4/16/2012

HROMATOGRAFIJA

dr Mara Aleksi, vanr. prof.

HROMATOGRAFIJA
Fizikohemijska metoda koja se bavi:

Razdvajanjem SEPARACIONA METODA Izolovanjem Identifikacijom (kvalitativna analiza) Odreivanjem (kvantitativna analiza)

4/16/2012

Razdvajanje komponenata smee izmeu dve faze: koje se ne meaju koje su razliitih pokretljivosti koje se nazivaju stacionarna i mobilna

RAZLIIT AFINITET KOMPONENTE PREMA STACIONARNOJ I MOBILNOJ FAZI !!!

MOBILNA FAZA GAS

TENOST

STACIONARNA FAZA
VRSTO TELO (porozno, ili granulisano) SLOJ TENOSTI ADSORBOVAN NA VRSTOM TELU JONOIZMENJIVA

Klasifikacija hromatografskih metoda

1. 2.

3.

Mehanizam razdvajanja Priroda stacionarne i mobilne faze (agregatno stanje faze) Tehnika izvoenja

4/16/2012

Klasifikacija hromatografskih metoda na osnovu mehanizma razdvajanja

adsorpcija adsorpciona hromatografija razliita rastvorljivost podeona (particiona) hromatografija jonska izmena jonoizmenjivaka hromatografija

Klasifikacija hromatografskih metoda na osnovu prirode stacionarne i mobilne faze

Mobilna faza Naziv hromatografske metode Stacionarna faza Naziv hromatografske metode TENOST Gasno-tena hromatografija (GLC) VRSTO Gasno-vrsta hromatografija (GSC) TENOST Teno-tena hromatografija (LLC) VRSTO Teno-vrsta hromatografija (LSC)

4 kombinacije faza teno/teno teno/vrsto gas/teno gas/vrsto

GAS Gasna hromatografija (GC)

TENOST Tena hromatografija (LC)

4/16/2012

Klasifikacija hromatografskih metoda na osnovu tehnike izvoenja

Planarna hromatografija

Hromatografija u koloni

Klasifikacija hromatografskih metoda na osnovu tehnike izvoenja

Ispitivana smea

Vrsta hromatografije
Gasna hromatografija

Gasovi i isparljive supstance

Supstance slinog hemijskog tipa Podeona hromatografija Supstance razliitog hemijskog Adsorpciona hromatografija tipa Neorganske i jonske supstance Jonoizmenjivaka hromatografija, Hromatografija na tankom sloju i papiru Jonoizmenjivaka hromatografija, Gel hromatografija

Jonske od nejonskih supstanci

Bioloki materijali i jedinjenja Gel hromatografija velike molekulske mase

4/16/2012

Nernstov zakon raspodele

Amobi ln a Astacionar

cs cm

K koeficijent raspodele cs ravnotena koncentracija komponente u stacionarnoj fazi cm ravnotena koncentracija komponente u mobilnoj fazi

K zavisi od prirode komponente, prirode jedne i druge faze (afiniteta) temperature

Razdvajanje komponenata smee

Metoda istiskivanja Frontalna analiza Eluiranje

4/16/2012

Metoda istiskivanja
Primenjuje se samo kod adsorpcione hromatografije

Komponente se adsorbuju po opadajuem afinitetu prema stacionarnoj fazi kroz hromatografski sistem proputa se supstancija koja se adsorbuje jae od svih komponente smee. istiskuje najjae vezanu komponentu sa stacionarne faze i vezuje se na njeno mesto istisnuta komponenta istiskuje sledeu, slabije vezanu komponentu, i proces istiskivanja se nastavlja kroz sistem. komponente nikada nisu sasvim razdvojene, ve naputaju stacionarnu fazu po redosledu opadajueg koeficijenta raspodele, ali uvek delimino pomeane sa susednom komponentom.

Metoda istiskivanja
Na vrh kolone nanese se mala zapremina smee A,B,C KONTINUIRANO SE PROPUTA rastvor D koji se najjae adsorbuje.

