Kolegij Genetiko inenjerstvo

Program

enzimi, vektori, domaini dobivanje, modifikacija, obiljeavanje DNA strategije kloniranja proizvodnja rekombinantnih proteina genske knjinice mutageneza inaktivacija gena

transgenine ivotinje i biljke, GMO kloniranje itavih organizama genetiko inenjerstvo u biotehnolokoj proizvodnji bioterapeutika transgenska tehnologija u funkcijskoj genomici
GM2005

Kolegij Genetiko inenjerstvo

Literatura

G. Maravi. CD s predavanjima. Desmond S. T. Nicholl, An introduction to genetic engineering, 2nd ed., Cambridge Univeristy Press, 2003. ISBN: 0-521-00471-3. (Algoritam 220 kn)
S. B. Primrose, R. M. Twyman, R. W. Old, Principles of gene manipulation, 6th ed., Blackwell Science, ISBN: 0-632-05954-0. (Algoritam - 360 kn)
GM2005

Kolegij Genetiko inenjerstvo

Enzimi za molekularno kloniranje

doc. dr. sc. Gordana Maravi Zavod za biokemiju i molekularnu biologiju Farmaceutsko-biokemijskog fakulteta
GM2005

Genetiko inenjerstvo
jest zahtijeva etiri osnovna koraka je poznato i kao

tehnologija
koja ukljuuje

stvaranje fragmenata DNA zdruivanje s molekulom nosaem (vektor) unoenje u stanicu domaina
koristi se za

kloniranje gena tehnologija rekombinantne DNA molekularno kloniranje

primjenjuje se u proizalo je iz

kidanje, mijenjanje i zdruivanje molekula DNA

pomou

znanosti biotehnologiji medicini i farmaciji

ali postavlja i neka

mikrobne i molekularne genetike

prvi je put ostvareno

enzima
kao to su

odabir eljenog slijeda DNA ligaza

moe se koristiti za

Restrikcijske endonukleaze

1972. na sveuilitu Stanford

pravna i etika pitanja

GM2005

Razvoj genetikog inenjerstva

MENDELOVA ILI KLASINA GENETIKA

1900 1910 1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000
MIKROBNA GENETIKA Molekularna genetika GENSKA MANIPULACIJA Razvoj tehnika Primjene Genetiko Mapiranje Transformacija

1958. 1962. 1965. 1968. 1969. 1975. 1978. 1980. 1993.

GM2005

Temeljna otkria Nobelove nagrade

1958. J. Lederberg, G. W. Beadle, E. Tatum

genska rekombinacija u bakerija, djelovanje gena 3D struktura DNA operonska teorija za gensku ekspresiju u bakterija otkrie genetikog koda i njegova uloga u sintezi proteina struktura i replikacija virusa reverzna transkriptaza i tumorski virusi tehnologija rekombinantne DNA, sekvenciranje DNA PCR, ciljana mutageneza

1962. F. H. C. Crick, J. D. Watson, M. H. F. Wilkins

1965. F. Jacob, A. M. Lwoff, J. L. Monod

1968. H. G. Khorana, R. W. Holley

1969. M. Delbrck, A. D. Hershey, S. E. Luria

1975. D. Baltimore, R. Dulbecco, H. M. Temin

1980. P. Berg, W. Gilbert, F. Sanger

1993. K. B. Mullis, M. SMith

GM2005

Primjena genetikog inenjerstva u farmaciji i medicini

profiliranje klonirani P450

ivotinjski modeli bolesti

genetike bolesti

infektivne bolesti

farmakogenomika

dijagnostike n.k. terapeutske n.k.

genska terapija popravak gena protusmislene n.k.

biljke mikrobi

male terapeutske molekule dijagnostiki proteini

FARMACIJA I MEDICINA
terapeutski proteini vakcine

DNA vakcine

biljke mikrobi ivotinje mikrobi

GM2005

Razlike u genskoj ekspresiji izmeu prokariota i eukariota

Prokarioti

transkripcija i translacija odvijaju se u citosolu i usko su povezane mRNA je policistronska - kodira za nekoliko polipeptida

Eukarioti

geni sadre introne i eksone transkripcija se odvija u jezgri, a translacija u citoplazmi nezrele molekule RNA podlijeu sazrijevanju mRNA je monocistronska - kodira za jedan polipeptid

