Practicum 5 & 6

Subcellulaire localisatie van LDH en GDH in kippenlever

Eline van Diest 3821021 Lisa Huwae 3784037 Anne Gelderloos 3831213 3 april 2012 Voorbereidingsvragen 1. LDH (lactaat dehydrogenase) is een katalysator voor onderstaande reactie:

Dit gebeurt in het cyotosol van vooral spiercellen onder anaerobe conditities, zoals bijvoorbeeld in een sprint waarbij zuurstof niet snel genoeg in bijvoorbeeld de spieren kan komen. Dan kan alleen de glycolyse plaatsvinden waarbij uit glucose 2 ATP, 2 NADH moleculen en 2 lactaat moleculen wordt gevormd. Omdat de oxidatieve fosforylering niet kan plaatsvinden kunnen de NADHs niet worden geoxideerd tot NAD+ waadoor deze opraakt en ook de glycolyse niet meer plaats kan vinden. Door de omzetteing van pyruvate tot lactaat wordt NADH weer geoxideert tot NAD+ waardoor hier weer genoeg van is voor de glycolyse.

GDH (glutamaat dehydrogenase) is een katalysator voor de volgende reactie:

Deze reactie is onderdeel van een cyclus waarbij aminozuren omgezet kunnen worden in een -ketozuur, waarbij glutamate eerst omgezet wordt is -ketoglutaraat waarna deze weer terug omgezet wordt naar glutamate. Bij deze terugomzetting kan een aminozuur omgezet worden naar een -ketozuur. Dit gebeurt in de matrix van de mitochondrin 2. LDH is gelokaliseerd in het cytosol, GDH is gelokaliseerd in de mitochondrin. 3. Latentie % = (A met triton - A zonder triton)/ A met triton x 100 %

4. Alle mitos intact LDH GDH lat rec lat 0 100 100 0 100 0 0 0 100 50% van de mitos kapot LDH GDH lat rec lat rec 0 100 50 100 0 100 0 50 0 0 50 50 Alle mitos kapot LDH GDH lat rec lat 0 100 0 0 100 0 0 0 0

PNS Cyt Mit

rec 100 0 100

rec 100 100 0

5. LDH:

GDH:

6. Beide reacties gebeuren onder invloed van NADH / NAD+. Bij reacties met NADH en NAD+ ligt het evenwicht onder fysiologische, pH neutrale, omstandigheden aan de kant van NAD+. Dit houdt in dat bij de reactie met LDH het evenwicht aan de kant van lactaat ligt en bij de reactie met GDH aan de kant van glutamaat. 7. Dit maakt de reactie irreversibel, het uit ADP gevormde AMP zal niet snel weer omgezet kunnen worden tot ADP. ADP weer terug omzetten naar ATP gaat makkelijker

Inleiding: Tijdens het hoorcollege hebben we geleerd dat sommige processen plaatsvinden in het mitochondrion terwijl andere processen juist in het cytosol plaatsvinden. Deze processen zouden ruimtelijk van elkaar gescheiden zijn. Tijdens dit practicum gaan we onderzoeken of twee processen, 1 in het cytosol en 1 in het mitochondrion ook daadwerkelijk van elkaar gescheiden zijn. Dit gaan we doen door celfractionering toe te passen zodat we de activiteit van enzymen in verschillende compartimenten van de cel te kunnen meten. We gaan de latentie en de recovery van LDH en GDH bepalen, in de PNS( post nucleaire supernatant) het cytosol en de mitochondrin. We gaan steeds meten met intacte organel membranen en kapot gemaakt membranen ( d.m.v triton). De berekende latentie van de enzymen is hoog bij een enzym dat eerst ruimtelijk gescheiden werd van het cytosol en dit na toevoeging van triton niet meer was. Er is in theorie sprake van zon ruimtelijke scheiding bij GDH en niet bij LDH. Materiaal en methoden: Voor alle gebruikte materialen en de gevolgde procedure zie blokboek.

