ABSTRAK

Teknik fotometri digunakan dalam eksperimen ini untuk mengkaji penentuan protein dan fosfat tak organik di dalam suatu ekstrak. Teknik fotometri ini berasaskan kepada prinsip penyerapan cahaya dalam julat ultra lembayung (200-400 nm), sinaran tampak (400-700 nm) dan sinaran infra merah dekat (700900 nm). Terdapat banyak kaedah yang boleh digunakan untuk menentukan protein di dalam larutan. Contoh kaedah-kaedah yang boleh digunakan untuk penentuan protein ini adalah seperti menggunakan kaedah Folin-Ciocalteau, yang menggunakan jarak gelombang 700nm dan kaedah ujian Biuret, dengan menggunakan jarak gelombang 550nm. Bagi fosfat pula, penentuan di lakukan dengan menggunakan kaedah Tausky dan Sherr dimana jarak gelombang yang digunakan ialah 725nm. Nilai bacaan yang diperolehi daripada daya penyerapan larutan di catatkan, graf piawai bagi protein dan fosfat boleh di plotkan dengan menendakan paksi-y sebagai nilai daya penyerapan dan paksi-x sebagai kepekatan sampel. Dengan menggunakan graf piawai tersebut, kepekatan sampel piawai protein menggunakan kaedah Folin-Ciocalteau boleh di dapati. Melalui keputusan yang didapati ini, kesimpulan yang boleh dibuat adalah eksperimen yang menggunakan campuran atau gabungan kaedah-kaedah di atas sesuai digunakan untuk protein yang berkepekatan rendah hingga protein yang berkepekatan tinggi.

TEORI
Ada beberapa kaedah yang boleh digunakan untuk menentukan protein dalam larutan. Namun, tiada satu kaedah tunggal yang boleh dikatakan paling baik. Kaedah yang dipilih tertakluk kepada ciri protein yang dikaji dan ciri bahan lain yang berada dalam larutan sampel protein. Kaedah yang dipilih haruslah memberi keputusan yang tepat dan boleh dipercayai serta mempunyai kepekaan yang tinggi. Kaedah yang biasa di gunakan adalah seperti ujian Biuret, ujian

Folin-Ciocalteau, penitratan Kjeldahl dan spektrofotometri

ultralembayung.

Dalam eksperimen ini kaedah Biuret dan kaedah Folin-Ciocalteau di gunakan. KAEDAH BIURET Kaedah Biuret ini menggunakan sebatian yang mengandungi 2 atau lebih ikatan peptida seperti yang terdapat dalam suatu protein boleh bertindakbalas dengan reagen kuprum sulfat dalam larutan alkali yang menghasilkan warna biru. Warna ini dihasilkan oleh kompleks atom kuprum yang berkoordinat dengan 4 atom nitrogen. Ujian Biuret digunakan untuk menentukan protein yang pekat (1.20 mg). Ia dinamakan sebagai Biuret kerana sebatian Biuret (HN 2-CONH_CO-NH2) memberi ujian positif dengan reagen. Protein + NaOH + CuSO4 Kompleks CU2+ (warna ungu) UJIAN FOLIN-CIOCALTEAU Kaedah ini adalah lebih peka dari ujian Biuret. Ianya digunakan untuk menentukan protein yang terlarut dan menentukan protein yang tidak terlarut dalam pelarut sebanyak 5 g protein per mililiter boleh ditentukan. Warna kompleks terhasil ialah biru-tua iaitu sama dengan ujian Biuret, tetapi ia perlu di ikuti dengan suatu tindakbalas lagi, iaitu penurunan fosfomolibdat-fosfotungstat (dalam reagen) oleh tirosina dan triptofana yang hadir dalam molekul protein. PENENTUAN FOSFAT Kaedah Fiske-Subbarow yang di ubahsuai dinamakan Kaedah pewarnaan Fiske-Subbarow atau kaedah Tausky dan Shorr. Ianya digunakan dalam menentukan kepekatan fosfat tak organik. Kedua kaedah ini dapat menentukan kepekatan fosfat antara 0.1 1.0 m fosfat/ ml dalam larutan. Dalam kaedah Tausky dan Shorr yang digunakan dalam eksperimen ini, fosfat tak organik di kompleks oleh kumpulan molibdat untuk membentuk kompleks - protein

