Practicum Biotechnologie

Protenen in voedingsmiddelen scheiding via agarose-gelelektroforese

Groep 212
Mattias Durnez in samenwerking met Ruth Bams, Jakob Mols, Carl Uydens, Thomas Goossens, Bastiaan Van Loo

Labverantwoordelijke

Leni Borremans

Inleiding
Om de samenstelling van verschillende soorten protenen of DNA(-fragmenten) in een staal te onderzoeken, kan je elektroforese toepassen. Kenmerkend voor deze techniek uit de moleculaire biologie is dat moleculen gescheiden worden op basis van hun lengte en moleculair gewicht. Voor niet-gedenatureerde protenen gebeurt dit ook op hun vormgrootte. In dit practicum worden stalen van voedingsmiddelen getest op de samenstelling van hun protenen. Voor bepaalde verwante voedingsmiddelen worden de stalen met elkaar vergeleken bij de analyse van de resultaten.

1. Doelstelling van het practicum

Het opzet van dit practicum is het scheiden van mengsels van protenen afkomstig van stalen uit voedingsmiddelen die rijk zijn aan protenen, zoals peulvruchten. Hiervoor gaan we gelelektroforese toepassen. Het principe hierachter is dat geladen (!) moleculen gescheiden worden op basis van hun beweging in een elektrisch veld in een zeker medium, in dit geval gel. De gebruikte gel in het practicum is agarose, maar ook andere gels zijn mogelijk. Een extra buffer wordt aangelegd rondom de gel zodat de stroomgeleiding efficint plaatsvindt. Om de protenen in de gel zichtbaar te maken na de agarose-gelelektroforese, is een kleurstof nodig waarmee deze kunnen binden. Zo komen we tot een lijst met benodigdheden om het practicum uit te voeren: Elektroforese-toestel met gelhouder voor horizontale scheiding van protenefragmenten via agarose-gelelektroforese Laemmli als ladingsbuffer om de protenen een uniforme, negatieve lading te geven Collodale coomassie kleurstof om de protenen zichtbaar te maken TBS buffer als running buffer voor stroomgeleiding Stalen uit voedingsmiddelen rijk aan protene Agarosegel (TB buffer, agarose)

De protenen verplaatsen zich van de min- naar de pluspool in het elektrisch veld en zouden in het ideale geval een bandenpatroon in de gel moeten vormen na kleuring. Grotere en langere protenen, al dan niet gedenatureerd, migreren trager en vormen op die manier banden in de gel die dichter tegen de minpool aanliggen dan voor kortere protenen.

2. Werkwijze - bereiding van de oplossingen

Het bereiden van gel en stalen gebeurt quasi simultaan, al draagt het de voorkeur te beginnen met de bereiding van de gel. De werkwijze voor beiden wordt hieronder apart weergegeven. Vervolgens brengt men de stalen aan in de gel en vindt de elektroforese plaats. Tenslotte volgt de kleuring van de gel.

2.1 Bereiding van de agarosegel

Men maakt 50 ml klaar van een 3% agarose-oplossing in een TB buffer door uitzonderlijk (!) 50 ml TB buffer en 1,5 g agarose te mengen. Dit levert geen exacte 3 % agarose-oplossing, maar omdat het geheel verhit wordt in de microgolfoven totdat de agarose is opgelost, zal een deel van het oplosmiddel verdampen. Dit gaat de fout tegen die gemaakt wordt door geen exact 3% agaroseoplossing te bereiden. Na verhitting moet de oplossing afkoelen tot een temperatuur waarbij de oplossing manueel in de gelhouder kan gegoten worden. Deze gelhouder dient zorgvuldig afgeplakt te zijn met tape langs de randen. Onmiddellijk na het gieten, of reeds voordien, brengt men de kam aan die zorgt voor de uitsparingen in de gel. Hierin giet men later de stalen. Wanneer de gel is gepolymeriseerd, verwijdert men de kam door deze loodrecht omhoog te trekken. De gel is dan klaar voor gebruik. Dit proces is zonder problemen doorlopen voor het practicum van onze groep.

