Disertacija

UNIVERZITET U NOVOM SADU MEDICINSKI FAKULTET KLINIKA MEDICINA
AROMATINE BILJKE I NJIHOV POSTDESTILACIONI OSTATAK KAO POTENCIJALNA SIROVINA ZA FARMACEUTSKU INDUSTRIJU
DOKTORSKA DISERTACIJA
Mentor: Doc. dr Biljana Boin
Kandidat: Neda Laki
Novi Sad, 2013. godine
UNIVERZITET U NOVOM SADU MEDICINSKI FAKULTET
KLJUNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

Redni broj: RBR Identifikacioni broj: IBR Tip dokumentacije: TD Tip zapisa: TZ Vrsta rada (dipl., mag., dokt.): VR Ime i prezime autora: AU Mentor (titula, ime, prezime, zvanje): MN Naslov rada: NR Jezik publikacije: JP Jezik izvoda: JI Zemlja publikovanja: ZP Ue geografsko podruje: UGP Godina: GO Izdava: IZ Mesto i adresa: MA
Monografska dokumentacija Tekstualni tampani materijal Doktorska disertacija Neda Laki Dr Biljana Boin, docent
Aromatine biljke i njihov postdestilacioni ostatak kao potencijalna sirovina za farmaceutsku industriju Srpski (latinica) srp. / eng. Republika Srbija Vojvodina 2013 autorski reprint 21000 Novi Sad, Hajduk Veljkova 3
Fiziki opis rada: FO Nauna oblast: NO Nauna disciplina: ND Predmetna odrednica, kljune rei: PO UDK uva se: U Vana napomena: VN Izvod: IZ
(broj poglavlja 8 / stranica 118 / slika 27 / tabela 29 /referenci 218 / priloga 3) Farmacija Farmakognozija Timijan; Matinjak; Pitoma nana; Biljni ekstrakti; Depsidi; Flavonoidi; Otpadni materijal 635.7:66.048 661.12:615
Aromatine biljke timijan (Thymus vulgaris), matinjak (Melissa officinalis) i pitoma nana (Mentha x piperita) imaju dugu tradiciju primene. Najvea koliina proizvedenog biljnog materijala utroi se za dobijanje lista i izolaciju etarkog ulja. Meutim, s obzirom na malu koncentraciju etarskog ulja (0,02-4%) najvea koliina biljnog materijala zapravo ostane neiskoriena. Za cilj ove doktorske disertacije postavljena su hemijska, biohemijska, mikrobioloka i farmakoloka ispitivanja ekstrakata otpadnog materijala (stabljika, postdestilacioni ostatak, list zaostao nakon izolacije etarskog ulja) timijana, matinjaka i pitome nane i poreenje ovih rezultata sa oficinalno pripremljenim ekstraktima. Ispitivani ekstrakti otpadnog materijala predstavljaju bogat izvor fenolnih jedinjenja, a kao dominantan sastojak odreena je rozmarinska kiselina (7,05-105,08 mg/g s.e.). Antioksidantni potencijal, kao i hepatoprotektivno delovanje ekstrakata otpadnog materijala uporedivo je sa aktivnou oficinalnih esktrakata, pri emu se posebno istiu oni dobijeni tretiranjem dearomatizovanog lista kako 45%, tako i 75% etanolom. Praenjem mikrobioloke aktivnosti ekstrakata otpadnog materijala na odabrane sojeve bakterija potvren je i njihov antimikrobni potencijal. U testu inhibicije acetilholinesteraze (AChE), kao jednog od moguih mesta delovanja potencijalnih lekova
u terapiji Alchajmerove bolesti, takoe su dobijeni rezultati uporedivi sa oficinalnim ekstraktima. Pored toga, ekstrakti su pokazali jai uticaj u odnosu na izolovanu rozmarinsku kiselinu to ukazuje na potencijalni sinergistiki efekat fenolnih jedinjenja u inhibiciji AChE. Rezultati farmakolokih ispitivanja na eksperimentalnim ivotinjama pokazali su da odabrani ekstrakti timijana i matinjaka (oficinalni i oni dobijeni tretiranjem dearomatizovanog lista) utiu na efekat midazolama, ali ne i fluoksetina. Nijedan od ispitivanih ekstrakata ne ispoljava uticaj na motornu koordinaciju, kao ni antidepresivno delovanje. Ekstrakti matinjaka poseduju anksiolitiko dejstvo, to zajedno sa rezultatima antioksidantnog potencijala i inhibitornog uticaja na AChE indikuje mogunost njihove primene u prevenciji i koterapiji Alchajmerove bolesti. Takoe, ekstrakti matinjaka pokazali su najvei potencijal u testu prepoznavanja novog objekta kojim je praen uticaj na memoriju. Ekstrakti otpadnog materijala timijana, matinjaka i pitome nane predstavljaju znaajan izvor fenolnih jedinjenja, pre svega rozmarinske kiseline, a mogu nai svoju primenu i u farmaceutskoj industriji za izradu razliitih fitopreparata, kao i u prehrambenoj industriji kao aditivi i stabilizatori prirodnog porekla. Datum prihvatanja teme od strane NN vea: DP Datum odbrane: DO lanovi komisije: (ime i prezime / titula / zvanje / naziv organizacije / status) KO 06.04.2011.
predsednik: prof. dr Neda Mimica-Duki, redovni profesor, Prirodno-matematiki fakultet u Novom Sadu lan: doc. dr Aleksandra Nikoli, docent, Medicinski fakultet u Novom Sadu lan: doc. dr Isidora Samojlik, docent, Medicinski fakultet u Novom Sadu lan: doc. dr Branislava Srenovi oni, docent, Medicinski fakultet u Novom Sadu lan: doc. dr Goran Anakov, docent, Prirodnomatematiki fakultet u Novom Sadu
University of Novi Sad

ACIMSI
Key word documentation
Accession number: ANO Identification number: INO Document type: DT Type of record: TR Contents code: CC Author: AU Mentor: MN Title: TI Language of text: LT Language of abstract: LA Country of publication: CP Locality of publication: LP Publication year: PY Publisher: PU Publication place: PP
Monograph documentation Textual printed material PhD Thesis Neda Laki Dr Biljana Boin, Assistant Professor Postdistillation waste of aromatic plants as a potential source for pharmaceutical industry Serbian eng. / srp. Republic of Serbia Vojvodina 2013 Author reprint 21000 Novi Sad, Hajduk Veljkova 3
Physical description: PD Scientific field SF Scientific discipline SD Subject, Key words SKW UC Holding data: HD Note: N Abstract: AB
Number of chapters 8/ pages 118 / pictures 29 / tables 27 / references 218 / additional files 3 Pharmacy Pharmacognosy Thymus plant; Melissa; Mentha; Plant extracts; Depsides; Flavonoids; Waste products 635.7:66.048 661.12:615
Aromatic plants thyme (Thymus vulgaris), lemon balm (Melissa officinalis) and peppermint (Mentha x piperita) have long tradition of use. The majority of produced plant material is used for the production of drugs and isolation of essential oils. However, since esential oils are present in very low amounts (0.02-4%) the largest amount of studied plants remains unused. The aim of this thesis was chemical, biochemical, microbiological and pharmacological analysis of waste material extracts (stems, postdistillation waste, dearomatized leaves) and the comparison of obtained results with officially prepared extracts. Investigated waste extracts are a rich source of phenolic compounds, where rosmarinic acid was determined as the dominant one (7.05-105.08 mg/g s.e.). Antioxidant potential and hepatoprotective effect of waste extracts is comparable with official extracts, where the most active ones were those prepared by treating the dearomatized leaves with both 45% and 75% ethanol. Also, regarding antimicrobial activity, waste extracts express similar effect to official ones. When inhibition of acetylcholinesterase (AChE), as one of the possible mechanisms of action of potential drugs used in the treatment of Alzheimer's disease was tested similar results were obtained.
In addition, the extracts showed a stronger effect than the isolated rosmarinic acid suggesting a potential synergistic effect of phenolic compounds on AChE inhibition. Results of pharmacological studies on experimental animals showed that thyme and lemon balm extracts (official and those made from dearomatized leaves) interfere with the effect of the drug midazolame, but not fluoxetine. None of examined extracts exerted the influence on motor coordination, nor acted as antidepressive. Examined lemon balm extracts posses anxiolytic effect, which together with the results of antioxidant potential and inhibition of AChE indicates their potential use in prevention and symptomatic therapy of Alzheimer's disease. Also, they have the largest potential to improve memory in novel object recognition test. Thyme, lemon balm and peppermint waste extracts represent significant source of phenolic compounds, especially rosmarinic acid and can be used in pharmaceutical industry for the production of various phytopreparations and in food industry as natural additives. Accepted on Scientific Board on: AS Defended: DE Thesis Defend Board: DB 06.04.2011.
president: prof. dr Neda Mimica-Duki, full professor, Faculty of Natural Sciences, Novi Sad member: doc. dr Aleksandra Nikoli, assistant professor, Medical Faculty, Novi Sad member: doc. dr Isidora Samojlik, assistant professor, Medical Faculty, Novi Sad member: doc. dr Branislava Srenovi oni, assistant professor, Medical Faculty, Novi Sad member: doc. dr Goran Anakov, assistant professor, Faculty of Natural Sciences, Novi Sad
SADRAJ
1. UVOD ............................................................................................................................................. 1 1.1 HIPOTEZE REZULTATA ISTRAIVANJA ................................................................................ 3 2. 3. CILJ ISTRAIVANJA .................................................................................................................... 4 OPTI DEO .................................................................................................................................... 5 3.1. PORODICA LAMIACEAE Lindley.............................................................................................. 5 3.1.1. Thymus vulgaris L. - timijan ................................................................................................... 7 3.1.1.1. Thymi folium list timijana ............................................................................................ 8 3.1.1.2. Hemijski sastav lista timijana........................................................................................... 9 3.1.1.3. Farmakoloko delovanje i upotreba droge Thymi folium ................................................ 10 3.1.1.4. Neeljena dejstva, kontraindikacije i upozorenja ............................................................ 11 3.1.1.5. Trudnoa i laktacija ...................................................................................................... 12 3.1.1.6. Interakcije sa lekovima, dijetetskim suplementima ili hranom ....................................... 12 3.1.1.7. Toksinost, genotoksinost, kancerogenost i mutagenost ............................................... 13 3.1.2. Melissa officinalis L. - matinjak .......................................................................................... 14 3.1.2.1. Melissae folium list matinjaka ................................................................................... 15 3.1.2.2. Hemijski sastav lista matinjaka .................................................................................... 15 3.1.2.3. Farmakoloko delovanje i upotreba droge Melissae folium ............................................ 18 3.1.2.4. Neeljena dejstva, kontraindikacije i upozorenja ............................................................ 20 3.1.2.5. Trudnoa i laktacija ....................................................................................................... 20 3.1.2.6. Interakcije sa lekovima, dijetetskim suplementima i hranom .......................................... 20 3.1.2.7. Toksinost, genotoksinost, kancerogenost, mutagenost................................................. 20 3.1.3. Mentha x piperita L. pitoma nana ...................................................................................... 21 3.1.3.1. Menthae x piperitae folium list pitome nane ................................................................ 23 3.1.3.2. Hemijski sastav lista pitome nane .................................................................................. 23 3.1.3.3. Farmakoloko delovanje i upotreba Menthae x piperitae folium ..................................... 25
3.1.3.4. Neeljena dejstva, kontraindikacije, upozorenja ............................................................. 26 3.1.3.5. Trudnoa i laktacija ....................................................................................................... 27 3.1.3.6. Interakcije sa lekovima, dijetetskim suplementima i hranom .......................................... 27 3.1.3.7. Toksinost, genotoksinost, kancerogenost i mutagenost................................................ 28 4. EKSPERIMENTALNI DEO.......................................................................................................... 29 4.1. MATERIJAL .............................................................................................................................. 29 4.1.1. Biljni materijal ..................................................................................................................... 29 4.1.2. Mikroorganizmi ................................................................................................................... 29 4.1.3. Eksperimentalne ivotinje .................................................................................................... 30 4.2. PRIPREMA UZORAKA ZA ISPITIVANJA .............................................................................. 31 4.2.1. Priprema poredbenih ekstrakata ............................................................................................ 31 4.3. HEMIJSKA ISPITIVANJA ........................................................................................................ 31 4.3.1. Odreivanje sadraja ukupnih fenola .................................................................................... 32 4.3.2. Odreivanje sadraja ukupnih flavonoida ............................................................................. 32 4.3.3. Visokoefikasna tena hromatografska (HPLC-DAD) analiza ................................................ 32 4.4. ISPITIVANJE BIOHEMIJSKIH AKTIVNOSTI ......................................................................... 35 4.4.1. In vitro ispitivanje antioksidantnog delovanja ....................................................................... 35 4.4.1.1. Odreivanje kapaciteta neutralizacije slobodnih radikala (RSC) ..................................... 35 4.4.1.2. Odreivanje lipidne peroksidacije (LP) .......................................................................... 36 4.4.2. Odreivanje inhibitornog uticaja na enzim acetilholinesterazu .............................................. 36 4.4.3. Odreivanje hepatoprotektivnog delovanja ........................................................................... 37 4.5. MIKROBIOLOKA ISPITIVANJA ........................................................................................... 39 4.5.1. Priprema ekstrakata za mikrobioloka ispitivanja .................................................................. 39 4.5.2. Odreivanje koncentracije bakterijskih elija u inokulumu ................................................... 39 4.5.3. Priprema inokuluma za mikrodilucijsku metodu ................................................................... 39 4.5.4. Odreivanje minimalne inhibitorne koncentracije mikrodilucijskom metodom ..................... 40 4.6. ISPITIVANJE FARMAKOLOKOG DELOVANJA ................................................................. 41 4.6.1. Farmakodinamska ispitivanja ............................................................................................... 41 4.6.1.1. Metoda rotirajueg tapa................................................................................................ 41 4.6.1.2. Test suspenzije o repu.................................................................................................... 41
4.6.1.3. Uzdignuti lavirint .......................................................................................................... 42 4.6.1.4. Test prepoznavanja novog objekta ................................................................................. 43 4.7. STATISTIKA OBRADA PODATAKA ................................................................................... 44 5. REZULTATI I DISKUSIJA .......................................................................................................... 45 5.1. HEMIJSKI SASTAV ISPITIVANIH EKSTRAKATA TIMIJANA, MATINJAKA I PITOME NANE ............................................................................................................................................... 45 5.1.1. Koliina suvog ekstrakta ...................................................................................................... 45 5.1.2. Odreivanje sadraja ukupnih fenola i flavonoida u ispitivanim ekstraktima ......................... 47 5.1.3. Rezultati HPLC-DAD analize ispitivanih ekstrakata ............................................................. 49 5.2. REZULTATI ISPITIVANJA BIOHEMIJSKIH AKTIVNOSTI .................................................. 53 5.2.1. In vitro antioksidantno delovanje .......................................................................................... 53 5.2.1.1. Skevinder aktivnost - RSC ........................................................................................ 55 5.2.1.2. Odreivanje lipidne peroksidacije - LP .......................................................................... 61 5.2.2. Hepatoprotektivno delovanje ................................................................................................ 64 5.2.3. Inhibicija acetilholinesteraze ................................................................................................ 70 5.3. REZULTATI MIKROBIOLOKOG ISPITIVANJA ................................................................... 74 5.4. REZULTATI ISPITIVANJA FARMAKOLOKOG DELOVANJA............................................ 77 5.4.1. Uticaj na motornu koordinaciju (metod rotirajueg tapa) ..................................................... 77 5.4.2. Antidepresivno delovanje (test suspenzije o repu) ................................................................. 81 5.4.3. Anksiolitiko delovanje (uzdignuti lavirint) .......................................................................... 83 5.4.4. Uticaj na memoriju (test prepoznavanja novog objekta) ........................................................ 87 6. 7. 8. ZAKLJUAK ............................................................................................................................... 89 LITERATURA .............................................................................................................................. 92 PRILOZI ..................................................................................................................................... 111 8.1. HROMATOGRAMI ISPITIVANIH EKSTRAKATA TIMIJANA ............................................ 111 8.2. HROMATOGRAMI ISPITIVANIH EKSTRAKATA MATINJAKA ...................................... 113 8.3. HROMATOGRAMI ISPITIVANIH EKSTRAKATA PITOME NANE ..................................... 115
Doktorska disertacija
Neda Laki
1. UVOD
Lekovite biljke od davnina privlae ovekovu panju. One su ukorenjene u tradicionalnoj medicini i farmaciji brojnih naroda, polazei od drevnih civilizacija kao to su Kina i Indija, preko antike Grke, pa sve do danas. Nepresuan su izvor inspiracije za brojne naunike irom sveta, a predstavljaju i vaan deo etnomedicine i etnofarmacije srpskog naroda. Prema podacima Svetske zdravstvene organizacije danas se preko 80% stanovnika zemalja u razvoju oslanja na tradicionalan nain leenja i upotrebu biljnih lekova u primarnoj zdravstvenoj zatiti. Meutim, i u razvijenim zemljama raste broj pacijenata koji se u prevenciji i leenju oslanjaju na biljne lekove. Vodea u potronji fitopreparata je Nemaka (3,5 milijarde evra godinje), a slina je situacija i u Francuskoj (Blumenthal, 1999). U Velikoj Britaniji 2000. godine potronja je iznosila 65 miliona funti, da bi se u sledeih pet godina poveala za ak 50% (Heinrich i sar., 2004). U Sjedinjenim Amerikim Dravama 2008. godine potroeno je 4,8 milijardi dolara na razliite dijetetske suplemente i lekove biljnog porekla (Cavaliere i sar., 2009). Uporedo sa porastom potronje biljnih lekova raste i potranja za novim lekovitim sirovinama biljnog porekla. Aromatine biljke porodice usnatica (Lamiaceae), kao to su timijan (Thymus vulgaris), matinjak (Melissa officinalis) i pitoma nana (Mentha x piperita ) imaju dugu tradiciju primene. Danas se velika koliina biljnog materijala dobijenog iz navedenih biljaka iskoristi za proizvodnju droga Thymi folium, Melissae folium i Menthae x piperitae folium koje su oficinalne po vaeoj Evropskoj farmakopeji (Eur. Ph. VI, 2007). Pored toga, iz nabrojanih droga se razliitim destilacionim tehnikama dobijaju etarska ulja Thymi aetheroleum, Melissae aetheroleum i Menthae x piperitae aetheroleum iji sadraj (%) predstavlja uslov za njihov kvalitet. Navedena etarska ulja uvrtena su u sve svetske farmakopeje, a pored farmaceutske industrije koriste se i u kozmetici, parfimeriji, prehrambenoj industriji i aromaterapiji. Za njih su potvrena i brojna farmakoloka dejstva: antimikrobno, antioksidantno, antiinflamatorno, spazmolitiko, sedativno (Marino i sar., 2001; Burt, 2004; Boin i sar., 2006; 2007). Obzirom da se u listovima navedenih aromatinih biljaka nalazi svega 0,02%-4% etarskog ulja, postavljaju se tri pitanja vezana za racionalnu iskoristljivost droga:
Neda Laki
da li delovi biljke koji ne ine drogu (npr. stabljika) mogu da se koriste za izolaciju etarskog ulja i dobijanje ekstrakata, da li dekokt koji zaostaje nakon hidrodestilacije etarskog ulja moe da nae svoju primenu u farmaciji i da li droga podvrgnuta destilaciji moe da poslui kao izvor fenolnih jedinjenja koja predstavljaju nosioce aktivnosti fitopreparata dobijenih alkoholnom ekstrakcijom?
S druge strane, zbog velike osetljivosti i posledinih nedostataka droga dobijenih iz aromatinih biljaka, kao to su gubitak odreenog procenta etarskog ulja zbog loeg uvanja i preterane usitnjenosti, variranje sastava aktivnih principa, pranjavost droge i mogunost kontaminacije mikroorganizmima, prepoznata je korist od ekstrakcije kao naina proizvodnje sasvim drugih tipova fitopreparata (Stahl-Biskup i Venskutonis, 2004). U novije vreme za ekstrakte timijana, matinjaka i pitome nane potvrena su brojna farmakoloka delovanja za koja su pre svega odgovorna fenolna jedinjenja. U razliitim test sistemima potvreno je njihovo snano antiokidantno delovanje koje otvara mogunost primene navedenih ekstrakata ne samo u prevenciji i simptomatskom leenju razliitih bolesti modernog doba povezanih sa oksidativnim stresom, nego i u prehrambenoj industriji za spreavanje kvarenja namirnica i produavanje njihovog roka trajanja (Zandi i Ahmadi, 2000; Herode i sar., 2003; Mencherini i sar., 2009). Za ekstrakte navedenih biljaka, zajedniko je prisustvo rozmarinske kiseline (Petersen i Simmonds, 2003). Rozmarinska kiselina je molekul od velikog interesa za koju je potvreno antioksidantno, antiinflamatorno, antimikrobno, a u odreenim test sistemima i antikancerogeno delovanje (Al-Saimary i sar., 2007; Juhas i sar., 2008; Undegar i sar., 2009). Brojne in vitro studije potvruju delovanje vodenih ekstrakata razliitih predstavnika porodice Lamiaceae na Herpes simplex virus tip I i II, kao i na one sojeve koji su razvili rezistenciju na aciklovir (Nolkemper i sar., 2006). Znaajni rezultati dobijeni su i u in vitro ispitivanjima delovanja navedenih ekstrakata na enzime acetil i butirilholinesterazu povezane sa nastankom i razvojem Alchajmerove bolesti (Akhondzadeh i sar., 2003; Akhondzadeh i Abbasi, 2006; Dastmalchi i sar., 2009). Razliiti in vivo testovi pokazali su da ekstrakti timijana, matinjaka i pitome nane ispoljavaju hepatoprotektivni i neuroprotektivni efekat (Pereira i sar., 2005; Lopez i sar., 2009). Ipak, kao to je ve reeno, najvei deo biljne mase navedenih biljaka koristi se za proizvodnju etarskog ulja. Razlog tome je i visoka cena koju relativno mala koliina etarskog ulja ima na
2
Neda Laki
tritu. Za proizvodnju ove koliine etarskog ulja potrebno je skoro pola tone biljnog materijala od kojeg najvei deo ostane zapravo neiskorien. Isto tako, danas postoji trend ispitivanja otpadnog materijala koji zaostaje prilikom proizvodnje razliitih biljnih preraevina. Tako se ispituje komina koja zaostaje nakon proizvodnje vina (Spigno i De Faveri, 2007; Sagdic i sar., 2011), komina koja zaostaje nakon proizvodnje maslinovog ulja (Cioffi i sar., 2010), komina cvekle, paradajza, nara (Viuda-Marlos i sar., 2011; Vuli i sar., 2012; etkovi i sar., 2012) u smislu koliine aktivnih principa koji zaostaju i u smislu njihovog potencijalnog biolokog delovanja, najee antioksidantnog, antimikrobnog i antikancerogenog. Isto tako razliita ispitivanja se bave i postdestilacionim ostatkom aromatinog bilja (Dorman i sar., 2003; Peev i sar., 2011) u smislu njegove bioloke aktivnosti i upotrebe kao potencijalnog izvora farmakoloki aktivnih jedinjenja, pre svega fenolne prirode, ali i u smislu njegove primene u agronomiji za stimulisanje rasta i obogaenje sadraja lekovitog bilja kroz uticaj na biosintezu razliitih sekundarnih biomolekula, pre svega monoterpena (Zheljazkov i Astatkie, 2011; 2012). Zbog svega navedenog, iznalaenje naina da i postdestilacioni ostatak aromatinih biljaka, kao i drugi nepropisani delovi biljke (npr. stabljika, list zaostao nakon izolacije etaskog ulja) nau svoju primenu u farmaceutskoj industriji u mnogome bi doprinelo iskoristljivosti biljnog materijala, proizvedenog ili sakupljenog u slobodnoj prirodi, to je vano ne samo sa
ekonomskog, ve i sa ekolokog stanovita.
1.1 HIPOTEZE REZULTATA ISTRAIVANJA
Postdestilacioni ostatak i drugi delovi biljke koji se uobiajeno ne koriste ispoljavaju farmakoloka delovanja (antioksidantno, antimikrobno, antiholinesterazno i dr.) koja su uporediva sa delovanjem komercijalnih ekstrakata timijana, matinjaka i nane pripremljenih po propisu vaeih farmakopeja i monografija.
Postdestilacioni ostatak i drugi delovi biljke koji se uobiajeno ne koriste se mogu primenjivati za izolaciju farmakoloki aktivnih jedinjenja (rozmarinske i hlorogenske kiseline, kao i pojedinih flavonoida) i proizvodnju razliitih dijetetskih suplemenata i fitopreparata.
Neda Laki
2. CILJ ISTRAIVANJA
Za ciljeve doktorske disertacije postavljena su: 1. Preliminarna hemijska ispitivanja ekstrakata timijana, matinjaka i pitome nane, pripremljenih oficinalnim postupkom, uparavanjem dekokta koji zaostaje nakon izolacije etarskog ulja, tretiranjem dearomatizovanog lista i samlevene stabljike: odreivanje sadraja ukupnih fenola i flavonoida visokoefikasna hromatografska analiza za kvantifikaciju pojedinih fenolnih jedinjenja 2. Ispitivanje biohemijskih aktivnosti: in vitro ispitivanje antioksidantne aktivnosti na DPPH i OH radikal, kao i uticaja na lipidnu peroksidaciju, in vivo odreivanje hepatoprotektivnog delovanja (merenje nivoa aktivnosti odreenih enzima i komponenata primarne anioksidantne zatite u homogenatu jetre eksperimentalnih ivotinja kao markera jetrene funkcije) odreivanje inhibicije enzima acetilholinesteraze in vitro 3. Mikrobioloka ispitivanja: in vitro odreivanje antimikrobnog delovanja ispitivanih ekstrakata na
Staphylococcus aureus, Salmonella liverpool, Escherichia coli, Bacillus cereus i Campylobacter jejuni 4. Farmakoloka ispitivanja: farmakodinamska ispitivanja uticaja ispitivanih ekstrakata na motornu koordinaciju (metod rotirajueg tapa), njihovo antidepresivno (test suspenzije o repu) i anksiolitiko delovanje (uzdignuti lavirint), uticaj na memoriju eksperimentalnih ivotinja (test prepoznavanja novog objekta), kao i potencijalne interakcije sa odreenim grupama lekova.
Neda Laki
3. OPTI DEO
3.1. PORODICA LAMIACEAE Lindley
Porodica Lamiaceae sa priblino 200 rodova i oko 3200 vrsta rasprostranjena je na gotovo celoj zemaljskoj kugli, izuzimajui arktike predele. Veina vrsta je poreklom iz Mediteranskog regiona i raste u predelima sa dosta toplote, tako da mnoge pokazuju manje ili vie kseromorfnu grau. Veina predstavnika familije usnatica ima etvorobrido stablo sa naspramnim, dekusiranim ili vrlo retko naizmenino rasporeenim listovima, najee pokrivenim mehanikim i lezdanim dlakama, bez zalistaka. Cvetovi su veinom dvopolni i uglavnom zigomorfne simetrije, najee sloeni u zbijene naspramne dihazijume, koji grade prividne prljenove u pazuhu listova stabla i brakteja. Zvonasta ili cevasta aica je obino sa 5 (ree 4) zubaca, dok je kod nekih predstavnika dvousnata. Krunica je izgraena iz 5 sraslih listia, krunina cev je razvijena, otvor krunice je kod veine predstavnika dvousnat. Gornja usna krunice je dvorenjevita, a donja trorenjevita. Ree je razvijena samo jedna usna. Ponekad je krunica i aktinomorfna. Andreceum je izgraen od 4 pranika, sloenih u dva para razliite duine. Tuak je sa ginobazinim stubiem, nadcvetan, dvokarpelan, lanom pregradom podeljen na 4 okca u kojima se nalazi po jedan anatropan semeni zametak. Plod je merikarpijum, sastavljen iz 4 oraice (Dikli, 1974). Infrafamilijarnom podelom prema Taktadjanu (1997) jasno su definisane dve grupe u porodici Lamiaceae. U prvu grupu spadaju predstavnici podporodice Nepetoideae. To su veinom aromatine biljke koje, prema hemijskom sastavu, karakterie odsustvo iridoidnih glikozida, prisustvo rozmarinske kiseline (tzv. tanin usnatica) i uglavnom vee koliine etarskog ulja. Podporodica Nepetoideae podeljena je u vei broj tribusa sa razliitim brojem rodova. Tribus Mentheae obuhvata rodove Acinos, Mentha, Lycopus, Hyssopus, Origanum, Thymus, Melissa, Satureja i druge, tribus Salvieae rodove Salvia i Rosmarinus, dok su tribusi Lavanduleae i Catoferieae monotipski. Rodovi Nepeta, Glechoma, Dracocephalum, Monarda i drugi ine tribus Nepeteae, a Ocimum, Hyptis i Orthosiphon tribus Ocimeae. U drugu grupu je svrstano est podporodica (Caryopteridoideae, Ajugoideae, Chloanthoideae, Wenchengioideae, Scutellarioideae i
Neda Laki
Lamioideae), koje, prema hemijskom sastavu, karakterie odsustvo rozmarinske kiseline, prisustvo iridoidnih glikozida i male koliine etarskog ulja. Sekretorne strukture usnatica predstavljene su specijalizovanim grupama elija na povrini biljnog tela koje se javljaju u obliku vieelijskih kapitatnih i peltatnih lezdanih dlaka na reproduktivnim i vegetativnim biljnim organima. Sekrecija lezdanih dlaka odvija se po ekstracelularnom, egzogenom tipu. Kod peltatnih dlaka etarsko ulje se lui u subkutikularni prostor, a kod kapitatnih direktno u spoljanju sredinu. Samo kod manjeg broja vrsta (Salvia officinalis, Rosmarinus officinalis) i kod kapitatnih dlaka dolazi do formiranja subkutikularnog prostora, nedovoljnog za skladitenje itave koliine etarskog ulja, tako da se deo akumulira u subkutikularnom prostoru, a deo isparava van biljke. Tip, distribucija i gustina lezdanih dlaka predstavljaju znaajan taksonomski karakter kada je ova porodica u pitanju, s obzirom da postoji mogunost variranja kako u okviru istog roda, tako i u okviru razliitih populacija iste vrste (Lakui, 1995). Lekovita svojstva veine aromatinih rodova podporodice Nepetoideae poznata su od davnina, o emu govore i njihova imena koja su iz grke ili rimske mitologije. Primena razliitih vrsta ove podporodice je i u savremenoj fitoterapiji veoma rasprostranjena i raznovrsna. Koriste se u leenju razliitih oboljenja gastro-intestinalnog trakta, respiratornih organa, psihovegetativnih oboljenja srca, migrene, neurednog menstrualnog ciklusa i dr. Mnoge od ovih biljaka su oficinalne droge brojnih farmakopeja, ulaze u sastav brojnih komercijalnih fitopreparata, a predstavljaju i polazne sirovine za dobijanje etarskih ulja koja se koriste u kozmetikoj i prehrambenoj industriji, kao i za dobijanje razliitih farmakoloki aktivnih jedinjenja znaajnih za farmaceutsku industriju (Bisset i Wichtl, 2001). Zbog veoma iroke primene aromatinih biljaka podporodice Nepetoideae, naroito najkomercijalnijih vrsta, kao to su timijan, matinjak i pitoma nana, one se i plantano gaje, radi dobijanja droge i izolacije etarskog ulja.
Neda Laki
3.1.1. Thymus vulgaris L. - timijan

