UNIVERZITET ZA POSLOVNE STUDIJE

SADRAJ

Uvod .....................................................................................................................2 1.0.GENETIKI ININJERING U BIOTEHNOLOGIJI..............................3 1.1.PROCES GENETIKOG ININJERINGA ININJERINGA........6 2.0.GENETIKI ININJERING KOD MIKROORGANIZAMA...................7 3.0.GENETIKI ININJERING KOD BILJAKA...........................................8 4.0.GENETIKI ININJERING KOD IVOTINJA.....................................10 Zakljuak....................................................................................................12 Literatura....................................................................................................13

UNIVERZITET ZA POSLOVNE STUDIJE

UVOD
Razvojem saznanja i dostignua iz molekularne biologije i naroito molekularne genetike, poetkom 70-ih godina prolog veka, omogueno je rekombiniranje molekula DNK. Neke biohemijske metode pruile su mogunost deljenja molekula DNK i njihovo prouavanje. Fenomen restrikcije i modifikacije omoguilo je dobivanje manjih fragmenata DNK, a njihovo spajanje, uz odreene enzime, nastanak novih kombinacija naslednih osnova koji u prirodi ne postoje. Takve rekombinantne molekule DNK mogue je uneti u ive elije odreenog domaina (mikrobnu, biljnu, ivotinjsku) u kojima ti rekombinovani molekuli DNK izraavaju svoja svojstva. Da bi to bilo mogue, bilo je potrebno konstruisati nosioce (vektore) koji se u unesenom domainu stabilno odravaju i nasleuju. Te tehnike nazvane tehnologijom rekombinantne DNK, ili popularnije, genetikim ininjeringom, znaajno su unapredile i ubrzale neka temeljna istraivanja na podruju prirodnih nauka, te su veoma brzo pronali put u praktinoj primeni.

UNIVERZITET ZA POSLOVNE STUDIJE

1.0. GENETIKI ININJERING U BIOTEHNOLOGIJI
Genetiko inenjerstvo je skup biohemijskih postupaka kojima se izrezuju cijeli geni, njihovi dijelovi ili skupine gena iz DNK jednog organizma i njihovo umetanje u unaprijed odreeno mjesto u DNK drugog organizma (najee takvog koji ima jednostavno genetiko ustrojstvo i koji se moe uzgojiti u neogranienim koliinama). Razvoj tih postupaka omoguio je upoznavanje grae i organizacije velikoga broja gena razliitih organizama, ukljuujui i ovjeka, te mogunost industrijske proizvodnje bjelanevina pomou mikroorganizama u koje su ugraeni sintetiki ili prirodni geni virusa, bakterija, gljiva i viih organizama, ukljuujui i ovjeka. Danas je mogue sintetizirati bjelanevine eukariota u prokariotskim stanicama. Te stanice proizvode inzulin, interferon, interlukine i hormon rasta te rekombinantna cjepiva. Postupci koji se primjenjuju u genetikom inenjerstvu uglavnom su enzimski i molekularno-bioloki te klasini postupci mikrobne genetike. Jedan od vanijih problema koji pokuava reiti genetiko ininjerstvo je u tome to se mnogi tipovi elija ne mogu gajiti van njihove prirodne okoline. Postoje brojne uspene metode jeftinog i brzog gajenja mikroorganizama. Npr. elije ljudske guterae, prirodnog izvora inzulina, ne mogu se gajiti odvojeno od tog organa, ali GE moe stvoriti mikroorganizme koji e proizvoditi tu materiju. Genetikim inenjerstvom se proizvodi humani rekombinantni inzulin (slika 1.) koji je jednoj brojnoj kategoriji ljudi dijabetiarima omoguio kvalitetan ivot. Na isti nain se proizvodi vakcina protiv hepatitisa B, opasne virusne zarazne bolesti koja se prenosi krvlju i krvnim derivatima i polnim putem, zahvaljujui vakcini imamo efikasnu zatitu. Primena genetikog inenjeringa:
1. omoguava dijagnostikovanje naslednih bolesti ( procenjuje se da je oko 4000 oboljenja uslovljeno promenama u jednom genu) 2. proizvodnja proteinskih hormona za leenje ljudi (pr. insulin, somatotropni hormon) 3. proizvodnja proteina za ishranu stoke (tzv. jednoelijski proteini) 4. proizvodnja novih antibiotika, vakcina, lekova 5. izrada mape ljudskog genoma tano posle 50 godina od kada su Votson i Krik otkrili strukturu DNK, zavrena je mapa humanog genoma tj. 2003.g. 6. upoznavanje sloene strukture gena 7. istraivanja tumorskih virusa koji inficiraju elije sisara 8. proizvodnja biljnih kultura koje daju vee prinose, otpornije su na biljne bolesti, nepovoljne klimatske uslove itd. 9. ugraivanje stranog gena u neki embrion ili zamena nekog gena u embrion

