iecarrai See Sean, CTBBRASIL SSSSSee eM wer con Vast nzeiya Svodo do Costs a fornagho' Documentos — OGIO Cit ‘Servigo de Protocolo Geral - SPC SOLICITACAO PARA FORMAGAO DE PROCESO. 1. Dados da Solicitagior ‘Assinalurae Carimbo do Nome de soctants: soltante L ‘ORLANDO APARECIDO VIEIRA CARDOSO. oid: ‘Sia « ‘COMISSAO TECNICA NACIONAL DE BIOSSEGURANCA | CTNBIO. y Data aa Soleo ns es Sousa “ 91 y_06 204 Beech 2, Dados do Documento: Ey ‘Catiga do Assunio Pincpal | Expécie: Namero ata cnr neotaaviisos [ae os amt Procedtnci: ‘MONSARTO.DO BRASIL LTDA nteressade: . [MONSANTO DO BRASIL LTDA “oral L (0 COMERCIAL aa TBERACA Assunt "Ccigo 66 AsSunio Seeanda|Palaae-chave (Grau 6 Sie '3.Dades de Eneaminhameate: Ags sus oman om rocesso, daver er encarinhado ao) Sa) Nome! [NUBIA NADIA DA SILVA SOUZA ae ISAO TECNICA NACIONAL DewrosseauRANcA—__[°®® crvsio ‘comissho Te IO. © lems [4: Outras informagées quejulgarnecessiio;Oe — hes pel Nera Core ‘oz Samant ios & WMO. SR. PRESIDENTE DA COMISSAO TECNICA NACIONAL DE BIOSSEGURANGA (CTNBIo) A ser0eianu — of poss Deven 3 tw: BS i ou Wy a ONSANTO DO BRASIL LTDA. com sede em Séo Pau - SP, na Aveda NapSes nid, 12901, Tore Nove, 7 ender, insrta no CNP ob or 648852510004 46, Bor sou represerare lel ina-essnac, vem, espofosamente ne foma oa Lel 574/906, modcata pela Meda Provitiia 2791-700%,requrer Qo ja arto Parecer Téenico.Prévie Conclusivo.raaivo & bosbegwanga Go. oars Senatcamente mesfeado (OGM) sesgnado “Miho AKEOS gonetiamente Iodide tolerate 0 gitosato ou Mino Roundup Ready” 2 pin eeto de sua Iberagso no meioambieie, comercakzacso, consumo e quasque ces stvcades ‘wiaconadas e esse OGM e inhagons clivres dole Jonvacos Adena, eau €) Sue reer Parecer Teri Provo Conclusive soja emo com bose na xa frase SRVALIAGAO "DE" BIOSSEGURANCA "DO. MILHO” NKGOS.TOLERANTE, "AO GUFOSATO™ e respoctos decurentas anoxadoso I) gue esta Conissio incre ‘203 demais Srgdos da AdministracSo Pubica acerca do alucido Parecer para efeitos do tisposto no artigo 7. da Lei 8974/1095, Nestos Termos. MCT) CTNBIo is ede deterimento, 54 MAL 2004 ‘io Paulo, 28 de mao de 2004, as MONSANT Luiz Antonio Abramides do Val Diretor de Regulamentagio REG - LAAV 119/04‘Avaiardo de Biossoguange do Miho Nk803 Tolerate ao Gifosato AVALIAGAO DE BIOSSEGURANGA DO MILHO NK603 TOLERANTE AO GLIFOSATO ‘COMISSAO INTERNA DE BIOSSEGURANGA DA MONSANTO DO BRASIL LTDA. ‘Av. Nagoes Unidas, 12901 Torre Norte -7° Andar CEP: 04578.910 ‘Sto Paulo, SP Documento preparado por: Daniella Pascon Vianna Braga, M.Sc. Geraldo Ubirajara Berger, Ph.D. ‘Sto Paulo, 28 de malo de 2004.‘alagdo de Blossegurance do Miho NkE03 Tolerate 20 Giosato GLIFOSATO Invice capiruLo. LISTA DE FIGURAS. LISTA DE TABELAS LISTA DE QUADROS. ‘SUMARIO EXECUTIVO. A. INTRODUGAO. B. ORGANISMO RECEPTOR - MILHO (Zea mays) x... 41. Aspectos taxondmicos do milho. 2. Blologl 2.4. Caracteristicas genéticas. 2.2. Aspectos morfofisiolégicos. 2.3. Caracteristicas reprodutivas. 2.3.4. Compatibilidade sexual com outras espécies de plantas ‘cultivadas ou selvagens. 2.3.4.1. Polinizagao cruzada com varledades cultivadas de Zea 2.3.1.2. Polinizagdo cruzada com espécies selvagens de Zea 2.3.2, Potencial do milho como planta daninhs 2.3.3, Disseminagio ... Y‘Avalogdo de Boscoguranca do Mine Nk6O3Toleante ao ifosato 300 24, Ecologia, tendéncla populacional © ostatisticas de produtividade. 3. O milho no mundo. 3.4. Porspectiva histérica 3.2. Distribulgdo goografi 3.3. Importancia econ6mica e status. 4.0 milho no Brasi 4,4, Perspectiva histérica 42, istribuigo geografica, 43. Importancia econémica e status. ©. CARACTERIZAGAO MOLECULAR DO MILHO NK603 1. Linhagem parental utilizada para transformaco genética e producso do mitho NK603 2, Modificagao genética .. 2.1. Deseri¢do dos métodos usados para a modificagdo genética. 2.2. Natureza o fonte do vetor utilizado. 2.3. Tamanho, organismo(s) doador(es) © fungao_preten ‘cada fragmento constituinte da regito utiizada para insergio....52 2.3.1, 0 plasmideo circular PV-ZMGT32 e o fragmento linearizado PV-ZMGT32L 52 2.3.2 Gene epé epsps. 2.3.3, Peptideo de transito para o cloroplasto (ctp2) 2.3.4, Sequéncis 3.0 milho NK03.. 3.1. Doscrigto das caracteristicas introduzidas no milho NK603.. rogulatérias 3.2. Informagées do Inserto genético no milho NK603,‘valagao de Blossegucance do Miho NKSO2 Tolerate ao Giossto 40281 3.2.4, Métodos utilizados na caracterizagao do inserto no milho NK60S . 3.2.2, Nimero de insertos © céplas presentes no milho NK60S.. tos. 3.2.2. Determinagao do nimero de 3.22.2. Detorminagdo do niimero de cépias. 3.22.3. Intogridade dos cassotes genéticos inseridos . 3224. Anélise de fragmentos da estrutura de replicagao (backbone), 3.2.2.5. SeqUéncias de DNA que flanquelam as extremidades 3° do inserto.. 3.22.6. Anilise das seqUéncias flanqueadoras das extremidades 3 através de anilise por RT-PCR. 3.2217. Anilise de bioinformética das seqUéncias flanqueadoras dda extromidade 3° 3.2.3. Localizagio do inserto nas células da planta (Integrado no cromossomo, cloroplastos, mitocéndria, ou mantido numa forma néo intograda) « métodos para sua determinacdo. 3.24, Confirmacio da identidade do milho NK603 em germoplasma brasileiro. 3.3. Expressio genética do insert... 3.3.1. Nivels das proteinas CP4 EPSPS expressas no milho NK603 ‘durante os estiglos de desenvolvimento da planta... 3.3.2, Niveis das proteinas CP4 EPSPS expressas no milho NK603 coletado no Brasil 101 3.3.3. Equivaléncia das proteinas CP4 EPSPS e CP4 EPSPS L214P_ expressas_no milho NK603 com a proteina CP4 EPSPS produzida om E. coll ena soja Roundup Ready... 103‘ago de Biosepranca do Mito E08 Tolan a0 Goss see2st, 6 D. SEGURANGA AMBIENTAL DO MILHO NKGO: 41. Desempenho agronémico do milho convencional e do milho NK603... 107 2, Establlidade genética do inserto e ostabilidade fenotipica do milho NK60% 7 oth) 3, Potencial para transferéncia génica vertical ou horizontal em milho.... 143 4, Interagd0s do milho NK603 com organismos nao-alvo.. 125 4.1. Intoragdos bas 126 42. Experiéneia com outras culturas geneticamente modificadas ‘comercialmente cultivadas que expressam a protoina ca epsps. 9 entre o milho 6 organismos nao-alvo. 126 ‘5. Descritores fenotipicos do mitho NK603. 5.1. Estados Unidos 135 136 5.2. Brasil. 138 6. Efledcla © tolerdncia ao glifesato em germoplasma de mihho NK603 adaptado ao Brasil 143 7. Conclus6es sobre a seguranca ambiental do milho NK603.. 147 E, SEGURANGA ALIMENTAR DO MILHO NKE03.. 149 149 182 4. Uso do milho na allmentagdo humana e animal 2, Proteinas EPSPS... a 2.1. Proteinas CP4 EPSPS expressas no milho NK603. 3. Seguranga das proteinas CP4 EPSPS. 3.1. Similaridade das proteinas CP4 EPSPS © CP4 EPSPS L214P, @ ‘similaridade das proteinas CP4 EPSPS com outras proteinas EPSPss. 155 3.2. Especificidade das proteinas CP4 EPSPS © CP4 EPSPS L214... 158 43.3. Consumo humano animal da proteina CP4 EPSPS, ss 158 3.4, Avaliagées de seguranca.. 161‘Avalagso de Bosseguanga do Miho NietS Tolerant 9 Gitosta oaozay TT ci 34.1. Seguranga da proteina CP4 EPSPS demonstada por 6 ‘exposicio oral aguda de camundongos .. 161 3.42, Digestdo das proteinas CP4 EPSPS © CP4 EPSPS L214P em fluidos géstrico e intestinal simulados.. 162 3.4.3. Auséncia de homologia estrutural das proteinas CP4 EPSPS @ CP4 EPSPS L214P com toxinas conhecidas. 164 3.4.4. Avallagio do potencial © CPAEPSPS L214P. lergénico das protoinas CP4 EPSPS 164 168 4. Anélises de composicio da forragem e de gros do milho NK603. 4,1. Anélises de composi¢io de forragem ¢ grios do milho NK603 - Estados Unidos ¢ Unido Européia. 173 4.2, Anélises de metabélitos secundarios em gréos do milho NK603 coletados nos Estados Unidos om 1998.. 176 4.3. Andlises de composi¢ao de forragem e griios do milho NK603 - dados coletados no Brasil. 189 192 193 ‘5. Estudos nutricionais. 5.1. Frango de corte 5.2. Ratos.. 198 5.3. Novithos (Gado de corte) 205 5.4, Vacas loiteiras. 207 5.5. Suinos 209 Conclusées sobre a seguranca do milho NK603 para humanos ¢ animais, das proteinas CP4 EPSPS expressas © dos estudos de composi¢ao 213 F. INFORMAGOES SOBRE AS LIBERAGOES DE EXPERIMENTOS E ‘COMERCIAIS PREVIAS DO MILHO NK603.. 216‘Avaliagdo de Biossoguange do Mino Nk603 Tolerane 20 Glfosato G. CONCLUSOES. H. REFERENCIAS. |. REFERENCIAS EM ANEXO. J. APENDICES 251 1. Materiais métodos utilizados na caracterizagio molecular do milho 1.2. Substancia controle. 1.3. Substancias referéncias 1.4, Extragao de DNA. 1.5. Quantificago do DNA e digestio com enzima de restrigao. 1.6. Preparagio das sondas de DNA... 1.7. Isolamento de RNA e selego de mRNA poll-A’ 41.8. Quantificagéo do RNA © mRN/ 1.9. Anélise de Southern biot.. 1.10. Confirmagao das seqiléncias de DNA das extremidaces 5° 6 3° flanqueadoras do inserto através da técnica de PCR... 257 1.11. Andlise das seqUéncias da oxtremidade 3' atavés de RT-PCR 258 259 do inserto através de PCR e seqenciamento de DNA...260‘Aalagso de Blossegurenca de Miho NkE03 Toerante a0 Gifosato 8ee263 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Mapa do plasmideo PV-ZMGT32. 0 plasmideo PV-2MGT32 fol utiizado para preparar o fragmento digerido com a enzima Mul (PV- ZMGT32L) utiizado na modificagao genética do milho NKB03. No fragmento PV-ZMGT32L as sequéncias da origem de replicago (or) ‘edo marcador de anibiticos (npt foram retiradas (ver Figura 2)... 54 Figura 2. Mapa linear do fragmento PV-ZMGT32L. Fragmento de DNA utlizado na geraggo do milho NK603, As linhas pontihadas Fepresentam 0s silos de restriguo Mlul_remanescentes pds a digestéo do plasmideo PV-ZMGT32, Embora com presenca cconfirmada, 0 sitio de restrigao Xbal 4082 nao foi cortado no inserto, provavelmente devido a uma modificagéo do sitio (tavez por metiagdo) cu porque teve o reconheciento esiutura do sto modiicado. 