Vrsta Thymus vulgaris (sl. 3.1.), u narodu poznat kao timijan ima dugu tradiciju upotrebe kao zain i biljni lek. Smatra se da mu ime potie od grke rei thymos to znai snaga, hrabrost, odvanost, a prvi zapis o timijanu je naen u Dioskoridovim delima (I vek nove ere) i Plinijevoj knjizi Istorija prirode (I vek nove ere) (Stahl-Biskup i Venskutonis, 2004). Snana antiseptika i konzervirajua svojstva timijana bila su poznata jo u starom Egiptu gde su ga koristili u procesu balzamovanja mrtvih (thym). Prema hrianskim predanjima timijan je bio jedna od biljaka koje su ispunjavale Isusove jasle (Boin, 2004). Iako je timijan oduvek korien kao zain u Mediteranskom podruju, u Evropi je postao iroko rasprostranjen i poznat tek u ranom srednjem veku, kada su ga Benediktinski monasi preneli preko Alpa u Centralnu Evropu i Englesku. Dame iz srednjovekovne Evrope poklanjale su granice timijana svojim vitezovima, jer se verovalo da se poveava hrabrost i odvanost onome ko ih nosi (Lavabre, 2004). Ova vrsta pripada tipskoj sekciji Thymus (tab. 3.1.) (Jalas, 1971). To je polubunasta, viegodinja, zeljasta biljka koja najvie naraste 30 do 40 cm. Na biljci se javlja vie tipova izdanaka. Mlade granice su etvorobride, kratke, gusto i ravnomerno obrasle beliastim dlaicama, a starije su oble, gole i drvenaste. Listovi su sedei ili na kratkoj drci, naspramno rasporeeni, dugi 5-10 mm, 2-3 mm iroki, u celini duguljasti, skoro igliasti, kruti, koasti, sivo-zelene boje, od gore skoro goli, a na naliju obrasli finim, mekim, sivim dlaicama i posuti mrkim kvricama, celog oboda, blago povijeni prema naliju. Cveta od maja do avgusta. Cvast izgledom podsea na klas, a u osnovi su mali dihazijumi grupisani prljenasto, koji s obzirom na blizinu internodusa podseaju na klas, smetena na vrhu izdanka. Cvast je izduena i ima oko 5 belih do bledo ruiastih, 3-6 mm dugakih cvetia na kratkim drkama. aica je cevasta, trbuasto proirena, sa trouglastim zupcima, zelena ili svetlo ruiasta, a krunica je roze do ljubiasta i dvousnata: gornja usna ima dva igliasta, a donja tri tupa zuba. Svi delovi cveta prekriveni su mehanikim dlakama i lezdama. Cela biljka je prijatnog mirisa na timol (thymolum) (Bisset i Wichtl, 2001; Jani, 2004).
7 Slika 3.1. Thymus vulgaris (foto orig.)
Neda Laki
Tabela 3.1. Sistematski poloaj vrste Thymus vulgaris L. (Takhtajan, 2009) RAZDEO (Divisio): KLASA (Classis): PODKLASA (Subclassis) NADRED (Superordo) RED (Ordo): PORODICA (Familia): PODPORODICA (Subfamilia): TRIBUS (Tribus): ROD (Genus): PODROD (Subgenus): SEKCIJA (Sectio): VRSTA (Species): Magnoliophyta Magnoliopsida Lamiidae Takhtajan ex Reveal Lamianae Takhtajan Lamiales Bromhead Lamiaceae Lindley Nepetoideae Takhtahaj Mentheae Takhtahaj Thymus L. Thymus Thymus (syn. Vulgares Velen.; Zygis Willik.) Thymus vulgaris L.
Timijan je mediteranska vrsta poreklom iz zapadnog Sredozemlja (panija, Maroko, Francuska) gde se javlja samoniklo. Izvan ovog podruja plantano se gaji u Evropi, Aziji, Africi, Severnoj Americi kao dekorativna biljka, ali i za dobijanje droge. Uspeva na suvom, siromanom tlu sa dosta svetla. etva se vri kada su biljke najaromatinije, na poetku i tokom perioda cvetanja, odsecanjem nadzemnih delova na visini 10-15 cm od zemlje. Koliko puta e se vriti etva tokom vegetacionog perioda, i u kom mesecu, zavisi od geografske zone i klimatskih uslova mesta gajenja, a zasad se moe eksploatisati nekoliko godina. Nakon etve biljke se preiste i sue. Listovi se odvajaju od stabljika i sortiraju prosejavanjem (Gorunovi i Luki, 2004; Kovaevi, 2004; Stahl-Biskup i Venskutonis, 2004).
3.1.1.1. Thymi folium list timijana List timijana je sitan, duine do 1 cm. Ima vrlo kratku peteljku ili je sedei. Koast je, celog oboda, a suenjem se povija ka naliju, tako da list dobija igliast oblik. Zelene je boje na licu i
Neda Laki
svetlije na naliju. List je maljav na naliju oko glavnog nerva. Ukusa je svojstvenog, nagorkog i pomalo ljutog, a mirisa specifinog, aromatinog, otrog, na timol (Kovaevi, 2004). Droga je opisana u brojnim svetskim farmakopejama i monografijama, a neke od njih su: Britanska herbalna farmakopeja (BHP, 1996), Britanska farmakopeja (BP, 2002), monografija Nemake komisije E (Blumenthal i sar., 1999) i Evropskog udruenja za fitoterapiju (ESCOP, 2003), Martindale: The Complete Drug Reference (Book), 33. izdanje (Sweetman, 2002), Evropska farmakopeja (Ph. Eur., 2007) i dr. Kao drogu veina farmakopeja propisuje osueni list timijana (Thymi folium) to je i po Ph. Jug. IV (1984) oficinalna droga. List timijana je sastojak oficinalnog prsnog aja (Species pectorales) (Formulae magistrales et reagentia, 1979), a koristi se i za izradu tinkture (Tinctura Thymi), sirupa od timijana sa natrijum-bromidom (Sirupus Thymi bromatus ili Sirupus Thymi compositus), etarskog ulja (Thymi aetheroleum) i za dobijanje timola (Thymolum) (Pharmacopoea Jugoslavica IV, 1984). Po Ph. Jug. V (2000) i WHO monografiji (1999) oficinalna je herba timijana (Thymi herba).
3.1.1.2. Hemijski sastav lista timijana Hemijski sastav timijana ine dve glavne klase sekundarnih biomolekula, terpenoidi prisutni u etarskom ulju i fenoli, od koji su najzastupljeniji flavonoidi i fenolkarbonske kiseline. Iz grupe fenolkarbonskih kiselina utvreno je prisustvo rozmarinske, kafene i litospermine kiseline (Wang i sar., 2004; Fecka i sar., 2007; Lee i sar., 2010). Od flavonoida najzastupljeniji su oni iz grupe flavona: apigenin i luteolin, njihovi derivati (metilflavoni), kao i glikozidi (apigenin-7-o--D-glukozid, hesperidin, luteolin-7-o--D-glukozid) (Kosar i sar., 2005); flavanoni: eriodiktiol i naringenin (Fecka i sar., 2008); flavanonoli: taksifolin (Depkevicius i sar., 2002); flavonoli: kemferol, kvercetin, kao i njihovi glikozidi od kojih je najznaajniji rutin (Miura i sar., 2002) (sl. 3.2.). U listu timijana identifikovani su i razliiti molekuli bifenolne prirode kojima se pripisuju deodoriua i antioksidantna svojstva (Okazaki i sar., 2002). Pored navedenih fenolnih jedinjenja kojima list timijana obiluje u njemu su pronaeni i glikozidi acetofenona (Wang i sar., 1999), kiseli polisaharidi (Chun i sar., 2001), a navodi se i prisustvo tanina, smole i saponina (Barnes, 2005). Janishak i sar. (2006) su u listu identifikovali i kvantifikovali oleanolnu i ursolnu kiselinu u okviru triterpenske frakcije.
9
Neda Laki
Slika 3.2. Hemijske strukture dominantnih flavonoida u ispitivanim ekstraktima lista timijana, matinjaka i pitome nane (Glu-glukoza; Rha-ramnoza) Etarsko ulje timijana (Thymi aetheroleum) je lako pokretljiva uto-crvenkasta tenost, ljutog ukusa i specifinog aromatinog mirisa. U suvom biljnom materijalu se nalazi 0,8-2,6% to je propisani standard, a ne bi trebalo da je ispod 1,2% (BP, 2002). Aromatini monoterpeni su glavne komponente i ine 20-80% ukupnog etarskog ulja. Najee i u najveem procentu zastupljene komponente su alkoholi, timol (25-50%) i karvakrol (3-10%) (Ph. Eur. VI, 2007). Pored toga, u listu su identifikovani i razliiti monoterpenski glikozidi (Tagashira i sar., 1998) i derivati hidroksijasmona (Kitajima i sar., 2004).
3.1.1.3. Farmakoloko delovanje i upotreba droge Thymi folium irom sveta timijan je visoko cenjen. Tradicionalno se koristi u leenju dispepsije, hroninog gastritisa, astme, dijareje i enureze kod dece, laringitisa, tonzilitisa (za grgljanje) i posebno za pertusis i bronhitis. U narodu, timijan ima reputaciju da utie na menstrualni ciklus i stoga ene ne bi trebalo da koriste velike koliine oralno. Timijan se koristi i kao zain u kulinarstvu. Dokumentovane farmakoloke aktivnosti podravaju neke od tradicionalnih upotreba, koje se
10
Neda Laki
prvenstveno pripisuju etarskom ulju i fenolnim sastojcima prisutnim u razliitim lekovitim pripravcima, pre svega ekstraktima lista timijana (Barnes, 2005). Tako je timijan od obine tradicionalne biljke prerastao u drogu koja se iroko koristi u savremenoj fitoterapiji. Nemaka komisija E je odobrila internu upotrebu timijana za leenje simptoma bronhitisa, velikog kalja i katara gornjih disajnih puteva (Blumenthal i sar., 1999). Brojnim istraivanjima dokazan je antibakterijski efekat ekstrakata timijana (Al-Saimary, 2007), sinergistiko baktericidno delovanje ekstrakta i etarskog ulja timijana (Al-Bayati i sar., 2008), sinergizam sa anisom (Pimpinella anisum L., Apiaceae), kao i antiparazitarno (Haghighi i sar., 2008) i antifungalno delovanje (Sasanelli i sar., 2009). Pored toga, utvreno je da vodenoalkoholni ekstrakt ispoljava znaajno antinociceptivno delovanje (Taherian i sar., 2009), kao i da poboljava mukocilijarni klirens, izaziva relaksaciju bronhija, uterusa i gastrointestinalnog trakta putem efekta na 2 adrenergike receptore (Babaei i sar., 2008). Efekat na relaksaciju bronhija sirupa timijana dokazan je i klinikim ispitivanjima (Mills i Bone, 2000). Vodeni ekstrakt timijana deluje hepatoprotektivno, podstie antioksidantnu sposobnost jetre, zbog ega deluje detoksikacijski kod zloupotrebe alkohola (Shati i Elsaid, 2009). Ekstrakt timijana deluje i antiinflamatorno, pre svega zahvaljujui prisustvu fenolkarbonskih kiselina, od kojih je za rozmarinsku kiselinu utvreno da inhibie aktivaciju komplementa (Sahu i sar., 1999). U ne-medicinskom kontekstu antioksidantna aktivnost je odgovorna za konzerviui efekat, posebno u prevenciji oksidacije lipida u hrani (Miura i sar., 2002). Koristei razliite test sisteme pokazano je da ekstrakt timijana ispoljava izuzetan antioksidantni potencijal (Wang i sar., 1998). Smatra se da su fenolna jedinjenja timijana, zahvaljujui svojoj elektron-donorskoj aktivnosti, glavni nosioci ovog dejstva (Dapkevicius i sar., 2002). Pored toga, potvreno je da ekstrakt timijana deluje i kao analgetik i antipruritiko sredstvo kod mieva (Barnes, 2005). 3.1.1.4. Neeljena dejstva, kontraindikacije i upozorenja Neeljena dejstva dokumentovana za timijan su munina, povraanje, stomani bol, glavobolja, vrtoglavica, konvulzije, srani i respiratorni zastoj (Duke, 1985). Timol je prisutan u nekim pastama za zube, a za njih je prijavljeno da izazivaju heilitis i glositis. Ispitani su i sluajevi kontaktnog dermatitisa izazvanog prainom timijana kod farmera koji rukuju suvom herbom (Spiewak, 2001).
11
Neda Laki
Kontraindikovana je upotreba droge i preparata dobijenih iz nje u sluaju preosetljivosti na neki od aktivnih supstanci koje se nalaze u timijanu ili drugim vrstama porodice Lamiaceae (EMEA, 2007). Pacijenti osetljivi na polen breze i celer mogu imati unakrsnu preosetljivost na timijan (WHO, 1999). Teni ekstrakt droge (1:2-2,5) i onaj dobijen iz svee biljke nisu preporuljivi da se koriste kod dece ispod 4 godine bez prethodnog savetovanja sa medicinskim strunjakom ili farmaceutom. Generalno, upotreba suve droge i preparata timijana nisu preporuljivi za primenu kod dece ispod 4 godine zbog nedostatka podataka o njihovoj bezbednosti i efikasnosti za ovaj uzrast (EMEA, 2007). Etarsko ulje timijana je toksino i mora se koristiti sa oprezom. Moe da se uzima oralno, ali u strogo propisanim dozama, a eksterno se primenjuje samo ako je razblaeno u odgovarajuem neutralnom nosau (Barnes, 2005). Iako postoje zabeleeni neeljeni efekti prilikom primene razliitih preparata na bazi timijana, oni se javljaju retko, tako da je timijan kategorisan kao generalno bezbedan - Generally Recognised As Safe (GRAS) (FDA, 2010). 3.1.1.5. Trudnoa i laktacija Ne postoje poznati problemi povezani sa korienjem timijana tokom trudnoe i dojenja, pod uslovom da doza ne prelazi iznos koji se koristi u hrani. Meutim, poto bezbednost upotrebe tokom trudnoe i laktacije nije utvrena, u odsustvu podataka, upotreba u terapeutske svrhe nije preporuljiva (EMEA, 2007).
3.1.1.6. Interakcije sa lekovima, dijetetskim suplementima ili hranom Do danas nisu zabeleene bilo kakve interakcije vrste Thymus vulgaris L. sa lekovima, dijetetskim suplementima ili hranom (EMEA, 2007). Meutim, postoje zabeleene interakcije nekih klasa flavonoida prisutnih u preparatima na bazi lista timijana. Farmakokinetika flavonoida je takva da oni imaju ogranienu apsorpciju i brzu eliminaciju, preteno zasnovanu na reakcijama konjugacije. U mnogo manjoj meri flavonoidi se metaboliu preko citohrom P450 izoenzima, tako da je smanjena mogunost interakcije sa brojnim lekovima. Ipak, prilikom unoenja vrlo visokih doza flavonoida moe doi do poveanja bioraspoloivosti odreenih grupa lekova, kao to su statini, benzodiazepini, ciklosporin i digoksin. Ova mogunost je pre
12
Neda Laki
svega vezana za suplemente na bazi istih flavonoida i ne moe se podrazumevati i za biljne lekove prirodno bogate flavonoidima (Cermak i Wolffram, 2005; Williamson i sar., 2009).
3.1.1.7. Toksinost, genotoksinost, kancerogenost i mutagenost Postoji malo podataka koji se tiu toksinih efekata timijana kod sisara. U akutnom testu toksinosti koncentrovan ekstrakt timijana je smanjio lokomotornu aktivnost i uzrokovao blago usporavanje respiracije kod mieva pri administraciji 0,5 do 3,0 g ekstrakta/kg telesne teine to odgovara 4,3 do 26,0 g suvog biljnog materijala. Subhronina toksinost je uoena kod mieva kojima je tokom tri meseca oralno aplikovan koncentrovani etanolni ekstrakt koji je izazvao poveanje teine jetre i testisa, kao i poveanu smrtnost mujaka za 30% i enki za 10% (WHO, 1999). Ne postoje podaci o kancerogenosti timijana, ve postoje podaci da neki od glavnih sastojaka ekstrakata timijana, kao to su kvercetin, apigenin i luteolin deluju kao snani antimutageni i antikancerogeni (Lin i sar., 2008; Seelinger i sar., 2008).
13
Neda Laki
3.1.2. Melissa officinalis L. - matinjak

