Bioloki fakultet Univerzitet u Beogradu

Studijski program:

Biologija mikroorganizama
Vrsta i nivo studija:

Specijalistike akademske studije

Naziv predmeta:

PRIMENJENA MIKROBIOLOGIJA

SEMINARSKI RAD
Tema:

MEHANIZMI REZISTENCIJE NA ANTIBIOTIKE

Kandidat: Marija Filipovi Mentor: Dr Branka Vukovi-Gai, vanredni profesor

Beograd, oktobara 2011.

MEHANIZMI REZISTENCIJE NA ANTIBIOTIKE

Uvod
Antimikrobni lekovi se koriste za leenje infektivnih bolesti jo od XVII veka. Meutim hemoterapija sa razumevanjem principa selektivne toksinosti, specifine hemijske veze izmeu mikrobnog patogena i leka i uloga kombinovane terapije poinje tek u XX veku. S obzirom da je istorija antibiotika relativno kratka i da se sa njihovom upotrebom poelo tek pre esdesetak godina uspeh je da danas imamo antibiotike kojima se praktino mogu leiti sve bakterijske infekcije. Naalost problem sa kojim se suoavamo je bri ili sporiji razvoj rezistencije bakterija na iste, tako da je pojava rezistentnih patogena vano podruje istraivanja u mikrobiologiji, molekularnoj i evolucionoj biologiji kao i u medicinskoj praksi. Dva su glavna pristupa problemu brzog irenja rezistencije. Jedan je povezan sa sticanjem, razvojem i irenjem samih gena, a drugi se odnosi na specifine biohemijske mehanizme odgovorne za antibiotiku otpornost. Antimikrobni lekovi mogu biti supstancije oznaene kao analozi faktorima rasta- hemijske supsatncije koje se dobijaju sintetikim putem i antibiotici- supstancije koje pored toga to se proizvode sintetikim putem nastaju kao produkti metabolizma mikroorganizama u prirodi. Analozi faktorima rasta su sintetike supstancije koje su sline po strukturi autentinim faktorima rasta mikroorganizama. Faktori rasta su biomolekuli koji su esencijalni za sintezu jedinjenja koja ulaze u sam sastav mikroorganizama, najee su to gradivni elementi nukleinskih kiselina i proteina. Meu onima koji su najee u upotrebi su: sulfonamidi, kinolini i fluorokinolini (Brock, 2009). Sulfonamid je analog p-aminobenzoevoj kiselini. Folna kiselina je neophodna za sintezu nukleinskih kiselina kod prokariota i eukariota, sa jednom razlikom to prokarioti poseduju metabolizam za sintezu folne kiseline. Prokarioti sintetiu sopstvenu folnu kiselinu iz paraaminobenzoeve kiseline PABA i ostalih metabolata uz pomo enzima dihidropteorat sintetaze, dihidrofolat sintetaze i dihidrofolat reduktaze. Sulfonamid deluje kao strukturni analog paraaminobenzoeve kiseline ometajui metabolizam sinteze (Brock, 2009). Kinolini i fluorokinolilini interaguju sa enzimima koji uestvuju u pakovanju DNK u eliju. Ovi antimikrobni lekovi deluju na nivou replikacije. Oni interaguju sa DNK girazom ili sa topoizomerazom IV. Ova dva enzima su tetrameri koji se sastoje od dva para subjedinica. Antibiotici vezuju ove enzime i tako ih inaktiviraju kompetirajui za isto mesto sa ATP-om na enzimu ili se neki vezuju za A subjedinicu kojom se enzim vezuje za DNK(Brock,, 2009). Kinolini interaguju sa DNK girazom, koja se sastoji od dve subjedinice: subjedinice A kodirane genima GirA i subjedinice B. Ciljno mesto kinolina je subjedinica A, koja ima ulogu u spreavanju formiranja supernavoja DNK priliokom replikacije. Fluorokinolimi interaguju sa topoizomerazom IV, enzimom odgovornim za formiranje supernavoja (Brock, 2009). Antibiotici u uem smislu nastaju kao produkt metabolizma mikroorganizama (bakterija i gljiva) i u niskim koncentracijama slue da inhibiraju ili spree rast drugih mikroorganizama. Od velikog broja antibiotika koji su pronaeni u prirodi samo 1% njih je ispitano. Antibiotici u irem smislu rei su sintetiki proizvodi koji se u potpunosti ili delimino proizvode hemijskim putem. Postoje razliite podele antibiotika: 1) Prema spektru delovanja antibiotici se dele na one sa uim i one sa irim spektrom delovanja. 2) Prema uinku dele se na baktericidne i bakteriostatike. Baktericidni su antibiotici koji ciljno

deluju na mikroorganizme unitavajui eliju (praktino slue da ubiju eliju) antibiotici sa bakteriostatskim dejstom spreavaju rast bakterijskih elija. Baktericidni antibiotici naruavaju integritet elije, najee inhibiraju sintezu elijskog zida i njihovim delovanjem se smanjuje broj elija mikroorganizama. Bakteriostatici inhibiraju sintezu proteina, esta meta su im ribozomi, i na taj nain spreavaju rast i razmnoavanje mikroorganizama (Brock, 2009). 3) Prema mehanizmu delovanja mogu biti:

a) oni koji imaju baktericidno dejstvo i inhibiraju sintezu elijskog zida ili ometaju
funkciju elijske membrane (penicilini, cefalosporini, karbapenemi, monobaktemi, glikopeptidi, vankomicin, bacitracinlinezolid, polimiksini, kloramfenikol) b) oni koji deluju na nivou transkripcije, na DNK zavisnu RNK polimerazu (rimfapicin) c) oni koji imaju bakteriostatsko dejstvo i deluju na nivou translacije, ometaju sintezu proteina 50s subjedinice (makrolidi, azalidi, linkozamidi, klindamicin, amfenikoli, hloramfenikol, florfenikol) ili ometaju sintezu proteina 30s subjedinice (tetraciklin, aminoglikozidi) 4) Prema hemijskoj strukturi antibiotici se dele na:

a)

antibiotike oligopeptidne grae i jednostavnih aminokiselina (penicilin, cefalosporini, karbapenemi, monobaktami) b) aminoglikozidni antibiotici (gentomicin, neomicin, streptomicin, kanamicin) c) polipeptidni antibiotici (bacitracin, polimiksini) d) polienski (nistatin) e) makrolidni (azalidi, linkozamidi, eritromicin, klaritromicin, azitromicin) f) tetraciklinski antibiotici (tetraciklin) g) nitrofenilpropilaminski (kloramfenikol)

