (tirpinama 25 mM kalio fosfato buferyje, pH 7,5 4. 3 M etanolis 5. 1 mg/ml ADH (liofilizuotas fermentas tirpinamas 25 mM kalio fosfato buferyje, pH 7,5).
146 _________________________________
Darbo eiga: 1. spektrofotometro kiuvet pilama: 2,8 ml Tris-HCl buferio pH 8,8; 0,1 ml (100 l) 3 M etanolio ir 0,1 ml (100 l) NAD+. 2. Kiuvet dedama spektrofotometro ulinl ir prietaisas nustatomas taip, kad rodyt optin tank lyg 0, esant bangos ilgiui = 340 nm. 3. Kelias minutes stebima (arba uraoma saviraiu), ar vyksta tuioji (blank) reakcija ( ar nesikeiia tirpalo sugertis, t. y. NADH susidaro ir nesant kiuvetje fermento). 4. kiuvet, kurioje stebtas tuiojo bandymo greitis, pridedamas tam tikras fermento tirpalo kiekis (10, 20, 30, 40, 50 l), greitai maioma ir kas 15 30 sek. 34 min. matuojamas tirpalo optinis tankis. Reikia parinkti toki fermento koncentracij, kad susidariusio NADH kiekis tiesikai didt laiko atvilgiu, t. y. per vienod laiko tarp (pvz., kas 30 sek.) tirpalo optinis tankis padidt tuo paiu dydiu. Taisyklingi matavimai yra, jei optinis tankis, esant bangos ilgiui 340 n m, per minut pakinta 0,02 0,04 vieneto (340/min = 0,02 0,04). 5. Atsivelgiant nustatytus duomenis, grafikai paymimas optinio tankio priklausomumas nuo laiko (ordinai ayje paymimas A340, abscisi laikas sekundmis). Pridedamo fermento kiekis taip parenkamas, kad grafikas bt kuo panaesnis ties.Atsivelgus io bandymo rezultatus apskaiiuojama NADH koncentracija (M) kiekvienu laiko momentu, t. y. prajus 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150, 180 sek. nuo reakcijos pradios. 6. Upildoma 10.1 lentel :
10.1 lentel. Susidariusio NADH koncentracijos priklausomumas nuo reakcijos trukms

Reakcijos trukm, sek. 15 15 30 45 60 75 90 120 150 180 A340 [NADH], M
7. Nubraiomas susidariusio NADH koncentracijos priklausomumo nuo laiko grafikas (ordinai ayje paymima NADH koncentracija, abscisi reakcijos trukm). Esant optimaliam fermento kiekiui, susidariusio NADH koncentracija tiesikai priklauso nuo laiko. Tuo atveju pradinis reakcijos greitis skaiiuojamas
atsivelgiant tiess posvyrio kampo tangent. Esant didesniam u optimal fermento kiekiui, grafikas yra kreivs formos. Gautai kreivei nubriama liestin, ir apskaiiuojamas pradinis reakcijos greitis (V0). 8. V0 taip pat nustatomas esant dar kelioms ADH koncentracijoms. 9. Nubraiomas V0 priklausomumo nuo fermento kiekio grafikas : ordinai ayje paymimas V0, abscisi fermento kiekis . 10.4.2. Pradinio reakcijos greiio priklausomumas nuo etanolio koncentracijos Reagentai: 1. 100 mM TRIS HCl buferis, pH 8,8 . 2. 25 mM kalio fosfato buferis pH 7,5. 3. 1 mg/ml NAD+ (tirpinama 25 mM kalio fosfato buferyje, pH 7,5 4. 3 M etanolis 5. 1 mg/ml ADH (liofilizuotas fermentas tirpinamas 25 mM kalio fosfato buferyje, pH 7,5). Darbo eiga: 1. Nustatomas pradinis reakcijos greitis (V o), esant skirtingoms etanolio koncentracijoms. 2. kiuvet pilami skirtingi etanolio kiekiai (25l, 50 l, 100 l, 150 l, 200 l, 300 l). ios reakcijos pradedamos pridedant kiuvet anksiau atrinkt optimal fermento kiek. 3. Nubraiomas susidariusio NADH koncentracijos priklausomumo nuo laiko grafikas, esant skirtingoms etanolio koncentracijoms ir vertinamas pradinis reakcijos greitis. Upildoma 10.2 lentel
1 0 . 2 l e n t e l . Reakcijos greiio priklausomumas nuo etanolio koncentracijos
Pridedamo etanolio kiekis, l 25 50 100 150 200 300 Etanolio koncentracija mginyje, M Pradinis reakcijos greitis, M/min. 1/V0 1/[S]
148 _________________________________
4. Nubraiomas reakcijos greiio priklausomumo nuo etanolio koncentracijos grafikas (Lainuiverio ir Berko koordinatse). 5. Apskaiiuojma Michaelio konstanta KM ir maksimalus reakcijos greitis Vmax
10.5. armins fosfatazs i E. coli pradinio reakcijos greiio nustatymas