Matinjak, kako je u narodu poznata vrsta Melissa officinalis ima veoma dugu tradiciju upotrebe. Stari Arapi su je koristili za leenje razliitih sranih poremeaja, ali i za "jaanje duha". Dioskorid je preporuivao stavljanje biljke na mesta ujeda korpija i pasa. U mnogim civilizacijama proglaena je za svetu biljku i nazivana "eliksirom ivota" (Wheelwright, 1997). Matinjak (sl. 3.3., tab. 3.2.) je viegodinja zeljasta biljka sa kratkim rizomom i kratkim podzemnim stolonima prekrivenim mesnatim donjim listovima. Slika 3.3. Melissa officinalis
Uspravna stabljika je visoka 30-80 (120) cm, pokrivena dlakama, a u gornjem delu i brojnim lezdama. Listovi su na lisnim drkama, sa jajastom do skoro rombinom, srcolikom liskom. Liska je du oboda grubo testerasto nazubljena i ima lezdane dlake na naliju. U pazuhu vrnih listova su cvetovi sakupljeni po 6 do 10 u skraene dihazijume. Priperci su dui od cvetova, po obliku slini listovima stabla. aica je cevasto zvonasta, dvousnata. Gornja usna aice je savijena navie, iroka, sa 3 mala zupca. Donja usna aice je dua, sa 2 lancetasta zupca.
Tabela 3.2. Sistematski poloaj vrste Melissa officinalis L. (Takhtajan, 2009) RAZDEO (Divisio): KLASA (Classis): PODKLASA (Subclassis) NADRED (Superordo) RED (Ordo): PORODICA (Familia): PODPORODICA (Subfamilia): TRIBUS (Tribus): ROD (Genus): VRSTA (Species): Magnoliophyta Magnoliopsida Lamiidae Takhtajan ex Reveal Lamianae Takhtajan Lamiales Bromhead Lamiaceae Lindley Nepetoideae Takhtahaj Mentheae Takhtahaj Melissa L. Melissa officinalis L.
14
Neda Laki
Krunica je dvousnata, plaviastobela, bledoljubiasta ili ukastobela, duplo dua od aice. Oraice su izdueno jajaste, kestenjaste do mrke boje. Cveta od juna do avgusta. Raste u zoni listopadnih uma i ibljaka, u meama, na zidinama, u vinogorju, oko sela i pored ograda. U Srbiji i Crnoj Gori je rasprostranjena sporadino (Dikli, 1974). Danas se gaji po batama, oko konica (medonosna biljka) ili se plantano gaji radi sakupljanja lista matinjaka i/ili izolacije etarskog ulja (Kovaevi, 2002).
3.1.2.1. Melissae folium list matinjaka List matinjaka sakuplja se neposredno pred cvetanje gajenih ili samoniklih biljaka i sui paljivo na promajnom mestu ili u blago zagrejanim suarama (35-40C). List je tanak, krt kada je suv, srcolik pri osnovi i zailjenog vrha, testerasto nazubljenog oboda, mreaste nervature. Tamnozelene je boje, slatkog, a potom naljutog ukusa i veoma specifinog mirisa na limun (Kovaevi, 2002). Droga je opisana u veini svetskih i evropskih farmakopeja kao to su: Evropska farmakopeja (Ph. Eur. VI, 2007), Britanska herbalna farmakopeja (BHP, 1996), Britanska farmakopeja (BP, 2002), monografija Nemake komisije E (Blumenthal, 1999) i Evropskog udruenja za fitoterapiju (ESCOP, 2003). Osueni list matinjaka (Melissae folium) oficinalna je droga i kod nas (Ph. Jug. V, 2000), koristi se kao sastojak nekih ajeva (Species sedativae) kao i za pripremu tinktura (1:5, ekstrakcija 45% etanolom V/V ili m/m), tenih (1:1, ekstrakcija sa 45% etanolom V/V ili m/m) i suvih ekstrakata (EMEA, 2007).
3.1.2.2. Hemijski sastav lista matinjaka Hemijski sastav lista matinjaka je veoma raznovrstan i varira u zavisnosti od starosti biljke, tj. vremena sakupljanja, geografskog podruja, uslova gajenja i proizvodnje. Od bioloki znaajnih, primarnih molekula prouen je vitaminski sadraj, gde je utvreno da su u listu matinjaka prisutni tokoferoli, -karoten, likopen i askorbinska kiselina. Takoe, identifikovano je preko 22 masne kiseline od kojih je najzastupljenija -linolenska, sa povoljnim odnosom nezasienih i zasienih masnih kiselina, kao i povoljnim odnosom n-6/n-3 nezasienih masnih kiselina (Iordache i sar., 2009; Dias i sar., 2012).
15
Neda Laki
List matinjaka sadri veliku koliinu fenolnih jedinjenja kao to su pre svega flavonoidi, fenolkarbonske kiseline, njihovi derivati, tanini i druge grupe bioloki aktivnih jedinjenja. U okviru flavonoidne frakcije identifikovani su: katehin, epikatehin, hesperetin, hesperidin, naringin, naringenin, eriodiktiol, derivati apigenina i luteolina, kvercetin, ramnocitrin, rutin, cinarozid, kozmozid. Ipak, najinteresantnije je prisustvo brojnih fenolnih kiselina u listu matinjaka: galne, protokatehinske, siringinske, kafene, p-kumarinske, ferulne, kao i njihovih depsida cinhorine, hlorogenske i rozmarinske kiseline (Schultze i sar., 1995; Lin i sar., 2012) (sl. 3.4., sl. 3.5).
Slika 3.4. Fenolkarbonske i hidroksicimetne kiseline identifikovane u ispitivanim ekstraktima timijana, matinjaka i pitome nane
16
Neda Laki
Procenat rozmarinske kiseline, znaajne sa aspekta farmakolokog delovanja droge Melissae folium, varira u suvom listu od 0,5-6,8 (Peev i sar., 2011). Pored rozmarinske kiseline, u listu matinjaka prisutni si i drugi derivati hidroksicimetne kiseline, pre svega njeni mono i diestri sa hinom kiselinom: 3-kafeoilhina, 4-kafeoilhina, 5kafeolihina, 3,4-dikafeoilhina, kafena i u najveoj koliini 4,5-dikafeoil hina, koje se jednim imenom nazivaju hlorogenske kiseline (Marques i Farah, 2009). Hlorogenske kiseline su prirodni antioksidansi koje biljke produkuju kao odgovor na napad patogenih mikroorganizama, mehanika oteenja ili preveliku izloenost UV ili vidljivom zraenju (Farah i Danangelo, 2006).
Slika 3.5. Depsidi fenolkarbonskih kiselina identifikovani u ispitivanim ekstraktima timijana, matinjaka i pitome nane
17
Neda Laki
Biljka sadri 0,02-0,3% etarskog ulja, tako da pored fenolnih jedinjenja list matinjaka obiluje i jedinjenjima terpenske prirode. U sveem listu prisutna je vea koliina etarskog ulja, ali tokom suenja ulje delimino ispari ili se usmoli. U etarskom ulju identifikovano je preko 70 komponenti, pre svega monoterpenske prirode, od kojih su dominantni monociklini monoterpenski aldehidi (geranial i neral). Ukupna koliina ovih aldehida je promenljiva, ali je stalan njihov meusobni odnos u ulju (4:3) i predstavlja identifikacioni karakter za otkrivanje falsifikata (npr. Cymbopogonis aetheroleum). Etarsko ulje matinjaka, pogotovo ono dobijeno iz biljaka koje su odgajane po standardima organske proizvodnje, ima veoma visoku cenu koja se moe kretati i do 10000 evra po jednoj litri (Cavaliere i sar., 2009). U listu matinjaka nalaze se i monoterpenski i drugi glikozidi sa isparljivim aglikonom, kao to je npr. eugenol glikozid (Bisset i Wichtl, 2001), kao i triterpenske kiseline: oleanolna, ursolna i karnozoinska i do sada neimenovani triterpeni sa sumporom (Herode i sar., 2003; Mencerini i sar., 2007; Mencerini i sar., 2009).
3.1.2.3. Farmakoloko delovanje i upotreba droge Melissae folium U tradicionalnoj medicini razliiti lekoviti pripravci Melissae folium preporuuju se kod prehlada (kao dijaforetik, umirujui i lek koji jaa organizam) i kod funkcionalnih cirkulatornih poremeaja (lupanje srca, migrena, histerija i melanholija) (Bisset i Wichtl, 2001). List matinjaka (Melissae folium) je oficinalna droga kod nas i koristi se kao sedativ kod neuroza eludano-crevnog sistema i psihovegetativnih oboljenja srca, kao karminativ, aromatik i digestiv, ali i kao emenagog i holeretik (Ph. Jug. V, 2000). Razliita bioloka delovanja i potencijalna primena lista matinjaka predmet su brojnih istraivanja. Svi navedeni fenolni i terpenski sastojci deluju kao snani antioksidansi preko razliitih mehanizama, pre svega neutraliui slobodne radikale i inhibiui proces lipidne peroksidacije (Mencherini i sar., 2007; Dastamalhi i sar., 2008; Ciriano i sar., 2010; Fadel i sar., 2011; Dias i sar., 2012; Lin i sar., 2012). Interesantan je i podatak da rozmarinska kiselina i ekstrakti koji je sadre tite kou od oksidativnog stresa uzrokovanog UVA zraenjem, te mogu nai svoju primenu i u razliitim fotoprotektivnim dermatokozmetikim preparatima (Psotova i sar., 2006). Potvreno je i da derivati rozmarinske kiseline spreavaju depigmentaciju koe (Ding i sar., 2010).
18
Neda Laki
Pored toga, droga Melissae folium ispoljava i znaajno antimikrobno delovanje kroz inhibitorni uticaj na rast i razmnoavanje gram negativnih i gram pozitivnih bakterija, kao i na neke sojeve gljivica, znaajnih s aspekta bezbednosti hrane, ali i sa klinikog aspekta (Bisset i Wichtl, 2001; Berastegi i sar., 2011; Lara i sar., 2011). Takoe, zabeleeno je i virustatsko delovanje lista matinjaka i to pre svega na virus Herpes simplex tip 1 i 2. Smatra se da ovaj efekat proizilazi iz interakcije fenola, pre svega rozmarinske kiseline, virusa i proteina elijskih membrana gde se fenolne komponente vezuju za virusne receptore i na taj nain spreavaju adsorpciju i ulazak virusa u elije (Nolkemper i sar., 2006; Mazzanti i sar., 2008). U novije vreme, u listu matinjaka identifikovano je i prisustvo cinhorine kiseline koja deluje kao imunostimulator kroz promociju fagocitoze, aktivaciju T-limfocita, poveanje produkcije interferona i imunoglobulina, to mogue doprinosi virustatskom delovanju ove droge (Lee, 2010). Znaajno antiinflamatorno delovanje posledica je nespecifine inaktivacije komplementa i inhibicije lipookigenaza i ciklooksigenaza, to za posledicu ima inhibiciju sinteze medijatora zapaljenja, leukotrijena (Sahu i sar., 1999). Inhibicija cikolokigenaza, posebno inducibilne izoforme COX-2, ija ekspresija i aktivnost moe biti stimulisana od strane razliitih karcinogena, faktora rasta, inflamatornih citokina i promotora tumora znaajna je u smislu antiinflamatornog delovanja, ali i prevencije karcinoma (Lin i sar., 2012). Komponente lista matinjaka deluju na centralni nervni sistem na brojne naine. Poznati umirujui lek tradicionalne medicine i farmacije, deluje kao inhibitor GABA transaminaze (za ega se odgovornim smatraju rozmarinska, ali i triterpenske kiseline) (Awad i sar., 2009), a zabeleeno i antidepresivno delovanje ove droge (Emamghoreishi i Talebianpour, 2009). Ipak, najvei broj radova bavi se potvrdom potencijalne primene lista matinjaka u prevenciji i koterapiji Alchajmerove bolesti i drugih neurodegenerativnih oboljenja (Akhondzadeh i sar., 2003; Akhondzadeh i Abbasi, 2006). Neuroprotektivni efekat se ostvaruje preko razliitih mehanizama: inhibicije enzima acetil i butirilholinesteraze (Ferreira i sar., 2006; Dastmalchi i sar., 2009; Lopez i sar., 2009; Orhan i Aslan, 2009), spreavanja vodonik-peroksidom izazvane apoptoze i propadanja dopaminerginih neurona (Lee i sar., 2008), kao i neutralizacije peroksinitrita, odgovornim za razvoj kognitivnih disfunkcija (Alkam i sar., 2007).
19
Doktorska disertacija 3.1.2.4. Neeljena dejstva, kontraindikacije i upozorenja
Neda Laki
Nije preporuljivo da deca mlaa od 12 godina uzimaju preparate na bazi matinjaka, a ako kod dece starije od 12 godina, odraslih i starih tokom uzimanja preparata ne dolazi do poboljanja simptoma, trebali bi se posavetovati sa lekarom ili farmaceutom (EMEA, 2007). Ipak, upotreba lista matinjaka oznaena je kao generalno bezbedna, odnosno ova droga ima GRAS status (FDA, 2010). 3.1.2.5. Trudnoa i laktacija Zbog nedostatka podataka o sigurnosti uzimanja preparata matinjaka u trudnoi i laktaciji ta upotreba se ne preporuuje u terapeutskim dozama (EMEA, 2007).
3.1.2.6. Interakcije sa lekovima, dijetetskim suplementima i hranom Do sada nisu potvrene interakcije preparata na bazi matinjaka sa lekovima, dijetetskim suplementima i hranom (Williamson., 2009).
3.1.2.7. Toksinost, genotoksinost, kancerogenost, mutagenost
Ne postoje podaci koji bi ukazivali na potencijalnu toksinost, genotoksinost, kancerogenost i mutagenost lista matinjaka (Pereira i sar., 2005; Furtado i sar., 2008; Mencherini i sar., 2009; Lin i sar., 2012). Najvie studija raeno je sa rozmarinskom kiselinom za koju je utvreno da se veoma brzo eliminie iz cirkulacije posle intravenske aplikacije (t1/2=9 min) i pokazuje vrlo nisku toksinost na mievima sa LD50=561mg/kg (Parham i Kesselring, 1985).
20
Neda Laki
3.1.3. Mentha x piperita L. pitoma nana

Za pitomu nanu vezane su brojne prie, s obzirom da ini neizostavni deo etnofarmacije brojnih naroda. Grki mitovi vezuju nanu za nimfu Minti, ija je lepota bila neodoljiva za Hada (Plutona) boga podzemnog sveta. Ljubomorna kraljica Persefona unitila je mladu Minti, pretvorivi je u biljku. Had joj je podario zanosni, isceljujui miris, znajui da e u vremenima koja dolaze, biti potovana. Ulaskom u grobnice Egipana arheolozi su osetili miris timijana i pitome nane, a biljku prijatnog mirisa koristili su kao lek protiv probavnih smetnji. Kao lekovitu biljku pominje je jo Hipokrat. Rimljani su je razneli irom Evrope, a iseljenici u Severnu Ameriku. Arapska medicina slavi nanu kao olienje prijateljstva i ljubavi, a u mnogim kulturama je simbol gostoljubivosti, tj. svaki gost se najpre posluuje ajem od nane. Japanci su utvrdili da miris nane stimulie ganglije, pojaava koncentraciju i budnost i na taj nain smanjuje sluajne greke i poveava efikasnost pri radu. Nana se spominje u Bibliji kao vid plaanja poreza, a u italijanskim crkvama prah biljke je posipan po podovima, odakle i potie naziv Erba Santa Maria. U Srednjem veku koriena je za prikrivanje neprijatnih mirisa, ekspir je pominje zajedno sa lavandom i ruzmarinom kao stimulus za sredovenu gospodu, a od XVIII veka poela je veoma da se ceni kao lekovita biljka, koja se primenjuje za leenje mnogih bolesti (Boin, 2004). Pitoma nana, metvica ili nana je viegodinja zeljasta biljka, jakog i otrog mirisa, sa snanim horizontalnim rizomom. Stabljika je uspravna, visoka 30-100 cm, razgranata, esto crvenkasta, gola ili du rebara oskudno dlakava. Listovi, na 6-8 mm dugim drkama, su jajasto izdueni ili lancetasti, po obodu nejednako nazubljeni, goli ili odozdo du nerava prekriveni kratkim mehanikim dlakama, takasto lezdasti. Cvetovi su na vrhovima stabljika i grana, skupljeni u izdueno glaviaste ili ree klasolike, pri osnovi isprekidane cvasti, najee sterilni. Brakteje su uske, ekinjaste, trepljaste, a pri osnovi gole. aica je cevasta, gola, ljubiaste boje, takasto prekrivena lezdama, sa uspravnim zupcima tri puta kraim od aine cevi. Krunica je gola sa beliastom cevi i ljubiastim renjevima. Slika 3.6. Mentha x piperita
21
Neda Laki
Ako nisu abortirali, pranici su krai od krunice iz koje tri stubi. Cveta od jula do septembra, a plod je objajasta, tamnomrka oraica (Dikli, 1974). Nana je poreklom iz Evrope, naturalizovana u Severnoj Americi i Kanadi, a gaji se u mnogim delovima sveta. Hibrid Mentha x piperita (sl. 3.6., tab. 3.3.) je nastao ukrtanjem vrsta M. aquatica L. i M. spicata L. Biljka je sterilna, pa se razmnoava iskljuivo vegetativnim putem, stolonima. Raste na rastresitom humusnom zemljitu, a zahteva dosta vlage i svetlosti. Najkvalitetnije sorte nane stvorene su selekcijom u Engleskoj, u oblasti Miam, gde je poela da se plantano gaji jo u 16.veku. Postoje dva varijeteta pitome nane: 1. M. piperita var. officinalis, sa dve forme : forma rubescens - Mitcham, crna ili paprena nana, forma palescens - bela nana;
2. M. piperita var. sylvestris.
Tabela 3.3. Sistematski poloaj vrste Mentha x piperita L. (Takhtajan, 2009) RAZDEO (Divisio): KLASA (Classis): PODKLASA (Subclassis) NADRED (Superordo) RED (Ordo): PORODICA (Familia): PODPORODICA (Subfamilia): TRIBUS (Tribus): ROD (Genus): VRSTA (Species): Magnoliophyta Magnoliopsida Lamiidae Takhtajan ex Reveal Lamianae Takhtajan Lamiales Bromhead Lamiaceae Lindley Nepetoideae Takhtajan Mentheae Takhtajan Mentha L. Mentha x piperita L.
ee se koristi M. x piperita var. officinalis f. rubescens (paprena nana), koja je tamnije zelene boje, ljueg ukusa i intezivnijeg mirisa, dok je bela nana blaeg ukusa i slabijeg mirisa, ali je otpornija na hladnou i suu. Najvei svetski proizvoai lista i etarskog ulja nane su SAD, Francuska, Italija, Engleska, Nemaka, a kod nas se najvie gaji u Vojvodini (Kovaevi, 2002).
22
Doktorska disertacija 3.1.3.1. Menthae x piperitae folium list pitome nane
Neda Laki
List se bere kada je potpuno razvijen, tokom cvetanja ili neposredno pred cvetanje biljke, jer tada daje najkvalitetniju drogu. Mlado, nerazvijeno lie sadri u etarskom ulju znatno vie mentofurana i drugih nezasienih ketona koji sa razviem listova prelaze u mentol, odnosno derivate ili estre mentola, i druge monoterpene, od kojih zavisi kvalitet i aroma droge. Osueni listovi su zeleni do zelenkastobraon boje, tanki, lako lomljivi, celi ili usitnjeni. Ceo list je duine 3-9 cm i 1-3 cm irine, esto naboran, ovalan do lancetast, zailjenog vrha, dvojno testerasto nazubljenog oboda. Nervatura je perasta, esto pigmetisana, istaknuta na naliju, pri emu boni nervi sa centralnim obrazuju ugao od 45. List je slabo dlakav, ali posmatranjem lupom mogu se uoiti lezdani trihomi u vidu ukastih takica. Kada se rastrlja, oseti se specifian, aromatian miris i pomalo opor i nagorak ukus (Ph. Eur., 2007).
3.1.3.2. Hemijski sastav lista pitome nane Hemijski sastav lista nane je veoma dobro prouen i varira u zavisnosti od starosti biljke, varijeteta, geografske regije i uslova proizvodnje (Blanco i sar., 2002). U pogledu sadraja vitamina i minerala utvreno je da svei listovi pitome nane sadre 940-1016 retinolskih
ekvivalenata (RE)/100g -karotena (Almeida-Muradian i sar., 1998). Takoe, dokazano je i prisustvo drugih karotenoida i hlorofila (Pilipenko i sar., 1998), kao i i tokoferola (Blumenthal i sar., 1999) i aksorbinske kiseline (Capecka i sar., 2005). Visoko je zastupljena i folna kiselina koja spreava akumulaciju homocisteina, nastalog u toku metabolizma proteina, za koji je potvreno da poveava rizik za nastanak ateroskleroze, ometa metabolizam kolagena i naruava integritet krvnih sudova. U listu nane po svojoj koliini izdvajaju se i vitamini B kompleksa: tiamin, niacin, riboflavin i vitamin B6 (Capecka i sar., 2005). Glavni minerali u suvom listu nane (g/kg) su: K (33), Ca (15,3), Mg (5,8) i manje koliine Na, kao i male koliine (mg/kg) Fe (239), Mn (188), Zn (51) i Cu (12). U tragovima (g/g) su prisutni i Cr (941), I (325) i Se (147). Koncentracija ovih minerala pronaenih u aju bila je priblino 8-60 % koliine prisutne u listu (Lozak i sar., 2002).
23
Neda Laki
Nana je dobar izvor dijetnih vlakana, koja imaju bitnu funkciju u stvaranju oseaja sitosti, zatiti debelog creva u spreavanju nastanka hemoroida, zatvora i divertikularnih poremeaja. Od aminokiselina najzastupljenije su aspartat i glutamat, dok se udeo masnih kiselina u listu pitome nane uglavnom sastoji od palmitinske (16:0), linolne (18:2), linolenske (18:3) (Maffei i Scanerini, 1992). List pitome nane sadri veliku koliinu fenolnih jedinjenja kao to su flavonoidi, fenolkarbonske kiseline i njihovi glikozidi, tanini i dr. Ukupan fenolni sadraj lista pitome nane je oko 19-23 % (ukupno12% flavonoida), to ukljuuje 59-67 % eriocitrina i rozmarinske kiseline (kombinovano), 7-12 % luteolin 7-O-rutinozida, 6-10 % hesperidina i manje koliine 5,6-dihidroksi 7,8,3,4-tetrametoksiflavona, pebrelin, gardenin B i apigenin (Areias i sar., 2001; Dorman i sar., 2003a; Kosar i sar., 2004) (sl. 3.7.).
Slika 3.7. Flavonoidni aglikoni identifikovani u listu pitome nane i matinjaka
Ono to je karakteristino za flavonoide lista pitome nane je da se javlja itav niz metilovanih aglikona, najee u poloajima 4 i 6 (Mimica-Duki, 1992; Voirin i sar., 1999; Mimica-Duki i Boin, 2008). Od fenolkarbonskih kiselina najzastupljenija je rozmarinska, ali su prisutne jo i
24
Neda Laki
kafena, hlorogenska, ferulana i cimetna kiselina. U listu je prisutno ak 6-12% tanina (Bisset i Wichtl, 2001). Etarsko ulje pitome nane, Menthae x piperitae aetheroleum, dobija se destilacijom vodenom parom iz prosuene herbe. To je bistra, bezbojna, lako pokretljiva tenost, vie ili manje ljutog i ukusa koji hladi, mirisa na mentol (Kovaevi, 2002). Neusitnjena droga Menthae x piperitae folium sadri najmanje 12 ml/kg, a usitnjena 9 ml/kg etarskog ulja (Ph.Jug.V, 2000). Kao oficinalna droga mnogih farmakopeja, etarsko ulje pitome nane standardizovano je u pogledu nekih svojih osobina (kiselinski broj <1,4; indeks refrakcije 1,457-1,467; ugao optike rotacije 10 do -30), kao i po hemijskom sastavu (30-50% mentola, 14-32% mentona, 1-9% mentofufana, 0,8-10% mentilacetata, 4% pulegona, 1% karvona, 1-5% limonena, 3,5-14% 1,8-cineola i 1,5-10% izomentona) (Ph.Jug.V, 2000; Eur. Ph.VI, 2007). Prisustvo i odnos pojedinih komponenata u etarskom ulju nane od izuzetnog je znaaja za karaterizaciju i determinaciju pojednih vrsta i varijeteta. (Mimica-Duki i sar., 2003; 2007; 2008).
3.1.3.3. Farmakoloko delovanje i upotreba Menthae x piperitae folium Pitoma nana spada svakako meu najpopularnije i najrasprostranjenije sastojke biljnih ajeva, pa je s pravom nazvana kraljicom ajeva. Nala je primenu u leenju digestivnih tegoba: bola u elucu, greva, zastoja u varenju i nadutosti. Etarsko ulje nane deluje oputajue na miie eluca i creva, smanjuje muninu, spreava zadravanje vazduha u crevima, posredno utie na normalizovanje funkcije jetre, luenje ui i smanjenje kolika une kesice, a lek je izbora za prenadraeno debelo crevo. Deluje umirujue, okrepljujue, vraa snagu i rehidrira organizam. Takoe, utie i na regulaciju ubrzanog sranog rada, oputa bronhije i olakava tegobe kod astme. Neutralie neprijatan zadah i u obliku rastvora za ispiranje usta prevenira bolesti zuba i desni. Umanjuje potekoe koje se javljaju u klimaksu, kao i menstrualne tegobe (Tucakov, 1997). Jo su stari Grci i Kinezi pravili osveavajue obloge i koristili ih za ublaavanje bolova. Mentol, primenjen lokalno, smanjuje osetljivost receptora za bol, pospeuje perifernu cirkulaciju i hladi, pa se koristi kod reumatskih bolova u obliku antireumatskih masti (Paroji i Stupar, 2003). Nana je poznata i kao zainska biljka. Iako u srednjoevropskoj kuhinji nana ne igra veliku ulogu, danas se u Engleskoj i SAD njome zainjavaju voni kokteli i sokovi, vone salate, graak i
25
Neda Laki
mrkva, aj i kakao. Najpoznatija upotreba je za uveni anglosaksonski mint-sos koji se slui uz ovetinu i teletinu, uz patete, elee i jela od ribe. Kod nas se upotrebljava za zainjavanje pasulja i drugog mahunastog povra, jer olakava njihovo varenje. Ulje nane slui za aromatizaciju likera, slatkia, zubnih pasta i lekova (Tucakov, 1997). Nauna medicina i farmacija potvrdile su brojna farmakoloka delovanja lista pitome nane i opravdale iroku upotrebu ove droge u tradicionalnoj medicini. Poto sadri znatnu koliinu komponenata sa antioksidantnim delovanjem (flavonoidi, fenolne kiseline, - i -tokoferol, karotenoidi, askorbinska kiselina) i sama droga je znaajan antioksidans, bilo kao hvata slobodnih radikala ili kao inhibitor procesa lipidne peroksidacije (Mimica-Duki, 1997; Zeng i Wang, 2001; Dragland i sar., 2003; Dorman i sar., 2003a; Kosar i sar., 2004). List pitome nane poseduje i snano antimikrobno delovanje. Ispitan je antibakterijski i antifungalni efekat lista pitome nane na brojnim sojevima bakterija i fungi. Ovaj efekat pripisuje se pre svega etarskom ulju (Burt, 2004), ali postoje podaci da i razliiti ekstrakti lista poseduju znaajno baktericidno i fungicidno delovanje (Rios i Recio, 2005; Gulluce i sar., 2007; Sandasi i sar., 2011; Singh i sar., 2011; Negi, 2012). Sa druge strane, ekstraktima lista pitome nane pripisuje se i znaajno antiviralno delovanje (McKay i Blumberg, 2006). Takoe, list pitome nane poseduje znaajno antihelmintiko i insekticidno delovanje (Kumar i sar., 2011; Carvalho i sar., 2012). Pretpostavlja se da pitoma nana spreava ili redukuje karcinogenezu indukovanu razliitim agensima u nekim ivotinjskim modelima (Semeena i Ashok, 2001; Kim i sar., 2002; Samarth i sar., 2006). Takoe, odreene studije zabeleile su i antialergijsko i antiinflamatorno delovanje lista pitome nane, za koje su pre svega odgovorni flavonoidi, ali i komponente etarskog ulja (Inoue i sar., 2002). Pored toga, dokazano je da pitoma nana utie na aktivnost centralnog i perifernog nervnog sistema, u smislu analgetskog i lokalno anestetskog efekta koji se pripisuje delovanju mentola (Galeotti i sar., 2001; Samojlik i sar., 2012). Bihevioralna ispitivanja lista pitome nane ukazuju da bi dopamin mogao da posreduje u njenim stimulatornim efektima (McKay i Blumberg, 2006).
3.1.3.4. Neeljena dejstva, kontraindikacije, upozorenja U studiji koja je poredila efekte infuza lista Mentha x piperita i M. spicata L. nisu utvreni dokazi o nefrotoksinosti M. piperita L. kod Wistar albino pacova (Akdogan i sar., 2003). aj
26
Neda Laki
M. spicata L. znaajno je, u poreenju sa vodom, uveao koncentraciju uree i kreatinina, a smanjio aktivnost superoksid dismutaze i glutation peroksidaze u plazmi. Nasuprot ovome, nijedan od ovih parametara nije se znaajno izmenio kod pacova kojima je dat infuz M. piperita L. Iako su histopatoloke promene uoene u grupama kojima je davana i jedna i druga vrsta aja, ove promene kod grupe M. piperita L. su bile male u poreenju sa onima u grupi M. spicata L. Kasniji eksperiment je pokazao samo minimalnu degeneraciju hepatocita pri tretiranju ajem M. piperita L. u poreenju sa M. spicata L. (McKay i Blumberg, 2006). Kontraindikovana je primena lista pitome nane kod preosetljivosti na neku od komponenata ove droge, najee mentol. Takoe, kontraindikovana je primena kod osoba koje imaju kamen u ui ili bilo koji upalni proces gastrointestinalnog trakta, bez lekarskog nadzora (EMEA, 2007). Pacijenti koji boluju od gastroezofagealnog refluksa treba da izbegavaju preperate na bazi lista pitome nane jer moe doi do pogoranja simptoma, zbog mogueg smanjenja tonusa ezofagealnog sfinktera (ESCOP, 2003). Kod dece mlae od 4 godine upotreba nije preporuljiva zbog nedostatka podataka o bezbednosti. Takoe, savetuje se da se, ukoliko se simptomi odreene bolesti pogoraju prilikom upotrebe preparata na bazi pitome nane, pacijent obrati lekaru ili farmaceutu (EMEA, 2007). Meutim, i pored odreenih upozorenja i mera opreza koje treba uzeti u obzir prilikom korienja pitome nane u terapeutskim dozama, ona je oznaena kao generalno bezbedna, odnosno ima GRAS status (FDA, 2010). 3.1.3.5. Trudnoa i laktacija Nisu zabeleeni neeljeni efekti prilikom korienja preperata na bazi pitome nane u trudnoi i za vreme dojenja. ak je utvreno da list pitome nane stimulie galaktoreju nakon poroaja, zbog svog spazmolitikog efekta. Ipak, zbog nedostatka dovoljnog broja pouzdanih podataka o sigurnosti uzimanja fitopreparata pitome nane u trudnoi i laktaciji ta upotreba se ne preporuuje u terapeutskim dozama (EMEA, 2007). 3.1.3.6. Interakcije sa lekovima, dijetetskim suplementima i hranom Infuz pitome nane umereno inhibie aktivnost enzima citohrom P450 CYP2E in vivo (Maliakal i Wanwimolruk, 2001) i ostale citohrom P450 izoenzime (CYP2C8, CYP2C9, CYP2C19 i CYP2D6) in vitro (Unger i Frank, 2004). Utvreno je da infuz pitome nane sadri komponente sline digoksinu, ali klinika znaajnost ovih komponenata nije do sada u potpunosti razjanjena
27
Neda Laki
i navodi se da je istovremena upotreba kardiotoninih lekova i preparata na bazi nane bezbedna. Nisu zabeleene interakcije sa drugim biljnim lekovima. Sa druge strane, infuz pitome nane moe uticati na apsorpciju gvoa, pretpostavlja se zbog sposobnosti fenolnih sastojaka da vezuju gvoe i na taj nain ometaju njegovo usvajanje, to treba imati u vidu naroito prilikom suplementacije (Akdogan i sar., 2004).
3.1.3.7. Toksinost, genotoksinost, kancerogenost i mutagenost Ne postoje pouzdani podaci koji bi ukazali na potencijalnu toksinost, genotoksinost, kancerogenost ili mutagenost lista pitome nane ili preparata na bazi ove droge (McKay i Blumberg, 2006; EMEA, 2007).
28
Neda Laki
4. EKSPERIMENTALNI DEO
4.1. MATERIJAL
4.1.1. Biljni materijal
Nadzemni delovi timijana (Thymus vulgaris), matinjaka (Melissa officinalis) i pitome nane (Mentha x piperita) su sakupljeni neposredno pre cvetanja biljaka, na lokalitetu Padej, avgusta 2009. godine. Materijal je determinisan do nivoa vrste (Fernandes, 1972; Harley, 1972; Jalas, 1972) i deponovan u herbarijumu Laboratorije za farmakognoziju Zavoda za farmaciju, Medicinski fakultet, Univerzitet u Novom Sadu (Voucher TV-78/09, MO-63/09, MP-70/09). Nakon suenja biljnog materijala, stabljike i listovi su razdvojeni i odvojeno uvani u kartonskim kutijama, na tamnom i suvom mestu, do pripreme ekstrakata.
4.1.2. Mikroorganizmi
Za odreivanje antimikrobne aktivnosti ispitivanih ekstrakata korieni su sledei bakterijski sojevi: Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella infantis, Escherichia coli i Campylobacter jejuni laboratorije za prehrambenu mikrobiologiju, Katedre za biotehnologiju, mikrobiologiju i ispravnost namirnica, Biotehnikog fakulteta Univerziteta u Ljubljani (tab. 4.1). Kulture su uvane u Brain Heart Infusion (BHI) tenoj podlozi sa dodatkom glicerola (850l kulture u BHI i 150l glicerola) u krioepruveti, na temperaturi od -20C. Revitalizacija sojeva vrena je tako to je sadraj iz krioepruvete dodavan u 4ml BHI, inkubiran 24h na 37C sa meanjem (100 o/min). Nakon inkubacije kulture su zasejane na selektivne podloge (24h, 37C) radi identifikacije, a nakon toga na hranljivu podlogu Mueller Hinton agar (MHA) (24h, 37C) na kojoj su uvane u friideru (u alu foliji, -8C) do poetka eksperimenta.
29
Neda Laki
Tabela 4.1. Sojevi mikroorganizama korieni u odreivanju antimikrobne aktivnosti ispitivanih ekstrakata BAKTERIJSKI SOJ Staphylococcus aureus Bacillus cereus Salmonella infantis Escherichia coli Campylobacter jejuni IZVOR ATCC 25923 MJ 164 MJ 106 MJ 370 NCTC 11168
ATCC-amerika kolekcija kultura (American Type of Culture Collection); MJ-soj Biotehnikog fakulteta u Ljubljani, Slovenija; NCTC-nacionalna kolekcija kultura (National Collection of Type Cultures) Soj Campylobacter jejuni uvan je u krioepruveti na temperaturi od -80 C. Revitalizacija soja izvedena je zasejavanjem na ploe sa Kolumbija krvnim agarom koje su nakon toga inkubirane 24h, pri mikroaerofilnim uslovima, na temperaturi od 42C.
4.1.3. Eksperimentalne ivotinje
U ispitivanjima su korieni polno zreli, est nedelja stari Swiss Albino mievi mukog pola, teine 25-35g, odgajani na farmi za eksperimentalne ivotinje Vojnomedicinske akademije u Beogradu. ivotinje su aklimatizovane u gajilitu za laboratorijske ivotinje Zavoda za farmakologiju, kliniku farmakologiju i toksikologiju Medicinskog fakulteta u Novom Sadu. Do momenta istraivanja i u toku eksperimenta ivotinje su boravile u elinim kavezima (podeljeni u plastine kaveze u grupe od po 10 ivotinja) u sobi sa kontrolisanim temperaturnim (23 1C) i svetlosnim reimom (smenjivanje svetlosti i mraka u trajanju od 12 asova), stalnom vlanosti vazduha, uz slobodan pristup vodi i hrani. Ispitivanje na ivotinjama i rukovanje sa njima izvedeno je u skladu sa etikim naelima rada sa laboratorijskim ivotinjama, uz saglasnost etike komisije za zatitu dobrobiti oglednih ivotinja Univerziteta u Novom Sadu (odobrenje broj: 01-273/4, dana 12.10.2010).
30
Neda Laki
4.2. PRIPREMA UZORAKA ZA ISPITIVANJA
4.2.1. Priprema poredbenih i ekstrakata od otpadnog materijala
Za pripremu ekstrakata koji su korieni kao poredbeni u ispitivanjima upotrebljena je metoda hladne maceracije sa 45% etanolom (EtOH) (odnos droga (Thymi folium, Melissae folium i Menthae x piperitae folium): solvens = 1:10) u vremenskom periodu od 24h, bez meanja (T1, M1, N1) (Ph. Eur. VI, 2007; EMEA monografije) (tab. 4.2). Etarsko ulje iz ispitivanih droga izolovano je metodom hidrodestilacije (Ph. Eur. IV, 2002). Ostatak posle destilacije je profiltriran, pri emu se dekokt (nakon uparavanja rastvaraa) koristio za dobijanje primarnog postdestilacionog ostatka (T2, M2, N2), a otpadni biljni materijal je nakon suenja podvrgnut postupku hladne maceracije sa 45% i 75% etanolom u trajanju od 24 asa (T3, T4, M3, M4, N3, N4). Stabljike ispitivanih biljaka (st) su, nakon sitnjenja (sito 0,75), podvrgnute hladnoj maceraciji sa 45% i 75% etanolom u trajanju od 24h (T5, T6, M5, M6, N5, N6). Tabela 4.2. Legenda tipova ekstrakata timijana (T), matinjaka (M) i pitome nane (N) koji su korieni u ispitivanjima. Skraenica T1, M1, N1 T2, M2, N2 T3, M3, N3 T4, M4, N4 T5, M5, N5 T6, M6, N6 Tip ekstrakta hladan macerat lista, 45%etanol, 24 asa dekokt koji zaostaje nakon izolacije etarskog ulja procesom hidrodestilacije hladan macerat lista iz koga je izolovano etarsko ulje procesom hidrodestilacije, 45%etanol, 24 asa hladan macerat lista iz koga je izolovano etarsko ulje procesom hidrodestilacije, 75%etanol, 24 asa hladan macerat samlevene stabljike, 45%etanol, 24 asa hladan macerat samlevene stabljike, 75%etanol, 24 asa
31
Neda Laki
Posle filtriranja ekstrakti su upareni do suva na rotacionom vakuum uparivau i sueni u vakuum-eksikatoru, na sobnoj temperaturi, do konstantne mase, da bi se odredila koliina suvog ekstakta (s.e.). Dobijeni suvi ekstrakti rastvoreni su u destilovanoj vodi u odreenoj koncentraciji i uvani u staklenim boicama sa gumenim epom u zamrzivau do poetka eksperimenata.
4.3. HEMIJSKA ISPITIVANJA
4.3.1. Odreivanje sadraja ukupnih fenola
Sadraj ukupnih fenola u ispitivanim ekstraktima odreen je pomou Folin-Ciocalteu reagensa (Fukumoto i Mazza, 2000) uz male modifikacije (Laki i sar., 2010). Koliina ukupnih fenola odreena je na osnovu kalibracione krive dobijene iz serije razblaenja galne kiseline (GK) i izraena u mg ekvivalenata galne kiseline po gramu suvog ekstrakta (EGK/g s.e.).
4.3.2. Odreivanje sadraja ukupnih flavonoida
Odreivanje sadraja ukupnih flavonoida zasniva se na njihovoj osobini da sa metalima daju odgovarajue metalo-komplekse od kojih je naroito znaajan Al(III)-flavonoid kompleks, pa se sumarni apsorpcioni maksimum flavonoida lako odreuje (Jia i sar., 1999). Koliina ukupnih flavonoida u ispitivanim ekstraktima odreena je na osnovu kalibracione krive izraene uz pomo serije razblaenja rastvora kvercetina i izraena u mg ekvivalenata kvercetina/g suvog ekstrakta (EK/g s.e.).
4.3.3. Visokoefikasna tena hromatografska (HPLC-DAD) analiza
Kvalitativni i kvantitativni sadraj fenolnih jedinjenja u ispitivanim ekstraktima timijana, matinjaka i nane odreen je tehnikom tene hromatografije visoke rezolucije (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) na aparatu HPLC Agilent 1200 serije. Koriena je kolona Agilent, Eclipse XDB-C18. Detekcija razdvojenih pikova je izvrena pomou detektora sa serijom dioda (Diode Array Detector, DAD) na 280, 330 i 350 nm, a apsorpcioni spektri komponenata su snimljeni u opsegu od 190 do 400 nm, R 500/100 nm.
32
Neda Laki
Kao mobilna faza korien je sistem rastvaraa: A metanol (HPLC gradient grade) i B 1% mravlja kiselina u ultraistoj vodi (v/v). Razdvajanje komponenti je izvedeno primenom sledeeg linearnog gradijenta: 0-10 min, 10-25 % A; 10-20 min, 25-60 % A; 20-30 min, 60-70 % A. Zavretak analize, odnosno stop time je podeen na 45 min, nakon ega je koloni ostavljeno vreme da se uravnotei na poetne uslove 10% A, time to je post time podeen na 10 min. Protok mobilne faze je iznosio 1 ml/min. Injektovano je 5 l rastvora uzorka, automatski, korienjem autosampler-a. Kolona je termostatirana na temperaturi od 30 C. Za HPLC odreivanja su korieni rastvori ispitivnih ekstrakata masenih koncentracija 10,0-20,0 mg/ml, pripremljeni rastvaranjem u smei metanola i 1% mravlje kiseline u vodi u odnosu 50:50. Pre injektovanja svi rastvori su profiltrirani kroz filtere sa veliinom pora 0,20 m (Nylon filters, Rotilabo-Spritzenfilter 13 mm, Roth, Karlsruhe, Nemaka).
Slika 4.1. Hromatogram smee standarda na 280nm korienih prilikom hemijske analize ekstrakata timijana. Redosled eluiranja jedinjenja: 1-galna kiselina, 2-protokatehinska kiselina, 3-p-hidroksibenzoeva kiselina, 4-kafena kiselina, 5-vanilinska kiselina, 6-hlorogenska kiselina, 7-siringinska kiselina, 8-p-kumarinska kiselina, 9-ferulna kiselina, 10-sinapinska kiselina, 11rutin, 12-miricetin, 13-rozmarinska kiselina, 14-cimetna kiselina, 15-kvercetin, 16-naringenin, 17-luteolin, 18-kemferol, 19-apigenin
33
Neda Laki
Fenolne komponente prisutne u uzorcima su identifikovane poreenjem njihovih retencionih vremena i spektara sa retencionim vremenom i spektrom standarda za svaku komponentu. Korieni su standardi galne, rozmarinske, ferulne, protokatehinske, hlorogenske, kafene, vanilinske, siringine i trans cimetne kiseline, kao i kvercetina, rutina, apigenina, naringenina, luteolina, kemferola, miricetina i aloe-emodina (sl. 4.1. i sl. 4.2.) (Roth, Karlsruhe, Nemaka). Za potvrdu identifikacije komponenata je utvrena i istoa pika. Kvantifikacija komponenti je izvrena metodom spoljanjeg standarda. Za svaki pojedinani standard je pripremljen osnovni rastvor standarda masene koncentracije 1,0 mg/ml, rastvaranjem u metanolu. Od ovog rastvora je pripremljena serija razblaenih rastvora standarda masenih koncentracija u opsegu 0,002 0,030 mg/ml. Konstruisana je kalibraciona kriva, za svaki standard, na osnovu dobijenih povrina pikova u zavisnosti od masene koncentracije standarda. Iz dobijene jednaine linearne zavisnosti izraunate su masene koncentracije komponenti u uzorcima (Mian i sar., 2011).
Slika 4.2. Hromatogram smee standarda na 280nm korienih prilikom hemijske analize ekstrakata matinjaka i pitome nane. Redosled eluiranja jedinjenja: 1-galna kiselina, 2protokatehinska kiselina, 3-katehin, 4-kafena kiselina, 5-vanilinska kiselina, 6-hlorogenska kiselina, 7-siringinska kiselina, 8-epikatehin, 9-ferulna kiselina, 10-rutin, 11-miricetin, 12rozmarinska kiselina, 13-cimetna kiselina, 14-kvercetin, 15-naringenin, 16-luteolin, 17-kemferol, 18-apigenin
34
Neda Laki
4.4. ISPITIVANJE BIOHEMIJSKIH AKTIVNOSTI
4.4.1. In vitro ispitivanje antioksidantnog delovanja
4.4.1.1. Odreivanje kapaciteta neutralizacije slobodnih radikala (RSC)
Antiradikalsko delovanje ispitivanih ekstrakata izvreno je na nivou neutralizacije: stabilnog sintetskog 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil radikala (DPPH) (Boin i sar., 2007) i hidroksil radikala (OH), jednog od najaktivnijih slobodnih radikala u ljudskom organizmu (Boin i sar., 2006). Antiradikalsko delovanje u oba test sistema izraeno je kao procenat neutralizacije (% RSC) ispitivanog slobodnog radikala prema sledeoj formuli:
% RSC = 100
Aradne probe x 100 Akontrolne probe
Kod svih ispitivanih uzoraka iz dobijenih RSC vrednosti regresionom analizom odreena je vrednost 50% neutralizacije ispitivanog slobodnog radikala (IC50 vrednost). Radi standardizacije i lakeg poreenja rezultata, u DPPH testu izraunat je indeks antioksidantne aktivnosti (antioxidant activity index (AAI)) prema sledeoj formuli: AAI=koncentracija DPPH u reakcionoj smei (g/ml)/IC50 (g/ml) Uzorci su klasifikovani kao slabi AAI<0,5; umereni 0,5<AAI<1; snani 1<AAI<2 i veoma snani potencijalni antioksidansi AAI>2 (Scherer i Godoy, 2009).
35
Neda Laki
4.4.1.2. Odreivanje lipidne peroksidacije (LP)
Stepen lipidne peroksidacije odreen je spektrofotometrijski merenjem intenziteta obojenosti produkta, nastalog u reakciji tiobarbiturne kiseline (TBA) sa malonildialdehidom (MDA) kao krajnjim proizvodom peroksidacije nezasienih masnih kiselina, u kiseloj sredini na 535 nm, putem TBA testa. Kao supstrat je korieno hladno ceeno kukuruzno ulje a kao sistem indukcije datog procesa Fe2+/H2O2 (Boin i sar., 2008; Milic-Torres i sar., 2011).. Inhibicija LP odreena je iz razlike absorbance uzorka i slepe probe u kojoj je uzorak zamenjen puferom, prema sledeoj formuli: % I = 100 Aradne probe Akontrolne probe Primenom regresione analize iz vrednosti dobijenih za stepen inhibicije niza rastuih koncentracija ispitivanih ekstrakata odreene su vrednosti 50% inhibicije LP (IC50 vrednosti).
4.4.2. Odreivanje inhibitornog uticaja na enzim acetilholinesterazu
Metoda se zasniva na osobini acetilholinesteraze (AChE) da hidrolizuje supstrat acetiltioholin jodid do odgovarajue masne kiseline i tioholina, ija tiol grupa reaguje sa 5,5'-ditio-bis-(2nitrobenzojevom kiselinom) (DTNB) uz formiranje utog anjona (Ellmanov anjon) 5-tio-2nitrobenzoata i drugih proizvoda. Brzina formiranja utog anjona meri se kontinuirano spektrofotometrijski na 410 nm i proporcionalna je aktivnosti datog enzima (Orhan i sar., 2008; Dastmalchi i sar., 2009; Hernandez i sar., 2010). Merenje je vreno na temperaturi od 37C, u trajanju od 3 minuta, na svakih 20 sekundi. Stepen inhibicije AChE od strane ispitivanih uzoraka odreen je na osnovu sledee formule: Aradne probe x 100 Akontrolne probe
% I = 100
36
Neda Laki
Primenom regresione analize iz vrednosti dobijenih za inhibitorno delovanje niza rastuih koncentracija ispitivanih ekstrakata odreene su vrednosti 50% inhibicije enzima
acetilholinesteraze (IC50 vrednosti).
4.4.3. Odreivanje hepatoprotektivnog delovanja