Mehanizmi delovanja antibiotika

Antibiotici koji spreavaju sintezu elijskog zida
elijski zid bakterija je izgraen od peptidoglikana. To je sloeni molekul (polimer) koga sainjavaju lanci od naizmenino rasporeenih molekula N-acetilglukozaminske i Nacetilmuraminske kiseline koje su meusobno povezne (1,4)-glikozidnom vezom. Za Nacetilmuraminsku kiselinu vezan je tetrapeptid. Boni, tetrapetidni lanci, imaju kod svih vrsta bakterija neke zajednike osobine. Veina vrsta na poziciji 1 ima L-alanin, na pozicija 2 D-glutamat a na poziciji 4 D-alanin. Najvea varijabilnost prisutna je na poziciji 3: veina gram-negativnih bakterija na poziciji 3 ima diaminopimelinsku kiselinu (za koju se vezuje lipoproteinska komponenta elijskog zida). Kod gram-pozitivnih bakterija na poziciji 3 nalazi se L-lizin ili diaminopimelinska kiselina ili neka druga amino kiselina L serije. Izmeu paralelno postavljenih polisaharidnih lanaca, dolazi do unakrsnog vezivanja tetrapeptida peptidnom vezom ime nastaje veliki trodimenzionalni molekul. Unakrsno vezivanje ini elijski zid vrstom i rigidnom strukturom, sposobnom da se suprotsavi delovanju osmotskog pritiska. Kod mnogih Gram negativnih bakterija peptidna veza se formira direktno izmeu -amino grupe diaminopimelinske kiseline (DAP) jednog lanca i -karboksilne grupe terminalnog D-alanina drugog lanca, dok gram-pozitivne bakterije ostvaruju ove veze posredno pomou umetnutih peptida. Na primer, D-alanin i L-lizin mogu biti povezani preko pentaglicina (Staphylococcus aureus). U graenju peptidne veze uestvuju enzimi transpeptidaze i oni mogu biti ciljno mesto za beta-laktamske antibiotike (Brock, 2009). Beta-laktamski antibiotici deluju inhibirajui formiranje elijskog zida bakterije, inhibicijom stvaranja peptidoglikanskih veza koje spajaju molekule polimera primarno kod gram-pozitivnih bakterija, spreavajui unakrsno vezivanje tetrapeptida peptidnom vezom. Ovo ima baktericidan uinak. Aktivnost laktamskih antibiotika zavisi od afiniteta samog antibiotika za PVP (penicilin vezujui proteini), to su proteini koji su ukljueni u sam proces formiranja elijskog zida. Ti proteini su zapravo enzimi transpeptidaza i karboksipeptidaza. Antibiotik-PVP kompleks stimulie sintezu autolizina koji dodatno lizira postojei elijski zid (Brock, 2009).

Slika 1. Rezistencija na betalaktamske antibiotike (Petrovi-Jeremi, 2011)

Prvi beta laktamski antibiotik je penicilin, izolovan iz gljivice roda Penicillium. Iako je penicilin otkriven jo 30-tih godina dvadesetog veka, njegova ira upotreba krenula je krajem drugog svetskog rata. Ve 1950 godine polovina stafilokoknih izolata razvilo je rezistenciju na penicilin. Kao odgovor 1960 u upotrebu je uao meticilin, da bi ve 70-tih godina MRSA (meticilin rezistentna Staphylococcus aureus) postao rastui problem. Meticilin je jedan od derivata penicilina, specifinost meticilina je u njegovoj otpornosti na dejstvo enzima penicilinaze koje lue neki sojevi bakterija, a koji se vezuje i razara beta laktamski prsten inaktivirajui ceo antibiotski molekul. Prisustvo orto-dimetoksifenilne grupe vezane sa penicilinsko jezgro meticilina onemoguava dejstvo enzima na beta-laktamski prsten, jer je ovaj enzim posebno osetljiv na promene u prostornoj konformaciji svog supstrata. Utoliko meticilin moe da deluje na standardan nain, bez obzira na prisustvo penicilinaze. Iako je njegova klinika upotreba u velikoj meri obustavljena (zahvaljujui razvitku drugih antibiotika) meticilin danas ima ulogu u laboratorijskim testiranjima mikrobiolokih kultura, gde slui kao referentna supstanca prilikom odreivanja antibiotske senzitivnosti datog soja. Nekad je upotrebljivan u leenju infekcija prouzrokovanih gram-pozitivnim bakterijama koje lue penicinilazu. Poslednjih godina sa svih strana sveta stiu podaci o irenju MRSA sojeva (Meticilin rezistentni Staphylococcus aureus), kako u bolnikoj tako i u vanbolnikoj sredini. Na osnovu podataka Centra za kontrolu bolesti u poslednjih deset godina se broj MRSA infekcija udvostruio i da je broj umrlih od ovih infekcija u SAD vei od broja umrlih od AIDS-a. Izmeu bolnikih i vanbolnikih sojeva MRSA osim slinosti ima i mnogo razlika, epidemiolokih, klinikih, po uestalosti javljanja i po faktorima virulencije. Vanbolnikih izolata ima jos uvek daleko manje nego bolnikih mada se predvia da e se ta razlika sve vie smanjivati. Vanbolniki izolati CA-MRSA, (community acquired MRSA) su virulentniji, bre se ire i mogu izazvati tee infekcije od bolnikih (hospital acquired MRSA). Sve vea rezistencija na meticilin znai i rezistenciju na sve beta-laktamske antibiotike koji se nalaze u klinikoj primeni (Petrovi- Jeremi, 2011).