UNIVERZITET ZA POSLOVNE STUDIJE

Slika 1. Proces proizvodnje humanog inzulina. Primena GE u biotehnologiji prolazi etiri glavne faze: 1. Dobijanje gena s kodom za proizvodnju odreene materije u mikrobu fabrici; 2. Ugradnja gena u mikroorganizme; 3. Iniciranje mikroorganizama na sintezu strane materije; 4. Izdvajanje konanog proizvoda. Bioloka istraivanja bazirana na ovoj tehnici genetikog ininjerstva se odnose uglavnom na upoznavanje strukture i funkcije gena da bi se zatim ta znanja prakticno primenila u korist oveka. Tako genetski modifikovani organizmi (npr. bakterija eerihija), kojima su ugraeni ljudski geni, proizvode humane proteine neophodne za leenje tekih bolesti inzulin (za lecenje dijabetesa), interferon (protiv virusnih oboljenja), faktori koagulacije (za lecenje hemofilije) ili razlicite vakcine. Prelomni trenutak u razvoju ove metode bilo je saznanje da postoji prirodni geneticki inenjering. Otkrivena je da jedna vrsta zemljine bakterije (Agrobacterium tumefaciens) moe deo svog genetickog materijala, tzv. plazmid, da ugradi u DNK biljke. (Plazmid je mali prsten DNK.) ta je uradila bakterija?! Pozabavila se genetikom kombinatorikom, a zato i da ne obe vrste organizama imaju DNK izgraenu od ona 4 slova: A,G,C i T. Druga generacija transgenih biljaka su one kojima je poboljan kvalitet, npr. obogacene su vitaminima ili se pomocu njih sintetiu vakcine i druge materije.

UNIVERZITET ZA POSLOVNE STUDIJE

Sutinske dobre strane upotrebe ovakvih biljaka kao ljudske hrane mogu se svesti na sledece: - daju bolje prinose, - ranije sazrevaju, - imaju vecu hranljivu vrednost, - due traju pa ak i to da lepe izgledaju. Znaci, reava se problem gladi u svetu jer se proizvodi dovoljna kolicina hrane koja je, uz to jo i jeftinija.

Slika 2. Genetiki ininjering. Poseban interes naucnika privukle su biljke i mikroorganizmi koji imaju sposobnost da upijaju i prerauju otrovne materije iz zemljita. Takve biljke se zatim jo malo genetiki obrade tako da rastu bre i upijaju vee koliine otrovnih materija. Najpoznatija takva biljka je suncokret koja moe da upija i preraduje olovo iz zemljita, dok se medu bakterijama izdvajaju vrste koje razgrauju radioaktivne supstance. Znacaj ovakvih GM bakterija i biljaka je ogroman pogotovo ako se zna injenica da je radioaktivni otpad jedan od glavnih problema savremene tehnologije. Na samom smo pocetku tzv. genske terapije koja ce, verovatno, uskoro biti uobicajeni nacin lecenja oboljenja koja su rezultat otecenja gena. Ovom terapijom ce takvi oteceni geni biti zamenjeni i na taj nacin ce se moci leciti oko 4000 oboljenja. Ova brojka deluje impozantno, medutim treba napomenuti da se svaka od ovih bolesti javlja jako retko u proseku jedna na oko 10 000 porodaja. Posebno interesantne su i ivotinje sa ugradenim stranim genima: ovce koje u mleku proizvode faktore koagulacije, koze sa genom za proizvodnju svile, kokoi cija jaja mogu da sadre od lekova do dodataka za hranu (aditiva)... Ljudska mata moe svata, spisak GMO je svakim danom sve dui i dui ...