Na osnovu rezultata biohemijskih in vitro testova, ekstrakti oznaeni sa nd (nain dobijanja opisan u poglavlju 4.2.2.) kod sve tri ispitivane biljke uli su u ispitivanje uticaja na jetrene enzime laboratorijskih ivotinja. Kriterijum za ukljuivanje u ispitivanje bio je ostvarivanje 70% aktivnosti postignute od strane standardnih ekstrakata. Tako je od 18 ekstrakata koji su bili ukljueni u biohemijska in vitro ispitivanja, 7 bilo podvrgnuto in vivo ispitivanjima. Laboratorijske ivotinje (Swiss albino laboratorijski mievi mukog pola) podeljeni su u grupe (n=10), po ispitivanom ekstraktu, metodom sluajnog uzorka. Aplikovana doza odabranih ekstrakata dobijena je preraunavanjem preporuene terapijske dnevne doze ispitivanih droga Thymi folium, Melissae folium, Menthae x piperitae folium za oveka (tab. 4.2) (Blumenthal, 1999; Bisset i Wichtl, 2001; EMEA monografije) i 10%, odnosno 20% ispitivanog vodenog ekstrakta (preko prethodno odreenog suvog ekstrakta u ispitivanom biljnom materijalu (tab 5.1)), pomou formule koja se koristi za odreivanje doze za laboratorijske eksperimentalne ivotinje (Jakovljevi, 2006): ekvivalentna doza za oveka (mg/kg) dnevna doza za mia (mg/kg) = (masa ivotinje (kg) / masa oveka (kg))0,33
Tabela 4.3. Dnevne doze koriene u odreivanju hepatoprotektivnog delovanja ispitivanih ekstrakata na laboratorijskim mievima UZORAK Thymi folium Melissae folium Menthae x piperitae folium Preporuena dnevna doza za oveka maksimalno 8g maksimalno 13,5g maksimalno 9g Prilagoena dnevna doza za mia 1,48 g/kg 2,5 g/kg 1,67 g/kg
37
Neda Laki
Pretretman ispitivanim ekstraktima vren je viekratno tokom pet uzastopnih dana. Ekstrakti su aplikovani peroralno uz pomo gastrine sonde. Ugljentetrahlorid (CCl4), u eksperimentu upotrebljen kao hepatotoksini agens, pripremljen je kao 50% rastvor u maslinovom ulju i primenjen intraperitonealno (i.p.) u dozi od 2 ml/kg petog dana, pet sati nakon poslednje aplikovane doze ekstrakta. estog dana (20 h nakon primene CCl4) ivotinje su rtvovane, metodom dekapitacije, radi uzimanja uzoraka jetre. Ispitivanje hepatoprotektivnog delovanja aplikovanih ekstrakata izvreno je
spektrofotometrijskim praenjem nivoa sledeih parametara u homogenatu jetre (jetra : TRISHCl pufer (pH=7,4) = 1:4; uz korienje Potter-Elvehjem homogenizatora na ledu) pretretiranih eksperimentalnih ivotinja (Popovi i sar., 2007):
odreivanje ukupnih jetrenih proteina (Walfson, 1948), odreivanje aktivnosti enzima ksantin oksidaze (XOD) (Bergmayer, 1974) i superoksid dismutaze (SOD) po komercijalnom kitu Biorex UK (Arthur i Boyne, 1985), odreivanje nivoa lipidne peroksidacije (LP) (Buege i Aust, 1978) i odreivanje glutationskog ciklusa preko: ukupnog glutationa (GSH) (Kapetanovi i Mieyal, 1979), enzima glutation peroksidaze (GSH-Px) po komercijalnom kitu Biorex UK (Paglia i Valentine, 1967), glutation reduktaze (GSH-R) (Glatzle i sar., 1974) i glutation-S-transferaze (GSH-(S)T) (Habig i sar., 1974).
U ispitivanjima je korien Agilent 8453 UV/VIS spektrofotometar sa termostatiranim multielijskim sistemom za pozicioniranje uzoraka i softverom za ispitivanje enzimske kinetike.
38
Neda Laki
4.5. MIKROBIOLOKA ISPITIVANJA
4.5.1. Priprema ekstrakata za mikrobioloka ispitivanja

Suvi ekstrakti pripremljeni po 4.2.1. za potrebe mikrobiolokih ispitivanja rekonstituisani su u onom rastvarau koji je korien za njihovu pripremu (voda, 45% ili 75% etanol).
4.5.2. Odreivanje koncentracije bakterijskih elija u inokulumu

Za odreivanje koncentracije bakterijskih elija u inokulumu, koje je neophodno za pravilno izvoenje mikrodilucijskog testa, koriena je metoda nakapavanja na plou (Drop plate method) preko brojanja bakterijskih kolonija. Rezultati su izraeni kao CFU/ml uzorka (Colony Forming Units) (tab. 4.3).
Tabela 4.4. Odreivanje koncentracije bakterijskih elija u inokulumu Soj bakterija Staphylococcus aureus Salmonella Escherichia coli Bacillus cereus Campylobacter jejuni CFU/ml 8,0E+06 1,9E+07 1,58E+07 1,18E+06 1E+06
4.5.3. Priprema inokuluma za mikrodilucijsku metodu

Za izvoenje eksperimenta koriene su revitalizovane i identifikovane iste kulture koje su sa hranljive podloge MHA aseptinim postupkom zasejane u 4 ml tene podloge Mueller Hinton bujon (MHB). Tako pripremljene kulture inkubirane su na 37C, 24h uz konstantno meanje. Nakon inkubacije i dodatnog meanja na vorteksu 75 l suspenzije je preneto u epruvete sa 5 ml podloge MHB i tako pripremljena kultura koriena je za izvoenje mikrodilucijskog testa.
39
Neda Laki
4.5.4. Odreivanje minimalne inhibitorne koncentracije mikrodilucijskom metodom

Minimalne inhibitorne koncentracije (MIC-Minimal Inhibitory Concentration) odreene su serijskim razblaivanjem u 96-elijske mikrotitar ploe. Radni rastvori ispitivanih ekstrakata nanoeni su na plou i serijski razblaivani u podlozi MBH du kolona mikrotitar ploe tako da je svaka naredna koncentracija bila za pola manja od prethodne. Radi provere rezultata na svakoj ploi pripremljena je i slepa proba (ista podloga MHB), pozitivna kontrola (MHB+kultura) i negativne kontrole za svaki uzorak (MHB+uzorak). Na kraju pripreme ploe u sve otvore (osim u slepu probu i negativne kontrole) dodavana je ispitivana bakterijska kultura. Nakon meanja (1min, 800 o/min) i inkubacije (24h, 37C) u sve otvore mikrotitar ploe dodato je 10 l indikatora jodonitrotetrazolijum hlorida (INT) (2 mg/ml). Ploe su prekrivene sa aluminijumskom folijom, promeane (1min, 800 o/min) i inkubirane (30min, 37C). Kao minimalna inhibitorna koncentracija odreena je ona koja je bila prisutna u prvom neobojenom otvoru (Klanik i sar., 2010). Rezultati su izraeni u mg ukupnih fenola (UF)/ml. Kod odreivanja antimikrobnog delovanja ispitivanih ekstrakata na Campylobacter jejuni koriena je takoe opisana mikrodilucijska metoda sa malim modifikacijama zbog specifinosti same bakterije. Nakon pripreme, mikrotitar ploe su u ovom sluaju inkubirane 24h, pri mikroaerofilnim uslovima na 42C. Za odreivanje MIC korien je Bac Titer-GloTM test (Promega) koji se zasniva na kvantifikaciji prisutnog ATP-a u bakterijskoj eliji, kao indikatora metabolike aktivnosti, merenjem luminescence nakon dodatka specifinog reagensa (Bac TiterGloTM) (Klanik i sar., 2009). Za merenje luminescence korien je Tecan Safire 2. Kao minimalna inhibitorna koncentracija odreena je ona koja se nalazila u prvom otvoru mikrotitarske ploe u kojoj nije detektovano prisustvo ATP-a. Rezultati su izraeni u mg UF/ml.
40
Neda Laki
4.6. ISPITIVANJE FARMAKOLOKOG DELOVANJA
4.6.1. Farmakodinamska ispitivanja

Farmakodinamska ispitivanja obuhvatila su praenje uticaja ispitivanih ekstrakata na motornu koordinaciju, antidepresivnog i anksiolitikog efekta, kao i uticaja na memoriju eksperimentalnih ivotinja. Takoe, odreene su i mogue interakcije ispitivanih ekstrakata sa lekovima: midazolamom i fluoksetinom. Doze ekstrakata koje su primenjene u farmakodinamskim ispitivanjima date su u tabeli 4.2.
4.6.1.1. Metoda rotirajueg tapa

Depresija motorne koordinacije izazvana midazolamom ispitivana je metodom "rotirajueg tapa (rotarod metodom) (Vogel i Vogel, 2002; Farkas i sar., 2005). Doza i.p. datog rastvora midazolama (5 mg/kg) primenjena je 2h nakon poslednje p.o. aplikovane doze ispitivanog ekstrakta, petog dana tretmana, nakon kontrolnog merenja motorne koordinacije u trajanju od 180 sec. Vreme odravanja ivotinje na rotirajuem tapu (u sekundama) mereno je 1, 5, 10, 15 i 20 minuta nakon primene leka. Kao maksimalno dozvoljeno vreme uzeto je kontrolno merenje motorne koordinacije u trajanju od 180 sec. Depresivni-hipnotiki efekat ispitivanih ekstrakata/midazolama izraunat je kao postotak promene vremena (sec) provedenog na rotirajuem tapu prema jednaini:
% depresije = ((A x 100)/B) - 100
gde je A mereno, a B kontrolno (maksimalno) vreme (180 sec).
4.6.1.2. Test suspenzije o repu

Pre poetka merenja testa suspenzije o repu (Tail Suspension Test - TST), ivotinje koje su bile ukljuene u eksperiment transportovane su u prostoriju gde se obavljalo merenje, najmanje sat vremena, kako bi se prilagodile novoj sredini. Eksperiment je izvoen u jutarnjim asovima, a
41
Neda Laki
tokom merenja morala je da vlada tiina. Aparat za izvoenje testa suspenzije o repu sastojao se od kutije sa horizontalnom prekom na visini od 58cm iznad podloge (stola). Rep mia privrivan je adhezivnom trakom za preku na 1 cm od vrha repa. U toku perioda od 6 minuta, nakon suspenzije o rep, topericom je mereno vreme (sec) u kojem je ivotinja pokazivala imobilnost (vreme imobilizacije). Ispitivani ekstrakti aplikovani su peroralno, pet uzastopnih dana, nakon ega je vreno merenje njihovog potencijalnog antidepresivnog efekta (Vogel i Vogel, 2002; OLeary i Cryan, 2009). Fluoksetin (32 mg/kg) je aplikovan i.p. estog dana, 2h nakon poslednje p.o. aplikovane doze ekstrakta, a merenje vremena imobilnosti vreno je nakon 30 minuta radi utvrivanja mogue interakcije ispitivanih ekstrakata i fluoksetina (Cryan i sar., 2005). Radi poreenja i potvrde rezultata, eksperiment je izveden i sa grupom ivotinja koja nije primala ni lek ni ekstrakt (negativna kontrola), kao i sa grupom ivotinja koja je primala samo lek (pozitivna kontrola).
4.6.1.3. Uzdignuti lavirint