Antibiotici koji ometaju funkciju elijske membrane

Antibiotici koji ometaju funkciju elijske membrane su polimiksini, to su polikatjonske povrinski aktivne supstancije, koje se ponaaju kao deterdenti, naruavaju strukturu membrane tako to naruavaju strukturu fosfolipida. Gram-negativne bakterije su osetljivije na polimiksine zbog vee koliine fosfolipida. Daptomycin je jedan od novijih antibiotika koji se prvenstveno koristi za leenje infekcija gram-pozitivnim bakterijama, ima takoe uticaj ne elijsku membranu tako to se vezuje za istu i izaziva brzu promenu polarizacije, posledica depolarizacije je gubljenje sposobnosti elije za sintezu esencijalnih makromolekula kao to su nukleinske kiseline i proteini to automatski uzrokuje smrt elije (Brock, 2009). .

Antibiotici koji spreavaju sintezu proteina

U ovu grupu antibiotika spadaju oni koji utiu na 50S i 30S subjedinicu ribozoma i oni imaju bakteriostatsko dejstvo. Na 30S subjedinicu utiu aminoglikozidi i tetraciklin. Aminoglikozidi su hidrofilni polikatjonski ugljeni hidrati koji sadre amino grupu. U prirodi su najee produkt aktinomiceta. Oni se vezuju za specifino mesto i spreavaju vezivanje aminoacil tRNK za A mesto na ribozomu i samim tim blokiraju inicijaciju sinteze proteina. Prvi otkriveni aminofglikozid je streptomicin kod Streptomyces griceus, zatim, neomicin kod Streptomyces fradiae, kanamicin kod Streptomyces kanamyceticus i gentamicin kod Micronospora purpurea i Micronospora echinospora. Streptomicin blokira prelazak sa inicijacije na elongaciju translacije, interagujui sa faktorima elongacije. Antibiotici koji takoe blokiraju sintezu proteina vezujui se za 50S

subjedinicu su makrolidi i linkozamidi. Tako eritromicin blokira translokaciju interagujui sa riboziomalnim proteinima koji uestvuju u translokaciji, a hloramfenikol blokira rad enzima peptidil transferaze 23S rRNK i onemoguava formiranje peptidne veze izmeu aminokiselina tj. formiranje kompletnog proteina (Sakar, 2010).

Slika 2. Tetraciklini-Ometanje sinteze proteina (Sakar, 2010)

Antibiotici koji deluju na nivou transkripcije

Mnogi antibiotici spreavaju transkripciju inhibirajui sintezu RNK. Rimfapicin inhibira sintezu RNK vezujui se za beta subjedinicu RNK polimeraze i na taj nain spreava rad ovog enziama. Aktinomicin takoe spreava sintezu RNK tako to se vezuje za bazni par guanin-citozin na molekulu DNK (Brock, 2009).

Mehanizmi razvijanja rezistencije

Rezistencija na antibiotike se moe biti uroena ili steena. Uroena se odnosi na otpornost roda ili vrste koja se temelji na nedostatku ciljnih mesta ili nedostupnosti ciljnih mesta na mikroorganizmu. Steena otpornost se temelji na mutaciji hromozomskih gena ili, jo vanije, prisutnosti mobilnih genskih elemenata koji nose informaciju za rezistenciju. Antimikrobna rezistencija je posledica ekspresije specifinih gena. Kada je u pitanju mutacija na hromozomu nastaju promene u strukturi bakterijske elije, a ako je rezistencija posredovana plazmidima onda bakterijska elija dobija informaciju o sintezi enzima koji razgrauju ili na neki nain blokiraju dati antibiotik. Treba napomenuti da se geni rezistencije smeteni na plazmidima jednostavno i brzo ire horizontalno, dok se geni smeteni na hromozomu po pravilu ire vertikalno. irenje gena odgovornih za rezistenciju na antibiotike Vertikalni transfer gena Rezistencija uzrokovana hromozomskim genima uvek se prenosi vertikalnim transferom, to znai da se rezistencija prenosi na erke elije tokom deobe elija. Horizontalni transfer gena iroko rasprostranjena rezistencija posledica je horizontalnog transfera gena putem mobilnih genetikih elemenata dole opisanih. Ovi se elementi mogu razmenjivati izmeu bakterija istih i razliitih bakterijskih vrsta i rodova i mogu se ak preneti i na domaina koji je filogenetski jako udaljen od prirodnog domaina. Mehanizmi prenoenja ovih gena su konjugacija, transdukcija, transpozicija i transformacija (Kneevi-Vukevi i sar, 2009). Elementi koji posreduju rezistenciju Postoje etiri najvanija tipa genetikih elemenata koji uestvuju u prenoenju informacije o rezistenciji na antibiotike: plazmidi, transpozoni, integroni i genske kasete. Plazmidi su nehromozomski genetiki elementi, najee dvostruki heliksi DNK koji se nalaze u gotovo svim bakterijskim rodovima. Veliine su od 2 do vie od 100 kbp, i imaju sposobnost da se sami reprodukuju, ne integriu se u hromozom i nose razliite genetike funkcije. U jednoj eliji se najee nalaze vie vrsta plazmida. Transpozoni su takoe dvostruki DNK heliksi, al za razliku od plazmida ne mogu se umnoavati samostalno, ve se ugrauju u hromozomalnu DNK ili plazmid. Najmanji transpozoni nose samo jedan gen za enzim transpozazu koji katalizuje njihovo premetanje sa jednog mesta na drugo na molekulu DNK i to su insercione sekvence. Vei transpozoni nose jo neke gene sem ovog i to su, najee oni za rezistenciju na antibiotike. Transpozoni nisu mesto specifini i mogu se ugraditi na bilo koje mesto u molekuli DNK. Neki transpozoni nose i gene koji im omoguavaju i prelazak iz jedne elije u drugu procesom konjugacije (Kneevi-Vukevi i sar, 2009). Genske kasete su mali pokretni elementi od 2kbp specifini za gram-negativne bakterije, sastoje se od rekombinacionog mesta i jednog gena koji je u veini sluajeva gen za rezistenciju. Oivieni su sekvencama koje prepoznaju integraze i koje ih mesto specifinom rekombinacjom mogu ugraditi u druge genetike elemente. Nemaju sposobnost samorepliciranja, a za razliku od transpozona nemaju sposobnost transpozicije, to su geni ili grupe gena koji se ne eksprimiraju jer nemaju sopstveni promotor (Kneevi-Vukevi i