UNIVERZITET ZA POSLOVNE STUDIJE

1.1. PROCES GENETIKOG ININJERINGA Jedna od dviju DNK mora biti plazmidskog ili virusnog poorijekla i mora posjedovati gene koji e joj dati sposobnost da se autonomno replicira u odgovarajuim stanicama. Ova DNK, koju nazivamo vektorom, slui za repliciranje one druge DNK. Druga DNK, koja je zapravo predmet prouavanja i koju elimo razmnoiti, naziva se stranom, jer u pravilu nije srodna niti s vektorskom DNK niti sa stanicom u koju e ui nakon spajanja sa vektorom. Za reakciju spajanja vektorske i strane DNK upotrebljava se naziv rekombinacija in vitro, dok se produkt reakcije naziva rekombinantnom DNK. Da bi se molekule rekombinantne DNK autonomno replicirale, treba ih unijeti u bakterijske ili kakve druge za to prikladne stanice. Unoenje rekombinantne DNK u stanice naziva se transformacijom ili transfekcijom, ovisno o tome slui li kao vektor plazmidska ili viralna DNK. Autonomna replikacija jedne molekule rekombinantne DNK poinje u jednoj stanici, a nastavlja se u potomcima te stanice ili u susjednim stanicama. Pri tome od svake pojedine molekule nastaje mnotvo njoj identinih molekula. Takav nain razmnaanja rekombinantne DNK i stranih gena, koje rekombinantna DNK u sebi nosi, naziva se kloniranje DNK ili kloniranjem gena.

Slika 3. ematski prikaz procesa genetikog ininjeringa. Strana DNK prelomi se na tono odreenim mjestima s pomou restriktivnog enzima. S pomou istog enzima napravi se jedan lom na odreenom mjestu u cirkularnoj molekuli plazmidskog vektora. Krajevi jednog od fragmenata strane DNK spoje se s pomou enzima

UNIVERZITET ZA POSLOVNE STUDIJE

DNK ligaze s krajevima vektorske DNK i na taj nain dobije se cirkularna rekombinantna DNK. Rekombintna DNK unosi se u bakterijske stanice, koje su prethodno obraene tako da postanu propusne za DNK. Nakon unoenja, rekombinantna DNK se replicira u bakterijskoj citoplazmi, dok se bakterije istodobno mnoe. Tako nastaje klon rekombinantne DNK i unutar njega, klon stranih gena.

2.0.

GENETIKI ININJERING KOD MIKROORGANIZAMA

Mikroorganizmi se veoma dugo koriste u razliitim proizvodnim procesima i manipulacija s njima je relativno dobro poznata.Zato nije ni udno to su upravo mikroorganizmi bili prvi organizmi koji su korieni za genetike manipulacije. Mikroorganizmi su najbrojniji ivi sistemi na planeti Zemlji sa jo uvek nesagledivim potencijalima. Neki od mikroorganizama su ve iskorieni za konstrukciju genetiki modifikovanih mikroorganizama (GMM), koji imaju praktinu primenu. Jedan od vanijih uloga GM mikroorganizama je biosinteza ljudskih proteina za medicinsku upoterbu. GM bakterija sa ugraenim ljudskim genom moe proizvesti insulina. Sutina ove tehnike je da se humani gen za insulin ugradi u plazmidbakterijske elije. Plazmidi su mali prstenasti molekuli DNK koji nisu deo hromozoma bakterije i umnoavaju se nezavisno od njega; poto se bakterije ubrzano dele za kratko vreme nastane ogroman broj kopija humanog gena za insulin. Bakterije e zatim po uputstvu tog gena proizvoditi humani insulin. Postupak je slijedei: 1. Isjecanje eljenog gena iz humane DNK uz pomo enzima koji e presei DNK na tano odreenim mjestima; enzimi koji ovo omoguuju su restrikcione endonukleaze (makaze) (enzimi koji djeluju na samo odreeni niz nukleotida tzv. palindromski niz (to su dvostruko simetrini nizovi nukleotida koji su isti kada se u oba lanca itaju u istom smjeru na pr. 53); 2. Presjecanje plazmida (osim plazmida mogu se koristiti i virusne DNK; molekuli DNK koji se koriste u te svrhe nazivaju se vektori za kloniranje) istom restrikcionom endonukleazom kojom je isjeena humana DNK; 3. Poslije dejstva r. endonukleaza krajevi iseaka postaju ljepljivi poto su jednolanani tee da hibridizuju sa sebi komplementarnim lancima; 4. Humani gen odnosno njegovi jednolanani ljepljivi krajevi hibridizuju sa krajevima iseenog plazmida; 5. Ligaza (ljepak) spaja hibridizovane molekule pri emu postaje rekombinovana (hibridna) DNK; 6. Umnoavanjem bakterija i plazmid se u nijma replikuje , tako da se u svakoj bakteriji dobije nekoliko stotina plazmida.