GM2005

Kontrola transkripcije kod prokariota

represija ili indukcija lac operon

GM2005

Enzimi za molekularno kloniranje

Restrikcijske endonukleaze Druge nukleaze Metil-transferaze Polimeraze Enzimi koji modificiraju krajeve DNA DNA ligaza

GM2005

Restrikcijske endonukleaze

Dio restrikcijsko-modifikacijskog sustava bakterija

endonukleaza i metilaza dijele isto mjesto prepoznavanja metilaza metilira vlastitu DNA za zatitu od djelovanja RE koja kida nemodificiranu stranu DNA

enzimi koji prepoznaju tono odreeni slijed nukleotida od 4 do 8 baza u dvolananoj DNA i kidaju oba lanca dvostruke uzvojnice TIP I - kidaju DNA >1000 pb dalje od mjesta prepoznavanja TIP III - kidaju DNA 24 do 26 pb nizvodno od mjesta prepoznavanja TIP II - kidaju DNA unutar samog mjesta prepoznavanja koje ima dvostruku rotacijsku simetriju (palindrom)
GM2005

Restrikcijske endonukleaze

do sada je otkriveno oko 3000 RE koji prepoznaju preko 200 razliitih sljedova (IZOSHIZOMERI prepoznaju isti slijed) nomenklatura: EcoRI: Escherichia coli RYI3; I - prva izolirana RE

EcoRI

EcoRV

GM2005

Mjesta prepoznavanja RE
HaeIII 5-GGCC-3 GGCC CCGG PstI 5-CTGCAG-3 CTGCAG GACGTC EcoRI 5-GAATTC-3 GAATTC CTTAAG

3- izboeni tupi krajevi

5- izboeni
GM2005

ljepljivi krajevi

Varijacije restrikcijskih mjesta

mnogi razliiti RE proizvode kompatibilne ljepljive krajeve

AgeI (A/CCGGT) i AvaI (C/CCGGG) proizvode kompatibilne 5 krajeve

ljepljivi krajevi mogu se spojiti ligazom dobiveni hibridni slijed esto mogu kidati RE koji prepoznaju 4 pb:

hibridni slijed ACCGGG prepoznaju: HpaII (C/CGG), NciI (CC/GGG), ScrFI (CC/NGG)
GM2005

Kreiranje novih restrikcijskih mjesta

GAATTC CTTAAG
EcoRI XmnI (GAANN/NNTTC)

GAATTAATTC CTTAATTAAG

G AATTC CTTAA G
DNA polimeraza

GAATT CTTAA

AATTC TTAAG

Tsp09I (/AATT) AseI (AT/TAAT) ili MseI (T/TAA)

GAATT CTTAA

AATTC TTAAG
DNA ligaza

G AATTC CTTAA G
isto kao i EcoRI

GAATTAATTC CTTAATTAAG

GAAT TAATTC CTTAAT TAAG

GM2005

Aktivnost restrikcijskih enzima

ovisi o:

pH (7.2- 8.5) Mg2+ ionima (5-30 mM) koncentraciji soli (mnoge RE 50-150 mM NaCl ili KCl) BSA stabilizira RE, titi od razgradnje proteazama, nespecifine adsorpcije ili tetnih faktora okolia (toplina, povrinska napetost) glicerolu zatita od smrzavanja na -20C; do 5-10% temperaturi veina RE ima optimalnu aktivnost na 37C, neki na 25C volumenu reakcijske smjese viskozna otopina DNA inhibira difuziju RE i smanjuje aktivnost razrijeene otopine s koncentracijom DNA ispod Km smanjuju aktivnost RE preporua se volumen 10- 50 L po g DNA

GM2005

Aktivnost restrikcijskih enzima

Star activity neeljeno kidanje DNA na

mjestima koja su slina mjestu prepoznavanja u uvjetima koji nisu optimalni za aktivnost RE:
neprikladan

pH ili ionska jakost neprikladan tip iona kofaktora (Mn2 + naspram Mg2+) poveana koncentracija glicerola, etilen-glikola

izraava se u jedinicama

1U je koliina RE koja e potpuno razgraditi 1 g DNA za 1 h na optimalnoj temperaturi

GM2005

Izrada restrikcijske karte

odreivanje poloaja restrikcijskih mjesta unutar fragmenta DNA kidanjem razliitim restrikcijskim enzimima pojedinano i u kombinaciji Zadatak:

Razgradnja fragmenta DNA veliine 15 kb trima restrikcijskim enzimima daje fragmente veliina navedenih u tablici. Odredite poloaj restrikcijskih mjesta u fragmentu DNA!
BamHI EcoRI 11 3 1 BamHI PstI 8 6 1 EcoRI PstI 7 5 3 BamHI EcoRI PstI 6 5 3 1

BamHI EcoRI 14 1 12 3

PstI 8 7

GM2005

Izrada restrikcijske karte

0 3 6 9 12 15 kb

14 kb 12 kb 3 kb 12 kb 3 kb

1 kb

BamHI

EcoRI
BamHI

EcoRI 3 kb EcoRI 3 kb 5 kb 11 kb PstI 6kb

EcoRI + BamHI
1 kb BamHI

EcoRI + BamHI + PstI

1 kb

GM2005

Izrada restrikcijske karte

Zadatak: Linearni fragment DNA veliine 100 kb obraen je polinukleotid-kinazom uz dodatak radioaktivnog ATP. Razgradnja s EcoRI daje fragmente veliina: 8*, 10, 15, 23 i 44* kb. Razgradnja s BamHI daje fragmente veliina: 11*, 14, 16, 24.5 i 34.5* kb. Razgradnja istovjetnog neradioaktivnog fragmenta s oba enzima daje fragmente veliina 3, 4.5, 5.5, 7, 8, 9.5, 10.5, 17.5 i 34.5 kb. Odredite poloaj restrikcijskih mjesta u fragmentu DNA!
8
8 3

EcoRI 10
7

23
17.5 5.5

15
10.5 4.5 9.5

44
34.5

11 BamHI

24.5

16

14

34.5

GM2005

Druge nukleaze
Nukleaza Bal 31
3- egzonukleaza + endonukleaza prisutna u vioj koncentraciji skrauje DNA s oba kraja

Egzonukleaza III
stvara 5 istaknute krajeve

5 5 3 3

Egzonukleaza
stvara 3 istaknute krajeve

DNaza I
nasumino kida jl ili dl DNA

Nukleaza S1
kida iskljuivo jl DNA ili RNA

RNaza -

kida RNA

GM2005

Metil-transferaze

mnogi laboratorijski sojevi E. coli sadre metiltransferaze Dam (GA*TC) i Dcm (CC*AGG i CC*TGG ako je DNA izolirana iz takvog soja, bit e otporna na djelovanje nekih RE jer mjesta prepoznavanja sadre metilirane nukleotide

MboI i Sau3A prepoznaju isti slijed GATC, no MboI ne kida DNA iz Dam+ i Dcm+ soja DNA iz Dam+ soja tee e transformirati Dam- bakteriju

metilacija utjee na uinkovitost transformacije

inicijacija replikacije ihibirana je kad je plazmid metiliran na Dam mjestima

Dam-modificirani plazmid moe se replicirati samo jednom u Damsoju i nakon toga replikacija prestaje

GM2005

DNA ligaza

popravlja jednolanani lom u okosnici eer-fosfat izmeu dviju susjednih nukleotida u molekuli DNA
Enzim-AMP Enzim
A P P OH P OH

T4 DNA ligaza ATP PPi

B B

AMP

P P
B B

P P
B B B B B B B B

P
B B

P
B B

P
B B B B

P P
B B B B

P P
B B B B

P
B B

B B

B B

B B

P P P P P

P P

P P GM2005

DNA ligaza

u molekularnom kloniranju najee se koristi DNA ligaza iz bakteriofaga T4 (T4 DNA ligaza) povezivanje krajeva DNA nastalih razgradnjom restrikcijskim enzimima tupi krajevi tee se povezuju od ljepljivih krajeva optimalna temperatura reakcije je 37C, no pri toj su temperaturi vodikove veze izmeu ljepljivih krajeva nestabilne

ljepljivi krajevi 3 h na 22C ili 16 h na 16C (moderna varijanta 5 min. na sobnoj temperaturi u posebnom puferu) tupi krajevi 4-16 h na 22C
GM2005