Za odreivanje mogueg anksiolitikog delovanja ispitivanih ekstrakata korien je uzdignuti lavirint (Elevated Plus Maze - EPM). Korien je lavirint izraen od stakla, postavljen na visinu od 45 cm (60 cm do vrha zatvorenog kraka). Kraci su bili 30 cm dugi i 5 cm iroki. Dimenzije centralne platforme su iznosile 5 x 6 cm. Eksperimentalne ivotinje koje su uestvovale u ispitivanju transportovane su u prostoriju gde je vreno merenje, najmanje sat vremena pre testa, kako bi se iskljuio uticaj premetanja na rezultate testa. Eksperiment je izvoen u jutarnjim asovima, a tokom merenja morala je da vlada tiina. Jedna ivotinja ulazila je samo jedanput u izvoenje EPM, kako bi se iskljuio uticaj ponovnog ulaska u test na rezultate (Walf i Frye, 2007). Nakon svake ivotinje, lavirint je temeljno ien, razblaenim rastvorom etanola. Ekstrakti su aplikovani peroralno 15 dana, sa poslednjom dozom 1h pre poetka EPM. ivotinje su postavljane u centar lavirinta okrenute ka otvorenom kraku, repom ka ekperimentatoru (Ibarra i sar., 2010). U periodu od 5 minuta, beleen je broj ulazaka i vreme provedeno u otvorenim i zatvorenim kracima, a na osnovu ovih merenja izraunato je i vreme koje je ivotinja provela na centralnoj platformi (Carobrez i Bertoglio, 2005). Anksiolitiki efekat ispitivanih ekstrakata praen je na osnovu dva parametra: indeksa aktivnosti, koji predstavlja broj ulazaka eksperimentalnih ivotinja u otvorene krake lavirinta podeljen sa ukupnim brojem ulazaka u sve
42
Neda Laki
krake, i indeksa zadravanja, koji prestavlja vreme provedeno u otvorenim kracima podeljeno sa vremenom provedenim u svim kracima u toku merenja (Ibarra i sar., 2010). Mala vrednost praenih indeksa odraavala je poveanu uznemirenost kod eksperimentalnih ivotinja. Radi poreenja i potvrde rezultata, eksperiment je izveden i sa grupama oznaenim kao negativna i pozitivna kontrola. Diazepam je korien kao pozitivna kontrola u dozi 1,5 mg/kg, aplikovan i.p. 30 minuta pre izvoenja testa (Labuda i Fuchs, 2001; Hagenbuch i sar., 2006; Carr i sar., 2006).
4.6.1.4. Test prepoznavanja novog objekta

Za praenje uticaja ispitivanih ekstrakata na memoriju (epizodiku) eksperimentalnih ivotinja korien je test prepoznavanja novog objekta (Novel Object Recognition - NOR). Aparat za izvoenje testa sastojao se od staklene arene, dimenzija 40 x 40 cm, sa visinom zidova od 40 cm, napravljene od stakla debljine 5 mm. Od objekata koriene su staklene, glatke, providne, okrugle posudice sa bruenim zatvaraem (prenika 3 cm i visine 7 cm) i obojena, hrapava, plastina kocka dimenzija 5 x 5 x 5 cm (Heyser i Chemero, 2012). Nakon svakog testiranja objekti su, kao i sama arena, detaljno ieni razblaenim etanolom, kako bi se otklonili mirisni tragovi. Eksperimentalne ivotinje koje su uestvovale u ispitivanju transportovane su u prostoriju gde je vreno merenje, najmanje sat vremena pre testa, kako bi se iskljuio uticaj premetanja na rezultate testa. Eksperiment je izvoen u jutarnjim asovima, a tokom merenja morala je da vlada tiina. Prvog dana testiranja, ivotinje su provodile po 3 minuta u praznoj areni, kako bi se na nju navikli. Drugog dana izvoen je NOR po sledeem protokolu: u prvom delu testa oznaenom sa T1 ivotinje su provodile po 3 minuta u areni u kojoj su bila postavljena dva identina objekta (staklene posudice), 5 cm od uglova arene, jedan naspram drugog; zatim je usledio interval izmeu dva testa (Intertrial Interval - ITI) u trajanju od 1h; a nakon toga drugi deo testa oznaen sa T2 u kom su ivotinje provodile ponovo po 3 minuta u areni, s tim to je ovaj put jedna staklena posudica bila zamenjena sa plastinom kockom (Dere i sar., 2007). Prilikom izvoenja testa praena su: vremena provedena pored objekta (sec) u T1 (a1 i a2) i vremena provedena pored objekata u T2 (a i b). Pod vremenom provedenim pored objekata podrazumeva se prouavanje objekata dodirivanjem njukom, prednjim apama ili brkovima.
43
Doktorska disertacija Na osnovu zabeleenih vremena, raunati su sledei parametri: e1 = a1 + a2; kao vreme provedeno pored identinih objekata u T1,
Neda Laki
e2 = a + b; zbirno vreme provedeno pored starog i novog, zamenjenog objekta u T2, d1 = b a; apsolutna razlika i d2 = d1/e2; relativna razlika, kao mere diskriminacije izmeu poznatog i novog objekta (indeks diskriminacije). ivotinje koje su provele manje od 7 sekundi pored objekata, bilo u T1 ili T2, iskljuene su iz ispitivanja. Ekstrakti su aplikovani peroralno tokom 15 uzastopnih dana, sa poslednjom dozom 1h pre T1. NOR je izveden i sa kontrolnom grupom ivotinja (koja nije primala ekstrakt). Dalje tumaenje rezultata vreno je na osnovu poreenja d2 sa kontrolnom grupom, kao i izmeu grupa (Bruin i Pouzet, 2006).
4.7. STATISTIKA OBRADA PODATAKA
Svi podaci dobijeni u in vitro i in vivo ispitivanjima, obraeni su pomou softverskog paketa Microsoft Office Excel for Windows ver. 2007, operacijama deskriptivne, univarijantne i test metodama statistike. Kao mera srednje vrednosti neke grupe podataka odreena je aritmetika sredina (x), a mera varijacije meu podacima izraena je standardnom devijacijom (). Statistika znaajnost razlika odreenih grupa, sa nivoom znaajnosti = 0.05 (odnosno verovatnoom p<0.05) ispitivana je Student t-testom za dva uzorka, odnosno analizom varijanse sa jednim promenljivim faktorom jednosmernom ANOVA analizom za istovremeno poreenje vie uzoraka.
44
Neda Laki
5. REZULTATI I DISKUSIJA
5.1. HEMIJSKI SASTAV ISPITIVANIH EKSTRAKATA TIMIJANA, MATINJAKA I PITOME NANE
U okviru ispitivanja poreenja hemijskog sastava ekstrakata otpadnog materijala koji zaostaje nakon izolacije etarskog ulja i standardnih komercijalnih ekstrakata timijana, matinjaka i pitome nane odreen je sadraj ukupnih fenola i flavonoida, dok je visokoefikasnom tenom hromatografijom izvrena identifikacija i kvantifikacija pojedinih biomolekula iz klase fenolkarbonskih kiselina i flavonoida.
5.1.1. Koliina suvog ekstrakta

Rezultati koliine suvog ekstrakta dobijenih metodom teno-vrste maceracije u 45% ili 75% etanolu (EMEA, 2007), kao i postdestilacionog ostatka dobijenog uparavanjem dekokta koji zaostaje nakon hidrodestilacije etarskog ulja predstavljeni su u tabeli 5.1. Koliine suvog ekstrakta dobijene od netretiranih listova (T1, M1, N1) (tab. 4.2) generalno odgovaraju podacima, saoptenim u literaturi (Kosar i sar., 2005; Dastmalchi i sar., 2008). Meutim, treba imati u vidu da se vrlo retko metodologija ekstrakcije u potpunosti podudara izmeu razliitih literaturnih navoda i da veliki broj faktora, kao to su polarnost ekstragensa, usitnjenost biljnog materijala, odnos droge i rastvaraa, temperatura i pritisak u sistemu i nain filtracije, utie na prinos suvog ekstrakta (Herode i sar., 2003; Peev i sar., 2010). Takoe, i veliki broj egzogenih faktora kao to su stepen osunanosti, tip, vlanost i sastav zemljita moe uticati na sadraj suvog ekstrakta u biljnom materijalu. to se tie ekstrakata dobijenih tretitanjem otpadnog materijala, u pogledu koliine suvog ekstrakta dobijeni su slini rezultati kod sve tri ispitivane droge. Naime, najvea koliina suvog ekstrakta dobija se uparavanjem postdstilacionog ostatka (T2, M2, N2) (24,2-37,19%) (tab. 5.1) i ovi rezultati su u saglasnosti sa podacima u do sada objavljenim radovima (Dorman i sar., 2003a; Kosar i sar., 2004). Znaajna razlika u sadraju suvog ekstrakta izmeu standardnih ekstrakata (T1, M1, N1) i onih dobijenih uparavanjem dekokta koji zaostaje nakon izolacije etarskog ulja (T2, M2, N2) delimino se moe objasniti
45
Neda Laki
nainom dobijanja uzorka. Kuvanjem droge u vodi (u postupku hidrodestilacije) ekstrahuju se vee koliine polarnih supstanci, ali i prisutni slobodni eeri, kao i oni nastali hidrolizom glikozida.
Tabela 5.1. Koliina suvog ostatka dobijenog iz Thymi folium, Melissae folium, Menthae piperitae folium i tretiranjem otpadnog materijala % suvog ekstrakta* (g s.e./100 g droge) 9,310,05 37,190,1 3,450,03 3,850,04 5,390,05 4,340,04 15,750,1 28,740,05 4,270,03 8,390,08 7,410,07 4,470,04 21,40,13 24,20,2 7,950,08 6,430,06 7,190,07 6,880,07
Uzorak T1 T2 T3 T4 T5 T6 M1 M2 M3 M4 M5 M6 N1 N2 N3 N4 N5 N6
*
srednja vrednost iz tri ponavljanja standardna devijacija
Koliina suvog ekstrakta koja se dobija hladnom maceracijom lista, iz koga je izolovano etarsko ulje i koji je nakon toga osuen (T3, T4, M3, M4, N3, N4), manja je u odnosu na koliinu koja se dobija od netretiranog lista (T1, M1, N1). Kod lista timijana i matinjaka neto vea koliina dobija se upotrebom 75% etanola (T4, M4), dok je se kod lista pitome nane vei prinos dobija korienjem 45% etanola (N3).
46
Neda Laki
Koliine suvog ostatka koje se dobijaju tretiranjem samlevene stabljike ispitivanih biljaka, takoe su manje u odnosu na standardno pripremljene ekstrakte, a u svim sluajevima favorizovana je upotreba 45% etanola kao ekstragensa.
5.1.2. Odreivanje sadraja ukupnih fenola i flavonoida u ispitivanim ekstraktima

Rezultati odreivanja sadraja ukupnih fenola i flavonoida u ispitivanim ekstraktima timijana, matinjaka i pitome nane dati su u tabelama 5.2, 5.3 i 5.4. U ispitivanim ekstraktima lista i stabljike timijana sadraj ukupnih fenola varira od 35,69 (T2) do 72,83 (T6) mg EGK/g s.e., dok se sadraj ukupnih flavonoida kree od 11,31 (T5) do 52,89 (T3) mg EK/g s.e. Znaajno je napomenuti da ekstrakti dobijeni tretiranjem dearomatizovanog lista (T3 i T4) imaju relativno visok sadraj i ukupnih fenola i ukupnih flavonoida kada se rezultati uporede sa sadrajem odreenim u netretiranim listovima (T1). to se tie ekstrakta dekokta koji zaostaje nakon izolacije etarskog ulja (T2) sadraj fenola i flavonoida je relativno mali u odnosu na T1, T3 i T4. Kada se ima u vidu da je u sluaju T2 dobijen najvei sadraj suvog ekstrakta, namee se zakljuak da su u tom ekstraktu u najveoj meri prisutni razliiti eeri koji doprinose prinosu, ali ne i poveanom sadraju aktivnih jedinjenja. Odreeni sadraj ukupnih fenola i flavonoida u T1 i T2 neto je nii u odnosu na podatke iz literature (Dorman i sar., 2003; Amarowicz i sar., 2009), dok za preostale ispitivane ekstrakte timijana ne postoje objavljeni navodi. Tabela 5.2. Sadraj ukupnih fenola i flavonoida u ispitivanim ekstraktima timijana TIP EKSTRAKTA sadraj ukupnih fenola (mg EGK/g s.e.) Thymus vulgaris - TIMIJAN T1 T2 T3 T4 T5 T6 49,71 35,69 58,23 62,45 45,95 72,83 33,88 22,79 52,89 50,09 11,31 18,34 sadraj ukupnih flavonoida (mg EK/g s.e.)
47
Neda Laki
Ekstrakti dobijeni tretiranjem stabljike timijana potencijalno bi mogli da poslue kao izvor fenolnih jedinjenja, dok su flavonoidi prisutni u relativno maloj koliini. Upotreba 75% etanola i u sluaju tretitanog lista i u sluaju stabljike (T4, T6) favorizovala je ekstrakciju aktivnih komponenti.
Tabela 5.3. Sadraj ukupnih fenola i flavonoida u ispitivanim ekstraktima matinjaka TIP EKSTRAKTA sadraj ukupnih fenola (mg EGK/g s.e.) Melissa officinalis - MATINJAK M1 M2 M3 M4 M5 M6 38,82 36,54 40,34 21,37 37,07 31,41 22,99 26,56 45,13 20,37 24,78 9,65 sadraj ukupnih flavonoida (mg EK/g s.e.)
U ispitivanim ekstraktima lista i stabljike matinjaka sadraj ukupnih fenola varira od 21,37 (M4) do 40,34 (M3) mg EGK/g s.e., dok se sadraj ukupnih flavonoida kree od 9,65 (M6) do 45,13 (M3) mg EK/g s.e. U sluaju ekstrakata matinjaka najvei sadraj ukupnih fenola i flavonoida odreen je u ekstraktu dearomatizovanog lista tretiranog 45% etanolom (M3), dok se znaajno manja koliina nalazi u ekstraktu dobijenom upotrebom 75% etanola (M4). Ovaj podatak je znaajan sa aspekta potencijalne primene otpadnog materijala koji zaostaje nakon izolacije etarskog ulja kao izvora fenolnih jedinjenja. Sadraj ukupnih fenola u netretiranom listu matinjaka (T1) neto je nii u odnosu na podatke iz literature (Dastmalchi i sar., 2009), dok je sadraj flavonoida neto vii (Carnat i sar., 1998). Stabljika matinjaka (M5, M6) odlikuje se relativno velikom koliinom ukupnih fenola, dok su flavonoidi prisutni u neto veoj meri kod ekstrakta dobijenog upotrebom 45% etanola (M5). Kada se analiziraju rezultati sadraja ukupnih fenola i flavonoida ispitivanih ekstrakata lista i stabljike pitome nane, vidi se da on varira od 24,14 (N5) do 38,73 (N4) mg EGK/g s.e., dok se
48
Neda Laki
sadraj ukupnih flavonoida kree od 10,44 (N5) do 67,63 (N4) mg EK/g s.e. Po sadraju ukupnih fenola i flavonoida, posebno se istie ekstrakt N4, dobijen tretitanjem dearomatizovanog lista 75% etanolom, posebno u pogledu ukupnih flavonoida gde je dobijena najvia vrednost u odnosu na sve analizirane ekstrakte. Ovakav rezultat moe se delimino objasniti dominacijom manje polarnih, metilovanih flavonoidnih glikozida u listu pitome nane, koji kuvanjem u vodi hidrolizuju na aglikon i eerne komponente. Osloboeni aglikoni dobro se ekstrahuju 75% etanolom kao manje polarnim ekstragensom (Mimica-Duki i Boin, 2008). Ekstrakt dobijen obradom dekokta koji zaostaje nakon izolacije etarskog ulja sadri neto manju koliinu ukupnih fenola u odnosu na literaturne podatke (Dorman i sar., 2003a).
Tabela 5.4. Sadraj ukupnih fenola i flavonoida u ispitivanim ekstraktima pitome nane TIP EKSTRAKTA sadraj ukupnih fenola (mg EGK/g s.e.) Mentha x piperita PITOMA NANA N1 N2 N3 N4 N5 N6 31,65 36,68 36,75 38,73 24,14 34,29 39,25 31,02 48,35 67,63 10,44 19,84 sadraj ukupnih flavonoida (mg EK/g s.e.)
Ekstrakti dobijeni tretiranjem stabljika pitome nane (N5, N6) sadre neto niu koliinu fenola i flavonoida u odnosu na ostale ispitivane ekstrakte pitome nane, a i u ovom sluaju vei sadraj dobijen je upotrebom 75% etanola kao ekstragensa (N6).
5.1.3. Rezultati HPLC-DAD analize ispitivanih ekstrakata

Zbog injenice da je u biljnim ekstraktima prisutan veoma irok spektar fenolnih jedinjenja, razvijen je metod koji omoguava simultanu detekciju razliitih fenola u jednoj analizi, to umnogome skrauje vreme potrebno za analizu kompleksnih meavina i smanjuje trokove (Mian i sar., 2011). Prilikom ispitivanja ekstrakata timijana izvrena je kvantifikacija sledeih
49
Neda Laki
fenolnih jedinjenja: galne, protokatehinske, kafene, hlorogenske, siringinske, p-kumarinske, ferulne i rozmarinske kiseline, kao i apigenina, kvercetina i rutina. Rezultati hromatografske analize ispitivanih ekstrakata timijana predstavljeni su u tabeli 5.5, a odgovarajui hromatogrami dati su u prilogu 8.1. U okviru frakcije fenolkarbonskih, hidroksicimetnih kiselina i derivata kafene kiseline, rozmarinska kiselina identifikovana je kao dominantni sastojak u svim ispitivanim ekstraktima timijana. Njena koliina varira od 52,36 (T5) do 105,08 (T4) mg/g s.e. to je u skladu sa prethodno objavljenim radovima za standardno pripremljen ekstrakt T1 (Wang i sar., 2004; Fecka i Turek, 2008). Takoe, galna, hlorogenska i ferulna kiselina prisutne su u znaajnoj koliini. Kao i u do sada objavljenim radovima kafena kiselina prisutna je u mnogo niim koncentracijama u odnosu na rozmarinsku kiselinu u ekstraktima timijana (Zheng i Wang, 2001; Wang i sar., 2004; Fecka i Turek, 2008). Tabela 5.5. Rezultati HPLC-DAD analize ekstrakata dobijenih tretiranjem lista timijana Uzorak c (mg/g s.e.) Galna kiselina Protokatehinska kiselina Kafena kiselina Hlorogenska kiselina Siringinska kiselina p-Kumarinska kiselina Ferulna kiselina Rutin Rozmarinska kiselina Kvercetin Apigenin T1 2,46 0,23 0,35 2,06 0,23 0,06 1,05 42,20 62,22 0,35 1,81 T2 2,58 0,22 0,23 2,02 0,42 0,04 0,89 34,44 60,49 0,04 0,79 T3 1,76 0,27 0,13 3,77 0,3 0,05 1,56 81,24 86,01 2,2 3,36 T4 0,77 0,37 0,33 4,75 0,36 0,06 1,9 87,11 105,08 3,98 4,45 T5 4,99 0,22 0,53 7,75 0,25 0,16 5,77 11,01 52,36 0,36 0,27 T6 4,18 0,39 0,9 9,76 0,33 0,18 8,64 14,16 94,2 0,83 0,81
U okviru flavonoidne frakcije rutin je kvantifikovan kao dominantan sastojak, a kao drugi po ukupnoj koliini u svim ispitivanim ekstraktima posle rozmarinske kiseline (11,01 (T5) do 87,11 (T4) mg/g s.e.). Ne postoje podaci o sadraju rutina u ekstraktima timijana, dok su odreene koncentracije apigenina u skladu sa prethodnim saoptenjima (Kosar i sar., 2005). Ono to se posebno izdvaja kao rezultat hromatografske analize ekstrakata timijana jeste injenica da je
50
Neda Laki
najvea koliina rozmarinske kiseline, ali i rutina, kvercetina i apigenina odreena u ekstraktu koji je dobijen tretiranjem dearomatizovanog lista 75% etanolom (T4). Znaajna koliina ovih jedinjenja dobijena je i u ekstraktu dearomatizovanog lista tretiranog 45% etanolom (T3). to se tie stabljike, ona je relativno siromana analiziranim fenolnim jedinjenjima (T5, T6), a po sadraju treba istai u njoj prisutnu koliinu hlorogenske (9,76 mg/g s.e.) i ferulne kiseline (8,64 mg/g s.e.) u ekstraktu stabljike dobijenog korienjem 75% etanola kao ekstragensa (T6). Prilikom ispitivanja ekstrakata matinjaka izvrena je kvantifikacija sledeih fenolnih jedinjenja: galne, protokatehinske, kafene, hlorogenske i rozmarinske kiseline, kao i katehina, naringenina i rutina. Rezultati hromatografske analize ispitivanih ekstrakata predstavljeni su u tabeli 5.6, a odgovarajui hromatogrami dati su u prilogu 8.2. Tabela 5.6. Rezultati HPLC-DAD analize ekstrakata dobijenih tretiranjem lista matinjaka Uzorak c (mg/g s.e.) Galna kiselina Protokatehinska kiselina Katehin Kafena kiselina Hlorogenska kiselina Rutin Rozmarinska kiselina Naringenin M1 0,14 0,44 0,59 0,86 0,82 3,38 40,39 0,79 M2 0,13 0,45 0,63 1,56 2,34 1,93 24,82 0,04 M3 0,15 0,62 0,85 1,43 1,71 1,99 42,51 0,37 M4 0,15 0,6 0,89 1,34 1,67 1,67 42,98 0,61 M5 0,25 0,25 0,27 0,93 0,82 0,69 15,82 0,12 M6 0,07 0,29 0,35 0,92 0,74 1,33 20,79 0,14
U svim ispitivanim ekstraktima rozmarinska kiselina kvantifikovana je kao dominantno jedinjenje, iji sadraj varira od 15,82 (M5) do 42,98 (M4) mg/g s.e, to je generalno u skladu sa rezultatima drugih naunika za standardno dobijeni ekstrakt M1 (Wang i sar., 2004; Dastmalchi i sar., 2008). Takoe, i sadraj kafene i hlorogenske kiseline odgovara objavljenim rezultatima za M1 (Marques i Farah, 2009), dok su galna i protokatehinska kiselina prvi put kvantifikovane. Sadraj flavonoida je relativno nizak, a dominantno jedinjenje je rutin, sa sadrajem od 0,69 (M5) do 3,38 (M1) mg/g s.e. Koliina naringenina odgovara rezultatima (Dastmalchi i saradnika, 2008). Od svih ispitivanih ekstrakata po sadraju rozmarinske kiseline, ali i drugih fenolnih
51
Neda Laki
jedinjenja (kafena i hlorogenska kiselina, rutin) se izdvajaju M3 i M4, dobijeni tretiranjem lista nakon izolacije etarskog ulja 45% (M3) i 75% (M4) etanolom. Dekokt lista matinjaka (M2), relativno je siromaan identifikovanim jedinjenjima, a posebno rozmarinskom kiselinom, u odnosu na druge analizirane ekstrakte lista matinjaka. Ovakav rezultat moe se objasniti podacima koji ukazuju na to da je rozmarinska kiselina nestabilna na temperaturama viim od 50C, pri emu se predlae superkritina ekstrakcija etarskog ulja aromatinih biljaka podporodice Nepetoideae radi poveanja prinosa rozmarinske kiseline (Angelov i sar., 2010). Hromatografskom analizom ekstrakata pitome nane izvrena je kvantifikacija sledeih fenolnih jedinjenja: galne, protokatehinske, kafene, hlorogenske, siringinske, ferulne i rozmarinske kiseline, kao i katehina, epikatehina, apigenina, naringenina i rutina. Rezultati su predstavljeni u tabeli 5.7, a odgovarajui hromatogrami dati su u prilogu 8.3. Tabela 5.7. Rezultati HPLC-DAD analize ekstrakata dobijenih tretiranjem lista pitome nane Uzorak c (mg/g s.e.) Galna kiselina Protokatehinska kiselina Katehin Kafena kiselina Hlorogenska kiselina Siringinska kiselina Epikatehin Ferulna kiselina Rutin Rozmarinska kiselina Naringenin Apigenin N1 0,15 0,27 0,46 4,29 0,56 0,07 0,35 0,24 0,61 20,51 0,18 0,51 N2 0,09 0,32 0,32 1,61 0,66 0,06 0,32 0,14 0,45 11,99 0,13 0,31 N3 0,08 0,39 0,88 2,09 1,12 0,09 0,47 0,18 0,66 18,89 0,73 3,07 N4 0,08 0,46 0,39 2,27 1,42 0,12 0,58 0,22 0,76 21,19 0,72 2,98 N5 0,11 0,25 1,41 2,47 0,82 0,09 0,45 0,13 0,5 7,05 0,03 0,31 N6 0,13 0,36 1,82 2,53 0,56 0,13 0,63 0,18 1,25 10,19 0,14 0,6
U okviru frakcije fenolkarbonskih, hidroksicimetnih kiselina i derivata kafene kiseline, rozmarinska kiselina identifikovana je kao dominantni sastojak u svim ispitivanim ekstraktima pitome nane. Njena koliina varira od 7,05 (N5) do 21,19 (N4) mg/g s.e. to je u skladu sa prethodno objavljenim radovima za standardno pripremljen ekstrakt N1, a takoe, i kafena i
52
Neda Laki
hlorogenska kiselina prisutne su u znaajnoj koliini (Wang i sar., 2004). Rezultati za koliinu ispitivanih fenolnih kiselina u dekoktu koji zaostaje nakon izolacije etarskog ulja (N2) u saglasnosti su sa do sada prezentovanim radovima (Dorman i sar., 2003a; Kosar i sar., 2004). U okviru flavonoidne frakcije apigenin je prisutan u najvioj koncentraciji (0,31 (N5) do 3,07 (N3) mg/g s.e.). Ekstrakti pripremljeni tretiranjem dearomatizovanog lista (N3 i N4) istiu se po sadraju kvantifikovanh fenolnih jedinjenja, a posebno N4, to je u skladu sa rezultatima dobijenim prilikom odreivanja sadraja ukupnih fenola i flavonoida. Generalno, svi ispitivani uzorci dobijeni ekstrakcijom lista iz koga je izolovano etarsko ulje timijana (T3, T4), matinjaka (M3, M4) i pitome nane (N3, N4), predstavljaju veoma znaajan izvor fenolnih jedinjenja, pre svega rozmarinske kiseline.
5.2. REZULTATI ISPITIVANJA BIOHEMIJSKIH AKTIVNOSTI 5.2.1. In vitro antioksidantno delovanje