UNIVERZITET ZA POSLOVNE STUDIJE

Bakterija sada moe da sintetie humani insulin. U kontrolisanim uslovima bakterije se mogu odgajati do postizanja mase koja omoguava sintezu odgovarajue koliine insulina koji se izoluje, proisti i kristalie. GM bakterije proizvode izmeu ostalog i faktore koagulacije, za lijeenje hemofilije, i hormon rasta, za lijeenje poremeaja rasta. Ljudski proteini koji su proizvedeni pomou GM bakterija su znaajno sigurniji, nego pripravci, koji dobiveni iz leeva i nosili rizik od oboljenja kao to su AIDS, Hepatits C, Creutzfeld Jakob bolest. Mikroorganizmi se ve due vreme koriste za ekstrakciju razliitih metala (bakar, zlato, uran) iz jalovina rudnika.ini proces eksploatacije rudnih bogatstava mnogo efikasnijim, s jedne, a ujedno evitalizaciju zemljita s druge strane. Mikroorganizmi su iskorieni kao domaini prvog izbora za dobijanje, npr. humanih proteina. Pre uvoenja genetikog inenjerstva, najvei problem je bio doi do dovoljnih koliina humanih proteina koji se koriste u terapeutske svrhe.

Slika 4. Mikroorganizmi.

3.0. GENETIKI ININJERING KOD BILJAKA

Primena genetikog ininjeringa u manipulaciji biljkama otvorilo je nesagledive perspektive korienja biljaka u budunosti. Glavni cilj genetikog ininjeringa biljaka je konstrukcija novih varijateta kultivisanih biljaka (transgenih biljaka), odnosno poljoprivrednih kultura. Izuavanja su usmerena na razvoj varijateta koji e dati vei prinos sa istim ili poveanim hranljivim kvalitetom biljke. Konstruisane su genetiki modifikovane biljke koje poseduju: rezistenciju na insekte, patogene herbicide, odreene stresne uslove sredine, biljke iji plodovi sporije trule ili biljke sa izmenjenim kvalitetom ulja ili proteina . Najbolji nain za unoenje stranih gena u biljnu stanicu je prirodni sistem transformacije indukcija crown-gall tumora. Bakterija tla Agrobacterium tumefaciens uzrokuje tumore vrata korijena (crown-gall) mnogih dvosupnica (slika 5.). Crown-gall tumor ine biljne stanice transformirane plazmidom Ti (tumor inducing) iz 8

UNIVERZITET ZA POSLOVNE STUDIJE

bakterije A. tumefaciens (slika 6.). Biljne stanice su transformirane plazmidnom T-DNA (transferred DNA) koja se ugrauje u kromosom stanice domaina. Stanice tumora proizvode derivate aminokiselina, opine, koje koriste bakterije. Ovaj sistem je vrlo pogodan za manipulaciju stranim genima u biljnoj stanici.

Slika 5. "Crown-gall" tumor na stabljici (lijevo); Crown-gall bolest na lukovicama vrste Gladiolus sp. desno.

Slika 6. Kloniranje gena od interesa u Ti plazmid. 9

UNIVERZITET ZA POSLOVNE STUDIJE

Najpoznatije biljke prve generacije GMO su kukuruz, pamuk, soja, kojima je ugraen ugraen bakterijski bakterijski gen. Zahvaljujui tom stranom genu ovakve biljke mogu da stvaraju otrov koji ih brani od tetnih insekata. Takve biljke se ne moraju prskati insekticidima koji su izuzetno tetni po zdravlje ljudi. Na biljke kojima se ubacuje gen da bi se njihov rast u loim uslovima poveao deluje se mnogo manjim koliinama pesticida i time se titi od zagaenja i hrana i spoljanja sredina. Druga generacija transgenih biljaka su one kojima je poboljan kvalitet, npr. obogaene su vitaminima ili se pomou njih sintetiu vakcine i druge materije (slika 6.). Sutinske dobre strane upotrebe ovakvih biljaka kao ljudske hrane mogu se svesti na sledee: daju bolje prinose, ranije sazrevaju, imaju veu hranljivu vrednost, due traju pa ak i to da lepe izgledaju. Znai, reava se problem gladi u svetu jer se proizvodi dovoljna koliina hrane koja je, uz to jo i jeftinija. Poseban interes naunika privukle su biljke i mikroorganizmi koji imaju sposobnost da upijaju i prerauju otrovne materije iz zemljita. Takve biljke se zatim jo malo genetiki obrade tako da rastu bre i upijaju vee koliine otrovnih materija. Najpoznatija takva biljka je suncokret koja moe da upija i prerauje olovo iz zemljita, dok se meu bakterijama izdvajaju vrste koja razgrauju radioaktivne supstance. Znaaj ovakvih GM bakterija i biljaka je ogroman pogotovo ako se zna injenica da je radioaktivni otpad jedan od glavnih problema savremene tehnologije.