55 Figura 3. Seqoéncla de aminodcidos deduzida des proteinas CPAEPSPS & C4 EPSPS L214P_ A seqUéneia incl o peptieo de transto para 0 Cloroplasto cip2 (amnoseidos 1-76 s80 0 cip2). A seqiéncia de minoacidoe mostreda na fgura 6 a mesma pera at duas protanas. A txcogdo 6 que a posigdo 200 (excundo 76 aminodcidos do cp2, & 8 posigdo 214) da protoina CP& EPSPS (em negro designada como Ll do leucina) 6 subsitulda com uma P, de proina, na protina CP EPSPS L214P. 60 Figura 4, Desenvolvimento do milho NK03... : ss 63 Figura 5. Anélise de Souther blot do milho NK603: determinago 6o ntimero de insertos. Dez microgramas de DNA genémico da linnagom B73 e {do milho NK603 extraldo de tecido de folha foram digericos com a fenzima de restrigso Stul. O DNA do plasmideo PV-ZMGT32 ‘misturado com o DNA da linhagem B73 foi digerido com as enzimas ‘Stul © Scel. As amostras de DNA foram separadas om gol de eletroforese,transferdas . e hibridizadas com 0 slasmideo PV-ZMGT32 marcado com P.... m1 Figura 6, Andlise de Southem blot do milho NK603: determinagao do ndmero de c6pias. Dez microgramas de ONA genémico da linhagem 873 e do ‘milho NK603 extraldo de tecido de folha foram digeridos com a ‘enzima de restriggo Xbal. As amostras de DNA foram separadas em {gel de letroforese, transferidas e hibridizadas com o plasmideo PV-2MGT32 marcado com *P. 73 Figura 7. Anélise de Souther blot do milho NK603: intron P-racttract?. Dez microgramas de DNA genémico da lishagem B73 e do mio NK603valagao de Biossoguange do Miho Nk603 Tolerate ao Gifosato 90281 ‘extraldo de tecido de folha foram digeridos com a enzima de restrigso EcoRV. As amostras de DNA foram separadas em gel de ‘letroforese, transferides © hibridizadas com uma mistura de sondas: © Intron intra P-ract{/ract! marcado com °#P-dCTP e um fragmento de 175 pb do intron P-ract/ractt marcado com SP-dATP. Figura 8. Andlise de Southem blot do milho NK603: sequéncia_cfp2- ‘op4 epsps. Dez microgramas de DNA genémico da linhagem 873 € {do milho NK603 extraldo de tecido de folha foram digericos com a tenzima de restrigdo EcoRV. As amostras de DNA foram separadas fem gel de eltroforese, transfers « hibridizadas com o olasmideo PV-2MGT32 marcado com *P. Figura 9. Andlise de Southem blot do milho NK603: promotor 35S. Dez microgramas de DNA gendmico da lithagem B73 e do milo NK603 ‘exiraido de tecido de folha foram digeridos com a enzima ds restrigdo EcoRV. As amostras de DNA foram separadas em gel de leyotorese,ransteias © hbrdlzadas com 0 fragmento intro do (2855 marcado com ™P. Figura 10. Andlise de Southern blot do milho NK603: sequéncia de poliadenilago NOS 3° Dez microgramas de DNA genémico da linhagem 873 @ do mitho NK603 extraldo de tecido de folha foram digeridos com a enzima de restriggo EcoRV. As amostres de DNA foram separadas em gel de eletroforese, transferidas e hibidizadas 0 fragmento da sequéncia de poliadenilagéo NOS 3 marcado com *P. Figura 11. Andlise do milho NK603 por Souther bio: anélise da estrutura de replicagSo (backbone) do plasmideo. Dez microgramas de DNA ‘gendmico da linhagem 873 6 do milho NKBO3 extraido de tecido de {olha foram digeridos com a enzima de restriclo Saci. As amostras de DNA foram separadas em gel de eletroforese, transferidas © ibriizadas com a estrutura de replicago (backbone) do plasmideo {otal consistindo das regi6es codificadoras ori e nptll marcada com *, vn Figura 12. Andlise das sequéncias flanqueadoras de DNA 5' e 3! no milho NK603 através de PCR. A andlise de PCR foi realizada utilizando iniciadores espectfios para as seqUéncias flanqueadoras 5' © 3' do ingerto no DNA genémico extraldo do miho NK603 e da linhagem 1873 (controle convencional). Aproximadamente 10 yl de cada reagao de PR foram colocados am um gel de agarose 2.0% oorado com ‘brometo de etic, Figura 13, Anélise das seqdéncias de DNA genémico que fanguetam as ‘extremidades 5' @ 3” do inserto no milho NK603 e da linhagem de mmiho convencional B73 através de PCR. A andlise de PCR foi 7 79 83 85 89 as‘Avalagso de Bioseguranga do Miho NkE03 Toerante a0 Gifossto 000: ane, Ele ot realizada utiizando um iniolador na sequéncia flanqueadora 5’ @ um na 3° do inserto no DNA genémico extraido do mitho NK603 ¢ da linhagem 873 (controle convencional), para vetifcar que as ‘soqdéncias flanqueadoras so nativas do genoma do. miho. ‘Aproximadamente 10 yl de cada reagdo de PCR foram colocados em tum gel de agarose 2,0% corado com brometo de eto. 90 Figura 14, Representago esquematica do milho NK6O3. Esta figura destaca © inserto previsto no milho NK603 dos dados da andlise de Souther lot © contacto das seqnias nae exemidades S @ 5 do inserto através de PCR... ci Figura 15. Andlise de Souther blot do milho NK603: estabilidade do DNA inserido. Dez microgramas de DNA genémico da linhagem B73 ¢ do milo NK603 exiraldo de tecido de folha foram digerides com a tenzima de restrigéo EcoRV. As amostras de DNA foram separadas fem gel de eletroforese, transferides » hibridizadag com o fragmento dda seqUéncia cip2-cp4 epspsinteira marcado com ™P. 96 Figura 16, Andlise de Souther lat do milho NK603 adaptado as condigées brasileiras: sonda TS-cip2ICR-cp4 epsps. O DNA contido na ‘membrana de hibrdizagao foi hibridizado com a seqdéncia TS- ‘ctp2ICR-cp4 epsps_marcada_com P™. Cada canaleta contém {aprximadamento 10 microgramas do DNA isclado do grdo geo ‘com a enzima apropriada, Figura 17. Wester blot mostrando a equivaléncia da proteina CP4 EPSPS ‘expressa em Ecol, soja Roundup Ready” e mitho NK603. 105Avaiogdo de Blossogurange do Miho Nk803 Tolerate ao Gitfosato *1de261 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Resumo dos elementos genéticos do plasmideo PV-ZMGTS2, 56 Tabela 2. Niveis das proteinas CP4EPSPS © CP4EPSPSL214P ‘mensurados por ELISA em amostras de tecidos do milho NK60S (uglg de peso fresco). sees 102 Tabela 3, Dados de segregacio e andlise de progénie do milho NK@DS....... 142 Tabela 4. Lista de todos os produtos Roundup Ready° cue foram sutontzadoe até o memento para LIBERAGAO AMBIENTA em vis paises. 128 Tabela 5. Resumo dos niveis de expresso da proteina CP4 EPSPS no ‘milho NK603 € outras culturas Roundup Ready® comercialmente disponivets. = 129 ‘Tabela 6. Resumo dos estudos de laboratério para avaliagdo de potenciais efeitos adversos das culturas Roundup Ready que exxressam a proteina CP4 EPSPS sobre espécies de invertebrados ndo-alvo, ‘Comparado com variedades convencionats. 133, Tebola 7. Avalagdo eprondmicn do iho NK6O3 reaizada noe Estados ‘Unidos. 198 ‘Tabela 8. Descritores morfolbgicos do mio NK6OS avaliados em trés locals no Brasil na safta 2002/2003 (proceso CTNBion (01200,001880/2002-44), _ 141 Tabela 9. Descritores morfologicos do miho NK603 avaliados em trés locals no Brasil na safra_ 2002/2003 (proceso CTNBio n°: 01200.001880/2002-44), ‘Tabela 10. A ullizagao do milho na alimentagto e industria, 142 180 ‘Tabela 11. Consumo de mitho por setor no Brasil em 1999, 2000, 2001 ‘2002 e estimativa de consumo em 2003, 182 Tabola 12: Wontiade o sklaridede do seqdéncis do aminodcidos entre proteinas EPSPS. 187 168 ‘Tabela 13. Caracteristicas de proteinas alergénicas conhecidas". Tabela 14. Valores de composigo de forragem de hibridos de miho ‘comercial resultantes de andlises realizadas em diversos paises e ‘anos agricolas (Fonte: www.cropcomposition org). 170 By‘Avalagdo de Blossoguranca do Miho Nk603 Tolerate ao Gifossto 12de261 Tabela 15. Valores de composicio de gros de hibridos de milho comercial resuitantes de andlises realizadas em diversos paises © anos agricolas (Fonte: wwrw.cropcompositon org). 171 ‘Tabela 16. Conteido de fibras, minerais @ bromatologia em GRAOS do mina NKEOS clades nes Estados Unies (688) © Unio Europa (1999), Tabela 17. Contetdo de fibras © bromatologia em FORRAGEM do mio 'NK603 coletada nos Estados Unidos (1998) ¢ Unio Européa (1999). 180, 17 Tabela 18. Composigo de aminodcidos dos GRAOS de milho NK603 ‘oletados nos Estados Unidos (1988) © na Unido Européia (1998)... 182 ‘Tabela 19. Composigo de acidos graxos de GRAOS do mio NK603 ‘oletados nos Estados Unidos (1998) e Unio Européia (1999)... 185 Tabela 20. _Contetido de Acido fice, inbidor de tripsina, vitemina E © ‘metabolites secundarios de GRAOS do miho NK60S coletados nos Estados Unidos (1988) ¢ Unido Européia (1998). 187 Tabela21. Resultados de composiglo de amostras de GRAOS ¢ FORRAGEM do milho NK603 coletadas em Roldndia (PR) e Santa Helena de Goiés (GO) na safra 2002/2003 (proceso CTNBio n° (01200.001980/2002-4.... ~ 190 Tabela 22. Conteddos tipicos de proteina, dleo e parede celular (g/kg ‘matéria seca ou g/kg ms) de GRAOS de milho @ seus subprodutos do processamento de allmento para animais, 192 ‘Tabela 23. Desempenho de frango de corte, rendimento de carcassa © ‘composigao de proteina e gordura de peilo e coxas (valores médios de machos ¢fémeas), comparaglo do miko NEO com gendtios ‘convencioneis.. 195 Tabola 24. Naileagdes na Unio Europsia (cada notficgao referee a um (QU MIS LOCA). nen s 217 Tabela 25, Experenos com o mio NKS0S tberados nos Estacoe Unidos pelo USDA... a 218 Tabela_ 26. Liberagbes planjadss no melo ambiente conceddas pola ‘CTNBIo no Brasi. 20‘Avalardo de Blossogurange do Mino NKO03 Tolerate ao Glfosato 1340261 LISTA DE QUADROS Quadro 1. Nameros. projetados relatives ao aumento do consumo @ ‘Produgao mundial nas safras de 2004/2005 e 2012/2013. 