armin fosfataz (EC 3.1.3.1) katalizuoja fosforo rgties liekanos atsklim nuo monoesterint jungini galo. Ji plaiai taikoma ribo- ir deoksiribonukleotid galiniam fosfatui paalinti. armin fosfataz (AP Alkaline Phosphatase) i E. coli yra dimerinis baltymas, kurio sudt eina Zn2+ ir Mg2+. Du Zn2+ jonai yra btini fermento molekuls aktyvumui atsirasti. Mg2+ didina Zn-turinio apofermento aktyvum. Fermento veikim slopina neorganinis fosfatas. Fermento aktyvumas nustatomas vartojant Gereno ir Levintalio (Garen ir Levinthal, 1960) metodik. Apie reakcijos greit sprendiama i optinio tankio 405420 nm srityje padidjimo, atsirandanio dl susidariusio p-nitrofenolio (p-NP).
Fermento vienetu laikomas fermento kiekis, kuris iskiria 1 mol p-nitrofenolio per 1 min., esant 250C temperatrai, pH 8, apibrtomis slygomis. Darbo tikslas: 1. Nustatyti pradinio reakcijos greiio priklausomum nuo fermento kiekio. 2. Itirti pradinio reakcijos greiio priklausomum nuo substrato (p-NPP) koncentracijos. 3. vertinti tiriamos reakcijos Michaelio konstant ir maksimal reakcijos greit. Reagentai: 7. 1,5 M TRIS HCl buferis pH 8,0. 8. 0,003 M p-nitrofenilfosfatas (p-NPP). 9. 0,03 M p-nitrofenilfosfatas (p-NPP). 10. Fermento tirpalas. Parenkama tokia fermento koncentracija , kad stebint sugerties kitim ties 410 nm ilgio banga, sugerties pokytis per minut (410/min.) bt 0,02 0,04.
Darbo eiga: 1. Spektrofotometras nustatomas ties 410 nm ilgio banga. 2. kiuvet pilama 2 ml Tris-HCl buferio pH 8,0 ir 1 ml 0,003 M p-NPP. 3. 45 min. stebimas tuiasis (blank) greitis, vliau pridedama 0,1 ml praskiesto fermento. 4. 35 min. stebimas sugerties kitimas. Fermento aktyvumas apskaiiuojamas i formuls : U/mg = 410/min. 1000 1,62104 mg fermento/ml reakcijos miinio
kur 1,62104 yra p-nitrofenolio (p-NP) molins ekstinkcijos koeficientas. 10.5.1. Pradinio reakcijos greiio priklausomumo nuo fermento kiekio nustatymas Reagentai: 1. 1,5 M TRIS HCl buferis pH 8,0. 2. 0,003 M p-nitrofenilfosfatas (p-NPP). 3. 0,03 M p-nitrofenilfosfatas (p-NPP). 4. Fermento tirpalas. Parenkama tokia fermento koncentracija , kad stebint sugerties kitim ties 410 nm ilgio banga, sugerties pokytis per minut (410/min.) bt 0,02 0,04. Darbo eiga: 1. kiuvet, kurioje stebtas tuiasis (blank) greitis, pilamas tam tikras fermento tirpalo kiekis (10100 l), greitai imaioma ir kas 1530 sek. 34 min. matuojamas tirpalo optinis tankis. 2. Reikia parinkti toki fermento koncentracij, kad susidariusio p-NP kiekis tiesikai didt laiko atvilgiu, t. y. per vienod laiko tarp (pvz., kas 30 sek.) tirpalo optinis tankis padidt tuo paiu dydiu. 3. Grafikai paymima optinio tankio priklausomyb nuo laiko (ordinai ayje paymima A410, abscisi laikas sekundmis). Pilamo fermento kiekis parenkamas taip, kad grafikas bt kuo panaesnis ties. 4. Apskaiiuojama p-NP koncentracija (M) kiekvienu laiko momentu, t. y. prajus 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150, 180, 210, 240 sek. nuo reakcijos pradios. Upildoma 10.3 lentel.
150 _________________________________
10 3 lentel. Susidariusio p-NP koncentracijos priklausomumas nuo reakcijos trukms