Resultaten

Afbeelding 1

Afbeelding 2

Afbeelding 1: P1, homogenaat gecentrifugeerd. Te zien is een duidelijke gscheiding tussen de verschillende componenten in het weefsel homogenaat. Afbeelding 2: P2, supernatant gecentrifugeerd. De mitochondrien zijn nu van de rest van het cytosol gescheiden. Absorptie waarden: Absorptie NADH bij LDH activiteit in PNS met triton Tijd in Absorptie Absorptie senconden duplo 15 0,881 0,991 30 0,880 0,984 45 0,878 0,987 60 0,877 0,987 75 0,876 0,987 90 0,876 105 0,875 0,751 120 0,875 0,580 135 0,401 150 0,583 0,301 165 0,404 0,255 180 0,289 0,239 195 0,235 0,234 210 0,216 0,232 225 0,211 0,232 240 0,210 0,232 255 0,209 270 0,209 285 0,209

Absorptie NADH bij LDH activiteit in PNS zonder triton Tijd in Absorptie Absorptie senconden duplo 15 0,971 1,009 30 0,788 0,848 45 0,662 0,695 60 0,550 0,584 75 0,473 0,513 90 0,420 0,473 105 0,393 0,455 120 0,381 0,448 135 0,377 0,445 150 0,375 0,444 165 0,374 0,443 180 0,374 0,443

Absorptie NADH in cytosol bij LDH 0,05 mL activiteit met triton Tijd in Absorptie Absorptie seconden duplo 15 0,774 0,793 30 0,678 0,686 45 0,579 0,571 60 0,487 0,472 75 0,402 0,382 90 0,330 0,307 105 0,271 0,250 120 0,223 0,203 135 0,185 0,172 150 0,159 0,153 165 0,140 0,142 180 0,129 0,135

Absorptie NADH in cytosol bij 0,05 mL LDH activiteit zonder triton Tijd in Absorptie Absorptie seconden duplo 15 0,778 0,777 30 0,682 0,675 45 0,581 0,570 60 0,485 0,493 75 0,385 0,407 90 0,328 0,333 105 0,268 0,272 120 0,221 0,223

Absorptie NADH in mitochondrin bij 0,1 mL LDH activiteit zonder triton Tijd in Absorptie Absorptie seconden duplo 15 0,895 0,897 30 0,893 0,896 45 0,893 0,895 60 0,893 0,895 75 0,893 0,895

Absorptie NADH in mitochondrin bij LDH 0,1 mL activiteit met triton Tijd in Absorptie Absorptie seconden duplo 15 0,750 0,777 30 0,733 0,763 45 0,716 0,747 60 0,700 0,730 75 0,683 0,715 90 0,666 0,700 105 0,649 0,684 120 0,633 0,670 135 0,620 0,655

Absorptie NADH bij GDH activiteit zonder triton PNS Tijd in Absorptie Absorptie senconden duplo 15 1,061 1,032 30 1,036 1,015 45 1,031 1,002 60 1,021 0,990 75 1,007 0,974 90 0,994 0,964 105 0,978 0,950 120 0,965 0,940 135 0,954 0,926 150 0,943 0,912 165 0,928 0,898 180 0,915 0,887 195 0,904 0,873 210 0,893 0,859 225 0,878 0,831 240 0,866 0,818 255 0,850 0,808 270 0,841 0,790 285 0,827 0,778

Absorptie NADH bij GDH activiteit in PNS met triton Tijd in Absorptie Absorptie senconden duplo 15 0,971 0,989 30 0,970 0,984 45 0,969 0,983 60 0,967 0,981 75 0,967 0,979 90 0,967 0,979 105 120 0,894 0,903 135 0,844 0,843 150 0,799 0,798 165 0,750 0,756 180 0,703 0,714 195 0,658 0,670 210 0,615 0,626 225 0,571 0,585 240 0,528 0,542 255 0,491 0,502 270 0,456 0,474 285 0,423 0,432 300 0,393 0,404 315 0,363 0,376 330 0,340 0,352 345 0,318 0,331 Absorptie NADH in cytosol bij 1,0 mL GDH activiteit met triton Tijd in Absorptie Absorptie seconden duplo 15 0,711 0,718 30 0,705 0,708 45 0,691 0,696 60 0,681 0,684 75 0,671 0,675 90 0,660 0,666 105 0,647 0,653 120 0,637 0,641 135 0,625 0,632 150 0,617 0,621

Absorptie NADH in cytosol bij 1,0 mL GDH activiteit zonder triton Tijd in Absorptie Absorptie seconden duplo 15 0,797 0,843 30 0,785 0,833 45 0,774 0,820 60 0,762 0,809 75 0,751 0,798 90 0,740 0,787 105 0,728 0,775 120 0,718 0,764 135 0,705 0,752 150 0,693 0,742 165 0,682 0,728 180 0,670 0,719