Molekulski kiseonik neophodan je za opstanak aerobnih organizama na Zemlji kao zavrni primalac elektrona u respiratornom lancu smetenom u mitohondrijama, ime se obezbeuje efikasnije stvaranje energije. Pored toga, ivi organizmi koriste kiseonik i za metabolike transformacije toksinih materija putem jetrenih enzima (citohrom P-450). Od ukupne koliine kiseonika u eliji, jedan mali deo (2-3%) se transformie u reaktivne oblike (kao to su hidroksil, superoksid anjon, hidrokoperoksil, peroksil, alkil i alkoksil radikali, singlet kiseonik, vodonik peroksid i organski peroksidi) koji su u stanju da reaguju sa osnovnim elijskim molekulima (proteini, lipidi, nukleinske kiseline) i organelama (lizozomi, peroksizomi) i da izazovu promenu njihove strukture i funkcije (Halliwell i Whiteman, 2004). Kao posledica toga, svi ivi organizmi razvijaju antioksidantni odbrambeni sistem, da bi se zatitili od toksinosti reaktivnih oblika kiseonika i ulaska u procese oksidativnog stresa. Ova zatita odvija se na dva osnovna nivoa. Prvi nivo predstavlja primarnu antioksidantnu zatitu u vidu enzimskih i neenzimskih sistema, dok se drugi naziva sekundarna antioksidantna zatita i obuhvata brojna niskomolekularna jedinjenja razliitog porekla. Veina sekundarnih antioksidanata poreklom je iz biljaka (flavonoidi, fenolne kiseline, komponente etarskih ulja). One ih stvaraju u toku svog sekundarnog metabolizma, ime upotpunjuju funkcionisanje biljnog organizma. Svoju
53
Neda Laki
antioksidantnu aktivnost navedena jedinjenja ispoljavaju preko razliitih mehanizama, a najee tako to uklanjaju ve stvorene radikale, vezuju metalne jone, inhibiu proces lipidne peroksidacije, a neki od njih inhibiraju i enzimske sisteme koji produkuju reaktivne oblike kiseonika (Burda i Oleszek, 2001; Dai i sar., 2006). Brojnim ispitivanjima, danas se potvruje njihova antioksidantna aktivnost i opravdanost korienja u razliitim fitopreparatima u prevenciji i koterapiji pojedinih oboljenja, najee hroninih, iji se nastanak i razvoj povezuje sa oksidativnim stresom, kao to su ateroskleroza, razliiti oblici karcinoma, brojna neurodegenerativna oboljenja, kao i sam proces starenja (Klauniq i Kamendulis, 2004). Takoe, oksidativni stres povezuje se i sa razliitim komplikacijama u trudnoi (Al-Gubory i sar., 2010), a prepoznata je korist od upotrebe antioksidanasa i u stanjima kao to je diabetes mellitus, u kojima je poveana produkcija reaktivnih oblika kiseonika, radi spreavanja i usporavanja razvoja komplikacija (Geil i sar., 2008). Pored toga, danas, posebno zapadno drutvo, suoeno je sa zelenom revolucijom koja, izmeu ostalog, zahteva to manju upotrebu sintetskih aditiva u hrani koji potencijalno mogu biti toksini i tetni po ivotnu okolinu (Burt, 2004; Selmi i Sadok, 2008; Berastegi sar., 2011). Tako jedinjenja prirodnog porekla koja poseduju antioksidantna svojstva postaju vrlo interesantna i za prehrambenu i kozmetiku industriju, jer mogu da spree ili suzbiju oksidativne procese koji se mogu javiti u sirovom materijalu, kao i u toku prerade, pre svega termike, ali i u finalnom proizvodu prilikom skladitenja. Isto tako, potvrena je i opravdanost upotrebe biljaka bogatih antioksadantima kao funkcionalne hrane, hrane koja, pored nutritivnih vrednosti, poseduje i lekovita svojstva (Ferrari, 2004). Procena antioksidantne aktivnosti nekog prirodnog proizvoda zapoinje in vitro testovima, kao jeftinijim i etiki prihvatljivijim u odnosu na in vivo modele. Meutim, treba imati na umu kompleksnu prirodu oksidativnih procesa koji se odvijaju u organizmu, pa se stoga preporuuje da se uvek izvede nekoliko testova usmerenih ka razliitim mehanizmima antioksidantne zatite, da bi se realno procenio antioksidantni potencijal ispitivanog uzorka (Houghton i sar., 2007). Zbog svega navedenog, in vitro antioksidantni potencijal ispitivanih ekstrakata otpadnog materijala timijana, matinjaka i pitome nane odreen je merenjem kapaciteta neutralizacije slobodnih radikala (RSC), kao i praenjem njihovog uticaja na intenzitet lipidne peroksidacije.
54
Neda Laki
5.2.1.1. Skevinder aktivnost - RSC

Antiradikalsko delovanje ispitivanih ekstrakata praeno je merenjem njihove sposobnosti da neutraliu stabilni sintetski 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil radikal (DPPH) i hidroksil radikal (OH). Primenom DPPH-testa praena je sposobnost ispitivanih ekstrakata da deluju kao donori H atoma ili elektrona stabilnim DPPH radikalima, pri emu dolazi do tranformacije ljubiasto obojenog radikalskog oblika (DPPH) u redukovanu, uto obojenu formu DPPH-H. Iako DPPH radikal predstavlja sintetski radikal, koji kao takav u prirodi ne postoji, rezultati ovog testa mogu se koristiti kao preliminarni pokazatelj antiradikalskog delovanja i mogu se iskoristiti u definisanju antioksidantne aktivnosti u kombinaciji sa rezultatima dobijenim u drugim testovima. Na slikama 5.1, 5.2 i 5.3 dati su rezultati regresione analize sposobnosti ispitivanih ekstrakata timijana, matinjaka i pitome nane da neutraliu DPPH. Takoe, vrednosti neutralizacije 50% DPPH radikala (IC50 vrednosti) odreene su i prikazane za dominantne komponente ispitivanih ekstrakata, rozmarinsku kiselinu i rutin, kao i za jedan od najee korienih sintetskih antioksidanasa, terc-butilhidroksitoluen (BHT). Svi ispitivani ekstrakti ispoljili su snanu ili veoma snanu skevinder aktivnost (tab. 5.7) (Scherer i Godoy, 2009).
Slika 5.1. IC50 vrednosti neutralizacije DPPH ispitivanim ekstraktima timijana i standardima rutina, rozmarinske kiseline i BHT-a (g/ml)
55
Neda Laki
Kod ekstrakata otpadnog materijala timijana uoena je izraena koncentracijska zavisnost neutralizacije DPPH radikala, pri emu se procenat neutralizacije kretao od 2,6 do 91,42 pri koncentracijama suvih ekstrakata od 0,25 do 7,5 g/ml. Ovakvi rezultati u saglasnosti su sa prethodnim saoptenjima za standardno pripremljen ekstrakt timijana (T1) (Kosar i sar., 2005). Ekstrakti otpadnog materijala, a posebno T3 i T4 pripremljeni tretiranjem dearomatizovanog lista, ispoljili su znaajnu antioksidantnu aktivnost u DPPH testu, to je u skladu sa odreenim visokim sadrajem fenolnih jedinjenja (tab. 5.2). Takoe, i ekstrakti stabljike timijana (T5 i T6) ispoljavaju snaan ili veoma snaan antiradikalski potencijal, to se moe povezati sa visokim koncentracijama hlorogenske kiseline u ovim uzorcima (tab. 5.5) (Marques i Farah, 2009).
Slika 5.2. IC50 vrednosti neutralizacije DPPH ispitivanim ekstraktima matinjaka i standardima rutina, rozmarinske kiseline i BHT-a (g/ml) Ekstrakti lista i otpadnog materijala koji zaostaju nakon izolacije etarskog ulja matinjaka pokazali su takoe izraenu koncentracijsku zavisnost neutralizacije DPPH radikala, pri emu se procenat neutralizacije kretao od 8,76 do 84,07 pri koncentracijama suvih ekstrakata od 0,25 do 7,5 g/ml. Ovakvi rezultati u saglasnosti su sa podacima iz literature za standardno pripremljen ekstrakt (M1) i infuz lista matinjaka (to bi se moglo porediti sa ispitivanim ekstraktom M2
56
Neda Laki
dobijenim uparavanjem dekokta koji zaostaje nakon izolacije etarskog ulja) (Dastmalchi i sar., 2008; Dias i sar., 2012; Lin i sar., 2012). Kao i u prethodnom sluaju, najjau skevinder aktivnost ispoljili su ekstrakti dearomatizovanog lista (M3 i M4) koji se odlikuju visokim sadrajem rozmarinske kiseline i drugih kvantifikovanih fenolnih jedinjenja (tab. 5.6). Ekstrakt M4 ispoljio je najvei antiradikalski potencijal u odnosu na sve ispitivane ekstrakte sa indeksom antioksidantne aktivnosti 8,44 (tab. 5.7). Ekstrakti stabljike matinjaka, M5 i M6 poseduju takoe snano delovanje na DPPH radikal (1<AAI<2), uporedivo sa delovanjem sintetskog antioksidansa BHT-a (tab. 5.8). Ispitivani ekstrakti pitome nane ispoljili su takoe koncentracijsku zavisnost neutralizacije DPPH radikala, pri emu se procenat neutralizacije kretao od 4,95 do 85,08 pri koncentracijama suvih ekstrakata od 1,25 do 12,5 g/ml.
Slika 5.3. IC50 vrednosti neutralizacije DPPH ispitivanim ekstraktima pitome nane i standardima rutina, rozmarinske kiseline i BHT-a (g/ml) Svi ispitivani ekstrakti pitome nane, osim ekstrakta dobijenog tretiranjem stabljike 45% etanolom (N5) koji je i najsiromaniji kvantifikovanim fenolnim jedinjenjima (tab. 5.7) ispoljili su veoma snanu skevinder aktivnost na DPPH to je u saglasnostima sa podacima iz literature (Dorman i sar., 2003; Capecka i sar., 2005). To je posebno znaajno sa aspekta
57
Neda Laki
potencijalne primene ekstrakata dobijenih tretiranjem otpadnog materijala pitome nane kao antioksidanata u prehrambenoj i farmaceutskoj industriji, s obzirom da su svi pomenuti ekstrakti ispoljili jau aktivnost u odnosu na BHT. Ono to se takoe uoava kod svih ispitivanih ekstrakata je da su standardni rastvori rozmarinske kiseline i rutina ispoljili jau antioksidantnu aktivnost u odnosu na same ekstrakte, to je u skladu sa podacima iz literature (Dastmalchi i sar., 2008), a moe ukazati na eventualnu primenu ispitivanih ekstrakata otpadnog materijala timijana, matinjaka i pitome nane za izolaciju ovih i slinih fenolnih jedinjenja.
Tabela 5.8. Indeks antioksidantne aktivnosti ispitivanih ekstrakata i standardnih supstanci.

Uzorak DPPH AAI*
3,30 T1 3,28 T2 2,11 T3 2,40 T4 1,74 T5 2,63 T6 3,43 M1 2,97 M2 4,84 M3 8,44 M4 1,76 M5 1,72 M6 3,11 N1 3,94 N2 2,75 N3 4,02 N4 1,05 N5 2,92 N6 16,16 Rozmarinska kiselina 7,28 Rutin 1,30 BHT * slabi AAI< 0,5; umereni 0,5<AAI<1; snani 1<AAI<2 i veoma snani potencijalni antioksidansi AAI>2
Radi dobijanja kompletnije slike o antiradikalskom potencijalu ispitivanih ekstrakata odreen je i njihov uticanj na hidroksil radikal (OH), hemijski najreaktivniji redukovani oblik kiseonika, koji je samim tim i najodgovorniji za njegove toksine efekte (Halliwell i Whiteman, 2004). Antiradikalsko delovanje ispitivanih ekstrakata na nivou neutralizacije OH radikala odreeno je merenjem stepena inhibicije degradacije 2-deoksi-D-riboze, pod uticajem OH generisanog u
58
Neda Laki
Fentonovoj reakciji, u produkte (pre svih malonil dialdehid-MDA) koji reaguju sa tiobarbiturnom kiselinom. Iz dobijenih rezultata neutralizacije OH radikala i na osnovu izraunatih IC50 vrednosti (sl. 5.4, 5.5 i 5.6) moe se uoiti da je najsnaniju skevinder aktivnost meu ekstraktima timijana ispoljio T4, dobijen tretiranjem dearomatizovanog lista 75% etanolom. Pored toga, i ekstrakt T3 ispoljio je signifikantnu aktivnost, uporedivu sa antiradikalskim delovanjem ekstrakta T1, koji je pripremljen od netretiranog lista, oficinalnim postupkom (EMEA, 2007). Najslabiju sposobnost neutralizacije OH radikala ispoljio je ekstrakt T2, nastao uparavanjem dekokta koji zaostaje nakon izolacije etarskog ulja i izdvajanja dearomatizovanog lista. Ovakav rezultat moe se objasniti injenicom da ovako pripremljen ekstrakt, iako daje najvei prinos suvog ekstrakta, ima najmanju koliinu aktivnih komponenti.
Slika 5.4. IC50 vrednosti neutralizacije OH ispitivanim ekstraktima timijana (g/ml) Procenat neutralizacije OH od strane ispitivanih ekstrakata timijana kretao se od 14,17 do 77,22 pri koncentracijama suvih ekstrakata od 8,33 do 133,3 g/ml, to je u skladu sa literaturnim navodima (Kosar i sar., 2005).
59
Neda Laki
Slika 5.5. IC50 vrednosti neutralizacije OH ispitivanim ekstraktima matinjaka (g/ml) Ispitivani ekstrakti matinjaka ispoljili su ujednaenu skevinder aktivnost na OH, pri emu se procenat neutralizacije kretao od 13,48 do 70,67, pri koncentracijama suvih ekstrakata od 8,33 do 166,7 g/ml. Ono to je znaajno istai je da su svi ekstrakti pripremljeni tretiranjem otpadnog materijala koji zaostaje nakon proizvodnje droga Melissae folium i Melissae aetheroleum ispoljili aktivnost koja je bliska i uporediva sa aktivnou standardno pripremljenog ekstrakta koji ulazi u sastav razliitih fitopreparata.
Slika 5.6. IC50 vrednosti neutralizacije OH ispitivanim ekstraktima pitome nane (g/ml)
60
Neda Laki
Meu ispitivanim ekstraktima pitome nane po sposobnosti neutralizacije OH u ispitivanom test sistemu istie se ekstrakt dearomatizovanog lista tretiran 45% etanolom (N3), iako je N4 okarakterisan kao najbogatiji rozmarinskom kiselinom (tab. 5.6). Ovako istaknuto delovanje ekstrakta N3 delimino se moe objasniti ne najveim, ve optimalnim odnosom fenolnih jedinjenja, povoljnim za neutralizaciju OH. Sa druge strane, N4 je oznaen kao ekstrakt sa najveim sadrajem ukupnih flavonoida. Ako se uzme u obzir da je dokazano i za list pitome nane karakteristino prisustvo metilovanih aglikona flavonoida (Mimica-Duki, 1992; MimicaDuki i Boin, 2008), koji imaju smanjen broj OH grupa raspoloivih za uee u slobodnoradikalskim reakcijama (Dai i sar., 2006) onda se ovakav rezultat i moe oekivati. Procenat neutralizacije OH od strane ispitivanih ekstrakata pitome nane kretao se od 13,97 do 73,43 pri koncentracijama suvih ekstrakata od 8,33 do 166,7 g/ml, to je u skladu sa literaturnim navodima (Dorman i sar., 2003). Treba napomenuti da je kod svih ispitivanih ekstrakata timijana, matinjaka i pitome nane nakon postizanja maksimuma neutralizacije OH radikala dolo do pada ili stagnacije skevinder aktivnosti.
5.2.1.2. Odreivanje inhibicije lipidne peroksidacije - LP

Pored antiradikalskog delovanja, u cilju odreivanja kompletne antioksidantne aktivnosti razliitih supstanci potrebno je ispitati i njihov uticaj na procese lipidne peroksidacije, s obzirom na to da peroksidacija lipida u organizmu pre svega kompromituje funkciju elijskih i subelijskih membrana, ali i drugih struktura koje sadre lipide. Takoe, lipidni radikali nastali u procesu peroksidacije, pored toga to reaguju sa susednim lipidima, mogu reagovati i sa drugim biomolekulima, kao to su proteini i nukleinske kiseline, izazivajui seriju oteenja i reaktivnih produkata (Halliwell, 2006). Pored toga, proces lipidne peroksidacije esto predstavlja problem u prehrambenoj i farmaceutskoj industriji u smislu smanjenja roka trajanja razliitih proizvoda i smanjenja njihovog kvaliteta (Kreivaitis i sar., 2013). Uticaj razliitih prirodnih proizvoda (izolovanih jedinjenja ili ekstrakata) na intenzitet lipidne peroksidacije prouava se na velikom broju razliitih supstrata. Najee su to lipozomi, prvenstveno zbog lakog dispergovanja u ispitivanom rastvoru i jednostavnog izvoenja metode. Sa druge strane, ispitivanje procesa lipidne peroksidacije na masnom ulju ili homogenatu jetre, iako oteano zbog kompleksnog sastava supstrata, moe dati realnije podatke o protektivnom
61
Neda Laki
delovanju odreenih ekstrakata u jednom takvom sloenom sistemu (Boin, 2009). Zbog svega navedenog, odreivanje uticaja ispitivanih ekstrakata timijana, matinjaka i pitome nane na proces lipidne peroksidacije izvreno je na kukuruznom ulju kao supstratu, putem TBA testa u Fe2+/H2O2 sistemu indukcije. Ispitivani ekstrakti timijana ispoljili su sposobnost smanjenja peroksidacije nezasienih masnih kiselina u kukuruznom ulju u opsegu od 6 do 88,15%, pri koncentracijama suvog ekstrakta od 2,5 do 50 g/ml. Kao i u testovima koji su pratili antiradikalsko delovanje ekstrakata timijana, najjau aktivnost ispoljili su ekstrakti dearomatizovanog lista (T3 i T4), dok je neto nia aktivnost zabeleena kod ekstrakata dobijenim od dekokta koji zaostaje nakon izolacije etarskog ulja i stabljike (T2, T5 i T6). Meutim, svi ispitivani ekstrakti ispoljili su delovanje na proces LP slian standardnom ekstraktu (T1), a takoe slinu ili ak jau aktivnost u odnosu da rozmarinsku kiselinu (sl. 5.7). Ono to je takoe znaajno jeste da su svi ispitivani ekstrakti timijana ispoljili jau inhibiciju LP u odnosu na sintetski antioksidans BHT.
Slika 5.7. IC50 vrednosti inhibicije lipidne peroksidacije ispitivanim ekstraktima timijana, rozmarinske kiseline i BHT-a u Fe2+/H2O2 sistemu indukcije (g/ml) Ispitivani ekstrakti matinjaka ispoljili su sposobnost inhibicije LP u opsegu od 1,86 do 96,89%, pri koncentracijama od 2,5 do 50 g/ml.
62
Neda Laki
Slika 5.8. IC50 vrednosti inhibicije lipidne peroksidacije ispitivanim ekstraktima matinjaka, rozmarinske kiseline i BHT-a u Fe2+/H2O2 sistemu indukcije (g/ml) Najjai inhibitorni uticaj ispoljio je ekstrakt dearomatizovanog lista tretiranog 75% etanolom (M4), to je u saglasnosti sa potvrenim znaajnim antiokidantnim potencijalom ekstrakata pripremljenih od dearomatizovanog lista matinjaka (sl. 5.8). Ekstrakti dobijeni od dekokta koji zaostaje nakon izolacije etarskog ulja (M2), kao i ekstrakti pripremljeni tretiranjem stabljike matinjaka (M5 i M6) ispoljili su neto slabiji inhibitorni uticaj na LP, slian sa do sada potvrenim uticajem infuza matinjaka pripremljenog od komercijalnih kesica aja (Dias i sar., 2012). Kod svih ispitivanih uzoraka nakon postignutog maksimuma inhibicije LP, dolo je do pada ili do stagnacije aktivnosti. U sluaju ispitivanih ekstrakata pitome nane, procenat inhibicije LP kretao se od 8,86 do 85,2 pri istim primenjenim koncentracijama kao i kod prethodnih ekstrakata. Skoro svi ispitivani ekstrakti ispoljili su snaan inhibitorni uticaj na LP, jai u odnosu na izolovanu rozmarinsku kiselinu (sl. 5.9). Ovakav rezultat ukazuje na svojevrsan sinergizam fenolnih jedinjenja prisutnih u ispitivanim ekstraktima na sloen proces peroksidacije lipida (Guimares i sar., 2011). Isto tako, svi ispitivani ekstrakti nane ispoljili su jae delovanje u odnosu na BHT, to je znaajno i sa aspekta potreba farmaceutske i prehrambene industrije za antioksidansima prirodnog porekla,
63
Neda Laki
koji e pored toga to su ekoloki i netoksini biti i dovoljno efikasni da spree oksidativna oteenja razliitih proizvoda.
Slika 5.9. IC50 vrednosti inhibicije lipidne peroksidacije ispitivanim ekstraktima pitome nane, rozmarinske kiseline i BHT-a u Fe2+/H2O2 sistemu indukcije (g/ml)
5.2.2. In vivo antioksidantno (hepatoprotektivno) delovanje

Izmeu stvaranja kiseoninih radikala i njihovog uklanjanja postoji sloena i precizno regulisana ravnotea. Ukoliko se ona poremeti dolazi do oksidativnog stresa, stanja organizma gde je dolo do potpunog ili deliminog gubitka kontrole nad metabolizmom kiseoninih radikala (Halliwell i Whiteman, 2004). Uklanjanje toksinih oblika kiseonika iz elija katalisano je razliitim enzimima primarne antioksidantne zatite kao to su superoksid dismutaza (SOD), katalaza (CAT), ksantin oksidaza (XOD), glutation peroksidaza (GSH-Px), glutation reduktaza (GSH-R) i glutation S-tranferaza (GSH-(S)T). U zatitu organizma protiv toksinog delovanja ROS ukljuene su i druge, neenzimske komponente primarne antioksidantne zatite, kao to su proteini transferin i ceruloplazmin, i razliiti elijski antioksidansi kao to su redukovani glutation (GSH), albumin, mokrana kiselina i bilirubin (Halliwell i Gutteridge, 1999).
64
Neda Laki
Prilikom ispitivanja i procene in vivo antioksidantnog delovanja razliitih prirodnih proizvoda, vrlo esto se prati njihov uticaj na aktivnost i nivo pomenutih komponenata antioksidantne zatite u odreenim tkivima. Ovakva ispitivanja znaajna su iz dva razloga. Prvo, ona pruaju kompletan uvid u antioksidantni potencijal odreenih ekstrakata ili izolovanih jedinjenja i mogunost njihove primene u prevenciji i koterapiji bolesti modernog doba koja se povezuju sa poveanom produkcijom kiseoninih radikala. Sa druge strane iroka i esta upotreba razliitih fitopreparata namee potrebu za poznavanjem ne samo efikasnosti i kvaliteta, nego i bezbednosti njihove primene. Jedan od potencijalnih mehanizama akutnog i, mnogo ee, hroninog oteenja zdravlja prilikom upotrebe razliitih agenasa konvencionalne, ali i alternativne medicine jeste iscrpljivanje sistema primarne antiokidantne zatite u organizmu. Najvei antioksidantni potencijal prema ksenobioticima poseduje jetra, s obzirom da sve materije koje se unesu u organizam u okviru metabolikih promena ostvaruju izvesno dejstvo na ovaj organ, kao svojevstnu laboratoriju organizma (Hussain i sar., 2009). Zbog svega navedenog, u okviru ispitivanja hepatoprotektivnog delovanja ispitivanih ekstrakata timijana, matinjaka i pitome nane praeno je nekoliko parametara: intenzitet lipidne peroksidacije, koliina redukovanog glutationa i aktivnost enzima ukljuenih u oksidativne procese u homogenatu jetre (XOD, SOD, GSH-Px, GSH-R, GSH-(S)T) eksperimentalnih ivotinja samostalno ili nakon akutnog tretmana ugljentetrahloridom, kao induktorom oksidativnog stresa. Za ispitivanja uticaja na jetrene enzime i oksidativni status eksperimentalnih ivotinja odabrani su ekstrakti timijana (T1 i T3), matinjaka (M1 i M3) i pitome nane (N1, N3 i N4), kao oficinalni ili pripremljeni tretitanjem dearomatizomanog lista kao otpadnog materijala koji zaostaje nakon izolacije etarskog ulja, koji su u in vitro testovima ispoljili najvei antioksidantni potencijal. Prilikom ispitivanja uticaja na proces LP utvreno je da su svi ispitivani ekstrakti doveli do statistiki znaajnog smanjenja intenziteta lipidne peroksidacije u homogenatu jetre eksperimentalnih ivotinja u odnosu na grupu tretiranu CCl4, dok su ekstrakti T1, T3 i N4 doveli i do statistiki znaajnog smanjenja LP u odnosu i na istu kontrolu (tab. 5.9, 5.10, 5.11).
65
Neda Laki
Tabela 5.9. Vrednosti ispitivanih biohemijskih parametara homogenata jetre kontrolnih i ivotinja tretiranih ekstraktima timijana EKSTRAKT PARAMETAR KONTROLA
T1
TRETMAN CCl4
397,435,4
*
T3
CCl4
45067,1
*
374,655,0
*
341,943,9
*
CCl4
436,530,9
*
proteini
(mg/g jetre)
31840,2
LP
(nmol MDA/mg pr.)
0,470,13
0,980,12
0,210,08
0,540,06
0,170,08
0,710,25
XOD
(nmol/mg pr. min-1)
4,710,98
11,841,45
3,680,17
5,220,51
4,470,34
5,81,33
SOD
(IU/mg proteina)
a
0,570,11
1,240,33
0,70,44 0,630,14
0,750,38
0,70,26
1,070,34 0,360,06*
GSH
(nmol/mg proteina)
1,050,31
0,050,04*
0,080,02*
0,580,18
GSH-Px (IU/g proteina) GSH-R