fosfomolibdat. Kompleks yang terhasil ini bertindakbalas dengan FeSO 4 untuk membentuk warna biru. SPEKTROFOTOMETRI Satu alat yang digunakan untuk menentukan kepekatan protein atau fosfat dalam larutan dinamakan Spektrofotometer. Ia adalah satu alat yang penting bagi ahli biologi dan biokimia kerana banyak sebatian biologi dan biokimia boleh menyerap cahaya dalam julat ultra-lembayung (200-400nm), sinaran ternampakkan (400-700nm) dan sinaran inframerah dekat (700-900nm). Spektrofotometer terdiri dari tiga komponen yang penting. Pertamanya adalah sumber cahaya, kedua penganalisa dan ketiga pengesan yang dihubungkan dengan meter atau perakam. Cahaya putih dari lampu tungsten melalui celah masuk dan difokuskan oleh kanta medan ke atas kanta objektif. Kanta objektif memfokuskan imej medan keatas kanta objektif. Kanta objektif memfokuskan imej celah masuk pada celah keluar selepas cahaya disebarkan oleh parutan atau prisma (penganalisa) dan dipantulkan oleh silinder (cam) memutarkan prisma atau parutan supaya hanya panjang-gelombang yang dikehendaki melalui celah keluar. Cahaya monokromatik yang keluar dari prisma atau parutan melalui sampel yang berada di dalam suatu tabung uji atau kuvet dalam lintasan cahaya. Cahaya monokromatik itu berakhir pada tabung-foto sukatan, dimana tenaga cahaya diubahbentukkan kepada suatu isyarat eletrik. Apabila sampel dikeluarkan dari spektrometer, satu alat halangan (occluder) akan tumbang untuk merintang semua cahaya keatas tabung- foto secara automatik. Spektrometer ini dapat di sesuaikan untuk mendapat 0%T pada meter. Suatu tombol untuk menyesuaikan 100%T diberikan juga untuk menentukan 100%T (Daya penyerapan sifar) dengan suatu larutan rujukan (biasanya pelarut) dalam pemegang sampel.

PRINSIP FOTOMETRI. Prinsip fotometri adalah berdasarkan kepada dua hukum yang terkenal iaitu Hukum Lambert dan Hukum Beer. Apabila cahaya putih melalui larutan yang mengandungi sebatian bewarna, jarak gelombang cahaya yang tertentu diserap secara terpilih. Warna yang terhasil disebabkan dari cahaya terpancar. Io ialah keamatan cahaya tuju dan I merupakan keamatan cahaya terpancar melalui bekas/kuvet yang tebalnya b cm, mengandungi larutan berkepekatan c mol/L :

Io

I Larutan = c mol L Sebatian bewarna dalam larutan

Hukum Lambert menyatakan bahawa jika satu alur cahaya monokromatik melalui suatu medium atau suatu larutan , daya penyerapan medium itu adalah berkadar terus dengan jarak lintasan yang dilalui. Penyerapan cahaya ini boleh dituliskan seperti berikut: A= 10g Dimana, A l lo l K = = = = = daya penyerapan atau ketumpatan optik keamatan cahaya yang melalui sampel keamatan cahaya tuju kepada sampel jarak lintasan cahaya atau panjang medium yang dilalui oleh suatu pemalar kekadaran yang bersandarkan kepada sifat molekul, jarak gelombang kepekatan larutan dan lain-lain. lo L = Kl