44 Quadro2. Area plantada (em mil hectares), produtividade (en kg/ha) @ 'Produgo (em mil toneladas) de milho por regio no Brasil nas safras {de 2001/2002 e 2002/2003, ¢ estimativa para a safra de 2003/2004.....49‘Avalagdo de Bosseguranca do Mino NkG03 Toeante a0 Gitfossto AVALIAGAO DE BIOSSEGURANGA DO MILHO NK603 TOLERANTE AO” GLIFOSATO ‘SUMARIO EXECUTIVO ‘A Monsanto desenvolveu 0 milho NK603 com a caracteristica de toleréncia 20 glifosato, que é ingrediente ativo dos herbicidas Roundup”. O milho NK603 expressa proteinas CP4 5-enolpirwilchiquimato-s-tsfato sintase (CP4 EPSPS) tolerantes 0 glfosato, © controle de plantas deninhas que & realizado pelo glfosato ocorre pela inibigo da enzima EPSPS produzida naturalmente pela planta. Essa enzima catalisa uma etapa =rlca na via metabblica do &cido chiquimico para a biossintese de aminodcidos aromaticos fem plantas © microrganismos, As proteinas CP4 EPSPS possuem baixa afinidade pelo gifosato, se comparada com a proteina EPSPS selvagem. Assim, {quando 0 milho NK603 que expressa as proteinas CP4 EPSPS 6 tratado com alfosato, as plantas continuam se desenvolvendo normalmente. Aagao continua da enzima CP4 EPSPS tolerante ao glifosato catalisa a sintese dos aminocidos aromaticos necessérios ao desenvolvimento normal das plantas. A via biossintética de aminoacidos aromaticas nao é encontrada em enimals, o que explca a atividade seletiva do glfosato em plantas e contrbui para uma baixa toxicidade para mamiferos. Dois cassetes pare expresso do gene op epsps {foram introduzidos no genoma do milho através de um Gnico insero, produzindo © milho NK603. O gene op4 epsps é derivado de uma bactéria comum de solo, a Agrobacterium sp. cepa CP4, que codiica a expresso da proteina EPSPS naturalmente tolerante ao glifosato. ‘A seguranga ambiental do mitho NK603 demonstrou ser equivalente 80 milho convencional, 0 que foi confirmado em diversos estudes realizados, Inclusive no Brasil. A establidade genética da caracteristica de toleréncia 20 lfosato, 2 auséncia de efeitos em organismos néo-alvo, o baixo potencial de transferéncla génica, a auséncia de caracteristicas que fagam com que o milho * Roundup® 6 marca regisada de Monsano Company.‘alagso de Blosseguranca de Miho Nk803 Toorante ao Giossto 1800261 NK603 se tome uma planta daninha, o desenvolvimento @ 0 desempenho agrondmico sto fatores que fazem com que o milho NK603 seja seguro ao meio ambiente. Os estudos reaizados demonstraram essa seguranga ambiental. ‘Adicionalmente, as observagbes da seguranga do produto ullizado como alimento(ragdo desde a liberagao comercial do milo NKB0S nos Estados Unidos fem 2000 @ no Canada e outros palses em 2001 substanciam as afirmativas AA seguranga allmentar do miho NK603 foi estabelecida com base em: avaliagSes da alividade da proteina CP4 EPSPS © sua homclogia com as proteinas EPSPS presentes em um amplo especto de plantas, indusive aquelas utiizadas como alimento; & balxa exposicao a CP4 EPSPS na dieta, ou soja, beixa concentraglo no gro e na forragem: répida digestiblidade da proteina CP4 EPSPS; © @ auséncia de toricidade ou alergenicidade das proteinas EPSPS em geral e verificada através de estudos com as proteinas CP4 EPSPS expressas em plantas. A equivaléncia entre o miho NK603 @ 0 milho convencional foi demonstrada através de andlises dos nulrientes-chave, Incluindo proteinas, lipides, carboidratos, umidade, aminoacidos, acidos graxos €@ minerals em estudos realizados em varios ambientes agricolas, inclusive no Brasil, A equivaléncia nutricional entre o milho NK603 e o mitho convencional fol ‘confirmada através de avaliagdo do desempenho alimentar em estudos com {rangos de corte, ratos, vacas letras, suinos e gado de corte. No Brasil, 0 resultados de estudos de eficacia agrondmica ¢ toleréncia, assim como das avaliagSes agronémicas, de descritores merfolégicos, de ‘expresso da protelna CP4 EPSPS e de composigdo (bromatologia) ‘demonstraram que © milho NK603 equivalente © to seguro cuanto o mitho convencional em termos de biosseguranga alimentar e ambiental Em resumo, o miho NK60S tolarante 2o glifosato, além de ser to seguro {quanto © milo convencional, fomece 20s agricultores indmeros beneficios, que Incluem: sistema efetivo, flexivel e simples para o controle de plentas daninhas 1a cultura do milho, com potencial para aumento de produtividace; redugdo de ‘ustos pela diminuigdo do uso de produtos herbicidas © do numero de Ry‘valiagdo de Bissogurance do Miho Nk803 Tolerate ao itfosato 1840261 ‘aplicagBes necessérias para o controle efetiv das plantas daninhas; adequago «¢ encorajamento para a adogao de sistemas conservacionistas de cultivo como © plantio direto; melhoria da qualidade da agua em fontes vulnerdveis através da redugdo da aplicagdo de herbicidas que so lixiviados; seguranca alimentar © ‘ambiental equivalente ao milho convencional, sende tao nutritive quanto 0 milho Cconvencional, 0 que foi demonstrado através de diversos estudes espectficos ‘com a proteina CP4 EPSPS, andlises dos nutrientes-chave, equivaléncia ‘utricional e avaliag6es ambiontas,‘alagdo de Biossogurange de Miho Nk803 Tolerate ao Gifosato 170261 AVALIAGAO DE BIOSSEGURANGA DO MILHO NK603 TOLERANTE AO GLIFOSATO A.INTRODUGAO ‘A Monsanto desenvolveu, através da biotecnologia, o milho NKBO3 com a caracteristica de tolerancia 20 glifosato, o Ingrediente ato cos herbicidas Roundup®, conferida pela expresso de proteinas CP4 S-enolpinvilchiquimato- S-fosfato sintase (CP4 EPSPS) naturaimente tolerantes a esse herbicida (Monsanto, 2003). A enzima EPSPS participa da via metabélica do écido ‘chiquimico para a biossintese de compostos fendlicos © aminodicicos arométicos ‘em plantas e microrganismos. A via de biossintese dos composios fendlicos @ dos aminoacidos arométicos no ocore em mamiferos, aves ou animals ‘aquaticos. Isso explica a atividade seletiva do glfosato em plantas e contribui para o seu balxo rsco & saiide humana e animal, assim como a0 melo ambiente, pelo uso deste herbicida conforme as indicagSes contidas no rétule dos produtos comerciaizados. Portanto, o milho NK603 oferece aos agtcultores uma altemativa adicional para aumentar a eficiéncia do controle de plantas daninhas ra cultura do miho, © uso do mitho NK603 tolerante ao glifosato ou milho Roundup Ready” 2 proporciona uma nova altemativa para o controle de plantas daninhas, culos maiores beneficios so: |. Controle de um amplo espectro de espécies de plantas daninhas: (8 herbicidas Roundup® controlam de maneira eficiente as plantas daninhas de folhas largas e gramineas, Inclusive as espécies resistentes a oukos herbicidas (Franz etal, 1987). |. Excelente seguranca para a cultura: os herbicidas Roundup®, quando usados nas dosagens tecnicamente recomendadas, controlam cficientemente plantas daninhas sem que hala danos & cultura do milho NKBO3, IIL Propriedade favordvel a0 meio-ambiente: 0 glfosato tem sido utiizado hd aproximadamente 30 anos para varios usos agticolas © néoalte de lstepranga do Mino NAS Tolan a Gtosso set oy areola. © principio ativo tom caracteristcas favoréveis 20 meio-ambiento, destacando-se: sua fore igagdo&s patcuas de sol, o que faz com que ndo se ‘mova para os longs feos; sua baixaecotovcdade; 6a ausércia de efeitos residuals no solo, uma vez que se degrada rapidamente em compostes que cvorrem naturamente no ambient. Adcionslmente, o gifosao ndo causa feitos indesejavels e adversos ao meto-ambiento sob condigbes recomendadas de uso (US EPA, 1983; WHO, 1995; Geisy et al, 2000). Por este motivo tem sido utlizado no manejo de plantas deninhas para preservagdo de locas como a reserva ecoligica des lhas Gélapagos, no Equador (Soria etal, 2002) © nas ruinas de Pompéia, na tla. IV. Mair flexbiidede para 0 contole de plantas ceninhas: nas cultures tolerantes 20 glfsato, este 6 apicado sobre as plantas daninhas apés a emergéncia da cultura. As aplcagses so necessérias aperas quando @ infestagao do plantas daninhas alcanga nivels de dano econtnico, podendo reduair @produtvidade a qualidade do produto (mpureza). V. Ata compatiiidade com téericas de conservagéo de solo: os beneficios do prepero conservacionsta do solo, como plano dreto na palha (Maschi, 2004; Embrepa, 2008; Mello, 2002), inctuem a melhoria da qualidade solo, o aumento da infitagso de agua, a redugdo da eros © de sedimentos nas fontes de agua, a redugdo da perda de nutrientes e pesticides para as équas de superficie, a melhaia do habitat para vida selvagem, a melhora da retengo 4e carbono no sol, a redugéo do uso de combustivele a ullizagio de péticas grcolas mais sustentaveis (Warburton @ Kimstra, 1984; Edwards et al, 1988; Hebblethwaite, 1995; Relcosky, 1995; Reicoshy e Lindstrom, 1996; Keeling et al, 1998; CTIC, 1996; CTIC, 20). Vi. DiminugBo dos cusos para o controle de planta daninhas:o custo do controle realizado com 0 glifosato € competitivo em relagéo ao custo de opgées altemativas de controle, especialmente em fungdo da grande eficcia de controle de plantas deninhas. Tanto grandes quanto pequenos produtores se benefciam dessa teonlogie de maneia semehanteAvalagso de Blosseguranga co Miho NK803 Toorante ao Giosato 1960261 Vil. Propicia um modo-de-agio herbicida adicional para controle de plantas daninhas durante a safra: 0 glfosato pode ser utiizado em aplicagées de és-emergéncla no milo NK6O3, Vill, Uso de um herbicida com baixo risco para a sade humana: nas ‘condigSes de uso dos produtos registrados @ nas recomendagdes técnicas, ‘lfosato ndo causa efeitos adversos sobre a saide humana (U.S. EPA, 1993; ‘WHO, 1995; Wiliams et al, 2000). Os herbicidas cujo principio ativo ¢ 0 glfosato esto entre os produtos ‘mais utllzados no mundo para 0 controle de plantas daninhas, Nos Estados Unidos, © glfesato foi classifiado como Categoria E (evidéncia de néo- ccarcinogenicidade para humanos) (U.S. EPA, 1992). Adicionalmente, a WHO afirmou que o glifosato néo 6 carcinogénico, mutagénico ou terategénico (WHO, 1095). As avaliagSes de risco ecotoxicolégico do Roundup® consideraram os efeitos diretos do herbicida © do surfactante sobre os organismos ndo-alvo © 0 meio ambiente (Farmer et al, 2001). A reviséo realizada por Giesy etal. (2000) Tetne os resultados de alguns estudos, mostrando que o gifosato fol amplamente avaliado para efeito de suporte do