sar, 2009). Integroni su genetiki elementi povezani sa viestrukom antibiotskom rezistencijom kod gram-negativnih eneterobakterija. To su specifini genski elementi koji se sastoje od nepromenljivog dela koji poseduje intI region koji kodira mesto specifinu integrazu i promenljivog sredinjeg regiona u koji se mogu ugraditi kasete gena odgovorne za rezistenciju. Mesto gde se ugrauju genske kasete je oznaeno kao attI. Vie kasete gena mogu biti poreane u tandeme, poznato ih je oko 60 i kodiraju rezistenciju na beta laktame, aminoglikozide, trimetropin, hloramfenikol i streptomicin. Integroni su esto ugraeni u transpozone i kao takvi poveavaju pokretljivost gena i irenje rezistencije (Kneevi-Vukevi i sar, 2009). Mehanizmi rezistencije na najee koriene antibiotike su:

1) smanjeno unutar-elijsko deponovanje antibiotika, promena propustljivosti membrane i brzo

izbacivanje leka iz elije 2) inaktivacija antibiotika uz pomo enzima koji hidrolizuju antibiotike, laktamaze, ili slue kao transferi za odreene grupe, metilaze, acetilaze, fosforilaze...i modifikacija enzima a) hidroliza antibiotika uz pomo beta laktamaza b) hidroliza antibiotika uz pomo esteraza c) metilacija 23S RNK (makrolidi) 3) alternativni metaboliki putevi, zaobilaenje inhibirane faze metabolizma 4) promena vezujueg mesta na membrani elije ili ribozoma

Slika 3. Mehanizmi rezistencije na najee koriene antibiotike (www.mecriticalcare.net)

Smanjeno unutarelijsko deponovanje antibiotika i propustljivost membrane

Moe biti posledica ili smanjenog unosa antibiotika ili njegovo pojaano izbacivanje putem transportnog sistema zavisnog od energije. Smanjeni unos antibiotika u eliju moe biti posledica smanjenog broja, promene ili potpunog gubitka porina na elijskoj membrani. Spoljna membrana gram-negativnih bakterija moe esto biti prepreka za prolaz nekih antibiotika. Promena elektrinog naboja lipopolisaharidne membrane od negativnog ka neutralnom moe spreiti ulazak antibiotika sa jako pozitivnim nabojem, kao to je to sluaj sa aminoglikozidima. Drugi nain je pojaano izbacivanje antibiotika tj. pojaan rad efluks pumpi.

Slika 4. Efluks pumpa mehanizam rezistencije (www.medicalscience.com)

Jedan od vrlo estih mehanizama rezistencije svodi se na propustljivost membrane, koja moe zavisiti od prisustva porina. Mali hidrofilni molekuli laktami, fluorokinolini prolaze kroz spoljanju membranu, kroz hidrofilne kanale okruene proteinima porinima. Proteini koji uestvuju u formiranju pora npr. kod P. aeruginosa geni koji kodiraju proteine porine oznaeni su sa opr i mutacije na ovim genima skopane su sa pojavom rezistencije. Aminoglikozidi i polimiksini se veu za lipopolisaharidnu komponentu spoljane membrane i menjaju njenu propustljivost, aminoglikozidi se zatim aktivnim transportom unose u elijiu kroz elijsku membranu, a polimiksini deluju na membranu menjajui njenu strukturu. Bakterijski efluks sistemi mogu se podeliti u etiri grupe na osnovu aminokislelinskih sekvenci: MFS (major facilitator superfamily), familija ATP-vezujuih kaseta, RND familijaresistence nodulation division, SMR familija- small multidrug resistance i peta grupa je multidrug resistance and toxic compound extrusion MATE. Familije MFS, RND i MATE spadaju u protonske