Tvorba rekombinantne molekule DNA

EcoRI
5-AATTC G 5-AATTC G G CTTAA-5

EcoRI
G CTTAA-5

DNA ligaza

TTC GAA AA G CTT

GAA C TT T TC AAG

GM2005

Polimeraze

DNA-polimeraza I

polimerazna, 35 i 53 egzonukleazna aktivnost lom jednog lanca dl DNA nastaje spontano ili djelovanjem niskih koncentracija DNaze u reakcijskoj smjesi DNA polimeraza I dodaje nove dNTP i razgrauje lanac 53 egzonukleaznom aktivnou jl lom (nick) tako se pomie uzdu molekule DNA visoko obiljeena molekula DNA nastaje dodatkom jednog radioaktivno obiljeenog dNTP (obino dATP obiljeen radioaktivnim fosforom 32P ili 33P)
GM2005

Nick translacija

Obiljeavanje DNA nick translacijom

jednolanani lom (nick)

Ako je jedan od dNTP u reakcijskoj smjesi radioaktivno obiljeen, djelovanjem DNApolimeraze I nastaje visoko obiljeena molekula DNA
DNA-polimeraza I

mjesto jl loma

GM2005

Polimeraze

Klenowljev fragment
dio DNA-polimeraze I kojem nedostaje 53 egzonukleazna aktivnost u reakcijskim uvjetima 35 egzonukleazna aktivnost je suprimirana uporaba pri sekvenciranju Sangerovom dideoksi metodom i za obiljeavanje DNA metodom produljenja ishodnice (primer extension, oligolabelling)

GM2005

Obiljeavanje DNA metodom produljenja ishodnice

denaturacija jednolanana DNA dodatak ishodnice slobodan 3-OH kraj
5 3

5 HO ishodnica

3 5

Klenowljev fragment DNA-polimeraza I (Klenow) DNA-polimeraze I nastavlja sintezu komplementarnog lanca produujui ishodnicu ugradnja radioaktivnog dATP daje obiljeenu molekulu s vrlo visokom specifinom aktivnou

ishodnica

GM2005

Polimeraze

Reverzna transkriptaza
RNA-ovisna DNApolimeraza nema egzonukleazne aktivnosti koristi se za dobivanje cDNA iz mRNA

GM2005

Enzimi koji modificiraju krajeve DNA

Alkalna fosfataza
bakterijska alkalna fosfataza (BAP) AP iz goveeg crijeva (CIP calf intestinal phosphatase) uklanja fosfatnu skupinu s 5-kraja DNA spreavanje neeljene ligacije (recirkularizacija plazmida razgraenog jednim restrikcijskim enzimom) koristi se i prije uporabe polinukleotid kinaze prilikom obiljeavanja DNA

GM2005

Enzimi koji modificiraju krajeve DNA

Polinukleotid-kinaza (PNK)

prenosi terminalnu fosfatnu skupinu ATP-a na slobodnu OH skupinu na 5-kraju DNA (DNA se prethodno defosforilira uporabom AP) slui za radioaktivno obiljeavanje krajeva DNA (i RNA)
PNK
HO HO OH OH
ATP

HO HO

OH OH

GM2005

Enzimi koji modificiraju krajeve DNA

Terminalna transferaza (TT) (terminalna deoksinukleotidil-transferaza)

opetovano dodaje nukleotide na slobodan 3-kraj najbolje radi na istaknutim 3-krajevima, no reakcijski uvjeti mogu se prilagoditi i za tupe i 3-uvuene krajeve uglavnom se koristi za dodatak homopolimera na kraj molekule DNA

GM2005

Za kidanje, modifikaciju i zdruivanje DNA

potrebni su
komercijalno dostupni
i

razliitih tipova stanica

proieni iz

enzimi
3 glavne skupine

katalitike proteinske molekule DNA ligaza

Restrikcijske endonukleaze
kidaju DNA na

enzimi koji modificiraju DNA Nukleaze EndoRE DNAza I S1 Bal 31 Exo III Exo EgzoDNA pol I Klenow RT Polimeraze Enzimi koji djeluju na krajevima

specifinim mjestima
i koriste se za

spaja molekule DNA

tvorbom

Stvaranje fragmenata DNA

Izradu restrikcijskih karata

AP PNK TT

Fosfodiesterskih veza

tvori rekombinantnu DNA

GM2005

Spajanje dvaju fragmenata DNA pomou homopolimernih repova

5 3 5 3 5 Egzonukleaza 5 3 3 5 3 5 3 5 Egzonukleaza 5 3

Terminalna transferaza + dATP 3A(A)nA 5 5 A(A)nA3 3T(T)nT 5

Terminalna transferaza + dTTP 5 T(T)nT3

T A( (T) A) n T nA

A A) n A( T) nT T(

GM2005

Linkeri (poveznice)