A,B,C
D potiskuje A, B, C, pa iz kolone prvo izlazi C, zatim B i na kraju A

K D > KA > KB > KC

D A B C

Zone se ne mogu potpuno razdvojiti samo kvalitativna analiza

4/16/2012

Frontalna analiza
kontinualno proputanje smee kroz stacionarnu fazu

A,B,C

KA > KB > KC

Iz kolone prvo izlazi ista komponenta C, zatim smea B i C i na kraju smea A, B i C

moe se odvojiti samo prva komponenta (sa najmanjim koeficijentom raspodele) u relativno istom stanju, dok se sve ostale komponente delimino meaju sa susednim Veoma retko se koristi

Eluiranje
mala koliina smee se unese u kolonu, a zatim
se vri kontinualno proputanje mobilne faze

4/16/2012

Eluiranje
Na vrh kolone nanese se mala zapremina smee A,B,C KONTINUIRANO SE PROPUTA IST RASTVARA !!! A,B,C KA > KB > KC

Iz kolone prvo izlazi C, zatim B i na kraju A

A B C

Zone se mogu potpuno razdvojiti kvalitativna i kvantitativna Najvanija metoda koja se koristi u analitike svrhe

TEORIJA HROMATOGRAFIJE
Komponenta A se raspodeljuje na deo koji se nalazi u stacionarnoj fazi cS i deo koji se nalazi u mobilnoj fazi cm.

Usled pomeranja mobilne faze deo komponente A migrira u smeru kretanja mobilne faze i naruava se uspostavljena ravnotea.

4/16/2012

TEORIJA HROMATOGRAFIJE

1. Teorija platoa 2. Teorija brzina

Stacionarna faza

Mobilna faza

Teorija platoa

7 6 5 4 3 2 1
a

8 16 32 8 8 8 8 8 8 8 16 16

4 8 4

4 8 4

16

c
1

7 6 5 4 3 2 1

*
K

2 4 4 8 4 8 4 2 6 6 2 2 6 6 2 2 6 6 2 6 6 2

1 4 6 4 1

1 4 6 4 1

1 4 6 4 1

4 6 4 1

cs 1 cm

cs cm

4/16/2012

Teorijski plato se moe definisati kao mali deo kolone u kome se uspostavlja ravnotea komponente izmeu stacionarne i mobilne faze, pre nego to mala zapremina mobilne faze sa svojim delom rastvorene komponente pree u susedni deo kolone, gde se proces ponavlja.

1 4 6 4 1

1 4 6 4 1

4 8 4

4 8 4

e Posle 5 uravnoteivanja molekuli se tako raspodeljuju po platoima da se dobija raspodela koja odgovara Gausovoj krivoj

Efikasnost kolone sposobnost kolone da potpuno razdvoji komponente koje se teko razdvajaju i srazmerna je broju teorijskih platoa u koloni

Visina ekvivalentna teorijskom platou HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate )

HETP

L N

L duina hromatografske kolone N broj teorijskih platoa

Efikasnost kolone bie vea to je vrednost HETP manja.

10

4/16/2012

Teorija brzina

oblik krive raspodele zavisi od brzine eluiranja.

HETP

B v

Van Deemter ova jednaina

C v
- brzina mobilne faze A, B i C faktori koji doprinose irenju trake

Hromatografske metode
Podeona (particiona) hromatografija

Apsorpciona hromatografija

Jonoizmenjivaka hromatografija

11

4/16/2012

Adsorpciona hromatografija
Zasniva se na adsorpciji komponenata smee na vrstom adsorbensu Mehanizam adsorpcije: Langmuirova (fizisorpcija) Freundlichova (hemisorpcija) adsorpciona izoterma U zavisnosti od agregatnog stanja: G- i T- 1903 ruski botaniar Cvet je na koloni razdvojio sastojke zelenog lia (razdvojio je hlorofil od drugih pigmenata iz biljnog
ekstrakta uz CaCO3 kao adsorbens i petrol-etar/etanol kao mobilnu fazu)
V bPVmax 1 bP
x m x m
1

kP n
1

kc n

Adsorpciona hromatografija

Adsorbat adsorbovan na povrini stacionarne faze - adsorbensa

12

4/16/2012

Adsorbesi i grupe koje se razdvajaju

Nepolarni
Al-oksid Mgoksid aktivni ugalj organske soli peptidi, ugljeni hidrati aminokiseline Mg-silikat silika-gel CaCO3 skrob