pumpe, a RND familija je karakteristina za gram-nagativne bakterije. Imaju tri domena, rade u saradnji sa mambranskim fuzionim proteinima koji su transmembranski linkovi i nalaze se u periplazmatskom prostoru i proteinima koji se nalaze na spoljanjoj membrani- outmembrane efflux protein. Veliki broj gena je ukljuen u sintezu ovih proteina koji uestvuju u aktivnom efluksu supstanci. P. aeruginoza je jedan od mikroorganizama sa razjanjenom genetikom osnovom rada ovih pumpi (Poole et al, 2000). Prirodna otpornost P. aeruginosa na antibiotike je najee posledica nemogunosti postizanja dovoljne koncentracije u citoplazmi, to je posledica nedovoljnog prolaza antibiotika ili pojaanog efluksa koji posledica pojaane ekspresije mexXY-OprM gena. Poznato je da genom kodira 12 efluksnih komponenti, a ti geni su mexAB-oprM, mexXY-oprM, mexCD-oprJ, mexEFoprN, mexJK-oprM (multidrug efflux resistence operon). Radi se o transmembranskoj komponenti koja se sastoji od tri proteina od kojih je jedan lociran ka citoplazmi i funkcionie po principu energetski zavisne pumpe, antiporter Mex-B, MexD, MexF i MexY. Na spoljanjoj membrani se nalazi porin OprN, OprJ i OprM i transmembranski link MexA, MexC i MexD i MexX koji povezuje ova dva. Mutacijom regulatornih gena moe doi do pojaanog rada ovih pumpi i pojaanog izbacivanja antibiotika. Najefikasnija pumpa kod P. aeruginosa je MexAB, ona izbacuje aktivno laktame, laktamaza inhibitore, fluorokinoline, makrolide, tatracikline, kao i MexCD, MexEF izbacuje akitvno fluorokonoline i hloramfenikol. Geni oznaeni sa MEX-OPR ine ustvari operon i tu se nalaze geni koji kodiraju proteine koji su sastavni deo ovih pumpi, meutim ispred ove sekvence postoji regulatorna koja kontrolie ekspresija ovih gena. Uzvodno od mexAB-oprM nalazi se gen mexR, on kodira represor koji kontrolie rad ovih gena, mutacijom na ovoj sekvenci moe doi do pojaane ekspresije, tzv. nalB mutacija. Isto tako takozvani nfxC mutanti, nose mutaciju na mexT lokusu uzrokuje rezistenciju na imipenem jer je skopana sa smanjenom ekspresijom gena proteina OprN koji izgrauju porine koji uestvuju u transportu ovog antibiotika. Homologi geni ovima kod E. coli su acr-tol i funkcioniu kao multidrug efflux sistem (Poole et al, 2000). Otpornost bakterija na makrolide je posledica takoe jednog vida izbacivanja antibiotika. U pitanju je opet efluks pumpa kodirana od strane i mef gena opisani kod roda Streptoccocus. Tako su MefA, MefE homologi sa major facilitator superfamily MFS efluks proteinima. Dok MsrA, MsrB, CarA, SrmB, OleA, OleC, VgaB pripadaju grupi ABC transportera. Postoje tri razliita efluks sistema koja su potvrena kod gram-pozitivnih koka, i to su MsrA (macrolide and streptogramin resistance), MefA (macrolide efflux) Vga and VgaB (viginamicin factor A i B). ABC transporteri su ATP zavisne pumpe.

Inaktivacija antibiotika uz pomo enzima

Hidroliza enzimima
Beta-laktamaze
Inaktivacija antibiotika enzimima bazira se uglavnom na hidrolizi antibiotika ili prenosa acetil, adenil ili fosforne grupe koja dovodi do konformacionih promena. Ovi enzimi uglavnom deluju na manji broj supstrata i nemaju znaaja na metaboliku aktivnost elije. Geni koji nose informacije za ovu vrstu rezistencije nalaze se najee na mobilnim genetikim elementima. Jedan od ovih naina razvijanja rezistencije na beta laktamske antibiotike je i sintetisanje enzima beta-laktamaze koja vri hidrolizu antibiotika. Rezistencija na antibiotike se prenosi hromozomski i putem plazmida, zavisi koji gen kodira iroku lepezu beta laktamaza. Ova rezistencija se jako brzo irila meu gram-negativnim bakterijama. Gram-negativne bakterije zahvaljujui postojanju spoljne membrane beta-laktamazu koncentruju u periplazmatskom prostoru, gram-pozitivne elije daleko osetljivije na beta-laktamske antibiotike od gram-negativnih.

10

U poetku se pojava ove rezistencije ograniavala na mali broj vrsta bakterija (E. cloacae, C. freundii, S. marcescens, P. aeruginosa). Ovi sojevi su produkovali laktamazu C tipa, hromozoski kodiranu, kasnije se ova rezistencija proirila na veliki broj bakterijskih vrsta i danas predstavlja veliki problem. Jo jedan primer progresivnog razvoja ove vrste rezistencije su enetrobakterije, koje ispoljavaju plazmid kodiranu rezistenciju TEM1, TEM2 i SHV1. Meutim osamdesetih je otkrivena nova grupa laktamskih enzima oznaenih kao extended spectrum beta lactamases ESBL. Ova klasa beta laktamaza je sposobna da hidrolizuje proireni spektar cefalosporina tako to dolazi do promena u aminokiselinskoj sekvenci oko mesta vezivanja , tj, aktivnog mesta enzima. Klasifikacija enzima je zasnovana na aminokiselinskim sekvencama.