4.0. GENETIKI ININJERING KOD IVOTINJA

Uzgajanje ivotinja za humane medicinske i ostale komercijalne/industrijske svrhe poveava se putem dvije nove biotehnologije. Jedna je genetski inenjering, to obuhvaa razdvajanje tuih gena u embrije ciljane ivotinje radi stvaranja "transgenih" ivotinja ili brisanje odreenih gena radi stvaranja "izuzetnih" genetski modificiranih ivotinja. Druga je kloniranje, to ukljuuje uzimanje stanica iz eljenog tipa ivotinje, koje mogu biti transgenske ili "izuzetne", ili iz konvencionalno uzgojenog genotipa koji posjeduje takva svojstva kao to su brzi rast, visoki prinos mlijeka ili vune, te umetanje jezgara ovih stanica u ispranjena jajaca ivotinja donora iste vrste. Kad se elektrinom fuzijom aktiviraju jezgre za stjenku jajeta, ova jajaca u kojima se razvija embrij, umeu se u zamjenske majke radi oplodnje. Uspjene tehnike razdvajanja i linije transgenih i izuzetnih ivotinja kao i mnoge vrste transgenih usjeva, osobito itarica, pamuka, rie i soje patentirali su vlada SAD-a, sveuilita i biotehnoloka industrija, poduzetnici i investitori, a naroito multinacionalne farmaceutske industrije i industrije kao Monsanto. Za i protiv, trokovi i posljedice ovih oblika ekstremnih biolokih manipulacija za dobrobit ljudi, istrait e se u smislu ko su prvenstveni dobitnici i gubitnici iz objektivne veterinarske bioetike perspektive. Posebno interesantne su ivotinje sa ugradenim stranim genima: ovce koje u mleku proizvode faktore koagulacije koze genima: ovce koje umleku proizvode faktore koagulacije, koze sa genom za proizvodnju svile, kokoi cija jaja mogu da sadre od lekova do dodataka za hranu (aditiva) od lekova do dodataka za hranu (aditiva)... 10

UNIVERZITET ZA POSLOVNE STUDIJE

Slika 7. Postupak kloniranja ovce Dolly.

11

UNIVERZITET ZA POSLOVNE STUDIJE

ZAKLJUAK
Neka nauna podruja su tradicionalno opasna zbog svoje bliskosti tetnim primjenama ve iskuanim u prolosti . Osim biotehnologije, mikrobiologije i fizike, koje su povezane s biolokim i atomskim ratovanjem, genetiki ininjering je povezan s potencijalnom zloupotrebom i raznim polemikama. Meutim, budunost genetikog ininjeringa i naina na koji e se on upotrijebiti ili zloupotrijebiti ovisi u velikom opsegu o nama. Bez obzira da li smo biotehnolozi, doktori, naunici ili sl. trebamo aktivno raditi kako bi se ulo nae miljenje i kako bi se genetiki ininjering upotrijebio za dobrobit , a ne na tetu ovjeanstva.

12

UNIVERZITET ZA POSLOVNE STUDIJE

LITERATURA
Doc. dr Obrenija Kalamanda, kolska skripta (slajdovi Genetiki ininjering IV predavanje), Univerzitet za poslovne studije Banja Luka, Banja Luka, 2013; Prof. dr. sc. Mirjana Pavlica, Mreni udzbenik iz genetike, Prirodnoslovni matematiki fakultet Sveuilita i Zagrebu, Zagreb, 2012; Internet stranice: - http://www.tehnickaue.edu.rs/REPOSITORY/4507_4Biotehnologija %20i%20geneticki%20in%C5%BEenjering%20prezentacija.pdf http://www.genetika.biol.pmf.unizg.hr/index.html http://www.bionetskola.com/w/Geneti %C4%8Dki_modifikovani_organizmi http://www.ef.uns.ac.rs/Download/menadzment-organske-proizvodnjehrane/2011-05-11-geneticki-modifikovani-organizmi.pdf http://www.vef.unizg.hr/org/stocarstvo/prezentacije/Za_Web_TPIUZ/III _sem/Seminari/GENETICKO_INZENJERSTVO.pdf

13