Polarni
neorganska jedinjenja, boje steroli, estri, gliceridi, alkaloidi steroli, aminokiseline karotenoidi, ksantofili enzimi

Adsorpciona hromatografija

Adsorpciona hromatografija se izvodi u koloni koja je ispunjena adsorbensom. Na vrh kolone nanosi se mala koliina analizirane smee, zatim se kroz kolonu vri eluiranje ime se postie razdvajanje komponenata. Komponente smee se selektivno adsorbuju na adsorbensu u zavisnosti od koeficijenta raspodele.

13

4/16/2012

Tehnika izvoenja adsorpcione hromatografije HROMATOGRAFIJA U KOLONI

Komponente A i B i C su razdvojene adsorpcionom hromatografijom.

Komponenta A ima manji koeficijent raspodele od komponente B, a vei koeficijent raspodele od komponente C. Koristei sliku kolone ucrtati zone sa razdvojenim komponentama.

KA

KB

cs A

c sB

cm A

cmB

KC

KA

csC
B A C

c sA

cmC

c mA

14

4/16/2012

Particiona - podeona hromatografija G-T, T-T

Koeficijent raspodele u podeonoj hromatografiji naziva se PODEONI KOEFICIJENT

cs cm

Komponenta rastvorena u tenoj fazi koja je vezana za vrst nosa

PRINCIP Razliita rastvorljivost komponenata smee izmeu dve tene faze ( dva rastvaraa koji se ne meaju) I stacionarna faza II mobilna faza

Tehnike izvoenja hromatografije na papiru ili tankom sloju

UZLAZNA TEHNIKA SILAZNA TEHNIKA

Rastvara se kree pod dejstvom kapilarnih sila; zbog suprotnog dejstva gravitacije dolazi do zaustavljanja protoka rastvaraa na odreenoj visini Za razdvajanje komponenata sa relativno velikim razlikama Rf vrednosti

Za razdvajanje komponenata koje imaju male, ili bliske Rf vrednosti Rastojanje koje prelazi front rastvaraa regulie se duinom podloge i visinom posude

HORIZONTALNA (KRUNA) TEHNIKA

15

4/16/2012

Vane veliine u PODEONOJ HROMATOGRAFIJI

Pri HORIZONTALNOM PROTOKU mobilne faze (rastvaraa)
(horizontalna tehnika) na molekule rastvaraa deluju samo kapilarne sile

RETENCIONI FAKTOR (faktor zadravanja), Rf vrednost IDENTIFIKACIJA KOMPONENTE

z (kt)1 / 2
k t konstanta (zavisi od prirode sistema ( , i )iT vreme za koje rastvara pree put z

Rf

a r

Kod uzlazne i silazne tehnike na molekule mobilne faze pored kapilarnih deluje i sila gravitacije koja smanjuje ili poveava njihovu brzinu Preeni put rastvaraa r

a preeni put komponente r preeni put rastvaraa Rf vea, ako se komponenta bolje rastvara u mobilnoj fazi Dobro razdvajanje: Rf 0,05

cs cm

podeoni koeficijent

KA
R f ( A)
Rf predjeni put komponente predjeni put rast var aca

KB
R f ( B)

KC
R f (C )

16

4/16/2012

Tehnike izvoenja particione hromatografije

Papirna hromatografija Hromatografija na tankom sloju

Izvoenje particione hromatografije

Mobilna faza Rastvara II i njegove zasiene pare

------------------------------------------------------------------------------------------Mala koliina smee (MRLJA)

Stacionarna faza - Rastvara I vezan za tanak sloj ili papir Tanak sloj nema ulogu adsorbensa iako se koriste isti materijali kao kod adsorpcione hromatografije zbog porozne strukture i velike protone moi (kapilarno prodiranje rastvaraa). Tanak sloj vrstog adsorbenta ili papir nosa stacionarne faze

---------------------------------------------vrst nosa staklena ploa

17

4/16/2012

Komponente smee, A i B, razdvojene su particionom hromatografijom na tankom sloju u sistemu u kome stacionarnu fazu predstavlja voda ( = 78,55), a mobilnu fazu smea etanola ( = 24,35) i benzena ( = 2,30).