One se prema aminokiselinskim sekvencama dele na: 1) serin enzimi gde imamo A, C i D klasu enzima 2) metalo enzimi gde imamo B klasu enzima ija funkcija zavisi od prisustva Zn Klasa A enzima je kodirana plazmidom (ampA gen, tem, shv, ctx i drugi geni) posledica su ESBL sojevi (penc-ceph-inh-R) Klasa C kodirana ampC genom na hromozomu (ceph-inh-R) Klasa D je ekvivalent klasi C ali je kodiran plazmidom oxa gena Klasa B kodirama Mbl genom na hromozomu i plazmid kodirane imp i vim genima (carbamenemes-inh-R) klasa A TEM - laktamaza se najee sree kod gram-negativnih bakterija, oko 90% ampicilinske rezistencije kod E. coli je posledica produkta tem1 gena, kao i penicilinske rezistencije kod H. influence i K. pneumonie. Rezistencija i pojava ESBL tipova je posledica supstitucija aminokiselina najee na pozicijama 104, 164 i 238. Promenom konfiguracije postaje dostupna oxiamino grupa beta laktamskog supstrata. Meutim supstitucija se ne zaustavlja na tih nekoliko mesta ve je mnogo ira ima oko 140 tipova Tem enzima. Ovi ESBL fenotipovi su karakteristini vie za USA. Meu ovim Tem enzimima ima i onih inhibitor rezistentnih. Poto se u farmaceutskoj industriji pribegava inhibiranju ovih enzima najee uz pomo klavulanske kiseline, poznati su i enzimi iz ove grupe koji su otporni na prisustvo klavulonata. Pronaeni su kod E. coli, K. pneumonie, Klebsiella oxytoca, P. miribilis, Citrobacter freundii SHV beta laktamaza deli 68% aminokiselinske strukture sa Tem1 enzimom, dakle imaju jako slinu strukturu. Najea je kod K. pneumonie i preko 20% plazmid posredovane ampicilinske rezistencije je posledica prisustva Shv enzima. Posledica mutacija kao i u predhodnom sluaju je supstitucija aminokiselina, tj izmena aminokiselinske sekvence najee ovde na poziciji 238 i 240. Poznato je oko 60 razliitih tipova enzima meu kojima su najei Shv5 i Shv12. CTX-M beta laktamaza je dobio naziv po velikom afinitetu prema antibiotiku cefotaximu i ceftazidinu nije mnogo slian sa predhodna dva slae se u 40% aminokiselina. Poznato je oko 80 tipova ovog enzima, najei su Ctx-M14, Ctx-M2, Ctx-M3. Pronaeni su kod E. coli i Salmonella enterica i nekih vrsta eneterobakterija. KPC beta laktamaza takoe spada u A klasu enzima koji jako dobro hidrolizuje karbapeneme, poznati Kpc1 i Kpc2 karakteristini za Ameriku. klasa C AmpC beta-laktamaze su najee izolovane iz proirenog spektra cefalosporin rezistentnih sojeva gram-negativnih bakterija kodirana je od strane ampC gena koji se nalaze na hromozomu. Pronaeni su kod rodova Citrobacter, Enterobacter i Serratia. Mogu biti kodirani i sa plazmida. CMY karbapenemaze otkrivene su 2006. god. izolovane iz virulentnog soja Enterobacter aerogenes, ovaj enzim je kodiran genima sa plazmida pYMG1 i mogu se premetati u druge bakterijske rodove.

11

Klasa D OXA beta laktamaze koje hidrolizuju oxaciklin i po tome su dobile naziv, manje su uobiajene plazmid kodirane beta laktamaze. I u ovom sluaju supstitucija aminokiselina dovodi do pojave ESBL fenotipova. Klasa B ovde spadaju beta laktamaze-karbapenemaze koje su oznaene kao metaloenzimi zato to za svoju aktivnost zahtevaju prisustvo cinka Imp tipovi beta laktamaza su plazmid posredovane, pronaene u Japanu 1990 god nekih gram negativnih enterokoka i kod rodova Pseudomonas i Acinetobacter. Imp sojevi se lagano ire u druge zemlje bliskog istoka, u Evropu su stigli 1997, a pronani su i u Kanadi i Brazilu. VIM (Verona integron-encoded laktamases) pronaena je u Italiji 1996. god. kod P. aeruginosa sad ima oko deset razliitih enziama, ovi sojevi su se brzo proirili po Evropi i Bliskom istoku, najpoznatiji su Vim4,Vim3, Vim2 i Vim1.

Esteraze
Jedna od prvootkrivenih rezistencija na na makrolide posredovana esterazom je kod E. coli. Visok nivo rezistencije kod ove bakterije na makrolide je posledica plazmid kodirane rezistencije. Geni koji su zadueni za sintezu esteraze su oznaeni kao ere geni, ereA gen kodira eterazu koja je specifina za hidrolizu 14-lanog prstena makrolida i pored E.coli pronaen je kod Klebsiella pneumonie i kod nekih enterobakterija. Nalazi se originalno na plazmidu pIP1100 organizovan u integron genske kasete, nosi sopstveni promotor i pripada drugoj klasi integrona, koji ima jednu insercionu sekvencu oznaenu IS1 uzvodno od intI2 gena koji kodiraju mesto specifinu integrazu. Genske kasete se ugrauju u integron uz pomo inegraze putem mesto specifine rekombinacije, izemu attI i attC mesta koje je povezano sa single open reading frame sekvencom koja je predstavlja genske kasete. U okviru intI sekvence pre attI regiona nalazi se promotor koji regulie ekspresiju ovih gena. Do sada je pronaeno vie od 70 antibiotskih rezistencijana ovim genima. Tako pored ereA gena kod nekih enterobacterija postoji ereB gen koji kodira jo jednu makrolid specifinu esterazu. Kod gram-nagativnih bakterija esteraze specifino hidrolizuju 14 i 15-lane makrolide dok kod gram-pozitivnih 14 i 16-lane makrolide. U odnosu na integrazu postoje dve klase integrona, one koje inkorporiraju u Tn21 familiju transpozona i druga klasa ona koja asocira sa Tn7 familijom transpozona (Biskri & Mazel, 2003).

Modifikacija enzimima
Jo jedan nain delovanja enzima i razvijanja rezistencije je preko enzima koji slue kao transferi odreenih grupa. esto je rezistencija na aminoglikozde i posledica delovanja inaktivirajuih enzima koji se dele u tri grupe: aminoglikozid fosforiltransferaze, adeniltransferaze i acetiltransferaze (rezistencija na netilmicin, amikacin, gentamicin). Svi ovi enzimi su jako specifini u odnosu na svoj supstrat. Identifikovano je najmanje 16 acetiltransferaza koji katalizuju prenoenje acetata sa acetil koenzimaA na amino grupu aminoglikozida. Aminoglikozidne adenilaze su nukleotidne transferaze koriste ATP i vezuju se za hidroksilne izloene grupe. Fosfotransferaze takoe fosforiliu hidroksilne grupe. Najee se geni koji kodiraju ove enzime nalaze na plazmidima. Ovi geni se najee nalaze na genskim kasetama, geni koji kodiraju aminoglikozid adenil transferazu oznaeni su sa aadA, aadB, oni koji kodiraju aminoglikozid acetil transferazu sa aacA, aacB, za chloramfenikol acetilazu catA, catB, za dihidrofolat reduktazu drfA, drfB i sl. (Recchia & Hall,1995). U poslednje vreme sve ee opisivana rezistencija je posredovana metilazama 16 rRNA, ili 23S rRNK, u tom sluaju obino postoji rezistencija na sve aminoglikozide i makrolide. Razlika je to u

12

sluaju metilacije 23S RNK i 16S RNK kao supstrat slui adeninski ostatak na rRNK i na taj nain dolazi do maskiranja ovog mesta tako da se antibiotik ne moe vezati.