seu registro em inimeros paises «© uso em experimentos cientfcos nao relacionados & sua regulamentagao. © primeiro milho Roundup Ready® comercializado nos Estados Unidos fem 1998 © no Canadé em 1999 foi 0 evento GAZI. Inimeros testes demonstraram que o milho GA21 6 equivalente 20 milho convencional em relagdo & segurance, nutrigfio, composieo © impacto ambiental (Sidhu et al., 2000). © milho GA21 produz a proteina mEPSPS que confere toleréncia 20 as diferengas genétcas existentes nas variedades tradicionals, Esses autores lstaram algumas variedades estudadas no Crile como possuindo ata coretago com variedades de miho do Centro e Sul do Basi (Freitas, 2002). Em termos de arquitetura da planta, milho © teosinte sio totalmente diferentes (Doebley et a, 1987). A grande diferenga fenotpica entre milho teosinto implica em uma divergéncia genética substancial ente as duas lespécies. Enretanto, a variagso interespectica observada nBo 6, de fato, maior 40 que a variagéo intraespectica do milho (Doebley, 1990). Ta dferenga no fen6tipo pode ser expicada por um efeito fundador na evolugdo do mitho, resultando de um efeito tipo gargalo de garafa, seguido por uma imensa ‘selegéo artical (Tanksley © McCouch, 1967). A principal diferenca entre as ues plantas € @ infloresctncia feminina (esplga). Durante 0 Século XX, ‘experimentos mostraram a estreta relagdo entre as duas espéclos Principalmente nos testes que demonstravam @ possibiidede de formagdo de Hbridos fetes entre elas, fazendo com que as diferentes variedades de teosinto fossem rebaizades,inclindo-as no género Zea (Reeves © Mangeldor, 1942) (0s genétipos atusis de miho possuem de 1-3 gomas de espiga, com Potencial para a formagio de 8 @ 24 fisiras de 45. 60 sementes, as quais Permanecem fechadas em folhas modiicadas denominadas de bricteas © ccomumente conhecidas como palha. © teosinte também tem gomas laterals, mas elas formam espigas de dues ficiras de aproximadamente 12 invélucros, sendo que cada um contém uma semente recoberta por uma gluma (Goodman, 1988), ‘Ao longo do processo de domesticagso © mesmo apés 0 estabelecimento o cultvo desta espécie, o mitho deve ter passado por introgresso com seus Parentes selvagens, aumentando assim a sua diversidade genética. Essa diversidade 6 uma das principais responsévels pela presenca desta planta em to amplo tert, juntamente com sua aceitagéo cultural e almentar pelos habitantes dessas regides. Dobley (1990) sugere que, atualmente, populagdes natures de teosinte da subespécie parviglumis possuem uma maior diiculdade‘Aalag0 de Blossegranca do Miho Nk803 Tolerate ao Gifosato 4240261 de introgresséio natural com 0 milho devido ao fato de que as populagSes no hhabitam um mesmo ambiente, J& as populagdes naturals da subespécie ‘mexicana ocorrem mais préximas aos campos de miho, podendo ocorrer introgressao mais facimente, Outro ponto comentado em diversos trabalhos a respeito da origem do illo 6 com relagéo ao nimero de vezes que o milho foi domesticado, ou soja, se ele foi domesticado somente uma vez e, @ partir desta planta original, todas {8 outras ragas de milho surgiram ou se ele fol domesticado indepandentemente mais de uma vez, como sugerem diversos aulores (McCintock, 1959; Mangelsdorf, 1974; Bird, 1980; Kato, 1984). Segundo Dosbley (1990), as ‘evidéncias moleculares apontam para uma (nica origem, sendo esta a partir de tum parente geneticamente muito préximo do genoma encontrado atualmente dentro da subespécie Zea mays parviglumis. Caso tenha ocorrida uma miltipla domesticagao, todas dever ter ocorrdo @ partir de populagSes de plantas desta subespécie, pois qualquer transformagdo de teosinte em miho deve ter fenvolvido uma série de improvavels mutagbes, como relatam Galinat (1983; 1088) ets 1987), 3.2. Distribulgdo geogratica © milho € uma planta de alta eficiéncia fotossintética © ¢ cultvado Praticamente em todas as latitudes, exceto em regiées muito frias ou onde a lestagdo de crescimento seja curta. A maior parte do cultivo do milho na Unio Européia e na América do Norte acha-se 0 sul da latitude 50°N. com estagio {de crescimento de, no minimo 140 dias. No hemisfério sul, o cultio estende-se 2 98°S na Nova Zeléndia (Von Pinho, 2001), Atualmente, o milho é a principal cultura produzida no mundo (aproximadamente 626 milhes de toneladas) seguida pelo trigo (aproximadamente 560 milhdes de toneladas). © avanco da ‘cultura do mitho entre 1991 © 2001 fol de 5%, alcangando 138 milhdes de hectares, de acordo com @ FAO/ONU. Entretanto, nesse periodo de dez anos a rodugéo mundial cresceu aproximadamente 26%, crescimento este resultante 4‘Aalogso de Bosseguranca do Mino NKE03 Tlerante ao Gifosato da utiizagdo de prticas agrlcolas mais adequadas & cutura e do melhoremento% = genético (Agianual, 2004) Os ganhos em produtvidade de miho tém sido crescentes a cada stra efizrem com que nos Estados Unidos, por exempo, produgdo selsse de cinco toneladesiectare om 1995 para mais de 16 toneladasmnectare em 2001, podendo cheger a 25 toneladeshectare. Essa cvolugloevidencla que a cultura do mio 6, dente s cereals, @ mals vivel © competitiva (Von Pinho, 2001). 3.3. Importancia econémica o status (Os Estados Unidos 80 responsaveis por aproximadamente 38% da produgéo mundial de milho, seguidos da China, com 20% e do Brasil, com 7%. Estima-se que em 2013 os Estados Unidos e a China serdo reszonséveis por 155% da demanda total de mitho no mundo, 0 que equivale a aproximadamento 421 mies de toneladas. A demanda 6 crescente tanto para o consumo hhumano e animal, quanto para a produgao de biocombustiveis (Da Silva, 2004). Esse crescimento devera ser da ordem de 22% nos préxiros dez anos (Agrianual, 2004). A queda nos estoques mundiais de milho a partir de +1809/2000 ocorreu devido 20 aumento da demanda em relagdo 8 produgo. A recomposigio dos estoques deve acontecer apenas a partir ce 2004/2005, ‘embora a relago entre consumo @ estoque deva cair de 12% em 2004/2005, ppara 10% em 2012/2013, o que levaré a um aumento do prego do cereal em longo prazo. Existe uma projegdo de que a valorizag&o dos pregos intemacionais, ‘serd acima de 30% a partir da safra 2004/2006 até 2012/2013 (Da Silva, 2004). ‘Considerando tal conério, acredita-se que haveré um avango da cultura do miho ‘sobre as éreas cultvadas com outras culturas, com a érea de miha aumentando ‘em aproximadamente quatro milhées de hectares no periodo acima referido. Com a lei americana que obriga a mistura de 5% de etanol a toda gasolina uusada no pals 2 partir de 2013, a demanda de milho para este objetivo deverd ‘aumentar de 34 (em 2003) para 74 milhdes de toneladas (em 2013) (Agrianual, 2004). No caso da China, cujos estoques esto se esgotando, em fungéo da‘Avalogdo de Bossoguranca de Miho NkE03 Toerants ao Gitossto 4460261 pprodugdo contida pela escassez de terras © gua, 0 consumo deverd ser de aproximadamente 132 milhées de toneladas em 2004. A projago para os proximos dez anos é de que © consumo do pals aumente 24%, em razo do Crescimento populacional e econémico. A China deverd, entéo, passar de fornecedor para exclusivamente importador a partir de 2005/2006 (Agrianual, 2004). A redugdio dos estoques mundiais favorecerd o Brasil, que partré de uma fatia de mercado de 3% em 2002/2003 para 20% das exportagdes mundiais em 2013 (Da Silva, 2004). ‘As perspectivas para a cultura do milho nos préximos dez anos sfo ‘excelentes, principalmente pelo aumento populacional e pela demanda de fontes de energia renovaveis. Os pregos do milho deverso aumentar, assim como sua liquidez pelo estabelecimento de pregos com base no mercado internacional (Da Silva, 2004). © Quadro 1 a seguir apresenta os nimeros projetados © apresentados no relatério Agrianual (2004), reativos ao aumento do consumo & Produgéo mundial nas safras de 2004/2005 2012/2013. Quadro 1.Nameros projetados relatives ao aumento do consumo © pprodugdo mundial nas safras de 2004/2005 © 2012/2013. Produgie mundial de milo | Consumo mundial de mith Paisos (cites de tonetadas) ZocaH00s | 207272073 EUR a ar China 720 735 Brasil 5 72 ‘argentina 7 B @ 3 Unido Europea | —__aT 6 B 7 ‘Ouives 730 Tat 187 Tes ‘undo oa 786 co Ter Fontes USDATENP; Aianval 2008‘Avalagdo de Blosseguranca co Maho Nk603 Tolerate 20 Giosato 4560261 4.0 miho no Brasil 4.1. Perspectiva histérica ‘Segundo Prous (1986), alguns achados arqueolégicos de milho sugerem ‘que seu culo era realizado em Minas Gerais pelo menos desie 4.500 AP. {antes do presente, tendo 0 ano de 1950 de nossa era como reeréncia inicial para base de célculo). Em relagéo ao mitho encontrado nesta &ree, Bird et al (1991) classificaram-no como pertencente & raga Entrelagado (Patemiani © ‘Goodman, 1977), a qual possul endosperma farindceo @ aleurona de coloragao roxa escura e clara, multo semelhante aos milhos cultvados pelos indios Xavantes (Brieger et al, 1958). Esta raga agrupa varias populagdes Pertencentes Bacia Amazénica, com excegdo das populagdes de Cateto Nortsta, sendo encontrada também no Peru e Bolivia, indicande uma vasta © ‘continua rea de ocorténcia. Brieger et al. (1958) sugerem que esta raga de mitho 6 muito antiga, tendo surgido por selegdo, a qual foi direconada para 0 ‘grande nimero de fleras e para o aumento do tamanho da espiga. Os autores ‘acreditam também que os gris entrelagados so contempordneos das primeiras ragas de milho domesticado. O milho Entrelagado é uma raga com _adaptagso a baixas altudes. ‘Além da regio acima mencionada, ha relatos de milho escavado em coutras regibes do Brasil Em Golds, nos vales do afluente do rio Paranalbs ‘existom alguns stios arqueolégicas onde foram encontrados restos de miho. Do ‘mesmo modo, foram encontradas oferendas de mitho aos mortos no Ro Grande do Sul, Neste titimo local, o miho se encontra em um tempo cronol6gico situado ‘entre os