Ukoliko fragment DNA nema prikladnih restrikcijskih mjesta, na krajeve DNA mogu se dodati kratki odsjeci DNA sa eljenim mjestima koje prepoznaju RE: Linkeri (poveznice)

komplementarni oligomeri tupih krajeva dobiveni kemijskom sintezom

CCGAATTCGG GGCTTAAGCC DNA ligaza CCGAATTCGG GGCTTAAGCC EcoRI 5-AATTCGG GCC CCG GGCTTAA-5 CCGAATTCGG GGCTTAAGCC

GM2005

Adaptori

Adaptori

sintetiki oligomeri koji s jedne strane imaju tupi kraj kojim se adaptor vee na eljenu molekulu DNA, a s druge ljepljivi kraj koji omoguava izravno povezivanje s kompatibilnim ljepljivim krajem vektora (ili neke druge DNA)
5-GATCCCCGGG GGGCCC DNA ligaza 5-GATCCCCGGG GGGCCC CCCGGG GGGCCCCTAG-5 BamHI adaptor

GM2005

Naini dobivanja fragmenata DNA

mehanikim kidanjem (soniciranjem) razgradnjom restrikcijskim enzimima (potpuna i djelomina) sintetikim putem (oligonukleotidi) prevoenjem mRNA u cDNA pomou reverzne transkriptaze umnaanjem lananom reakcijom polimeraze

GM2005

PCR u kloniranju: dizajn posebnih ishodnica

dodavanje kratkih odsjeaka nekomplementarnih kalupu na 5-kraj ishodnice

mjesta prepoznavanja RE sljedovi za lake proiavanje proteina (6x-His tag)

5 3 5 5GCGCA 3 HindIII 5 GCGCAAGCTT 3 CGCGTTCGAA EcoRI GAATTCGGCC CTTAAGCCGG
AGCTT
CTTAA GCCGG

3 5 3 5 5

GM2005

PCR u kloniranju: dizajn posebnih ishodnica

ako je poznat samo dio a.k. slijeda proteina, a elimo izolirati gen:

za degenerirani kodon sintetizira se mijeana ishodnica sa svim kombinacijama nukleotida na 3. mjestu

a.k. slijed broj kodona po a.k. Phe-Leu-Pro-Ser-Ala-Lys-Trp-Ala-Tyr-Asp-Pro 2 6 4 6 4 2 1 4 2 2 4

Sinteza mijeane ishodnice

Ala Lys Trp Ala Tyr Asp Pro GCA AAA TGG GCA TAC GAC CC T G T G G C C T T

broj kombinacija

4 X 2 X 1 X 4 X 2 X 2 X1

= 128

GM2005

PCR u kloniranju: dizajn posebnih ishodnica

ako je poznat samo dio a.k. slijeda proteina, a elimo izolirati gen:

umjesto 3. mjesta u ishodnicu se ugrauje inozin koji se jednako dobro sparuje sa svim nukleotidima
a.k. slijed broj kodona po a.k. Phe-Leu-Pro-Ser-Ala-Lys-Trp-Ala-Tyr-Asp-Pro 2 6 4 6 4 2 1 4 2 2 4

Uporaba inozina kao degenerirane baze

Ala Lys Trp Ala Tyr Asp Pro GCI AAA TGG GCI TAC GAC CC T T G 1 X 2 X 1 X 1 X 2 X 2 X1 =8

broj kombinacija

GM2005

Polimeraze s mogunou popravka ugradnje krive baze

Taq polimeraza nema 35 egzonukleaznu aktivnost ugradnja pogrenog nukleotida zaustavlja sintezu

standardni PCR ne moe uinkovito umnoiti odsjeke puno dulje od 3 kb dodatkom proofreading polimeraze omoguava se vjerna i uinkovita sinteza duljih fragmenata

Tma (Thermotoga maritima) Deep VentTM (Pyrococcus sp.) Tli (Thermococcus litoralis) Pfu (Pyrococcus furiosus) Pwo (Pyrococcus woesi)
GM2005