Metilacija 23S rRNK

Makrolid-linkozamin-streptogramin MLS sojevi nose rezistenciju na ove antibiotike i ona je zasnovana na metilaciji adeninskog ostatka na 23S subjedinici rRNK. Metilaza vri dodavanje dve metil grupe na adeninski ostatak na 23S rRNK. Ova ribozomalna RNK je ustvari ribozim, ima enzimsku aktivnost i ustvari je peptidil transferaza, tako se metilacijom zapravo titi ovaj enzim od dejstva antibiotika iji je on supstrat. Pronaeno je oko 30 razliitih erm gena, kod gram pozitivnih i gram negativnih bakterija. Kod stafilokoka ermA, ermB, ermC i ermF, kod sterptokoka ermAM kod roda Bacillus ermD i ermG. Najea etiri gena za metilazu koji su identifikovani kod roda Staphilococcus: ermA, ermB, ermC i ermF, od kojih je ermC najzastupjleniji, te je tako i najbolje prouen. Prva dva su transpozon kodirana, a ermC je plazmid kodirana. Postoji dva tipa ermC ekpresije, tzv. inducibilna i konstitutivna. Razlika izmeu ova dva tipa ekspreije je u tome to je konstitutivna stalno prisutna, a inducibilna ekspresija zavisi od uslova u kojima se elija nalazi. Genetika osnova razlike ova dva tipa eksptresije lei u regulatornom regionu koji je smeten uzvodno od strukturnih ermC gena. Indukovana ermC genska ekspresija indukovana je prisustvom antibiotika, zapravo sinteza metilaze zavisi od prisustva antibiotika. Regulacija ove eksptresije se odvija po principu translacione atenuacije slino kao regulacija sinteze triptofana. Regulatorni region poseduje ORF za 19 aminokiselina i etirri invertovana ponovka, tj. dva para. Mesto vezivanja ribozoma oznaeno sa SD2 i stratni kodon za ermC gene je u okviru etvrtog invertovanog ponovka IR4. Tako da kada je ovo mesto slobodno, tj. kada se ne formira ukosnica izmeu treeg i etvrtog ponovka onda se translacija nesmetano obavlja, ukoliko se formira ukosnica i blokira ovo mesto blokira se i sinteza metilaze. Plazmid oznaen pE194 originalno je izolovan iz Staphylococcus aureus, i pronaeno je da nosi inducibilnu rezistenciju na makrolide i linkozamide. Nizom eksperimenata dolo se do zakljuka da mutacijom na ponovcima delecijom i duplikacijom inducibilona ekpresija se moe transformisati u konstitutivnu koja ne zaviasi od prisustva antibiotika ve je reglisana samo jainom promotora (Werckethin et al, 1999). Dakle antibiotici iz MLS grupe mogu se podeliti u dve podgrupe: induceri ermC genske ekspresije koji ukljuuju 14- i 15-lane makrolide i neinducere u koje spadaju 16-lani makrolidi streptogramin B i linkozamidi. Stafilokoke koje nose inducibilne ermC gene rezistentne su samo na inducere. One koje nose konstitutivnu rezistentne su na sve antibiotika iz ove grupe (Werckethin et al, 1999).

Metilacija 16S rRNK

Metil-transferaze koje pruaju otpor aminoglikozidnim antibioticima otkrivene su kod prirodnih proizvoaa iz roda Streptomyces. One metiliraju guaninske i adeninske ostatke na 16S rRNK i pripadaju porodici Arm kodirane od starne arm gena (aminoglycoside resistance methyltransferase) ili metilaze iz porodice Kam za kanamicin. Pored ove dve kod E.coli pronaena je i metilaza oznaena NpmA koja prua rezistenciju na iroki spektar aminoglikozida. Svoje delovanje metilaze ispoljavaju tek nakon formiranja 30S subjedinice, dakle jedini supstrat koji se moe uspeno metilovati je zrela 30S ribozomska subjedinica.

Promena ciljnog mesta

Promena ciljnog mesta moe biti posledica rada enzima koji slue za modifikaciju mesta

13

vezivanja kao to je ve gore opisano u sluaju metilacije vezujueg mesta za antibiotike na ribozomu, ti enzimi su razliite transferaze koje maskiraju vezujue mesto dodavanjem razliitih grupa. Promena ciljnog mesta moe biti i na samoj membrani u sluaju beta laktamskih antibiotika, gde dolazi do promene vezujueg proteina. MRSA sojevi imaju mecA gen koji kodira penicillin vezujui protein PVP2a, on je lociran na scc-mec, Staphylococcal Cassettte Chromosomes. Ekspresija PVP2a ima za posledicu rezistenciju bakterije na sve peniciline, cefalosporine i karbapeneme. esti uzronici infekcija kod dece su Streptococcus pneumoniae, ove koke razvijaju rezistenciju na penicilin tako to menjaju ciljno mesto vezivanja antibiotika. Do promene dolazi zbog izrazite sklonosti za genetsku transformaciju, strana DNK koja se ugrauje u njihov genom potie od viridis streptokoka koje sa njima dele stanite u sluznici gornjih disajnih puteva. Pneumokoke ne prelaze odjednom iz kategorije osetljivih u kategoriju rezistentnih, ve se to deava postepeno prelazei fazu umerene rezistencije.