Reakcijos trukm, sek. 15 30 45 60 90 120 150 180 210 240 A410 [p-NP], M
5. Nubraiomas susidariusio p-NP koncentracijos priklausomybs nuo laiko grafikas (ordinai ayje paymima p-NP koncentracija, abscisi reakcijos trukm). Sudarytai kreivei nubriama liestin ir apskaiiuojamas pradinis reakcijos greitis (V0) (r.10.4). 10.5.2. Pradinio reakcijos greiio priklausomumo nuo p-NPP koncentracijos nustatymas Reagentai: 1. 1,5 M TRIS HCl buferis pH 8,0. 2. 0,003 M p-nitrofenilfosfatas (p-NPP). 3. 0,03 M p-nitrofenilfosfatas (p-NPP). 4. Fermento tirpalas. Parenkama tokia fermento koncentracija , kad stebint sugerties kitim ties 410 nm ilgio banga, sugerties pokytis per minut (410/min.) bt 0,020,04. Darbo eiga: 1. Nustatomas pradinis reakcijos greitis (Vo), esant skirtingoms p-NPP koncentracijoms. 2. kiuvet, kurioje stebtas tuiasis (blank) greitis, kiuvet pilami skirtingi 0,03 M p-NPP kiekiai (100 l, 250 l, 500 l, 750 l, 1000 l). Pilant maesnius, kaip 1000 l p-NPP trius, atitinkamai didinamas pilamo buferio tris, kad suminis buferio ir substrato tris bt 3 ml. 3. ios reakcijos pradedamos pilant kiuvet anksiau atrinkt optimal fermento kiek. 4. Apskaiiuojama susidaranio p-NP koncentracija. 5. Nubraiomas susidariusio p-NP koncentracijos priklausomumo nuo laiko grafikas ir apskaiiuojami pradiniai reakcijos greiiai (V0). Upildoma 10.4 lentel.
1 0 . 4 l e n t e l . Reakcijos greiio priklausomumas nuo p-NPP koncentracijos

Dedamo p-NPP kiekis, l 100 250 500 750 1000 p-NPP koncentracija mginyje, M Reakcijos greitis, M/min. 1/V0 1/[S]
6. Grafike paymima V0 priklausomumas nuo p-NPP koncentracijos Nubraiomas reakcijos greiio priklausomumas nuo substrato koncentracijos grafikas Lainuivero ir Berko koordinatse. 7. Apskaiiuojame Michaelio konstant ir maksimal reakcijos greit.
Literatra: D. E. Metzler. Biochemistry. Harcourt/Academic Press. 2001. Vol.1. P. 454503. A. Glema. Fermentai. Mokslas, 1987, p.109 158. A. Prakeviius, L. Ivanovien, N. Stasinien, J. Burneckien, H. Rodoviius, L. Lukoeviius, D. Kondratas. Biochemija. KMU leidykla, Kaunas, 2003, p. 122 160. http://www.worthington-biochem.com/ADH/
Kontroliniai klausimai 1. Kaip apibdinama fermentin reakcija? Reakcijos substrat ir produkt samprata. 2. Ferment struktra (apofermentai, kofermentai, kofaktoriai, holofermentai). Kas yra aktyvusis fermento centras? 3. Kas lemia fermentins reakcijos r ir katalizs veiksmingum. Ferment savitumas. 4. Grtamosios ir negrtamosios reakcijos. Fermentini reakcij aktyvikliai ir slopikliai. 5. Kuriose lstels dalyse yra sutelkti fermentai? 6. Kuo ireikiamas reakcijos greitis? Kuo pasireikia fermentins reakcijos produkt taka reakcijos greiiui? 7. Kas yra pradinis fermentins reakcijos greitis? Kaip grafikai jis ireikiamas? 8. Koki reakcij katalizuoja alkoholio dehidrogenaz? Apibdinkite nikotinamidini koferment viesos sugerties ypatumus. 9. Kur pritaikoma armin fosfataz? 10. Kas yra molins ekstinkcijos koeficientas? Kaip apskaiiuoti mediagos koncentracij atsivelgiant pamatuot optin tank? 11. Kaip priklauso fermentini reakcij greitis nuo temperatros, terps pH ir substrato koncentracijos?
152 _________________________________
11.
Priedai
11.1 lentel. Daugikliai m () n p f a z (mili) (mikro) (nano) (piko) (femto) (ato) (zepto) 10-3 10-6 10-9 10-12 10-15 10-18 10-21 k M G T P E Z Y (kilo) (mega) (giga) (tera) (peta) (ekza) (zeta) (yota) 103 106 109 1012 1015 1018 1021 10
11.2.lentel. Tam tikr mediag moliniai ekstinkcijos koeficientai