anos de 140 @ 1790 A.D. (Anno Dommini, depois de Cristo) (Prous, 1992). © milho foi descrito por Roosevelt (1996) como pertencente 8 raga Coroico, outra denominagao do milho Entrelagado, Temos ainda relatos de milho ‘om Santa Catarina (impresséo da espiga em cordmica), tha de Marajé e, mais, rocentemente, em diversos quilombos espalhados pelo Brasil (Provs, 1982)‘Avalagso de Blosseguranca do Miho Nk603 Tolerate a0 Gifossio 4860261 4.2. Distribuigdio geogratfica ‘Atualmente, @ cultura do milho encontra-se amplamente disseminada em todo 0 pas. Isto se deve tanto & multplicidade de usos na prooriedade rural ‘quanto & tradigao de cutive deste alimento pelos agricutorss brasileiros (Magalhaes et al, 2002). A variabilidade geogréfica da cultura do mitho no Brasil {faz com que aparegam mercados totalmente regionalizados (Saboya, 2004), As 94K —> 66K_— 4k 23 ke— 20K0— Figura 5. Andlise de Southern blot do milho NK603: determinagao do rniimero de insertos. Dez microgramas de DNA genémico da lirhagem B73 6 do milho NK603 extraido de tecido de folha foram digeridos com a enzima de restriggio Stu. © DNA do plasmideo PV-ZMGT32 misturado ccm 0 DNA da linhagem B73 fol digerido com as enzimas Stul e Scal. As amestras de DNA foram separadas om gel de eletroforese, transferidas e hibridzadas com 0 plasmideo PV-ZMGT32 marcado com *P, DDesignagio das canaletas: 4: DNA da inhagom 873 (contd longa) 2: DNA do min NK603 (conde longa) '3: DNA da linntagem B73 misturado com 14,5 pg PV-ZMGT32 (comida ct) ‘DNA da linhagem B73 misturado com 28,0 pg PV-ZMGT32 (comida cuta) '5: DNA do mio NK603 (conde cuta) ‘Selas: denotam of tamanhos oblidos através dos marcadores molezulares em gel ‘corado com brometo de etido, M: denote as canaletas com os marcadores molecuares. *y‘Aalaggo de Blosseguranca do Miho Nk603 Tolerante a0 Gitosato 7260261 3.22.2, Determinagao do nimero de c6pias (© nimero de copias do fragmento de DNA utlizado na transformagso @ inserido no mitho foi determinado. © DNA do miho NK603, do controle Convencional e do controle convencional misturado com 0 plasmideo PV- ZMGT32 fol digerido com a enzima de restrig’o Xbal © realizou-so uma anélise de Southem blot. A membrana foi hbridizada com 0 plasmideo PV-ZMGTS2 marcado com *P, Como a enzima Xbal corta o fragmento linearizado PV- ‘ZMGT32L apenas uma vez (Croon et al., 2001; Croon et al, 2000a), a digestio dveria produzir dls fragmentos contendo tanto © DNA inserido quanto o DNA de regiées flanqueadoras, caso 0 milho NK60S contivesse somente uma cdpia dese fragmento linearizado PV-ZMGT32L. Os resultados s80 mostrados na Figura 6. © DNA controle convencional (canaleta 1) néio produziu nenhum sinal de hibridizago, conforme esperado. 0 DNA do plasmideo PV-ZMGT32 rmisturado a0 DNA do controle convencional (canaletas 3 e 4) produziu a banda de tamanho esperado de aproximadamente 9,3 kb, que é © tamanho do plasmideo PV-ZMGT32 total (Figura 2). © DNA do milho NK603 {canaletas 2 € 5) produziu duas bandas de aproximadamente 9,0 e 5,8 kb. A presenga de duas bandas de hibridizago estabeleceu que somente uma cOpia do fragmento Uutiizado na transformagao foi integrada no DNA do milho, gerendo o evento NK603. “Ss es‘Avalogso de Bosseguranca do Mino NKG03 Tolerante ao Gitfosato 1360261," ely Conida Longa | Corrida Gurta ma2i}3 45M +m ae ot + 66Kt 23,1kb—+ ae ie awe, 66K 7 | = AAW, ‘a A -— 0640 — 030 — 0208 23K 20K— Figura 6. Anélise de Southern blot do milho NK603: determinagao do ‘nGimero de cépias. Dez microgramas de DNA gendmico da linnayem 873 @ do rmilho NK603 extraido de tecido de folha foram digeridos com a enzima de resto Xbal. As amostras de DNA foram separadas em gel de eletroforese, transferidas e hibridizadas com 0 plasmideo PV-ZMGT32 marcado com *P. Designagso das canaletas: ‘2 DNA a innagem 873 (cortida longa) 2: DNA do mith NKB0S (comida longa) 3: DNA da linhagem B73 misturado com 14,5 pg PV-ZMGTS2 (comida cura) 4: DNA da linhagem B73 misturado com 29,0 pg PV-ZMGT32 (cord cirta) DNA do mihe NKB0S (cond cura) ‘Setas: denotam os tamanhos obtidos através dos marcadores molezulares em gol ‘corado com brometo de edo. M: dena as canaletas com os marcadores moleculares. % @‘Avaliogso de Biossoguange co Mino NX60S Tolerate 0 Gosia 140281 3.2.2.3. Integridade dos cassetes genéticos inseridos A integridade dos cassetes genéticas inseridos foi determinada pela analise dos componentes dos mesmos: promotores, regides codiicadoras © sequéncias de poliadeniiaggo. A seguir, os resultados para cade um dos elementos avallados s8o apresentados, Intron P-ractt/ractt Para avaliar @ integridade da sequéncia do intron da actina de aroz (P- ractt/ractt), © DNA do milho NK603, do controle convencional © do controle Convencional misturado com 0 plasmideo PV-ZMGTS2 (Figura 1) fol digerido ‘com EcoRV, seguido de Souther blot. A membrana foi hibridizada com uma mmistura da sequéncia inteira do Intron P-ractt/ractt marcada com *P dCTP @ lum fragmento de 175 pb derivado da extremidade §' do intron Prractt/ractt marcado com ™P dATP. Os resultados 80 mostrados na Figura 7. 0 DNA controle convencional (canaleta 1) no gerou sinais de hibridizagéo (bandas), conforme esperado. O DNA do plasmideo PV-ZMGT32 misturado com o DNA do Controle convencional (canaletas 3 e 4) produziu a banda de tamanho esperado de aproximadamente 3,8kb contendo a seqdéncia do Intron P-ractt/ractt (Figura 1). © DNA do milo NK60S (canaletas 2 e 5) também produziu a banda de tamanho aproximado de 3,8 kb, 0 que confirmou a presenga de sequéncia do Intron P-ractt/ract{ no ONA inserido. Um fragmento de aproximadamente 0,2 kb fol detectado na comida curta do DNA do milho NK603 (canaleta 5), indicando a presenga de um fragmento adicional contendo um fragmento da sequéncia do Intron P-ract1/ractt. A corida longa do gel nfo permit a detecgao do fragmento de aproximadamente 0,2 kb na canaleta 2. Os experimentos que determinaram a ssoqUéncia das extremidades do inserto, revelaram que um fragmento de 217 pb ‘contendo uma porgdo da regio aumentadora do promotor da actina de arroz cestava presente na orientagso reversa e proxima a extremidade 3'do cassete de transformagao. Esse fragmento manteve um sitio da enzima EcoRV distante em 20 pb da extremidade 3° da sequéncia de DNA gendmico do miho (Figura 14).‘Avalingso de Bosseguranga do Mino NkEO3 Tolerante ao Gifossto 1500261 Esses resultados confirmaram © explicaram os resultados dessa anélise de ‘Southem blot. Esse fragmento de 217 pb incul uma seqaéncia de mitiplos sitios (polylinker) de 60 pb © os primeiros 167 pb da regio aumentadora do promotor da actina de arroz, posigdo 835 2 669 do inicio da transcrigfo, como definido por McElroy et al. (1990), Nem a sequéncia TATA (TATA box) nem o sitio de iniciago da transcrigfo esto presentes dentro do fragmento, o que sugere que esse fragmento no deveria funcionar como promotor. Isso fot ‘embasado pelos trabalhos de Zhang etal. (1991) e Wang et al. (1992), nos quais (0s pesquisadores claramente demonstraram que @ regidio de 836 a 669 nto se ‘comporta como um promotor. Portanto, 6 extremamente improvavel que o fragmento de 217 pb na extremidade 3° do inserto no mitho NK603 atue como ‘um promotor. A anélise por Northen blot foi realizada com RNA poll (A+) ‘selecionado do milho NK603 para demonstrar @ auséncia de detecedo de produtos de transcrigso contendo esse fragmento de 217 pb (Croan et al., 2001; Croon et al, 20002), Nenhum sinal de hibridizagdo foi detectado no RNA poli (A+) do mitho NK60S nas concentragdes de 1,0 19, 0,1 ug ou 0,01 jg quando a sonda que contém a sequéncia de 167 pb do promotor da actina de arroz foi utlizada, Entretanto, sinal de hibridizagso fol detectado em 0,01 ug do RNA Controle positiv transcrito in vitro, validando a fungao da sonda. Um controle ara @ hibridizagéo, utiizando a sonda cp4 epsps de 163 pb, detectou um transcrito do tamanho esperado na canaleta contendo 1,0 yg de RNA poli (A+) do milho NKBO3. Juntamente com uma fotografia do gel de agarase contendo o RNA poli (At) antes da transferéncia, esse controle da hibridizagao mostrou que © RNA pol (A+) nd fol degradado © era de qualidade sufciente 2ara se ligar & sonda, caso 0 transcrto estivesse presente. Juntos, esses resultados demonstraram que um transorto contendo 08 primeiros 167 pb do promotor da ‘actina de arroz presente na extremidade 3' do inserto no 6 detectado. Isso fol confirmado pelos resultados de POR transcriptase reversa (RT-PCR), que é uma técnica extremamente sensivel ¢ que, neste caso, no detectou nenhum produto de transcrigdo que se inica no DNA gendmico que flanqueia a extremidade 3° do inserto e continua dentro dele (Croon et al, 2001; Croon et al, 20008). aX‘Aalogao de Blossoguange do Miho Nk603 Toeranto ao Gfosato 780261 cr Entretanto, foi observado um produto de transcrig8o que se inkia dentro do Inserto © se estende além do elemento genético NOS 3, com término no DNA ‘gendmico que flanqueia a extremidade 3! do inserto.Figura 7. Andliso de Southern blot do milho NK603: intron P-ractt/ractt. Dez microgramas de DNA genémico da lithagem B73 © do miho NK603 extraido de tecido de folha foram digeridos com a enzima de restrigéo EcoRV. ‘As amostras de DNA foram soparadas em gel de eletroforese, transferidas © hibriizadas com uma mistura de sondas: 0 intron intelro P-racttractt marcado com %2P-4CTP @ um fragmento de 175 pb do Intron P-ractt/ract1 marcado com Sp.gATP, Designagso das canaletas: ‘1: DNA da inhagom 873 (cori longa) 2: DNA do miho NK603 (corida longa) NA da innagem BY misturado com 14,5 pg PV-ZMGT32 (corida cura) 0 py PV-ZMGT32 (comida cista) ‘corado com brometo de etlco. M: denota as canalalas com os marcadores molecules. ‘Avalagso de Biossegurance de Miho Nk603 Toleranto ao Gifosato 770201 © S)Aaingo de Bioseoguranga do Miho NK803 Tolerate