Mobilna faza etanol benzen

Preeni put A a (cm) 5,5 4,2

Preeni put B b (cm) 3,5 0,2

Preeni put mobilne faze r (cm) 6 6

Razdvajanje komponenata ponovljeno je dva puta sa razliitim sastavom mobilne faze: benzen: etanol = 2 : 1 benzen : etanol = 1 : 2

1 2

Dobijene vrednosti duina preenih puteva komponenti A I B i mobilne faze, i Rf vrednosti Mobilna faza Preeni put A a (cm) 5 5,2 Preeni put B b (cm) Preeni put mobilne faze r (cm) 6 6 RfA RfB

1 2

3 4

0,833 0,866

0,500 0,667

18

4/16/2012

Mobilna faza 1 2

Preeni put A a (cm) 5 5,2

Preeni put B b (cm) 3 4

Preeni put mobilne faze r (cm) 6 6

RfA

RfB

0,833 0,866

0,500 0,667

Voda je polarnija supstancija od benzena i etanola (ima veu vrednost dielektrine propustljivosti, ) B se bolje rastvara u vodi, tj, u stacionarnoj fazi i pokazuje manju Rf vrednost. B je polarnija supstanca od A Sa promenom sastava mobilne faze Rf vrednost B se menja, jer je delimino rastvoran u etanolu, pa kada je etanol dominantan rastvara u mobilnoj fazi (2) i Rf vrednost je vea. A se bolje rastvara se u rastvaraima sa manjom dielektrinom propustljivou, - u mobilnoj fazi odnos benzena i etanola u mobilnoj fazi ne utie znatno na njegovu Rf vrednost,
R f (1) 0,833 0,500 0,333

R f (2) 0,866 0,667 0,199 Povoljiniji sastav mobilne faze je sastava

benzen : etanol = 2 : 1:

Komponente ispitivane smee su dobro razdvojene u oba sluaja, jer je razlika retencionih faktora, Rf uvek vea od 0,05.

Jonoizmenjivaka hromatografija

Razdvajanje jonskih vrsta na osnovu njihovog afiniteta ka izmeni sa jonima funkcionalnih

grupa.

19

4/16/2012

Podela jonoizmenjivaa

Neorganski
sintetiki oksidi kisele soli vievalentnih metala heteropoli kiseline

Organski
sintetiki polistiren

prirodni zeoliti gline minerali

prirodni /

Umreavanjem dobija se smola koja na povrini mora imati funkcionalne grupe.

Podela jonoizmenjivaa
katjonski anjonski -SO3H -COOH -SH -OH -NH2 -NHR -NR2 amfoterni sadre i katjonske i anjonske funkcionalne grupe

Funkcionalna grupa se sastoji iz dva dela: 1. Fiksirani jon kovalentno vezan za matricu smole R 2. Kontrajon izmenjuje se sa jonima iz rastvora

R-SO3H + NaCl

R-SO3Na + HCl

R-OH + NaCl

RCl + NaOH

20

4/16/2012

Tehnika izvoenja jonoizmenjivake hromatografije

Suspenzija

izmenjivaa u vodi sipa se u kolonu koja je delimino napunjenu vodom (da ne ue vazduh) viak vode se ispusti ali iznad smole uvek mora postojati sloj tenosti

Preiavanje izmenjivaa Prevoenje jonoizmenjivaa u eljeni jonski oblik

Kapacitet jonoizmenjivaa
Definicija: - Broj funkcionalnih grupa po jedinici mase suvog jonoizmenjivaa - Koliina jednovalentnog jona u mmol koju moe da razmeni 1g suvog izmenjivaa
4 mmolg-1 H+ jona - katjonski 4 mmolg-1 OH- jona - anjonski

Vc m

V zapremina utroenog titranta c molarna koncentracija titranta m odmerena masa smole

21

4/16/2012

LITERATURA

1.

M. Aleksi, Teorija hromatografije skripta

2.

V. Kunti, M. Aleksi, N. Peji, S. Blagojevi, Praktikum iz fizike hemije, Farmaceutski fakultet, Beograd 2010.

22