Slika 5. (www.mecriticalcare.net)

Zaobilaenje inhibirane faze metabolizma

Neke bakterijske elije razvijaju rezistenciju na aminoglikozide npr. tako to zaobilaze inhibiranu fazu metaboliza. To je u sluaju metabolizma folne kiseline. Bakterijska elija u ovom sluaju ne sintetie folnu kiselinu ve se ponaa kao eukariotska elija i koristi je iz spoljne sredine. Folna kiselina ima ulogu koenzima u procesu transfera karboksilne grupe prilikom sinteze timidina i purina. Za sintezu folne kiseline neophodna je PABA, dihidrofolat sintetaza i dihidrofolat reduktaza i dihidropteorat sintetaza. Sulfonamidi su strukturni analozi PABA, oni inhibiraju rad

14

dihidropteorat sintetaze u funkciji kompetitivnog inhibitora, spreavajui inkorporaciju PABA i sintezu dihidropteorine kiseline. Mutacija na genima dhps, na hromozomu kod E. coli dae mutanta koji je otporan na sulfonamide. Kod mutanta se umesto fenilalanina javlja izoleucin na 28 mestu tako da se ovde javlja izmenjen enzim sa manjim afinitetom za date antibiotike. Da li je u pitanju takasta mutacija ili duplikacija ili delecija, zavisno od soja bakterija , posledica je izmenjen enzim u manjoj ili veoj meri. Kod gram-negativnih enterobakterija ee je pojava plazmid posredovane rezistencije na sulfonamide. Plazmid posredovana rezistencija na sulfonamide ukljuuje pojaanu sintezu dihidrofolat reduktaze ili PABA. Geni odgovorni za ovu rezistenciju su oznaeni sa sulI, sulII i sulIII. Jo Jedan nain je i sinteza izmenjeneog enzima sa manjim afinitetom za sulfonamide. Dakle, bakterijske elije pored toga to imaju sposobnost da uzimaju folnu kiselinu iz spoljanje sredine ponaajui se kao eukariotske elije, razvile su i alternativne puteve njene sinteze (Huovinen, 1995).

15

LITERATURA
Christiane Werchenthin, Stefan Chwarz and Henrik Westh, (1999), Structural Alteration in Translation Attenuator of Constituitively, Antimicrobial Agents and Chemoteraphy, 16811685, www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC89343/pdf/ac001681.pdf, pristupljeno 15.08.2010. Darko Sakar, (2006), Makrolidi i linkozamidi i aminoglikozidi, Zavod za farmakologiju i toksikologiju, Veterinarski fakultet sveuilita u Zagrebu Donald D Kirsch and Margaret H. Lai, (1984), Regulation of Macrolide resistance Gene fusion in Escherichia coli, Journal of bacteriology, 381-384 www.ncbi.nlm.gov/pmc/articles/PMC/215641/.../jbacter00230-0389.pdf, pristupljeno 14.07.2010. Gavin D. Recchia and Ruth M. Hall, (1995)Gene casette and new class of mobile element, Microbyology, 141, 3015-3027, http://mic.sgmjournals.org/content/141/12/3015.full.pdf, pristupljeno 10.07.2010. Jelena Kneevi-Vukevi, Branka Vukovi-Gai i Draga Simi, (2009), Osnovi biologije prokariota, Modul 2. Osnovi genetike prokariota, Univerziteta u Beogradu, Bioloki fakultet Lateef Adewoye, Ainsley Sutherland, Ramakrishnan Srikumar, and Keith Poole, (2000), The MexR Repressor of the mexAB-oprM Multidrug Efflux Operon in Pseudomonas aeruginosa: Characterization of Mutations Compromising Activity, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, p. 2233-2241, Vol. 44, No. 9, www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC135222/pdf/1452.pdf, pristupljeno 12.07.2010. Latefa Biskri and Didier Mazel, (2003), Erythromycin esterase gene ereA is located in a functional gene cassete in an unusual class 2 integron, Antibicrobial Agents and Chemotherapy, p.3326-3331, http://aac.asm.org/cgi/reprint/47/10/3326, pristupljeno 29.08.2010. Ljiljana Petrovi Jeremi, (2010), Uestalost meticilin rezistentnih Staphylococcus aureus MRSA sojeva, Acata Medica Medianae, vol.49 http://publishermedfak.ni.ac.rs/2010-html/1broj/6Ljiljana%20Petrovic%20UCESTALOST%20MRSA%20SOJEVA%2033-36.pdf, pristupljeno 02.06.2010. Mazen Kherallah, (2010), Antimicrobial Rezistance Mehanisms, www.mecriticalcare.net/downloads/IDCcourse/mechanismsofResistance.pdf, pristupljeno 25.07.2010. Michael T. Madigan & John M. Martinko, (2006), Brosk-Biology of Microorganisms, Eleventh edition Pentti Huovinen, Lars Sundstrom, Gote Swedberg and Ola Skold, (1995), Trimetropim and sulfonamid resistance, Antimicrobial Agents and Chemoterapy, p.279-289, http://acc.asm.org/cgi/reprint/39/2/279.pdf, pristup 29.08.2010. S. Schwarz, Carla Lange and Christiane Werchenthin, (1998), Molecular analysis of the macrolide-linkosamide resistance gene region of novel plasmid from Staphylococcus, J. Med Microbiol. Vol47 63-70 http://jmmsgmjornals.org/content/47/1/63.full.pdf, pristupljeno

16

10.08.2010.

Sanda Sardeli i Branka Bedeni, (2009), Rezistencija na antibiotike u Pseudomonasa aeruginosa Infektoloki glasnik 29: 4,177-183 www.hrcak.srce.hr/file/77685, pristupljeno 29.06.2010.

17