2.2 Bereiding van de stalen

De stalen worden klaargemaakt door ze fijn te maken met stamper en mortier als het een vast staal betreft. Een mespunt van een staal volstaat. Samen met 0,5 ml van de Laemlli buffer brengt men elk staal in een eppendorfbuisje dat men vervolgens goed schudt. Nadat de onopgeloste delen bezonken zijn (ongeveer 5 min), is er de mogelijkheid n, meerdere of alle stalen te verhitten. Dit is niet gebeurd voor de stalen in dit verslag. De stalen zijn dan klaar om in de gel aangebracht te worden. In dit verslag bestaat het gamma aan stalen uit gekookte rijst, filet americain, erwten, kaas, niet gekookt eiwit en eigeel en tenslotte tweemaal melk. Dit aantal van acht stalen is het maximum aantal mogelijke stalen voor n gel.

2.3 Agarose-gelelektroforese en kleuring

Na bereiding van gel en stalen, verwijdert men de tape van de gelhouder en vervolgens plaatst men de gel in het gelelektroforese-toestel tesamen met de running buffer TBS. Het is aangeraden de uitsparingen in de gel zo goed als mogelijk zichtbaar te maken door er bijvoorbeeld een donkergekleurd papier onder te leggen als ze moeilijk zichtbaar zijn. Dan is het tijd om 35 l van de stalen in de uitsparingen aan te brengen met een micropipet. Belangrijk hierbij is de volgorde te onthouden waarin de stalen worden aangebracht, bijvoorbeeld door nummering en afzonderlijke notatie van de stalen op papier zoals verkozen door onze groep. Finaal rest enkel nog het aankoppelen van de stroombron. Er moet ongeveer drie kwartier gewacht worden zodat de protenen kunnen migreren tot aan de pluspool. Na migratie volgt de kleuring van de gel door middel van collodale coomassie kleurstof (blauwe kleur). Dit gebeurt overnacht in een bakje dat voortdurend geschud wordt. Hiervan wordt de dag nadien een foto genomen zoals die verderop in het verslag afgebeeld staat.

3. Resultaten en besprekingen
Na de beschrijving van het doel van dit practicum en van de manier waarop we getracht hebben dat te bereiken, is het tijd om de resultaten te bespreken. Hierbij beperk ik me tot mijn eigen staal, bestaande uit erwten, en de vergelijking van stalen afkomstig van verwante voedingsmiddelen, zijnde niet gekookt eiwit versus niet gekookt eigeel en erwten versus gekookte rijst. Ook besprekingen van de Laemlli buffer, het gebruik van opgekookte stalen en een mogelijk alternatief voor de agarosegel als scheidingsmedium komen aan bod.

3.1 Laemlli buffer

In de Laemlli buffer die wordt toegevoegd aan de stalen, zijn verscheidene bestanddelen terug te vinden die de buffer zijn verschillende functies geven. Een eerste bestanddeel is bromofenolblauw dat aangeeft hoe ver de protenen gemigreerd zijn in de gel. Dit bindt niet met de protenen zelf. Ook is er glycerol aanwezig in de buffer om de densiteit te verhogen. Dit zorgt ervoor dat de stalen naar de bodem van de welletjes in de gel zakken. Een derde bestanddeel is SDS, het denaturerend agens. SDS denatureert echter niet alleen de moleculen, het geeft ze ook een uniforme lading zodat elektroforese mogelijk wordt.

3.2 Resultaten eigen staal

Het is nuttig eerst op te zoeken welke protenen aanwezig zijn in een erwt. Uit een Ph.D. thesis (Tzitzikas, 2005) blijkt dat een erwt volgende protenen bevat: albuminen, conviciline, legumine, post-translationeel gemodificeerde viciline, ongemodificeerde viciline en ook nog enkele aan globulinen gerelateerde protenen. Vergelijken we dit met de resultaten van staal nummer 5 op figuur 1, dan is duidelijk dat deze verscheidenheid aan protenen niet te onderscheiden valt op de figuur. Een mogelijke verklaring hiervoor is dat ons elektroforese-toestel slechts een 25-tal minuten aangesloten is geweest op de stroombron, omdat men het tegelijk heeft afgekoppeld met gels die al een 10-tal minuten eerder aangesloten waren. Bijgevolg zijn de protenen nog niet tot halverwege de agarosegel gemigreerd.