Junginys Triptofanas Tirozinas Fenilalaninas Histidinas Cisteinas Hipoksantinas Guaninas Guanozinas Adeninas Adenozinas 9-metiladeninas Citozinas Citidinas Uracilas Uridinas Timinas Timidinas DNR RNR Kofeinas Izokofeinas lapimo rgtis NAD+ NADH max
nm
280 274 257 211 250 248 249 252 261 259 260 267 271 259 261 264 267 258 258 278 239 238 260 260
max M-1 cm-1 5600 1400 200 5900 300 10300 9100 13600 13400 14900 14200 6100 9100 8200 10100 7900 9700 6600 7400 10900 7600 9800 18000 16900
max
nm
219 222 206
max M-1 cm-1 47000 8000 9300
max
nm
max M-1 cm-1 48000 60000
pH 7,0
193 188
7,0 7,0 7,0 7,0 7,0
273 273
7500 7500
7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0
267 293 340
9000 12200 6220
7,0 7,0 7,0 7,0
11. Priedai darbo biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls ________________________ 1. Saugaus _____________________________________________________________________ 153
11.3 lentel. UV ir regimosios viesos bang ilgiai

Tirpalo spalva Bespalvis Geltonai alia Geltona Oranika Raudona Purpurin Violetin Mlyna aliai mlyna Mlynai alia Spektro sritis Ultravioletin Violetin Mlyna aliai mlyna Mlynai alia alia Geltonai alia Geltona Oranika Raudona viesos bang ilgiai, nm 220 ? 400 400 ? 450 450 ? 480 480490 490 ? 500 500 ? 560 560 ? 575 575 ? 590 590 ? 625 625 ? 770
11.4 lentel. Skysi pH

Sistema (tirpalas) Seils mogaus kraujas Skrandio sultys Aaros lapimas pH 6,356,85 7,357,45 1,61,8 7,4 4,87,5 Sistema (tirpalas) Jros vanduo Kiauinio baltymas Apelsin sultys Pomidor sultys Pienas pH 8,0 8,0 2,64,4 4,3 6,6-6,9
11.5 lentel. Indikatorini da savybs

Daas Timolio mlynasis Bromfenolio mlynasis Kongo raudonasis Metiloraninis Fenolis raudonasis Fenolftaleinas Rgtis/baz spalvos kitimas Raudona geltona geltona mlyna mlyna raudona Raudona geltona Geltona raudona Bespalvis raudona Indikatoriaus naudojimo pH intervalas 1,26,8 1,26,8 3,05,2 4,36,1 6,88,2 8,310,0
154 _________________________________
11.6 lentel. Danai naudojami buferiniai tirpalai