Absorptie NADH in bij 1,0 mL GDH activiteit in mitochondrien zonder triton Tijd in Absorptie Absorptie seconden duplo 15 0,856 0,863 30 0,855 0,858 45 0,852 0,855 60 0,849 0,852 75 0,846 0,848 90 0,853 0,845 105 0,841 0,842

Absorptie NADH bij 1,0 mL GDH activiteit in mitochordrien met triton Tijd in Absorptie Absorptie seconden duplo 15 0,741 0,761 30 0,709 0,737 45 0,781 0,712 60 0,654 0,685 75 0,623 0,650 90 0,597 0,637 105 0,567 0,612 120 0,540 0,589 135 0,514 0,563 150 0,488 0,540 165 0,461 0,517

Met al deze meetgegevens kunnen steeds de latentie en recovery berekend worden van LDH en GDH in de Post nucleaire supernatant, in het Cytosol, en in de een suspensie met mitochondrien. Dit kan gedaan worden door alle meetgegevens uit te zetten in een grafiek waarbij de absorptie wordt uitgezet tegen de tijd. De richtingscofficint van deze lijnen staat gelijk aan de A/min. Als deze van alle lijnen is uitgerekend ( zie werkblad) kan hiermee steeds de latentie en recovery worden berekend. De latentie wordt berekend d.m.v de volgende formule: (A met triton - A zonder triton)/ A met triton x 100 % Bij het berekenen van de recovery wordt de A/min gemeten bij PNS met triton van zowel LDH als GDH op 100% gesteld. Vervolgens kan steeds de recovery berekend worden door: de gevonden A/ min te delen door de op 100% gestelde A/min en deze x 100 te doen. ( zie werkblad)

Conclusie en Discussie De gevonden resultaten komen lang niet altijd overeen met de verwachte resultaten we zullen per resultaat bespreken hoe dit zou kunnen komen. LDH De latentie van LDH in PNS was 15 %, dit is meer dan de verwachte 0%. Dit kan verklaard worden door de vorming van vesicles waar LDH in wordt ingesloten. Bij het homogeniseren van de kippenlever gaan membranen kapot, deze kunnen resealen en zo vesicles vormen met cytosol hierin. Deze gaan kapot door Triton waardoor je weer een hogere LDH activiteit meet. De latentie van LDH in het Cytosol was 28%, ook dit is veel meer dan de verwachte 0%. Het kan niet helemaal verklaard worden waarom dit zoveel hoger is. Dit zou te weer temaken kunnen hebben met vesicles in combinatie met onnauwkeurig werken, de twee berekende A/min met triton lagen vrij ver uit elkaar en de recovery was ook vrij laag. De latentie van LDH in de Mitochondrien was 97% dit is te verklaren doordat de membranen kapot gaan en resealen , hierbij worden vesicles gevormd met cytosol erin. Deze gaan aan de mitochondrin plakken waardoor deze met de mitochondrien neerslaan. De waargenomen LDH activiteit wordt benvloed door de LDH die vrijkomt uit de vesicles wanneer je triton toevoegt. Al met al kunnen we wel concluderen dat LDH inderdaad in het cytosol aanwezig is. GDH In het PNS was de latentie van GDH vrij hoog, maar geen honderd. Dit komt doordat mitochondrin kapot gegaan kunnen zijn tijdens het potteren. Hierdoor kwam GDH al vrij in het cytosol voor toevoeging van triton waardoor de latentie lager uitvalt. In het cytosol was de latentie zoals verwacht zeer klein. Er zitten geen mitochondrin meer bij, de activiteit die wel gemeten wordt, wordt veroorzaakt door mitochondrin die al eerder kapot zijn gegaan waardoor GDH in het cytosol kwam. In de mitochondrin was de latentie zoals verwacht zeer hoog. GDH kwam inderdaad vrij uit de mitochondrin na toevoeging van triton. Voor toevoeging van triton was er nauwelijks activiteit. De activiteit die er was kan weer verklaard worden door kapotte mitochondrin. Wederom kunnen we concluderen dat GDH inderdaad in de mitochondrin aanwezig is en niet in het cytosol.