(nmol NADPH/ mg pr. min )
-1
1,930,75
3,160,86
1,390,3
2,120,61
2,3 1,0
2,371,14
12,615,58
18,940,93
7,954,19
9,446,08
8,345,89
10,3212,34
GSH-(S)T
(nmol konjugata/mg pr. min-1)
a *
5,482,84
16,318,87
11,323,46
18,365,06
6,11,01
15,828,61
IU - internacionalne jedinice - t-testom potvrena statistika znaajnost razlike u odnosu na istu kontrolu (p<0,01) - t-testom potvrena statistika znaajnost razlike u odnosu na grupu CCl4 (p<0,01) Ono to je ipak od najveeg znaaja jeste signifikantno smanjenje intenziteta LP prilikom istovremene aplikacije CCl4 i ekstrakata T1 i M1, to ukazuje na njihovo protektivno delovanje.
66
Neda Laki
Tabela 5.10. Vrednosti ispitivanih biohemijskih parametara homogenata jetre kontrolnih i ivotinja tretiranih ekstraktima matinjaka EKSTRAKT Kontrola PARAMETAR proteini
(mg/g jetre) 31840,2
M1
TRETMAN 374,040,08
M3
CCl4 CCl4
CCl4
397,435,4
*
448,274,3 0,520,11
362,528,9 405,518,0*
*
LP
(nmol MDA/mg pr.)
0,470,13
0,980,12
0,330,17
0,730,08
0,810,13
XOD
(nmol/mg pr. min )
-1
4,710,98
11,841,45
3,930,61
5,111,10
3,770,26
6,330,79
SOD
(IU/mg proteina)
a
0,570,11
1,240,33*
*
0,960,42
1,020,26*
*
0,690,35
1,170,28*
*
GSH
(nmol/mg proteina)
1,050,31
0,050,04
0,490,19
0,060,01
0,560,09
0,150,03
GSH-Px (IU/g proteina) GSH-R

(nmol NADPH/ mg pr. min-1)
a
1,930,75
3,160,86
1,740,37
3,491,59
1,160,41
3,680,84
12,615,58
18,940,93
10,546,66
22,514,62
10,84,83
17,8911,9
GSH-(S)T
a *
5,482,84
16,318,87
14,9110,02 18,2315,06 16,186,89
11,214,66
IU - internacionalne jedinice - t-testom potvrena statistika znaajnost razlike u odnosu na kontrolu (p<0,01) - t-testom potvrena statistika znaajnost razlike u odnosu na grupu CCl4 (p<0,01) Praenjem ispitivanja uticaja ekstrakata timijana, matinjaka i pitome nane na enzim ksantin oksidazu utvreno je da T1, T3, M1 i M3 ispoljavaju protektivno delovanje jer dovode do statistiki znaajnog smanjenja aktivnosti XOD u stanju indukovanog oksidativnog stresa, tj. nakon aplikacije CCl4 u odnosu na grupu kojoj je jednokratno aplikovan CCl4. Ovakav rezultat je u skladu sa prethodno dobijenim uticajem na intenzitet LP, ime se naroito ispitivani ekstrakti timijana istiu po antioksidantnom delovanju.
67
Neda Laki
Enzim superoksid dismutaza katalizuje reakciju dismutacije superoksidnog radikala do vodonik peroksida i molekulskog kiseonika iju dalju transformaciju preuzimaju drugi enzimi primarne antioksidantne zatite. U stanjima oksidativnog stresa, kada je poveana produkcija slobodnih radikala u organizmu, poveava se i aktivnost ovog enzima, pa je tako u grupi eksperimentalnih ivotinja koje su tretirane CCl4 dolo do statistiki znaajnog poveanja aktivnosti SOD u odnosu na kontrolnu grupu. Sa druge strane, ekstrakt T1 spreio je statistiki znaajno poveanje aktivnosti SOD nakon aplikacije CCl4 u odnosu na grupu kojoj nije bio viekratno aplikovan T1 pre indukcije oksidativnog stresa, to ponovo ukazuje na njegov protektivni efekat (Hartog i sar., 2003). Glutation peroksidaza katalizuje redukciju vodonik peroksida do vode, uz prisustvo redukovanog glutationa kao donora elektrona. Kao i u sluaju SOD, jednokratna aplikacija CCl4 dovela je do znaajnog poveanja aktivnosti GSH-Px u odnosu na kontrolnu grupu, dok je T1 ispoljio protektivni efekat i spreio ovo poveanje. CCl4 kao hepatotoksini agens, poveavajui aktivnost enzima primarne antioksidantne zatite troi redukovani glutation. Ekstrakti T3, N3 i N4 spreavaju znaajniji pad koncentracije GSH, odnosno u grupama ivotinja pretretiranim ovim ekstraktima koliina GSH u homogenatu jetre statistiki znaajno je vea u odnosu na grupu koja je primala samo CCl4. Pored toga, N4 dovodi i do statistiki znaajnog poveanja koncentracije GSH u odnosu na kontrolnu grupu. Ovakvi rezultati ukazuju na antioksidantni potencijal i otpadnog materijala koji zaostaje nakon izolacije etarskog ulja pitome nane. Prilikom praenja uticaja ispitivanih ekstrakata na GSH-R i GSH-(S)T, zabeleeno je da sami ekstrakti timijana, matinjaka i pitome nane, kako standardni, tako i oni pripremljeni od otpadnog materijala, iako ne ispoljavaju protektivni efekat u smislu smanjenja aktivnosti pomenutih enzima, ne utiu statistiki znaajno na njihovu aktivnost u odnosu na kontrolnu grupu. Ovo moe biti pokazatelj bezbednosti primene i potvrde GRAS statusa ispitivanih ekstrakata.
68
Tabela 5.11. Vrednosti ispitivanih biohemijskih parametara homogenata jetre kontrolnih i ivotinja tretitanih ekstraktima pitome nane EKSTRAKT N1 TRETMAN 397,435,4 0,980,12* 0,730,16 7,630,9 0,860,45 1,580,05 2,081,58 6,642,31 3,341,16 11,412,16* 1,120,29* 0,30,08* 2,271,03 0,970,54 11,841,45* 1,240,33* 0,850,29 1,60,53 3,031,17 9,498,33 10,596,66 1,410,94 19,3111,86 10,125,44 0,290,14* 1,350,47 0,050,04* 3,160,86 18,940,93 16,318,87 7,51,52 11,340,72* 0,660,07 1,260,3* 317,827,1 360,411,3 317,332,0 359,214,0 351,213,2 0,130,03* 7,372,49 0,520,22 2,750,49* 10,23 CCl4 CCl4 CCl4 CCl4 392,753,2 1,140,17* 9,541,84* 0,90,42 0,960,28 2,140,88 18,3410,41 10,8912,69 13,525,72 14,4310,63 5,491,89 7,393,64 N3 N4
Kontrola
PARAMETAR
proteini
(mg/g jetre)
31840,2
LP
(nmol MDA/mg pr.)
0,470,13
XOD
(nmol/mg pr. min-1)
4,710,98
SOD
(IU/mg proteina)a
0,570,11
GSH
(nmol/mg proteina)
1,050,31
GSH-Px
(IU/g proteina)a
1,930,75
GSH-R
(nmol NADPH/ mg pr. min-1)
12,615,58
GSH-(S)T
5,482,84
Neda Laki
IU internacionalne jedinice - t-testom potvrena statistika znaajnost razlike u odnosu na kontrolu (p<0,01) - t-testom potvrena statistika znaajnost razlike u odnosu na grupu CCl4 (p<0,01)
69
Neda Laki
5.2.3. Inhibicija acetilholinesteraze

Jedna od bolesti modernog doba koja se povezuje sa poveanom produkcijom kiseoninih radikala je i Alchajmerova bolest (AB), ija uestalost znaajno raste sa godinama starosti, od 5% u dobi od 65 godina do 90% i vie u dobi od 95 godina (Rang i sar., 2005). Prema podacima pojedinih autora i Svetske zdravstvene organizacije (Adams i sar., 2007; WHO, 2012) oko 35 miliona ljudi u razvijenim zemljama imalo je razvijene simptome AB do 2010., pri emu i dalje postoji tendencija rasta broja obolelih. Nijedan od farmakolokih pristupa nije uspeo da u potpunosti zaustavi progresiju AB, koja predstavlja jedan od najveih zdravstvenih problema dananjice (Anekonda, 2005). Zbog toga se smatra da je neophodna i potreba za alternativnim pristupom leenja u vidu fitoterapije, poto se biljke od davnina tradicionalno koriste u tretmanu razliitih neurodegenerativnih oboljenja (Dastmalchi i sar., 2008). Alchajmerova bolest vezuje se za smanjenje modane mase i lokalizovani gubitak neurona, preteno u hipokampusu i bazalnom delu prednjeg mozga. Dve mikroskopske promene su karakteristine za ovu bolest: ekstracelularni amiloidni plakovi, sastavljeni od amorfnih depozita proteina -amiloida (A) i intraneuronalni spletovi neurofibrila, koje ine vlakna fosforilisanih proteina vezanih za mikrotubule (Tau). Mikroskopske promene u mozgu praene su inflamacijom i poveanim oksidativnim stresom u samim neuronima, kao i poremeajem neurotransmisije, pre svega holinergine. Zbog toga su pokuaji normalizacije holinergine transmisije racionalno mesto delovanja lekova koji se koriste u leenju i ublaavanju simptoma AB. To se moe postii na dva naina: stimulacijom holinerginih receptora (stimulacija nikotinskih receptora nikotinom) i produavanjem dejstva acetilholina (ACh) u sinaptinoj pukotini inhibicijom enzima acetilholin esteraze (AChE) (Howes i sar., 2003). Upravo su inhibitori AChE, kao to je galantamin, lekovi izbora za simptomatsko leenje AB (Pearson, 2001). Takoe, postoje dokazi da antiinflamatorni lekovi, kao i antioksidansi mogu uticati na tok AB i smanjiti gubitak neurona (Sugaya, 2000). Veliki broj biljnih vrsta nalazi svoju primenu u prevenciji i leenju razliitih oboljenja centralnog nervnog sistema (Zhang, 2004; Adams i sar., 2007). Smatra se da razliiti fitopreparati svoje dejstvo kod AB ostvaruju preko inhibicije AChE, koje je vrlo esto udrueno sa izraenim antiinflamatornim i antioksidantnim delovanjem (Howes i sar., 2003). Za ovo delovanje
70
Neda Laki
odgovorna su, pre svega fenolna jedinjenja, flavonoidi i fenolkarbonske kiseline (Pereira i sar., 2005). Ekstrakti timijana, matinjaka i pitome nane bogat su izvor ovih jedinjenja, a poznato je da se u narodu smatra da matinjak doprinosti dugovenosti i ouvanju memorije (Santos-Neto i sar., 2006). Zbog svega navedenog u okviru ispitivanja biohemijskih aktivnosti, praen je i uticaj ekstrakata timijana, matinjaka i pitome nane, kako standardnih, tako i onih dobijenih tretiranjem otpadnog materijala na enzim acetilholinesterazu. Kao pozitivna kontrola korien je galantamin, a praen je i uticaj izolovane rozmarinske kiseline. Ovo odreivanje zasniva se na redukciji Ellmanovog reagensa (5,5'-ditio-bis(2-ntrobenzoeva) kiselina (DTNB)) do nitrobenzoata. Tioholin, kao donor elektrona u ovoj reakciji nastaje delovanjem AChE na supstrat, acetiltioholin jodid (Wook Choi i sar., 2007; Conforti i sar., 2007; Orhan i sar., 2008; Dastmalchi i sar., 2009). Ispitivani ekstrakti timijana ispoljili su inhibitorni uticaj na AChE pri emu se IC50 vrednost kretala od 0,86 (T4) do 3 (T2) mg/ml (sl. 5.10). Ove vrednosti su neto vie u odnosu na one odreene za ekstrakte drugih Thymus vrsta (Mata i sar., 2007). Najjae delovanje ispoljili su ekstrakti T3 i T4, koji su u hemijskim ispitivanjima oznaeni kao najbogatiji izvor fenolnih jedinjenja (tab. 5.5).
Slika 5.10. IC50 vrednosti inhibitornog delovanja na enzim acetilholinesterazu ispitivanih ekstrakata timijana, galantamina, rozmarinske i hlorogenske kiseline (mg/ml)
71
Neda Laki
Ekstrakti stabljike timijana (T5 i T6) ispoljili su inhibitorni uticaj slian standardno pripremljenom ekstraktu, to se moe povezati sa relativno visokim sadrajem hlorogenske i ferulne kiseline u ovim ekstraktima. Za ferulnu kiselinu utvreno je da utie na kognitivne funkcije, mogue uticajem na AChE, a pored toga ima izraeno antiinflamatorno i antioksidantno delovanje, to sve doprinosi pozitivnom uticaju na simptome AB (Howes i sar., 2003). Za ekstrakte netretiranog lista matinjaka postoje brojni podaci koji potvruju njegovo antiholinesterazno delovanje (Ferreira i sar., 2006; Dastmalchi i sar., 2009; Lopez i sar., 2009; Orhan i Aslan, 2009). Pored toga, smatra se da sedativni i anksiolitiki efekat ekstrakata lista matinjaka moe biti od koristi u ublaavanju simptoma bihevioralnih poremeaja i agitacije kod obolelih od AB. Takoe i antioksidantno i antiinflamatorno delovanje ekstrakta lista matinjaka, kao i vezivanje za muskarinske i nikotinske receptore in vitro, mogue je, doprinose povoljnom delovanju na holinerginu funkciju kod AB (Wake i sar., 2001; Lin i sar., 2012). I ono to je najznaajnije, brojne klinike studije su pokazale da je kod pacijenata obolelih od AB koji su primali ekstrakt lista matinjaka dolo do znaajnog poboljanja kognitivnih funkcija (Akhondzadeh i sar., 2003; Akhondzadeh i Abbasi, 2006; Santos-Neto i sar., 2006).
Slika 5.11. IC50 vrednosti inhibitornog delovanja na enzim acetilholinesterazu ispitivanih ekstrakata matinjaka, galantamina, rozmarinske i hlorogenske kiseline (mg/ml)
72
Neda Laki
Vrednosti 50% neutralizacije AChE (IC50 vrednosti) ispitivanih ekstrakata matinjaka kretale su se u opsegu od 0,34 (M1) do 3,98 (M5) mg/ml (sl. 5.11). Najjae delovanje ispoljio je standardno pripremljen ekstrakt (M1), pri emu su dobijene neto nie vrednosti u odnosu na podatke iz literature. Takoe, neto nie vrednosti dobijene su i za M2, koji se moe uporediti sa vrednostima ranije objavljenim za dekokt lista matinjaka (Ferreira i sar., 2006; Orhan i Aslan, 2009). Ekstrakti tretiranog lista (M3 i M4) ispoljili su izraeno antiholinesterazno delovanje sa vrednostima IC50 koje se mogu uporediti sa vrednostima dobijenim za dekokt. Ovakvi rezultati ukazuju na mogunost primene dearomatizovanog lista matinjaka za izradu ekstrakata koji bi svoju primenu mogli nai u prevenciji i koterapiji AB. Ispitivani ekstrakti pitome nane ispoljili su ihibitorni uticaj na AChE, sa vrednostima IC50 od 0,88 (N4) do 5,43 (N2) mg/ml (Mata i sar., 2007). Najjae delovanje ispoljili su ekstrakti dearomatizovanog lista, a posebno N4 koji je i najbogatiji kvantifikovanim fenolkarbonskim kiselinama i flavonoidima (tab. 5.7). Pored uticaja na AChE, ekstrakti bogati flavonoidima mogu imati terapijski efekat kod AB, zbog potencijala flavonoida da tite mozak od delovanja neurotoksina i razliitih zapaljenskih procesa, da aktiviraju sinaptiku transmisiju i poboljavaju cirkulaciju u mozgu (Spencer, 2010).
Slika 5.12. IC50 vrednosti inhibitornog delovanja na enzim acetilholinesterazu ispitivanih ekstrakata pitome nane, galantamina, rozmarinske i hlorogenske kiseline (mg/ml)
73
Neda Laki
Takoe, svi ispitivani ekstrakti ispoljili su jai uticaj u odnosu na izolovane fenolkarbonske kiseline, to ukazuje na sinergistiko delovanje fenolnih jedinjenja u inhibiciji AChE.
5.3.
REZULTATI MIKROBIOLOKIH ISPITIVANJA
Biljke se od davnina koriste kao hrana, zain i lek. Mnogo pre nego to se i znalo za postojanje mikroorganizama, biljke su se kao deo tradicionalne medicine brojnih naroda koristile za leenje razliitih infektivnih bolesti. Isto tako, upotrebom biljaka kao zaina ne samo da se uticalo na organoleptika svojstva namirnica, nego je to bio i jedan od naina za njihovo konzerviranje (Rios i Recio, 2005). I danas moderni potroai zahtevaju namirnice koje e biti minimalno obraene i koje e sadrati to je vie mogue aditive prirodnog porekla koji za razliku od sintetskih aditiva, nee biti potencijalno toksini i neekoloki. Isto tako i sam pristup u odgajanju stoke i hrane biljnog porekla ide ka tome da se koriste tradicionalni pristupi u zatiti od bolesti i tetoina (Selmi i Sadok, 2008). Pored toga, neracionalna upotreba antibiotika u humanoj i veterinarskoj medicini, ali i za promociju rasta u poljoprivredi dovela je do sve ee pojave rezistencije nekih patogenih mikroorganizama (Palaniappan i Holley, 2010) kao to su Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Entherococcus spp., Salmonella spp., i Campylobacter spp. (Marchado i sar., 2003; Voravuthikunchai i sar., 2004; Fukai i sar., 2004; Rani i Khullar, 2004). Od znaaja je poznavanje i potencijalnog sinergistikog delovanja rezliitih prirodnih proizvoda i konvencionalnih antibiotika kako bi se uticalo na smanjenje pojave rezistencije (Shibata i sar., 2005; Garcia-Garcia i sar., 2011). Brojne studije potvrdile su i opravdale upotrebu lekovitog bilja kao antiinfektivnih agenasa (Negi sar., 2012). Meu njima, posebno se po antimikrobnom potencijalu istiu razliita fenolna jedinjenja (Sohn i sar., 2004) ili biljni ekstrakti koji su bogati ovim jedinjenjima. Ovo je posebno znaajno s obzirom da fenolna jedinjenja poseduju i snaan antioksidantni potencijal, pa je ovakvo udrueno delovanje znaajno ne samo u farmaceutskoj i prehrambenoj industriji, nego i u svim drugim oblastima gde je znaajno spreiti oksidaciju i kontaminaciju odreenog proizvoda (Moure i sar., 2001). Zbog svega navedenog, antimikrobno delovanje ispitivanih ekstrakata timijana, matinjaka i pitome nane odreeno je praenjem njihovog uticaja na Staphylococcus aureus, Salmonella infantis, Escherichia coli i Bacillus cereus (tab. 5.12).
74
Neda Laki
Ispitivani ekstrakti timijana ispoljili su relativno snaan antimikrobni potencijal na sve ispitivane sojeve, pri emu se po delovanju istiu T3 i T4, ekstrakti dobijeni od dearomatizovanog lista.
Tabela 5.12. Antimikrobno delovanje ispitivanih ekstrakata timijana, matinjaka i pitome nane Tip Staphylococcus ekstrakta aureus MIC (mg UF/ml) Salmonella infantis MIC (mg UF/ml) Escherichia coli MIC (mg UF/ml) Bacillus cereus MIC (mg UF/ml)
Thymus vulgaris - Timijan T1 T2 T3 T4 T5 T6 0,09 0,14 0,04 0,06 0,09 0,1 0,28 0,39 0,12 0,12 0,13 0,14 0,14 0,56 0,12 0,12 0,19 0,2 0,14 1,55 0,03 0,03 0,06 0,04
Melissa officinalis Matinjak M1 M2 M3 M4 M5 M6 0,22 0,18 0,08 0,03 0,21 0,22 0,22 0,25 0,08 0,17 0,29 0,35 0,22 0,25 0,08 0,17 0,21 0,26 0,22 0,51 0,12 0,17 0,26 0,26
Mentha x piperita - Pitoma nana N1 N2 N3 N4 N5 N6 BHT (mg/ml) 0,12 0,15 0,07 0,15 0,13 0,28 0,55 0,125 0,15 0,15 0,21 0,39 0,55 0,55 0,26 0,3 0,18 0,15 0,20 0,19 0,55 0,35 0,59 0,07 0,11 0,27 0,28 0,28
75
Neda Laki
Takoe, i ekstrakti stabljike timijana ispoljavaju znaajno antimikrobno delovanje. Uporeivanjem ovih rezultata sa podacima dobijenim za BHT, esto korieni sintetski aditiv jo uoljiviji postaje potencijal ekstrakata otpadnog materijala timijana. U sluaju ekstrakata matinjaka, dobijeni su slini rezultati, gde se takoe, ekstrakti lista kao otpadnog materijala koji zaostaje nakon izolacije etarskog ulja (M3 i M4) istiu po svom antimikrobnom delovanju. I u sluaju ekstrakata koji se dobijaju od otpadnog materijala pitome nane dobijeni su slini rezultati, pri emu je ekstrakt N3 ispoljio najjai antimikrobni potencijal. Analizom prezentovanih rezultata, izdvojeni su ekstrakti T3, M3 i N3, kao i standardno pripremljeni ekstrakti, radi poreenja, za testiranje njihovog bakteriostatskog delovanja na Campylobacter jejuni (sl. 5.13). Ovaj soj predstavlja poseban problem u proizvodnji i preradi mesa, pa tako vrlo esto moe biti uzrok trovanja hranom.
Slika 5.13. Minimalne inhibitorne koncentracije (mg UF/ml) ispitivanih ekstrakata timijana, matinjaka i pitome nane na Campylobacter jejuni Odabrani ekstrakti ispoljili su relativno snano antibakterijsko delovanje na Campylobacter jejuni, a posebno je znaajno to su ekstrakti dearomatizovanog lista (T3, M3 i N3) ispoljili veoma slino (u sluaju timijana) i jae delovanje u odnosu na oficinalne ekstrakte matinjaka i pitome nane. Rezultati mikrobiolokih ispitivanja ukazuju na mogunost primene ekstrakata otpadnog materijala pre svega u prehrambenoj industriji kao prirodnih aditiva, a takoe i za izolaciju dominantnih jedinjenja, fenolkarbonskih kiselina i flavonoida, najzaslunijih za izraeno antimikrobno delovanje.
76
Neda Laki
5.4.
REZULTATI ISPITIVANJA FARMAKOLOKOG DELOVANJA
Biljni lekovi predstavljaju jedan od najeih oblika alternativnog leenja u svetu. Ono to se danas zahteva u okviru racionalne fitoterapije je da biljni lekovi budu kvalitetni, efikasni i bezbedni. Meutim, trite je preplavljeno brojnim preparatima, esto nejasno definisanog sastava. Sa druge strane, veina ljudi (ak 80%) koji koriste biljne lekove i dijetetske suplemente odabir pravi na osnovu saveta prijatelja ili na osnovu informacija dostupnih preko interneta i drugih sredstava informisanja. Isto tako, samo 45% ljudi koji biljne lekove daju deci prijavljuje to pedijatru (Giveon i sar., 2004). Pretpostavka je da pacijenti ne prijavljuju korienje svojim lekarima iz razloga to ih smatraju potpuno bezbednim, ak i kada ih kombinuju sa konvencionalnim lekovima. Danas postoji sve vei broj podataka o neeljenim efektima i interakcijama biljnih lekova sa drugim biljnim ili konvencionalnim lekovima odnosno hranom. Ove interakcije nekad mogu da budu i vrlo opasne, bilo da vode ka potenciranju ili ka izostajanju dejstva konvencionalnog leka (Williamson i sar., 2009). Zbog svega navedenog, izuzetno je vano dobro definisanje farmakolokog delovanja biljnih lekova, koje se moe ostvariti razliitim in vivo testovima, kao i prouavanje mogunosti stupanja u interakciju sa konvencionalnim lekovima. U okviru ispitivanja farmakolokog delovanja odabranih ekstrakata timijana (T1 i T3), matinjaka (M1 i M3) i pitome nane (N1, N3 i N4), praen je njihov uticaj na motornu koordinciju, antidepresivno i anksiolitiko delovanje, kao i uticaj na memoriju eksperimentalnih ivotinja. Pored toga, praena je i mogunost pojave interakcija izmeu ispitivanih ekstrakata i odreenih lekova iz grupe sedativa (midazolam) i antidepresiva (fluoksetin).
5.4.1. Uticaj na motornu koordinaciju (metod rotirajueg tapa)