cahaya

Hukum

Beer

menyatakan

bahawa

apabila

suatu

alur

cahaya

monokromatik melalui suatu larutan atau medium, jika jarak lintasan di tetapkan, daya penyerapan berkadar terus kepada kepekatan sampel dalam larutan.Daya penyerapan A boleh di ungkap sebagai : A = 1010 I0 = KC I di mana C = kepekatan sampel K = gelombang, jarak lintasan dan lain-lain. Dengan menggabungkan kedua hukum ini , kita dapati A = log10 I0 = ecl I dimana E = keserapan molar jika c dalam unit mol/liter dan I dalam unit cm. Ia adalah pemalar kekadaran yang di kenali sebagai pekali pemadanan molar. Kadangkala nilai penghantaran T% kepekatan sampel. Nilai tersebut diberi oleh persamaan T = I pemancaran. I0 I0 Persamaan itu memberi kepekatan daya penyerapan linear jika e dan I adalah tetap. Suatu larutan akan mempunyai suatu pemalar spesifik pada suatu = e-kcl dimana I = boleh digunakan untuk menentukan atau I= Ioe-kcl pemalar kadar yang bersandaran kepada sifat sampel, jarak

panjang gelombang tertentu. Plot daya penyerapan lawan kepekatan larutan yang mengikut hukum Beer-Lambert kelihatan seperti rajah di bawah.

Daya Serapan A

Kepekatan Terdapat juga banyak larutan kimia dan protein yang tidak bewarna di dalam air. Keadaan yang sedemikian memerlukan sebatian tadi ditindakbalaskan dengan satu atau banyak reagenuntuk menghasilkan suatu kompleks yang mempunyai warna khas. Keamatan warna yang terbentuk adalah berkadar dengan kepekatan sebatian asal yang tidak mempunyai warna jika tindakbalas ituberlaku secara kuantitatif. Sebatian yang tidak diketahui kepekatannya, biasanya kiya menggunakan satu siri larutan piawai yang mempunyai kepekatan yang kita telah ketahui dan suatu larutan blank (terdiri daripada pelarut sahaja). Kepekatan sebatian yang belum diketahui boleh ditetukan dengan mengukur daya penyerapannya daripada plot piawai yang dibuat berdasarkan siri larutan piawai tadi.

KEPUTUSAN DAN ANALISIS

Jadual 1.1: Penentuan protein dengan Kaedah Folin Ciocalteau . Protein Tabung uji 1 (blank) 2 3 4 5 6 7 (sampel 1) 8 (sampel 2) Piawai (ml) Isipadu Air (ml) Kepekatan Protein (g) Larutan Cu(g/ml) Reagen Folin Beralkalin (ml) 0.0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.30 1.00 1.00 1.00 0.95 0.90 0.85 0.80 0.70 0.00 0.00 0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 300.0 338.0 234.0 6 6 6 6 6 6 6 6 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0 0.085 0.220 0.273 0.419 0.449 0.616 0.428 Daya Penyerapan (nm)

i) Dari jadual 1.1, nilai daya penyerapan adalah berkadar terus dengan kepekatan protein. ii) Dari graf ,kepekatan protein dalam larutan sampel 1 tabung uji 7 adalah 338.0 g. iii) Dari graf, kepekatan protein dalam larutan sampel 2 tabung uji 8 adalah 234.0 g.

Jadual 1.2 : Penentuan protein dengan menggunakan Kaedah Biuret .

Air Tabung uji 1 2 3 4 5 6 (sampel 1) 7 (sampel 1) 8 (blank) Suling (ml) 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.5 0.1 1.0

Larutan Protein Piawai 1mg/ml(ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 0 0

Larutan Protein Uji (ml) 0 0 0 0 0 0.5 0.9 0

Reagen Biuret (ml) 4 4 4 4 4 4 4 4

Kepekatan Protein (g) 200 400 600 800 1000 245 490 0

Daya Penyerapan (nm) 0.008 0.019 0.030 0.040 0.049 0.012 0.024 0

Pengiraan Kepekatan Protein. M1 V1 = M2 V2, dimana: M1 ialah kepekatan larutan Protein piawai (g) V1 ialah isipadu protein piawai (ml) M2 ialah kepekatan Protein di cari (g) V2 ialah isipadu keseluruhan (ml) Kepekatan Protein Tabung uji 1: M1 V1 = M2 V2 1000 g x 0.2ml = M2 x 1ml M2 = 200 1 M2 = 200g. Kepekatan Protein Tabung Uji 1 ialah 200g. Kepekatan Protein Tabung uji 2: M1 V1 = M2 V2