ao Gfossto 7ode261 © Seaiiéncia ctp2-cp4 epsps Para avaliar a integrdade da seqUéncia cfp2-cp4 epsps, 0 DNA do milho 'NK603, do controle convencional e do controle convencional misturado com © plasmideo PV-2MGT32 foi digerido com a enzima de restrgso EcoRV, seguindo- ‘80 0 Souther blot. A membrana fol hibridizada com 0 fragmento cp2-cp4 epsps Intel. Os resultados sto mostrados na Figura 8. O DNA controle convencional (canaleta 1) no mostrou sinais de hibricizagao (bandas), conforms esperado. O DNA do plasmideo PV-ZMGT32 (Figura 1) misturado com o DNA controle convencional (canaletas 3 ¢ 4) © 0 DNA do milho NK603 (caraletas 2 @ 5) produziram os fragmentos de tamanho esperado de aproximadamente 3,8 kb © 28 kb, correspondendo aos tamanhos corretes dos dois fragmentos gerados pela digestdo com EcoRV, cada qual contendo uma sequénca cp2-cp4 epsps inteira (Figura 1). Outras bandas no foram detectadas, estabelacendo que o rmilho NK603 no contém nenhuma sequéncia cfp2-cp4 epsps adicional © detectével além das duas sequéncias do gene op4 epsps (cassees proximal & distal) presentes no inserto, Andlises de PCR © seqlenclamento do DNA dos quatro produtos de POR que recobrem a extensdo do inserto na miho NK6O3 foram realizadas (Croon et al., 2001; Croon et al, 2000a). A sequéncia dos dois cassetes do gene op4 epsps, que comptem o inserto tnico no mitho NK6O3, foram comparadas com 2 sequéncia do plasmideo PV-ZMGTS2, A sequéncia 94 epsps do cassete proximal (préximo a extremidade 5° do fragmento PV- ‘ZMGT32L) 6 idéntica no inserto e no plasmideo. Entretanto, a comparagao de ssoqléncias de DNA do inserto © do plasmideo revelou duas trocas de rnucleotideos no cassete distal (préximo & extremidade 3° do fagmento PV- ZMGT32L), Uma das trocas de nucleotideos fol sllenciosa © ‘soguinte troca de aminodcidos na proteina expressa: 0 aminodcifo na posigo 214 6 a LEUCINA no plasmideo PV-ZMGT32 e a PROLINA no DNA do cassete distal, que pertence a0 inserto no milho NK603. A proteina expressa pelo ccassete distal fol, portanto, designada CP4 EPSPS L214P, ¢ sua sequéncia ccadificadora referida como op4 epsps I214p. outra resultou na‘Aalagao de Blosseguranca de Miho Nk603 Tolarante ao Gifosato 1960261 ‘Confida Longa | Corda Curta | ma 2|s 4 som 23.4 ose 23.4 kb sso 94 kb — 4 4400 oe 66K — : - = 230 ee mee Ako — A . 14K = - F 23K — 20K —+ Figura 8. Andlise de Southern blot do milho NK603: seciéncla ctp2- ¢p4 opsps. Dez microgramas de DNA genomico da linhagem 873 ¢ do mitho [NK603 extraido de tecido de folha foram digeridos com a enzima de restrigo EcoRV. As amostras de DNA foram separadas em gel de eletroforese, transferidas e hibridizadas com 0 plasmideo PV-ZMGT32 marcado com *P. Designaeso das canaltas: 4: DNA da inhagem 873 (corida longa) 2: DNA do milho NK603 (conida longa) 3: DNA da innagem B73 misturado com 14,5 pg PV-ZMGT32 (comida cuta) 4 DNA da inhagem B73 misturado com 28,0 pg PV-ZMGT32(corrda curt) '5 DNA do miho NK603 (corida cuta) ‘Solas: denolam 08 tamanhos obtidos através dos marcadores mole:ulares em gel ‘corado com bromato de else. M: denote as canaletae com os marcadores molecules. Bg‘Avalagso de Blosseguranca Go Mino NKE03 Tlerante 20 Gifosato 8060251 Promotor e355 Para avaliar a integridade do promotor 85S, 0 DNA do milho NK803, do Controle convencional © do controle convencional misturado com © plasmideo PV-2MGT32 fol digerido com a enzima de restrig#o EcoRV, sequido de Southem blot. A membrana fol hibridizada com © promotor @38S intsiro. Os resultados estdo apresentados na Figura 9. © DNA controle convencional (canaleta 1) no ‘mostrou sinais de hibridizago (bandas), conforme esperado O DNA do plasmideo PV-ZMGT32 misturado com o DNA controle corvencional (canaletas 3.@ 4) © 0 DNA do mitho NK603 (canaletas 2 e 5) produziram os fragmentos de tamanho esperado de aproximadamente 3,8 kb e 2,8 kb, correspondendo aos dois fragmentos gerados pela digesto com EcoRV, cada qual contendo uma Porgo da sequéncia €35S (Figura 1). O fragmento de aproximadamente 2,8 kb representa a hibrdizagéo da sonda @ uma pequena porgéo (91 pt) do promotor 1235S cortado do restante da sequéncia @35S pela enzima EcoRV, conforme fevidenciado pelo sinal de hibrdizagdo mais fraco do que o sinal de aproximadamente 3,8 kb (canaletas 2, 3, 4 5). Outras bandas néo foram detectadas, estabelecendo que o milho NK603 ndo contém nenhuma sequéncia £2355 adicional detectavel além daquela presente no fragmento de DNA inserido.‘Avago de Blosseguranga do Miho NK603 Tolerate ao Giosato 140261 Corda Longa | Corrida Gurta 234 b> 94K 66 k>— 4a ke Benda fees 28 KO 23% 20K>—- Figura 8. Andliso do Souther blot do milho NK603: promotor 6255. Dez ‘microgramas de DNA gendmico da inhagem 873 e do milho NK6O3 extraldo de tecido de folha foram digeridos com @ enzima de restrgso EcoRV. As amostras 4e DNA foram separades om gel de eletroforese, transferdas ¢hitrdizadas com 6 fragmento intro do 35S marcado com *P. Designacso das canaltas: 4: DNA de linnagem 873 (coria longa) 2: DNA do mio NK603 (comida longa) 3: DNA da innagem B73 misturado com 14,5 pg PV-ZMGT32 (comida cuts) 4: DNA da linnagem B73 misturado com 28,0 pg PV-ZMGT32 (comida euta) ‘5: DNA do milo NK603 (corida cuta) ‘Selas: denotam os tamanhos obtdos através dos marcadoces molesulares em get ‘orado com brometo de edo. M: dena as canaletas com os marcadores molecuares, 82 v-Avalagso de @ossagurange do Mino NK603 Tolerane 2 Glfosato 8202612», 35, ‘Seatiéncia de poliadenilacso NOS 3° Para avaliar a integridade da seqUéncia de poliadenilago NOS 3',0 DNA 4do mith NK603, do controle convencional e do controle convencional misturado ‘com 0 plasmideo PV-ZMGT32 fol digerido com a enzima de restigao EcoRV, seguindo-se a realizagio de Southern blot. A membrana foi hibrdizada com a sequéncia de poliadenilagso NOS 3' intera. Os resultados esto apresentados ra Figura 10. © DNA controle convencional (canaleta 1) no mostrou sinais de hibrdizagao (bandas), conforme esperado. O DNA do plasmideo PV-ZMGTS2 ‘misturado com © DNA controle convencional (canaletas 3 @ 4) e @DNA do milho INKB0S (canaletas 2 @ 5) produziram os fragmentos de tamanho esperado de aproximadamente 3,8 kb e 2,8 kb, correspondendo aos dois fragmentos gerados pola digesto com EcoRV, cada qual contendo a seqiéncia de finalizacdo da transcrigéo @ polladeniiagso NOS J intera (Figura 2). Outras bandas néo foram detectadas, estabelecendo que o milho NKE03 no contém nenhuma sequéncia, de poliadenilago NOS 3 adicional detectavel além daquelas presentes nos dois ‘cassetes do inserto Unico no milo, que gerou © evento NKB03.‘Avaiagao de Biossequranga do Mino NK603 Toerante ao Giossto Figura 10. Andlise de Southern blot do milho NK603: soqliéncia de polladenilago NOS 3. Dez microgramas de DNA genémico da linhagem B73 6 do mitho NK603 extraido de tecido de folha foram digeridos com a enzima de restrggo EcoRV. As amostras de DNA foram separadas em gel de eletroforese, transferidas © hibridizadas o fragmento da sequéncia de poliaderiiagso NOS 3 ‘marcado com *P. Designagso das canaltas: 4: DNA da inhagem 873 (cori longa) 2: DNA do milho NK603 (coniéa longa) 5: DNA da inhagem B73 misturado com 14,5 pg PV-ZMGT32 (comida euta) 4 DNA da innagem B73 misturado com 28,0 pg PV-ZMGT32 comida ct) 5: DNA do milho NKB03 (coniéa cuta) ‘Selas: denolam 05 tamanhos oblios através dos marcadores molecuiares em gel ‘corado com brometo de edo. M: dena as canaletas com os marcadores moleculares.Avaliogto de Blossaguranga do Mano NkS0 Tolerano 90 Gifosto 24 d0251 32.2.4. Anilise de fragmentos da estrutura de replicagso (backbone) Para avallar a presenga da estrutura de replicago (backbone) do plasmideo, 0 DNA do miho NK603, do controle convencional e do controle convencional misturado com o plasmideo PV-ZMGT32 fol digerido com a enzima de restig8o Sacl, seguindo-se 0 Southem blot. A membrana fol hbridizada com a estrutura de replicagdo inteira, Os resultados esto apresentados na Figura 11. © DNA do plasmideo PV-ZMGT32 misturado com 0 DNA controle convencional (canaletas 3 @ 4) produziu o fragmento de aproximadamente 38 kb, que é 0 fragmento que contém a estrutura de replicago (Figura 1). O DNA controle convencional (canaleta 1) ¢ 0 DNA do milho NK603 (canaletas 2 © 5) no rmostraram sinais de hibrdizagao (bandas). Esse resultado estabelece que o rmilho NK603 no contém nenhum fragmento detectével da estrutura de replicag&o do plasmideo, incluindo as seqiéncias codificadores ori © nptl, conforme esperado, uma vez que o fragmento de DNA linear ullizado na transformagao (PV-ZMGT32L) foi purficado sem a sequéncia de replicagéo. &‘Aalagso de Blossegurance do Miho Nk60S Tolerante ao Gifosato 8546261 Contda Longe] Cova Gara wtaisa sm j west za = ge sake tte 6,6 kb. - 230 te as 23% a oom 20K - — 0s 02k 44k — i Figura 11. Anélise do mitho NK603 por Southern blot: andlise da estrutura de replicagao (backbone) do plasmideo, Dez microgramas de DNA gendmico a linnagem 873 @ do miho NK603 extraido de tecido de folha foram digeridos com a enzima de restrigao Sacl. As amostras de DNA foram separadas em gel de cletroforese, transferidas e hibrdizadas com a estrutura de replicagdo (backbone) do plasmideo total consistindo das regiées codificadcras orf © nptll marcada com *P, Designaglo das canaletas: 4; DNA da linhagem B73 (corrida longa) 2: DNA do miho NK603 (crrida longa) 3; DNA da inhagem B73 misturado com 14,5 pg PV-2MGT32 (corida cuta) 44: DNA da lintagem B73 misturado com 28,0 pg PV-ZMGT32(corrida cura) 5: DNA do rio NK603 (coda curta) Selas: denotam 08 tamannos obdos através dos marcadores moleculares em gel corado 6am bromelo de lio, M: denota as canalelas com os marcadores moleculares. “x$220 Stein GoW gn tanguatin sxe 803! doinerto A andlise de PCR fol reaizada com © DNA genémica exttaido do milho NKB03 e com o controle convencional B73 para veriicagao das seqUéncias de DNA que flanqueiam as extremidades 5' e 3' do inserto no milho NKB03 (Croon ft al,, 2001; Croon et al, 20002). Os resultados dessa andlise de PCR so apresentados na Figura 12. As reagdes controle que no continham amostra de DNA (Canaletas 4 © 8) © as reagdes contendo DNA do controle convencional B73 (Canaletas 2 e 6) ndo geraram um produto de PCR com qualguer grupo de iniciadores utiizado, conforme esperado. © PCR com 0 DNA do mitho NKBO3 (Canaletas 3 © 7) gerou 0s produtos de tamanho esperado de 500 pb (representando a regido flanqueadora 5) e de 1183 pb (representando a regio flanqueadora 3), Esses resultados demonstraram que os produtos de PCR previstos s8o gerados em ambas as extremidades do inserto no miho NKB03. 