Figuur 1 - resultaat agarose-gelelektroforese

1. Staal A van melk 2. Filet americain

3. Gekookte rijst 4. Kaas

5. Erwt 6. Niet gekookt eigeel

7. Niet gekookt eiwit 8. Staal B van melk

De onvolledige scheiding van de verschillende moleculen heeft geleid tot een smeer van protenen in de gel. Enkel de stalen met nummers 1, 4 en 7 vertonen al min of meer een vage bandenstructuur met overlapping. Dit in tegenstelling tot het verwachte, duidelijke bandenpatroon in de agarosegel voor de stalen. Figuur 2 geeft weer hoe een bandenpatroon van een erwtenstaal eruit ziet na elektroforese in een 12 % polyacrylamide gel omgeven door TPPE. De banden aangeduid door nummers 1, 2, 3, 4 en 5 komen overeen met respectievelijk conviciline, legumine, ongemodificeerde viciline, post-translationeel gemodificeerde viciline en aan globulinen gerelateerde protenen. (Tzitzikas, 2005)

Figuur 2 - Bandenpatroon van een erwt na 12% polyacrylamide gel elektroforese

Het gebruik van de polyacrylamide gel is een alternatief voor de agarosegel. Het heeft als voordeel dat de resolutie van het bandenpatroon veel hoger is omdat moleculen veel nauwkeuriger gescheiden kunnen worden op grootte. Dit betekent echter ook dat het bereik van een polyacrylamide gel kleiner is dan deze van een agarosegel. Bovendien is een polyacrylamide gel moeilijker te bereiden en is acrylamide neurotoxisch, dus voorzichtigheid is geboden. (Bowen, 2000)

3.3 Vergelijking verwante stalen

Omwille van de smeer aan protenen aanwezig in de gel, is het niet eenvoudig enige resultaten af te leiden met betrekking tot verwante stalen, toch zal ik een bescheiden poging ondernemen. 3.3.1 Erwten versus gekookte rijst Het naast elkaar leggen van de smeer aan protenen van zowel gekookte rijst als erwten (figuur 1) laat toe te beschouwen dat beiden gelijkend zijn: het merendeel van de smeer is doorzichtig en er is enkel een lichtblauwe verkleuring aan de kant van de minpool. Dit kan wijzen op een lage hoeveelheid protenen in beide stalen, onder meer door onvoldoende opname van protenen in de Laemlli buffer. 3.3.1 Niet gekookt eiwit versus niet gekookt eigeel Het vage bandenpatroon van niet gekookt eiwit (figuur 1) vertoont duidelijk een grotere aanwezigheid van protenen aan de kant van de pluspool dan het patroon van niet gekookt eigeel. Dit wijst erop dat eiwit kortere en kleinere protenen bevat dan eigeel. Deze migreren immers sneller doorheen de agarosegel.

3.4 Opgekookte stalen versus niet opgekookte stalen

In tegenstelling tot de stalen bereid in dit practicum is het mogelijk stalen op te koken vooraleer elektroforese toe te passen. Het percentage aan gedenatureerde protenen in een opgekookt staal zal groter zijn dan het percentage aan gedenatureerde protenen in een niet opgekookt staal. Hitte zorgt immers voor denaturatie van protenen wanneer de temperatuur voldoende hoog is. Het resultaat na agarose-gelelektroforese zal anders zijn bij een opgekookt staal omdat gedenatureerde protenen vlotter doorheen de gel zullen migreren. Dit heeft tot gevolg dat er duidelijkere banden in de gel te zien zullen zijn na kleuring en dat de banden dichter tegen de positieve pool zullen liggen voor eenzelfde tijdsduur van de test bij een niet opgekookt staal.

Besluit
Het is niet onmiddellijk mogelijk conclusies te trekken uit de resultaten van de elektroforese uitgevoerd door onze groep. Een verkorte tijdsduur van de agarose-gelelektroforese heeft waarschijnlijk aan de basis gelegen van de smeer aan protenen die in de gel is ontstaan. Dit maakt een analyse en vergelijking van de samenstelling van de protenen in de verscheidene stalen lastig en onbetrouwbaar.

Bibliografie
Bowen, R. A. (2000). Principles of Gel Electrophoresis. In R. A. Bowen, et al, Biotechnology and Genetic Engineering. Colorado State University. Tzitzikas, E. N. (2005). Exploring variation in pea protein composition by natural selection and genetic transformation. Experimentele Planten Wetenschappen. Wageningen, Nederland: Wageningen Universiteit, p. 23, 31, 32, 105.