1000 g x 0.4ml = M2 x 1ml M2 = 400 1 M2 = 400g. Kepekatan Protein Tabung Uji 2 ialah 400g. Kepekatan Protein Tabung uji 3: M1 V1 = M2 V2 1000 g x 0.6ml = M2 x 1ml M2 = 600 1 M2 = 600g. Kepekatan Protein Tabung Uji 3 ialah 600g. Kepekatan Protein Tabung uji 4: M1 V1 = M2 V2 1000 g x 0.8ml = M2 x 1ml M2 = 800 1 M2 = 800g. Kepekatan Protein Tabung Uji 4 ialah 800g. Kepekatan Protein Tabung uji 5: M1 V1 = M2 V2 1000 g x 1.0ml = M2 x 1ml M2 = 1000 1 M2 = 1000g. Kepekatan Protein Tabung Uji 5 ialah 1000g. i) ii) iii) Dari jadual di atas nilai daya penyerapan adalah berkadar terus dengan Dari graf , kepekatan protein dalam larutan sampel 1 tabung uji 6 adalah 224 g Dari graf, kepekatan protein dalam larutan sampel 2 tabung uji 7 adalah 490 g Jadual 1.3 : Penentuan fosfat.

kepekatan protein.

Air Tabung uji Suling (ml)

Larutan Fosfat Piawai 1mg/ml (ml)

Larutan Fosfat Uji (ml)

Reagen Fosfat (ml)

Kepekatan Fosfat (g)

Daya Penyerapan (nm)

1 (blank) 2 3 4 5 6 7 (sampel 1) 8 (sampel 2)

3.0 2.7 2.5 2.0 1.5 1.0 2.5 2.0

0.0 0.3 0.5 1.0 1.5 2.0 0 0

0 0 0 0 0 0 0.5 1.0

2 2 2 2 2 2 2 2

0 100 166.7 333.3 500 666.7 50.0 96.0

0 0.202 0.329 0.622 0.911 1.234 0.090 0.172

Pengiraan Kepekatan Fosfat. M1 V1 = M2 V2, dimana: M1 ialah kepekatan larutan Fosfat piawai (g) V1 ialah isipadu Fosfat piawai (ml) M2 ialah kepekatan Fosfat di cari (g) V2 ialah isipadu keseluruhan (ml)

Kepekatan Fosfat Tabung uji 2: M1 V1 = M2 V2 1000 g x 0.3ml = M2 x 3ml

10

M2 = 300 3 M2 = 100g. Kepekatan Fosfat Tabung Uji 2 ialah 100g. Kepekatan Fosfat Tabung uji 3: M1 V1 = M2 V2 1000 g x 0.5ml = M2 x 3ml M2 = 500 3 M2 = 166.7g. Kepekatan Fosfat Tabung Uji 3 ialah 166.7g. Kepekatan Fosfat Tabung uji 4: M1 V1 = M2 V2 1000 g x 1.0ml = M2 x 3ml M2 = 1000 3 M2 = 333.3g. Kepekatan Fosfat Tabung Uji 4 ialah 333.3g. Kepekatan Fosfat Tabung uji 5: M1 V1 = M2 V2 1000 g x 1.5ml = M2 x 3ml M2 = 1500 3 M2 = 500g. Kepekatan Fosfat Tabung Uji 5 ialah 500g. Kepekatan Fosfat Tabung uji 6: M1 V1 = M2 V2 1000 g x 2.0ml = M2 x 3ml M2 = 2000 3 M2 = 666.7g. Kepekatan Fosfat Tabung Uji 6 ialah 666.7g. i) Dari jadual di atas nilai daya penyerapan adalah berkadar terus dengan kepekatan fosfat tak organik