0 seqinciamento dos produtos de PCR indicou que © DNA amplifcado da extremidade 5' (Figura 12) consiste de 307 pb de DNA gendnico de miho flanqueando 0 inserto, seguido de 193 pb na extremidade 5' do inserto contendo £50 pb da sequéncia do local de sitios maltiplos (polylinker) © 143 pb do promotor da actina de arroz. A extremidade 3' compreende 164 pb da sequéncia de poliadenilagéo NOS 3 que define a extremidade 3° do inserto, mediatamente seguida por um segmento de DNA de 217 pb derivado da extremidade 5° do cassette de transformaglo. Esse segmento de 217 pb & seguido por um ‘sogmento de 305 pb com homologia a0 DNA do cloroplasto, ‘A andlise de bioinformética identificou que © fragmentc de DNA do cloroplasto acima mencionado foi originado da seqaéncia codificadora para a ssubunidade a da RNA-polimerase e da proteina ribossomal $11 de miho @ no tem fungdo ativa da forma como ocorrem no milho NKBOS (Croon et al, 2001; Cron et al.,2000a). Esse DNA do cloroplasto no estava presente no fragmento de restrigdo gerado pela digestao com a enzima Miu, isolado em gel de agarose € utlizado no processo de transformagio. Portanto, acredita-se que a origem do‘Avaiagao de Blossoguange do Mano NK60S Toleranta ao Gifosato, 97 40261 fragmento de DNA de cloroplasto fol a propria célula embriogénica de mitho utlizada na transformagéo. Uma vez que tanto @ RNA polimerase quanto @ proteina ribosomal $11 so ubiquitas nas plantas © néo tm fungdo ativa no milo NK603, nfo possuem atividade farmacologicamente ativa na planta. A anélise de bioinformatica (Croon et al, 2001; Croon et al, 20008) demonstrou também que essas seqliéncias de DNA de cloroplasto nao tém homologia com seqUéncias potencialmente toxicas ou alergénicas, nao havendo implicagées para @ satide humana e animal, o que corrobora os resultados de seguranca do ‘iho NK6O3, ‘A andlise de PCR (Croon et al., 2001; Croon et al., 20008) foi realizada ‘com © DNA genémico extraldo do milho NK03 ¢ o controle convencional 873, usando um par de Iniciadores desenhado para amplifcar ao longo do sitio de Insergao no milho NK603, demonstrando que as sequéncias de DNA das cextremidades 5° e 3° que flanqueiam o inserto s8o nativas do genoma do milho. Os resultados dessa andlise so mostrados na Figura 13. A reago controle sem amostra de DNA (Canaleta 4) no gerou um produto de PCR, conforme ‘esperado. © DNA do controle convencional B73 (Canaleta 2) ¢ 0 DNA do mitho NK603 (Canaleta 3) geraram um produto de PCR de tamanho 267 pb. Uma ‘omparagao das sequléncias do produto gerado pela linhagem farental B73 & pelo mitho NK603 indicou que ocorreu uma delegio de trés pares de bases no milo NKB03 apés a insergo do DNA. Entretanto, 0 DNA do mitho NK603 (Canaleta 3) também gerou um produto de PCR de 267 pb. A explicagio seria de que © DNA do milho NK603 ullizado nessa andlise no era homozigoto ©, portanto, continha um sitio de inser8o tipo-selvagem em um zielo eo DNA Inserido no segundo aleto. as andlises de PCR, seqienciamento e bioinformatica pede-se conciuir {que 0 DNA das sequéncias que flanquelam as extremidades 5 @ do inserto no ‘milo NKE03 so nativas do genoma do milho e que, provavelmente, @ presenga dda seqéncia de 305 pb homéloga 20 DNA de cloroplasto seja resultado de co- integragao dessa sequéncia junto com 0 inserto durante 0 processo de transformagaio.‘Avaogto de Blossoguanga de Miho Nk603 Toeranta ao Gfosato 08.60261 ‘A coxintegragde de transgenes © material genético do hospedeito fol observada em varios estudos (Salomon ¢ Puchta, 1998; Gorbunova e Levy, 1997; Kohl et a, 1989; De Buck et al, 1998; Krizkova e Hrouda, 1998). € mai provavel que essa co-integragto resulte do sistema de reparo nallvo aturalmente encontrado em células vivas apés a quebra da fita de dupla hélice de DNA. Os organismos vivos devem ser efetivos no processo de reparo apés a |uebra da dupla hélice de DNA para a sobrevivéncia e utlizagao dese processo normal @ continuo, fazendo com que haja sucesso no desenvovimento, bem ‘como na transformagdo de plantas. Durante © processo de ‘ransformagao genética, 0 material exdgeno € incorporado no genoma do hospedeiro. Relatérios publicados revelaram que tais sequéncias de preenchimento (filer sequences) do proprio organismo so também comumente co-incorporadas com ‘material exégeno durante 0 processo de reparo apés a quebra da fita dupla de DNA em células de mamiferos @ em células de plantas (Salomon © Puchta, 1998; Gorbunova e Levy, 1997; Kohli et al, 1999; DeBuck et a.,1999). Além disso, @ observaglio da ligago de extremidades no proceso de reparo de quebras som alteragtes na seqiéncia 6 considerada rara (Gorbunova e Levy, 1997). Considera-se que a fonte desse DNA de preenchimento seja o préprio ‘material genético da planta (Gorbunova e Levy, 1997; Salomon e Puchta, 1998). Embora no nativo ao sitio de integracéo do inserto no milho NK6C3, parece que © segmento de DNA derivado de cloroplasto pode ter sido incorporado durante © processo de reparo da quebra no momento da transformago da célula. No se espera que a covintegragao desse DNA de cloroplasto possue potencial de Impacto adverso sobre a seguranga alimentar do milho NK603, conforme os resultados da andlise de bioinformatica (Croon et al,, 2001; Croon et al., 20002). Baseado nos resultados obtidos nas anélises de Souther tlot e PCR, um ‘mapa de restrigao do inserto presente no milho NK60S é forecide na Figura 14, ‘A Figura 14 também indica as posig6es dos grupos de iniciacores de PCR utiizados na determinagao das sequéncias fanqueadoras.Avago de Blossaguranga do Mi NKS0Y Tolerate a0 Gato 040261 AS 42345 678 1100p 1200 tg 700 po —_ W008 400 pb 500 pb —> 300 po— 100 pb. Sages anes Sect enna Figura 12. Anilise das seqUéncias flanqueadoras de DNA 5’ e 3 no milho NK60S através de PCR. A andlise de PCR foi ealizada utlizando iniciadores ‘espectficos para as seqdéncias flanqueadoras 5' © 3° do inserto no DNA ‘gen6mico extraldo do miho NK603 e da linhagem B73 (controle convencional). ‘Aproximadamente 10 ul de cada reagso de PCR foram colocados em um gel de agarose 2,0% corado com brometo de eto. Designagtes das canaletas: 4165: Gibco BRL. 100 pb DNA Ladder (marcador molecular de tamanho) 206 6: DNA da lihagem 873 (convenciona) 3.7: DNA do mio NK603 ‘46.8: Controle sem amostra ‘Stas: denotam os tamanhos obtidos com 0 marcador Gibco BRL. 100 pb DNA Ladder.‘Avaiogdo de Biossoguranga do Mino Nk603 Toerana ao Gosia % Figura 13. Anélise das seqUéncias de DNA genémico que fanqueiam ‘extromidades 5° @ 3 do inserto no milho NK603 ¢ da linhagem de milho convencional B73 através de PCR. A andlise de POR foi realizada utlizando um iniciador na sequéncia flanqueadora 6’ e um na 3° do inserto no DNA ‘genémico extraido do mitho NK6O3 e da linhagem 873 (controle convencional), para veriicar que as sequéncias flanqueadoras s80 natives do geroma do mitho. ‘Aproximadamente 10 yl de cada reago de PCR foram colocados em um gel de agarose 2,0% corado com brometo de etidio. Designagées das canaltas: {Gibco BRL 100 pb DNA Ladder (marcador molecular de tamanho) 2: DNA da innagem 873 (convencional) 3: DNA do mitho NK603 4 Conte sem amostra ‘Selas: denotam os tamanhos obtidos com 0 marcador Gibco BRL. 100 pt ONA Ladder.‘aloo de Bssepurana do Miho NiGD8 Tara 20 Gossto srdeze1 2g Figura 14, Representagio esquematica do milho NK6O3. Esta figura destaca © insorto previsto no milho NKB03 dos dados da andlise de Southem Blot © confirmagso das sequéncias nas extremidades 3° © 5’ do inserto através de PcR.‘Aalagao de Blossoguranca do Miho NK603 Tolerants ao Gifossto 92.0261 3226. Anéliso das soqléncias flanqueadoras das extromidades 3' através de anélise por RT-PCR Um estudo fol realizado para determinar se a transcrigdo ocorre ao longo dda extremidade 3° do inserto, inciuindo 0 segmento de 217 pb da regiéo ‘aumentadora do promotor da actina de arroz e o DNA genémice adjacente no mitho NK603, usando PCR-transcriptase reversa (RT-PCR; técnice que amplifica DNA a partir de uma amostra de RNAm pol-A) como ferramenta de andlse (Croon et al., 2001; Croon et al., 2000a). A andlise de RT-PCR no detectou rnenhum produto de transcrigdo que se inicia no DNA genémico que flanqueia a fextremidade 3'do inserto. no milho NK603 @ continua para dentro do DNA inserido. Entretanto, um produto de transcrigdo fol detectado @ $8 inicia dentro do inserto no mith NK603, provavelmente em um dos dos promotores Presentes no inserto, © se estende através da sequéncia NOS 3' de sinal de poliadenilagao da transcrigo dentro do DNA genémico adjacente que fanquela a extromidade 8! do inserto. ‘Anélises Northem blot (técnica utlizada para detecgao de RNA) néo detectaram 0 estado de acumulagéo constante de um produto de transcrigio (RNA mensageiro) contendo © segmento de 217 pb do promoto da actina de aroz presente na extremidade 3'do inserto (Croon et al., 2001; Croon et al., 20002). Considera-se, portanto, que 0 transcrito de RNA detectado pelo RT-PCR 6 raro e/ou instével. Adicionaimente, nenhuma proteina