Buferiai Natrio citratascitrin rgtis Natrio acetatasacto rgtis MESNaOH NaH2PO4 Na2HPO4 ImidazolasHCl MOPSKOH Trietanolamino hidrochloridasNaOH TRISHCl HEPESNaOH TricinasNaOH Natrio tetraboratasboro rgtis Bicinas NaOH GlicinasNaOH Rekomenduojama naudoti pH sritis 3,.06,2 3,65,6 5,66,8 5,88,0 6,27,8 6,67,8 6,88,8 7,09,0 7,28,2 7,68,6 7,69,,2 7,78,9 8,610,6
Konstantos Avogadro skaiius, NA = 6.022045 1023 mol1 Bolcmano konnstanta, k=1.3806221023 J/ Universalioji duj konstanta, R=8.31434 J/*mol Nukleorgi molins mass: bazs= 324.5Da bazi pora = 649Da ribo baz = 340.5Da 1kb ds DNA (Na) = 6.5x105Da 1kb ss DNA (Na) = 3.3x105Da 1kb ss RNA (Na) = 3.4x105Da

Biochem Lab Darb

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

You might also like

Biochem Lab Darb

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Biochem Lab Darb

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

VILNIAUS UNIVERSITETAS BIOCHEMIJOS IR BIOFIZIKOS KATEDRA

VILNIAUS UNIVERSITETO LEIDYKLA

BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI

1. Saugaus darbo biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls ________________________

BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI

1. Saugaus darbo biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls ________________________

BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI

1. Saugaus darbo biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls ________________________

1. Saugaus darbo biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls

1.1. Bendrosios taisykls

BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI

Laboratorijoje naudojami sveikatai kenksmingi reagentai ir darbo ypatumai:

1. Saugaus darbo biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls ________________________

Pirmoji pagalba nelaiming atsitikim atveju

BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI

2.1. Tirpal koncentracijos reikimo bdai

P a v y z d y s . Koks kiekis ir kokia mas(m) KCl yra 5 ml 5M KCl tirpalo?

BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI

2.2 Tirpal ruoimas, darbas su tirpalais

BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI

2.3. Tirpal trio matavimo priemons

Ar tinka kartotiniam dozavimui, ( + / ) + + + + + + +

BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI

2.4. Darbas automatiniu dozatoriumi

ia n matavim skaiius, wi i-tojo matavimo metu gauta matuojamo dydio vert.

BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI

Absoliuioji paklaida (E):

ia vo dozuojamas tris, aritmetinis vidurkis. Santykin matavimo rezultat paklaida (E%):

BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI

3 . Tirpal pH. Buferiniai tirpalai

3.1. Vandenilio jon koncentracijos reikimas

C(H + ) x.C(OH ) =1,81016 . C(H 2 O)

inodami, kad vandens koncentracija 55,55 M, galime parayti:

3.2. Vandenilio jon koncentracijos matavimas

BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI

3.3. Silpn rgi ir bazi jonizacija

C(H + ) x.C(A ) . C(HA)

Bazs ekvivalent skaiius

Rgties molekuls krvis CH3COOH

(x)(x) =1,75 x105 . 0,01 x

4,18 x 10 4 = 4,18x102 arba 4,18 %. 0,01 C(CH3COO )+C(CH3COOH) =

BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI

3.4. Buferiniai tirpalai

C(A ) arba C(HA)

pK+3 pK+2 pK+1 pK pK1 pK2 pK3

3.3 pav. Buferinio tirpalo veikimas

Hendersono irHeselbacho lygtis acetatiniam buferiui:

C(A ) 0,1+0,05 = 4,76+0,48 =5,24. , pH = 4,46+lg 0,10,05 C(HA)

BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI

3.5. Buferini tirpal ruoimas

BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI

]= [H2PO ], pH = pKa = 6,8.

BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI

4 . Audini ir lsteli ardymas ir frakcionavimas

4.1. Lsteli ir audini suardymas

centrifugavimas ulstelinis ekstraktas

4.1 pav. Bendra altinio frakcionavimo schema

iorin membrana peptidoglikanas periplazmin ertm plazmin membrana

peptidoglikanas plazmin membrana

7. Saugaus darbo ________________________________________ 1. Chromatografija biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls 79

7. Saugaus darbo ________________________________________ 1. Chromatografija biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls 81

7. Saugaus darbo ________________________________________ 1. Chromatografija biochemijos laboratorijoje pagrindins taisykls 83