Practicum 5 & 6

Subcellulaire localisatie van LDH en GDH in kippenlever

Meander Kloosterman (3928586) groep 10, H1 Laura van Vuuren (3968235) groep 11, H1

Voorbereidingsvragen
1. LDH (lactaat dehydrogenase) is betrokken bij de onderstaande reactie:

LDH zorgt voor de omzetting van pyruvaat naar lactaat. Dit gebeurd in het cytosol van vooral spiercellen, wanneer de condities anaeroob zijn. Dit is het geval bij een sprint waarbij er niet genoeg zuurstof in de spieren is. De terugreactie vindt plaats in bijvoorbeeld levercellen, zodat gluconeogenese plaats kan vinden en het glucose kan worden opgeslagen in glycogeen. GDH (glutamaat dehydrogenase) is betrokken bij de volgende reactie:

Deze reactie is onderdeel van een cyclus waarbij aminozuren omgezet kunnen worden in een -ketozuur, waarbij glutamate eerst omgezet wordt is -ketoglutaraat waarna deze weer terug omgezet wordt naar glutamate. Bij deze terugomzetting kan een aminozuur omgezet worden naar een -ketozuur. Dit gebeurt in de matrix van de mitochondrin 2. LDH is gelokaliseerd in het cytosol, GDH is gelokaliseerd in de mitochondrin. 3. Latentie % = (A met triton - A zonder triton)/ A met triton x 100 %

4. Alle mitos intact LDH GDH lat rec lat 0 100 100 0 100 0 0 0 100 50% van de mitos kapot LDH GDH lat rec lat rec 0 100 50 100 0 100 0 50 0 0 100 50 Alle mitos kapot LDH GDH lat rec lat 0 100 0 0 100 0 0 0 0

PNS Cyt Mit 5.

rec 100 0 100

rec 100 100 0

LDH

GDH 6. Beide reacties gebeuren onder invloed van NADH / NAD+. Bij reacties met NADH en NAD+ onder fysiologische, pH neutrale omstandigheden ligt het evenwicht aan de kant van NAD+. Dit houdt in dat bij de reactie met LDH het evenwicht aan de kant van lactaat ligt en dus lactaat wordt omgezet tot pyruvaat en bij de reactie met GDH ligt het evenwicht aan de kant van glutamaat en dus wordt -ketoglutamaat gevormd. 7. GDH bindt aan ADP waardoor GDH actief wordt. Hierdoor kan dus de reactie tussen glutamaat en -ketogluraat plaats vinden.

Resultaten
Onder bepaalde omstandigheden hebben wij de enzym expressie gemeten van LDH en GDH. Dit hebben wij gedaan in de mitochondrin en het cytosol, maar ook wanneer deze bij elkaar in hetzelfde mengsel zitten. Wij hebben dit gedaan door middel van de absorptie te meten ten opzichte van de tijd. Dit hebben wij gedaan met behulp van een spectrofotometer. De resultaten zijn verwerkt in grafieken, die bijgevoegd zijn bij het verslag. Door slordigheid hebben wij 1 epje sediment bij stap 13 verloren. Hierdoor moeten alle uitkomsten keer 0,75 worden gedaan.

Discussie en conclusie
De gevonden resultaten komen niet altijd overeen met de verwachtingen. Wij zullen per resultaat bespreken hoe dit zou kunnen.

LDH
De latentie van LDH in PNS was -26%, dit is minder dan de verwachte 0%. De grootste reden is waarschijnlijk een meetfout, maar ook doordat triton de eiwitten kan denatureren en dus een deel van LDH gedenatureerd is. Door slordigheid zijn wij ook vergeten water bij de oplossingen te voegen zonder triton. Dit betekend dus dat de oplossing minder verdund is, waardoor de waarden iets hoger uitvallen van de oplossingen zonder triton. De latentie van LDH in cytosol wat -10,5%. Ook dit is minder dan de verwachte 0% en dit zou kunnen komen door dezelfde redenen als het LDH in PNS. Het verschil in percentage kan niet echt verklaard worden. Het kan komen doordat triton minder enzym denatureert, misschien door later toevoegen van triton. De latentie van LDH in de Mitochondrien was -11,1%. Dit is te verklaren door dezelfde redenen bij PNS en het cytosol.

GDH
In het PNS was de latentie van GDH 80%, maar geen honderd. Dit komt doordat mitochondrin kapot gegaan kunnen zijn tijdens het potteren. Hierdoor kwam GDH al vrij in het cytosol voor toevoeging van triton waardoor de latentie lager uitvalt. In het cytosol was de latentie zoals verwacht zeer klein, deze is namelijk 10%. Er zitten geen mitochondrin meer bij, de activiteit die wel gemeten wordt, wordt veroorzaakt door mitochondrin die al eerder kapot zijn gegaan waardoor GDH in het cytosol kwam. In de mitochondrin was de latentie 86%. GDH kwam inderdaad vrij uit de mitochondrin na toevoeging van triton. Voor toevoeging van triton was er nauwelijks activiteit. De activiteit die er was kan weer verklaard worden door kapotte mitochondrin. Hieruit kunnen we concluderen dat GDH inderdaad in de mitochondrin aanwezig is.