imuno-reativa de peso molecular maior do que o tamanho esperado de aproximadamente 47 kDa fol detectada pela andlise Westom blot (técnica utlizada para detecoao de proteinas) (com um limite de sensitividade de 1 ng) em extratos do milho NK6O3 (Croon et l., 2001; Croon et al., 20003). Iss0 indica que o produto de transcrigao detectado através de RT-PCR 6 uma espécie de RNA minortaria. (0s resultados do estudo utilzando RT-PCR foram analisades em detalhes (Croon et al, 2001), com referéncia particular a sequranga do miho NK603. Essa andlise corroborou concluszio de que © Inserto Unico no evento NK6O3 contém dois cassetes gensticos funcionais (cassetes proximal e distal; Figura 2), B‘AalogSo de Bosseguranca do Maho NK603 Toernts eo Gifossio 93.0261 (08 qusis codificam as proteinas CP4EPSPS © CP4EPSPSL214P de ‘aproximadamente 47 kDa cada. Além disso, 0 DNA inserido no miho NK603, as soqdénclas de DNA que flanqueiam o inserto Unico @ qualquer transcrito (RNA ‘mensageiro) contendo a regio flanqueadore 3° s80 constituintes do material testado nos estudos de seguranca alimentar © ambiental do milo NK6O3. Em resumo, a presenga de transcritos (RNA mensagelro) mais longos nas andlises {de RT-PCR nao implicam em preacupagées sobre a seguranga dorilho NKBO3, 322.7. Anélise de bioinformatica das sequénci flanqueadoras da extremidade 3 ‘As andlises de bioinformatica foram realizadas para avallaro potencial de toxicidade, alergenicidade ou atlvidade farmacoldgica de possiveis polipeptideos: codiicados nas jungdes do segmento de DNA de cloroplasto (veja segao 3.2.2.5), 0 qual encontra-se localizado na jungo distal (downstream) do inserto ‘no milho NKBOS. Essa seqUéncia de DNA distal em relaglo & exttemidade 3° do Ingerto foi descrita em Croon et al. (2001) © Croon et al. (2000a). Os polipeptideos possiveis na jung&o proximal em relagao ao inserto no mitho NK60S foram definidos pela jungao de um segmento do promoter da actina de ‘arroz @ © DNA de cloroplasto, enquanto os polipeptideos da junc distal do inserto foram defnidos pela jungo do DNA de cloroplasto © DNA genémico da planta, A sequéncia relativa a essas duas jungbes fol traduzida de um cédon de {érmino (stop codon) para um cédon de término em todas as fases de leltura, © ‘cada fase de letura fol comparada com bancos de dados contendo sequéncias de alérgenos (UPDATE2), toxinas (TOXIN) e de dominio pabiico (ALLPEPTIDES), utlizando a bioinformatica (Croon et al., 2001; Croon et al., 2000a). A ferramenta de alinhamento de seqUéncias FASTA fol ulizada para avalar 2 similaridade estrutural entre as seqUéncias. Assim, avaliouse a similaridade estrutural entre cada possivel polipeptideo traduzido e cada seqdéncia dos bancos de dados. Adicionalmente, cada possivel polipeptideo fol avaliado quanto & similaidade imunoldgica com sequéncias dos bancos de‘Aalagdo e Bisseguranca do Miho NkE03 Toerante ao Giosato 94 40281 dados. Nessa andlise, se houvesse uma seqiéncia de ito eminodcidos lineramente adjacentes © idénticos, esta teria sido definida como Imunologicamente relevante. © nimero de olte aminoacides adjacentes © idénticos (estringéncia da andlise) representa a seqUéncia minim tipica de um cepitopo de IgE (responsdvel pelo desencadeamento de processes alérgicos ou toxicidade), Nenhuma sequéncia de similaridade imunolégica relevante € comum centre quaisquer dos polipeptideos das jungSes do inserto no milhc NK603. Além disso, nenhuma similaridade estrutural biologicamente relevante com alérgenos « toxinas fol observada. A ocorréncia ubiquita das proteinas RNA polimerase @ fibossomal de cloroplasto em plantas levou @ conclusdo de que esses ‘segmentos na jungo do inserto do milho NK603 nao conferem rsco & satide, Os resultados da andlise de bioinformtica demonstraram que, cas> ocorresse a tradugso dos. polipeptideos possivels a partir desse DNA sogmento de Cloroplasto, estes ngo teriam um grau de similaridade com seqdéncias téxicas, alergénicas ou que possuem outras implicagdes adversas sede animal humana (Croon etal, 2001; Croon et al., 20003). 3.2.3 Localizago do Inserto nas células da planta (integrado no cromossomo, cloroplastos, mitocondria, ou mantido numa forma no integrada) e métodos para sua determinagao ‘A anélise por Souther blot fol realizada para confimar a localizagéo © & establidade do DNA inserido no milho NK603. © DNA genémico extraido de {ecido de folhas da geragso F'1 (progénie do cruzamento com Rd) e da quinta ‘geragto de retrocruzamento (BC5F 1) do milho NK60S fol digerido com a enzima EcoRV, seguindo-se 0 Southern blot, cuja hibrdizagao foi realizada com uma sonda que consistia no fragmento cip2-cp4 epsps inte, Os resultados sao apresentados na Figura 18. © DNA do controle convencional (canaleta 1) no rmostrou sinais de hibrdizagdo (bandas). © DNA do plasmideo PV-ZMGTS2 mmisturado com DNA controle convencional (canaleta 2), 0 DNA do mitho‘alagdo e Biossoguranga do Miho Nk803 Tolorante ao Gifesato 950261 NK6O3F1 (canaleta 3) e 0 DNA do miho NK603BCSF1 (canaleta 4) produziram ‘a3 bandas de tamanho esperado de aproximadamente 3,8 kb ¢ 2,8 kb, cada uma contendo a sequéncia do gene cfp2-cp4 epsps. © padréo de bandas nao ‘mostrou diferengas entre o DNA extraldo da geragdo F1 © o DNA da geragao BCSF1 do milo NK60S. Isso demonstra establidade do DNA inserido, em _amostras de cinco geragdes, © & consistente com um sitio de integragao Gnico & ‘tivo no DNA do mitho NKB03.aS Bones oo MOIS Tre 9 tno see gs", == a oe 23,1 ko— 84 Ko 86 kb — 48K 20K 1k 08 kb + 03 kh Figura 15. Anélise de Southern blot do milho NK603: estabilidade do DNA Inserido. Dez microgramas de DNA gendmico da linhagem B73 @ do mitho |NK603 extraldo de tecido de folha foram digeridos com a enzima de restrigéo EcoRV. As amostras de DNA foram separadas em gel de elatroforese, transferidas e hibridizadas com o fragmento da seqdéncia cfp2-cp4 epsps intera ‘marcado com *P, DDesignagdo das canaletas: DNA da ingen 873 innagem B73 misturado com 29,0 pg PV-ZMGT32 E:DNA de Fi ao mine Neos ‘& DNA de BCSFT do mio NKBOS ‘Selas: denotam os tamanhos obtios através dos marcadores moleculares em gel ‘orado com brometo de etc, M: denota as canaletas com os marcaderes moleculares (1g 60 marcador I! misturado com 1 ng do marcador 1X). 7)‘Aalogso de Bosseguranca do Mano NkEO3 Tlerante ao Gifossto 970261 3.2.4. Confirmagao da identidade do milho NK603 em germoplasma brasileiro © objetivo desse estudo foi confirmar a identidade do mitho NK603 em um .germoplasma tropical adaptado ao Brasil. Um hibrido de milho NKB03 adaptado ‘20 ambiente brasileiro fol produzido pelo cruzamento do miho N<603 com um hbrido adaptado 8s condigSes bresileires. A andlise de Souhern blot foi realizada com esse material © os resultados demonstraram 0 que foi previamente reportado (Croon et al., 2001; Croon et al., 2000ab) » apresentado neste documento (Figura 16). © padriio do NK603 com uma dnica banda de hibriizago esta presente no hibrido produzido para as condigses brasileiras (Figura 16),‘Aalagao de Blossogarance do Miho Nk803 Tolerate ao Gifosato 98 60261 Figura 16, Andlise de Southern blot do milho NK603 adaptado as condig6es brasiloiras: sonda TS-ctp2ICR-cp4 epsps. O DNA contido na membrana de ridizagSo fol hibridizedo com a seqiéncia TS-clp2ICR-cp4 eosps marcada com P%. Cada canaleta contém aproximadamente 10 microgramas do DNA Isolado do grdo e digerido com a enzima apropriada. Designapso das canaltas + Miho eonvencional dos Estados Unisos 2 Milho convencional dos Estados Unidos misturado com o plasmideo PV-ZMGT32 3: NK603 em um germoplasma dos Estados Unidos. 4: Miho eonvencional do Bra ‘5: NKB03 em um germoplasma brasileiro ‘Selae: denotam os lamanhos em kb abides através dos marcadores molecules em {91 corado com brometo de etl. 93,‘Avatogso de Bosseguranca do Milne Nk6O3Tolerants ao Gifosato 3.3. Expressio genética doinserto % 3.3.1, Niels das proteinas CP4 EPSPS expressas no milho NK603 durante os estagios de desenvolvimento da planta ‘As proteinas CP4EPSPS © CP4EPSPSL214P estio presentes em pequenas concentragBes nos gros @ na forragem do mitho NKB0S. A expresso das proteinas CP4 EPSPS 6 esperada nos diversos tecidos da planta, uma vez ue 08 promotores da actina de arroz @ 35S propiciam a expresso da proteina do forma constitutiva no milho NK60S (Zhong etal, 1996; Kay et a, 1985; Odell etal, 1985). Os estudos foram conduzidos para caracterizar as proteinas expressas © doterminar 0s nivels de expresso nos componentes de alimentos e ragbes. Os nivels das proteinas CP4 EPSPS © CP4 EPSPS L214P foram estimados em amostras de forragem e grdos coletadas de cite ambientes representativos da cultura de milho nos Estados Unidos na safra de 1998. Sols ensaios foram Conduzidos utlizando 0 sistema de parcelas subdivididas ene o parental Convencional e © mitho NK603. Dols ensalos foram conduzidos ullizando 4 repetigSes, Os ensaios foram conduzidos nos estados de lowe, Ilinols, Indiana, Kansas e Ohio, ¢ foram utiizados na avaliagso da expressao das oroteinas CP4 EPSPS e CP4 EPSPS L214P, Amostras de forragom e gros coleladas do mitho 'NK603 @ do milho parental convencional (LH82 X 873) foram aralisadas pela técnica de ELISA (Harlow © Lane, 1988) para estimar os nivels das proteinas (CP4 EPSPS © CP4 EPSPS L214P prosentes nesses tocidos (Tabela 2). O niveis das proteinas foram estimados usando a técnica de ELISA sanduiche com anticorpe duplo, que consiste de um anticorpo monoclonal ant-CP4 EPSPS ‘como anticorpo de captura e um anticorpo polcional anti-CP4 EPSPS conjugado ‘com uma peroxidade horseradish (HRP) como anticorpo de detecgso. Um substrato para a peroxidade horseradish (substrato TMB ou 33.5.5) {etrametiibenzideno) foi adicionado para 2 produgdo de coloragao. A ‘quantficagéo das proteinas fol realizada por comparagdo da a2sorbancia da