11

ii) iii)

Dari graf , kepekatan fosfat tak organik dalam larutan sampel 1 tabung uji 7 adalah 8 adalah 0.100 mol 0.340 mol Dari graf, kepekatan fosfat tak organik dalam larutan sampel 2 tabung uji

12

PERBINCANGAN
Pemerhatian daripada eksperimen yang dijalankan mendapati daya penyerapan adalah berkadar terus dengan kepekatan larutan piawai protein dalam kaedah Folin- Ciocalteau dan kaedah Biuret, manakala dalam ujian Fosfat, daya penyerapan juga berkadar terus dengan kepekatan larutan piawai fosfat. Dalam ujian yang menggunakan kaedah Folin Ciocalteau , apabila protein bertindakbalas dengan reagen Folin Ciocalteau, kompleks Cu 2+- protein fosfomolibdat akan terbentuk. Larutan ini akan berwarna ungu dan dibaca dengan menggunakan spektrofotometer pada jarak gelombang 700 nm. Pada jarak gelombang ini didapati daya penyerapan adalah berkadar terus dengan kepekatan protein. Jika hukum Beer-Lambert di patuhi, dan l (jarak lintasan cahaya ) adalah tetap, satu plot daya penyerapan melawan kepekatan protein akan memberikan satu graf bergaris linear. Dari eksperimen yang dilakukan , didapati grafnya juga berbentuk lurus. Ini bermakna graf yang didapati secara amali adalah sama dengan graf yang di dapati secara teori. Dengan ini boleh dikatakan bahawa larutan protein piawai dan larutan protein sampel 1 dan 2 mematuhi Hukum Beer-Lambert. Bagi ujian yang menggunakan kaedah Biuret , satu graf bergarisan lurus juga diperolehi. Untuk ujian fosfat , graf bergaris lurus juga diperolehi. Ini bermakna semua ujian yang dilakukan, Hukum Beer Lambert adalah dipatuhi.,walaupun terdapat data-data berada di luar kawasan lurus. Untuk keputusan yang lebih tepat,pastikan kuvet spektrofotometer berkeadaan baik dan tidak calar. Ini kerana sekiranya menggunakan kuvet yang kotor, ini akan menyebabkan ralat. Sebelum membaca bacaan absorbance, lapkan bahagian licin/rata kuvet untuk memastikan kuvet benar-benar bersih. Isipadu larutan ujian perlu memenuhi dua per tiga kuvet tersebut bagi membolehkan lampu mengenai larutan tersebut. Penerangan mengenai penggunaan alat spektrofotometer juga perlu supaya pengendali tahu bagaimana untuk mengendalikan alat tersebut. Selain dari itu, aspek yang tidak kurang penting adalah selenggaraan alat spektrofotometer. Ia adalah untuk mendapat bacaan yang di perolehi itu boleh dipercayai.

13

KESIMPULAN
Dalam eksperimen ini, kita telah melakukan tiga eksperimen iaitu penentuan protein menggunakan kaedah Folin-Ciocalteau, yang menggunakan jarak gelombang 700nm dan kaedah ujian Biuret, dengan menggunakan jarak gelombang 550nm. Bagi fosfat pula, penentuan di lakukan dengan menggunakan kaedah Tausky dan Sherr dimana jarak gelombang yang digunakan ialah 725nm. Prinsip fotometri telah digunakan dan eksperimen ini telah menepati dua hukum yang terkenal iaitu Hukum Lambert dan Hukum Beer. Eksperimen ini telah berjaya kerana pada ketiga-tiga graf, plot daya penyerapan melawan kepekatan protein dan fosfat akan memberikan satu graf bergaris linear. Dari eksperimen yang dilakukan , didapati grafnya juga berbentuk lurus. Jadi, kepekatan protein dan kepekatan fosfat sampel-sampel ujian telah berjaya diketahui kepekatannya apabila ia di plotkan pada graf. Graf-graf ini bolehlah digunakan untuk eksperimen-eksperimen akan datang.

14