Metod rotirajueg tapa je jednostavan farmakodinamski test za praenje uticaja sintetskih lekova, kao i prirodnih proizvoda (izolovanih jedinjenja ili razliitih ekstrakata) na motornu koordinaciju eksperimentalnih ivotinja. Lek koji se najee koristi kao pozitivna kontrola u ovom testu je midazolam, iz grupe benzodiazepinskih sedativa, koji u manjim dozama deluje kao anksiolitik i antikonvulziv, dok u veim dozama deluje hipnotiki uz uticaj na miini tonus i koordinaciju. Karakterie ga brz poetak i kratak period dejstva, metabolie se preteno u jetri
77
Neda Laki
preko izoenzima CYP3A4, naroito ukoliko se aplikuje parenteralno (Rang, 2005). Zbog toga je, pored toga to se koristi zbog uticaja na motornu koordinaciju, njegova intraperitonealna primena u eksperimentalne svrhe pogodna i za indirektno ispitivanje potencijalnih interakcija na nivou pomenutog jetrenog enzima. Tabela 5.13. Retenciono vreme kao merilo efekta midazolama na motornu koordinaciju kod kontrolne i grupa tretiranih ispitivanim ekstraktima timijana VREMENSKI PERIOD (min) 1-4 5-8 10-13 15-18 20-23 T1-kontrola 128,868,1 17225,3 180,00,0 180,00,0 180,00,0 T1-lek 86,173,5* 128,967* 145,751,2 16450,6 151,750,3 T1-ekstrakt 180,00,0 180,00,0 180,00,0 180,00,0 180,00,0 T1-interakcija 130,372,9* 16934,8* 172,623,4* 170,430,3 170,729,4 T3-kontrola 146,647 180,00,0 175,313,4 180,00,0 180,00,0 T3-lek 117,572,63* 134,262,8* 132,657,4* 135,667,8 153,257,3 T3-ekstrakt 166,542,7 177,77,3 180,00,0 180,00,0 180,00,0 T3-interakcija 116,778,7 89,375,5 150,364,0 16727,4 165,634,1 * - t-testom potvrena statistika znaajnost razlike u odnosu na kontrolu (p<0,05) EKSTRAKT Midazolam je, primenjen intraperitonealno u dozi od 5 mg/kg, doveo do poremeaja motorne koordinacije kod svih ispitivanih grupa ivotinja, to se manifestovalo kao skraenje vremena koje su ivotinje provele na tapu (naroito u prvom i petom minutu nakon aplikacije) u odnosu na grupu ivotinja koja nije primala lek (tab. 5.13, 5.14, 5.15).
Slika 5.14. Stepen (%) depresivnog delovanja leka midazolama, ispitivanih ekstrakata timijana i kombinacije leka i ekstrakta na motornu koordinaciju eskperimentalnih ivotinja
78
Neda Laki
Nijedan od ispitivanih ekstrakata timijana, matinjaka i pitome nane nije ispoljio uticaj na motornu koordinaciju eksperimentalnih ivotinja nakon viekratne peroralne aplikacije doza prikazanih u tabeli 4.2 (sl. 5.14, 5.15, 5.16). Tabela 5.14. Retenciono vreme kao merilo efekta midazolama na motornu koordinaciju kod kontrolne i grupa tretiranih ispitivanim ekstraktima matinjaka VREMENSKI PERIOD (min) 1-4 5-8 10-13 15-18 20-23 M1-kontrola 77,772,7 122,858,1 160,739,5 180,00,0 180,00,0 M1-lek 62,263,7* 109,875,3* 13747,2* 145,651,2 148,351,7 M1-ekstrakt 180,00,0 180,00,0 180,00,0 180,00,0 180,00,0 M1-interakcija 147,948,6* 1800,0* 16547,4 1779,5 1800,0 M3-kontrola 9970,1 102,669,1 166,540,5 171,226,4 165,241,2 M3-lek 97,583* 80,466,6* 149,856 16536,1 162,235,6 M3-ekstrakt 174,816,4 165,844,9 180,00,0 180,00,0 180,00,0 * M3-interakcija 116,271,1 161,438,3 180,00,0 180,00,0 180,00,0 * - t-testom potvrena statistika znaajnost razlike u odnosu na kontrolu (p<0,05) EKSTRAKT Prilikom istovremene aplikacije ispitivanih ekstrakata timijana (T2) i pitome nane (N1, N3 i N4) utvreno je da oni ne utiu statistiki znaajno na dejstvo primenjenog leka. Kod ovih grupa eksperimentalnih ivotinja nije dolo ni do produetka ni do skraenja vremena provedenog na rotirajuem tapu, u odnosu na grupu kojoj je aplikovan samo midazolam.
Slika 5.15. Stepen (%) depresivnog delovanja leka midazolama, ispitivanih ekstrakata matinjaka i kombinacije leka i ekstrakta na motornu koordinaciju eskperimentalnih ivotinja
79
Neda Laki
Meutim, ANOVA testom utvreno je da postoje statistiki znaajne razlike izmeu grupa koje su primale lek i grupa koje su primale lek u kombinaciji sa ekstraktima T2, N1, N3 i N4 (p<0,05), to potvruje da midazolam deluje u obe grupe tokom ispitivanog vremenskog perioda. Tabela 5.15. Retenciono vreme kao merilo efekta midazolama na motornu koordinaciju kod kontrolne i grupa tretiranih ispitivanim ekstraktima pitome nane VREMENSKI PERIOD (min) 1-4 5-8 10-13 15-18 20-23 N1-kontrola 74,7879,31 134,5569,59 180,00,0 180,00,0 180,00,0 N1-lek 88,5581,42* 115,3375,3* 132,7874,07 149,6760,46 170,6727,26 N1-ekstrakt 142,2261,03 169,7830,67 174,4416,67 180,00,0 180,00,0 N1-interakcija 146,6767,51 152,5559,21 166,6740,0 170,8927,33 180,00,0 N3-kontrola 79,675,8 13474,32 159,245,53 180,00,0 180,00,0 N3-lek 80,775,4* 112,686,75* 140,369,06 164,648,7 180,00,0 N3-ekstrakt 180,00,0 180,00,0 180,00,0 180,00,0 180,00,0 N3-interakcija 118,873,13 146,371,11 178,54,74 180,00,0 180,00,0 N4-kontrola 97,976,4 14867,48 164,349,65 168,337,0 180,00,0 N4-lek 180,00,0* 180,00,0* 180,00,0 180,00,0 180,00,0 N4-ekstrakt 83,777,49 95,487,37 151,648,02 169,234,15 170,629,73 N4-interakcija 112,975,18 127,684,39 141,167,72 177,77,27 180,00,0 * - t-testom potvrena statistika znaajnost razlike u odnosu na kontrolu (p<0,05) EKSTRAKT Sa druge strane, za ekstrakte T1, M1 i M2 utvreno je da utiu na dejstvo leka, jer postoje statistiki znaajne razlike u vremenima, u odreenim delovima testa (prvi i peti minut od aplikacije midazolama), u odnosu na grupu ivotinja koja je primala samo midazolam. Ovaj uticaj se ogleda u produetku vremena odravanja na tapu kod grupe ivotinja koja je istovremeno primala i ekstrakt i lek (tab. 5.13, 5.14. 5.15). To znai da ranije prestaje efekat leka, odnosno ranije prestaje ometanje motorike pod uticajem midazolama. Razlog ovom slabijem dejstvu leka moe biti njegova bra eliminacija, odnosno ubrzan metabolizam zbog indukcije jetrenog izoenzima CYP3A4 od strane ispitivanih ekstrakata. Ova interakcija potvrena je i ANOVA testom (p<0,05), jer postoje statistiki znaajne razlike u vremenima provedenim na tapu u vremenskom toku ispitivanja, to ukazuje da ekstrakt menja efekat leka.
80
Neda Laki
Slika 5.16. Stepen (%) depresivnog delovanja leka midazolama, ispitivanih ekstrakata pitome nane i kombinacije leka i ekstrakta na motornu koordinaciju eskperimentalnih ivotinja
5.4.2. Antidepresivno delovanje (test suspenzije o repu)

Test suspenzije o repu jedan je od najee primenjivanih farmakodinamskih testova za procenu antidepresivnog delovanja sintetskih lekova, kao i prirodnih proizvoda. Test se zasniva na injenici da bezizlazna situacija kao to je suspenzija o rep kod ivotinja izaziva, nakon odreenog vremena borbe, odustajanje od izbavljenja koje se manifestuje nepokretnou. Razliiti lekovi koji imaju antidepresivno dejstvo smanjuju period imobilnosti, a poveavaju vreme u kom ivotinja pokuava da se izbavi iz ove stresne situacije (Cryan i sar., 2005). Fluoksetin, koji je korien kao pozitivna kontrola, je antidepresiv iz grupe selektivnih inhibitora preuzimanja serotonina sa dugim vremenom polueliminacije (24-96h), to poveava mogunost stupanja u interakcije sa drugim sintetskim i biljnim lekovima (Rang, 2005).
81
Neda Laki
Fluoksetin je, primenjen intraperitonealno u dozi od 32 mg/kg, doveo do statistiki znaajnog skraenja perioda imobilnosti kod svih ispitivanih grupa ivotinja, u odnosu na grupu ivotinja koja nije primala lek (tab. 5.16, 5.17, 5.18). Sa druge strane, nijedan od ispitivanih ekstrakata viekratno aplikovan per os nije ispoljio antidepresivno delovanje u odnosu na grupu ivotinja koja nije primala ekstrakt. Vremena imobilizacije u ovim grupama bila su vrlo bliska kontrolnim vrednostima. Tabela 5.16. Vreme imobilizacije (s) tokom TST u trajanju od 6 minuta nakon primene leka fluoksetina i ispitivanih ekstrakata timijana VRSTA TRETMANA Vreme imobilizacije (s) T1-kontrola 162,738,6 T1-lek 9538,5* T1-ekstrakt 143,850,8 T1-lek+ekstrakt 93,954,7* T3-kontrola 85,353,7 T3-lek 53,256,7* T3-ekstrakt 110,567,9 T3- lek+ekstrakt 53,243,4* * - t-testom potvrena statistika znaajnost razlike u odnosu na kontrolu (p<0,05) Takoe, prilikom praenja mogue interakcije izmeu ispitivanih ekstrakata timijana, matinjaka i pitome nane i fluoksetina, njihovom istovremenom aplikacijom utvreno je da nema farmakodinamskog sadejstva, odnosno, nisu utvrene statistiki znaajne razlike u vremenima imobilizacije u odnosu na grupu ivotinja kojoj je aplikovan samo fluoksetin. Tabela 5.17. Vreme imobilizacije (s) tokom TST u trajanju od 6 minuta nakon primene leka fluoksetina i ispitivanih ekstrakata matinjaka VRSTA TRETMANA Vreme imobilizacije (s) M1-kontrola 107,631,5 M1-lek 66,127,2* M1-ekstrakt 10051,0 M1- lek+ekstrakt 57,133,2* M3-kontrola 124,735,2 M3-lek 69,635,4* M3-ekstrakt 118,551,3 M3- lek+ekstrakt 66,530,9* * - t-testom potvrena statistika znaajnost razlike u odnosu na kontrolu (p<0,05)
82
Neda Laki
Tabela 5.18. Vreme imobilizacije (s) tokom TST u trajanju od 6 minuta nakon primene leka fluoksetina i ispitivanih ekstrakata pitome nane VRSTA TRETMANA Vreme imobilizacije (s) N1-kontrola 118,3336,6 N1-lek 51,2531,9* N1-ekstrakt 101,2532,59 N1- lek+ekstrakt 62,1242,8* N3-kontrola 112,851,8 N3-lek 69,849,3* N3-ekstrakt 10950,3 N3- lek+ekstrakt 74,153,0* N4-kontrola 105,246,15 N4-lek 59,650,9* N4-ekstrakt 97,152,7 N4- lek+ekstrakt 5653,3* * - t-testom potvrena statistika znaajnost razlike u odnosu na kontrolu (p<0,05) Na osnovu dobijenih rezultata moe se zakljuiti da ispitivani ekstrakti ne menjaju znaajno mehanizam dejstva leka, odnosno da ispitivani ekstrakti nemaju upliva u obrt serotonina. Ovaj podatak je znaajan jer ukazuje na to da nema opasnosti od pojave razliitih neeljenih dejstava (npr. serotonerginog sindroma) prilikom istovremene upotrebe antidepresiva iz grupe fluoksetina i ekstrakata timijana, matinjaka i pitome nane.
5.4.3. Anksiolitiko delovanje (metod uzdignutog lavirinta)

Jedan od testova koji se koristi za procenu anksiolitikog delovanja razliitih jedinjenja, prirodnog ili sintetskog porekla je metod uzdignutog lavirinta. Kao pozitivna kontrola koristi se diazepam, iz grupe benzodiazepinskih anksiolitika (Walf i Frye, 2007). Diazepam je, aplikovan intraperitonealno u dozi od 1,5 mg/kg, ispoljio anksiolitiko delovanje koje se manifestovalo statistiki znaajnim poveanjem indeksa aktivnosti i indeksa zadravanja u odnosu na grupu ivotinja koja nije primila lek (sl. 5.17, 5.18, 5.19). Drugim reima, diazepam je izazvao poveanje broja ulazaka u otvorene krake uzdignutog lavirinta i produio vreme boravka ivotinja u otvorenim kracima (tab. 5.19, 5.20, 5.21). Ispitivani ekstrakti timijana, kako standardni, tako i onaj pripremljen od dearomatizovanog lista, nisu ispoljili anksiolitiko delovanje u uzdignutom lavirintu, odnosno nije dolo do znaajnijeg
83
Neda Laki
poveanja ni indeksa aktivnosti, ni indeksa zadravanja u odnosu na kontrolnu grupu ivotinja (tab. 5.19, sl. 5.17). Ovakav rezultat u skladu je sa do sada poznatim i potvrenim farmakolokim efektima lista timijana (Barnes, 2005). Tabela 5.19. Standardni parametri zabeleeni u uzdignutom lavirintu kod kontrolnih i grupa tretiranih ispitivanim ekstraktima timijana EKSTRAKT T1-kontrola T1-lek T1-ekstrakt T3-ekstrakt
a
STANDARDNI PARAMETRIa nO 0,570,79 6,436,97* 1,291,5 0,570,79 nZ 9,571,81 12,143,39 9,712,5 11,572,64 tO (s) tZ (s) tCP (s) 2,713,64 154,7126,46 142,5726,02 38,4350,73* 128,5750,04 118,7135,96 7,579,68 180,1416,10* 112,2915,14* 2,574,39 184,7124,23 112,7121,77*
- nO-broj ulazaka u otvorene krake; nZ-broj ulazaka u zatvorene krake; tO-vreme provedeno u otvorenim kracima; tZ-vreme provedeno u zatvorenim kracima; tCP-vreme provedeno na centralnoj platformi * - t-testom potvrena statistika znaajnost razlike u odnosu na kontrolu (p<0,05) - t-testom potvrena statistika znaajnost razlike u odnosu na diazepam (p<0,05)
- t-testom potvrena statistika znaajnost razlike u odnosu na kontrolu (p<0,05)
Slika 5.17. Indeks aktivnosti i indeks zadravanja u uzdignutom lavirintu nakon primene diazepama i ispitivanih ekstrakata timijana Za razliku od timijana, ispitivani ekstrakti matinjaka, pripremljeni od netretiranog (M1) i dearomatizovanog lista (M3) ispoljili su anksiolitiko delovanje u uzdignutom lavirintu. Naime, prilikom viekratne peroralne aplikacije ekstrakata matinjaka, u dozi prikazanoj u tabeli 4.2, dolo je do statistiki znaajnog poveanja kako indeksa aktivnosti, tako i indeksa zadravanja u
84
Neda Laki
odnosu na kontrolnu grupu ivotinja (tab. 5.20, sl. 5.18), to je u skladu sa do sada objavljenim literaturnim navodima (Ibarra i sar., 2010). Pretpostavlja se da je mehanizam anksiolitikog dejstva ekstrakata lista matinjaka vezan za GABA-nergini sistem, odnosno potvreno je da rozmarinska kiselina, kao dominanti sastojak, u sadejstvu sa triterpenskim kiselinama prisutnim u drogi Melissae folium deluje inhibitorno da GABA-transaminazu, ime se poveava nivo -aminobuterne kiseline u mozgu (Awad i sar., 2009). Pored toga, mogue je da se ovakav efekat ostvaruje i preko vezivanja fenolkarbonskih i triterpenskih kiselina lista matinjaka za GABA receptore u mozgu. Tabela 5.20. Standardni parametri zabeleeni u uzdignutom lavirintu kod kontrolnih i grupa tretiranih ispitivanim ekstraktima matinjaka EKSTRAKT M1-kontrola M1-lek M1-ekstrakt M3-ekstrakt
a
STANDARDNI PARAMETRIa nO 0,570,79 6,436,97* 3,432,07* 2,291,8* nZ tO (s) tZ (s) tCP (s) 9,571,81 2,713,64 154,7126,46 142,5726,02 12,143,39 38,4350,73* 128,5750,04 118,7135,96 11,862,73* 22,8614,85* 129,1418,03* 148,012,01 11,142,48 22,7122,59* 116,023,99* 161,326,54*
Slika 5.18. Indeks aktivnosti i indeks zadravanja u uzdignutom lavirintu nakon primene diazepama i ispitivanih ekstrakata matinjaka
85
Neda Laki
Zbog svog sedativnog i anksiolitikog efekta ekstrakt lista matinjaka moe biti od koristi u ublaavanju simptoma bihejvioralnih poremeaja i agitacije kod obolelih od AB. Sa druge strane, potvreno je i antiholiesterazno delovanje ekstrakata lista matinjaka, to moe biti od znaaja za njegovu primenu u koterapiji AB, kada je ve dolo do znaajnijeg oteenja holinergikih neurona, dok je u prevenciji AB njegova primena pre svega zasnovana na znaajnom antioksidantnom i antiinflamatornom delovanju (Sugaya i sar., 2000). Tabela 5.21. Standardni parametri zabeleeni u uzdignutom lavirintu kod kontrolnih i grupa tretiranih ispitivanim ekstraktima pitome nane EKSTRAKT N1-kontrola N1-lek N1-ekstrakt N3-ekstrakt N4-ekstrakt
a
nO 0,570,79 6,436,97* 1,571,62 32,08* 21,73*
STANDARDNI PARAMETRIa nZ tO (s) tZ (s) 9,571,81 2,713,64 154,7126,46 12,143,39 38,4350,73* 128,5750,04 10,141,86 6,146,41 164,4341,66 82,24 14,5714,42* 144,8635,82 8,713,15 6,148,23 142,8643,33
tCP (s) 142,5726,02 118,7135,96 129,4344,97 140,5727,96 15144,86
Slika 5.19. Indeks aktivnosti i indeks zadravanja u uzdignutom lavirintu nakon primene diazepama i ispitivanih ekstrakata pitome nane
86
Neda Laki
Slino matinjaku, ispitivani ekstrakti pitome nane dobijeni tretiranjem otpadnog materijala doveli su do statistiki znaajnog poveanja indeksa aktivnosti u odnosu na kontrolnu grupu ivotinja. Meutim, iako je N4 izazvao i statistiki znaajno poveanje vremena provedenog u otvorenim kracima (tab. 5.21), ni prilikom aplikacije N3, ni N4 nije dolo do znaajnijeg porasta indeksa zadravanja (sl. 5.19). Ovakav rezultat ukazuje na uticaj ekstrakata lista pitome nane na poveanu aktivnost centralnog nervnog sistema, uz izostajanje anksiolitikog efekta. Bihejvioralna ispitivanja lista pitome nane ukazuju da bi dopamin mogao da posreduje u njenim stimulatornim efektima (McKay i Blumberg, 2006).
5.4.4. Uticaj na memoriju (test prepoznavanja novog objekta)

Neurodegenerativna oboljenja predstavljaju jedan od najveih problema sa kojima se suoava zdravstveni sistem dananjice. Jedan od simptoma neuropsihijatrijskih bolesti je i poremeaj epizodike memorije. U potrazi za novim, efikasnim sintetskim ili prirodnim lekovima, prati se i njihov uticaj na memoriju eksperimentalnih ivotinja putem testa prepoznavanja novog objekta (Dere i sar., 2007).
Slika 5.20. Relativna razlika (d2), kao mera diskriminacije izmeu poznatog i novog objekta u NOR nakon primene ispitivanih ekstrakata timijana, matinjaka i pitome nane
87
Neda Laki
Ispitivani ekstrakti timijana, matinjaka i pitome nane, pripremljeni od netretiranog lista (T1, M1, N1) ili od otpadnog materijala koji zaostaje nakon izolacije etarskog ulja (T3, M3, N3 i N4) nisu pokazali znaajan uticaj na memoriju eksperimentalnih ivotinja u testu prepoznavanja novog objekta. Naime, nakon viekratne peroralne aplikacije ispitivanih ekstrakata u dozama datim u tabeli 4.2. nije dolo do statistiki znaajnog poveanja indeksa d2, kao mere diskriminacije izmeu poznatog i novog objekta (sl. 5.20). Najvea vrednost d2 (0,59) postignuta je nakon primene ekstrakta M1, pa bi se moda znaajnija razlika u odnosu na kontrolnu grupu ivotinja dobila ukoliko bi se promenio reim doziranja, u smislu poveanja doze i produetka vremena aplikacije ekstrakta M1.
88
Neda Laki
6.
ZAKLJUAK
Na osnovu hemijskih, biohemijskih, mikrobiolokih i farmakolokih ispitivanja ekstrakata timijana, matinjaka i pitome nane, pripremljenih oficinalnim postupkom (T1, M1, N1), uparavanjem dekokta koji zaostaje nakon izolacije etarskog ulja (T2, M2, N2), tretiranjem dearomatizovanog lista (T3, T4, M3, M4, N3, N4) i samlevene stabljike (T5, T6, M5, M6, N5, N6) mogu se izvesti sledei zakljuci:
Koliina suvog ekstrakta u ispitivanom biljnom materijalu kretala se od 3,45% (T3) do 37,19% (T2). Najvee vrednosti dobijene su za ekstrakt nastao uparavanjem dekokta koji zaostaje nakon izolacije etarskog ulja timijana (37,19%), matinjaka (28,74%) i pitome nane (24,2%). Sadraj ukupnih fenola u ispitivanim ekstraktima kretao se od 21,37 (M4) do 72,83 (T6) mg EGK/g s.e., dok se sadraj ukupnih flavonoida kretao od 9,65 (M6) do 67,63 (N4) mg EK/g s.e. Sadraj ukupnih fenola i flavonoida nije u korelaciji sa odreenom koliinom suvog ekstrakta. HPLC-DAD analizom rozmarinska kiselina identifikovana je kao dominantno jedinjenje u svim ispitivanim uzorcima. Njena koncentracija kretala se od 7,05 (N5) do 105,08 (T4) mg/g s.e. Ekstrakti dobijeni tretiranjem dearomatizovanog lista timijana, matinjaka i pitome nane predstavljaju dobar izvor rozmarinke kiseline. U in vitro ispitivanjima antioksidantnog delovanja pojedini ekstrakti timijana (T3, T4), matinjaka (M3, M4), i pitome nane (N3, N4) ispoljili su uporedivu ili snaniju skevinder aktivnost na DPPH i OH, kao i znaajan inhibitorni uticaj na lipidnu peroksidaciju u odnosu na oficinalne ekstrakte. In vivo ispitivanja antioksidantnog delovanja pokazala su da ekstrakti kako oficinalni, tako i oni pripremljeni od lista kao otpadnog materijala ispoljavaju znaajno hepatoprotektivno delovanje, a naroito ekstrakti timijana (T1 i T3) kod kojih je jasno uoljiv protektivni efekat u procesima lipidne peroksidacije, uticaj na aktivnost enzima
89
Neda Laki
primarne antioksidantne zatite (XOD, SOD, GSH-Px), kao i uticaj na koncentraciju GSH. Praenjem uticaja ispitivanih ekstrakata timijana, matinjaka i pitome nane na AChE utvreno je da svi uzorci otpadnog materijala ispoljavaju delovanje koje je uporedivo sa oficinalnim ekstraktima. Pretpostavka je da je inhibicija AChE posledica pozitivnog sinergnog efekta grupe fenolnih jedinjenja, s obzirom da svi ispitivani ekstrakti ispoljavaju jae delovanje u odnosu na izolovanu rozmarinsku kiselinu. Rezultati mikrobiolokih ispitivanja ukazuju na izraeno bakteriostatsko delovanje svih analiziranih ekstrakata na sojeve Staphylococcus aureus, Salmonella liverpool, Escherichia coli, Bacillus cereus i odabranih na Campylobacter jejuni, to ukazuje na mogunost primene kako oficinalnih, tako i ekstrakata otpadnog materijala, pored farmaceutske i u prehrambenoj industriji. Ekstrakti timijana i matinjaka doveli su do skraenja uticaja midazolama na motornu koordinaciju eksperimentalnih ivotinja u metodi rotirajueg tapa. Nijedan od ispitivanih ekstrakata nije ispoljio antidepresivno delovanje u testu suspenzije o repu. Takoe, nije zabeleena interakcija sa fluoksetinom to ukazuje na bezbednost njihove istovremene primene. U uzdignutom lavirintu ekstrakti matinjaka (M1 i M3) ispoljili su anksiolitiki efekat, to ukazuje zajedno sa rezultatima dobijenim u ispitivanju uticaja na AChE, kao i antioksidantnog potencijala na mogunost njihove primene u prevenciji i koterapiji AB. Ekstrakti pitome nane (N1, N3 i N4) ispoljili su stimulatorno dejstvo na CNS, dok za ekstrakte timijana (T1 i T3) nije utvreno anksiolitiko delovanje. Prilikom praenja uticaja na memoriju, najvei potencijal pokazao je oficinalni ekstrakt matinjaka (M1), dok kod drugih ispitivanih ekstrakata nisu dobijeni znaajniji rezultati u uslovima testa prepoznavanja novog objekta.
90
Neda Laki
Dobijeni rezultati ukazuju na to da postdestilacioni ostatak i drugi (otpadni) delovi biljke koji se uobiajeno ne koriste (npr. stabljika, list zaostao nakon destilacije) ispoljavaju uporediva farmakoloka delovanja (antioksidantno, antimikrobno, antiholinesterazno i dr.) sa ekstraktima timijana, matinjaka i pitome nane pripremljenim po propisu vaeih farmakopeja i monografija. Takoe, otpadni materijal ispitivanih aromatinih biljaka moe nai svoju primenu kao potencijalna sirovina farmaceutske industrije za izolaciju farmakoloki aktivnih jedinjenja i izradu razliitih fitopreparata.
91
Neda Laki
7.
1.
LITERATURA
Adams, M., Gmnder, F., Hamburger, M., 2007. Plants traditionally used in age related brain disorders-A survey of ethnobotanical literature. Journal of Ethnopharmacology, 113: 363-381.
2.
Akdogan, M., Kilinc, I., Oncu, M., Karaoz, E., Delibas, N., 2003. Investigation of biochemical and histopathological effects of Mentha piperita L. and Mentha spicata L. on kidney tissue in rats. Human & Experimenatl Toxicology, 22: 213-219.
3.
Akdogan, M., Gultekin, F., Yontem, M., 2004. Effects of Mentha piperita (Labiateae) and Mentha spicata (Labiateae) on iron absorption in rats. Toxicology and undustrial Health, 20: 119-122.
4.
Akhondzadeh, S., Noroozian, M., Mohammadi, M., Ohadinia, S., Jamshidi, A.H., Khani, M., 2003. Melissa officinalis extract in the treatment of patients with mild to moderate Alzheimer's disease: a double blind, randomised, placebo controlled trial. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psichiatry, 74: 863-871.
5.
Akhondzadeh, S., Abbasi, S.H., 2006. Herbal medicine in treatment of Alzheimer's disease. American Journal of Alzheimers Disease and Other Dementias, 21: 113-8.
6.
Al-Bayati, F.A., 2008. Synergistic antibacterial activity between Thymus vulgaris and Pimpinella anisum essential oils and methanol extracts. Journal of Ethnopharmacology, 116(3): 403-406.
7.
Al-Gubory. K.H., Fowler, P.A., Garrel, C., 2010. The role of cellular reactive oxygen species, oxidative stress and antioxidants in pregnancy outcomes. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 42: 1634-1650.
8.
Alkam, T., Nitta, A., mMizoguchi, H., Itoh, A., Nabeshima, T., 2007. A natural scavenger of peroxynitrites, rosmarinic acid, protects against impairment of memory induced by A25-35. Behavioural Brain Research, 180: 139-145.
9.
Almeida-Muradian, L.B., Rios, M.D., Sasaki, R., 1998. Determination of provitamin A of green leafy vegetables by high performance liquid chromatography and open column chromatography. Bollettino Chimico Farmaceutico, 137: 290-294.
92
Neda Laki
10. Al-Saimary, I.E., Bakr, S.S., Khudaier, B.Y., Abass, Y.K., 2007. Efficiency of antibacterial agents extracted from Thymus vulgaris L. (Lamiaceae). The Internet Journal of Nutrition and Wellness, 1(4), DOI: 10.5580/269. 11. Amarowicz, R., Zegarska, Z., Rafalowski, R., Pegg, R.B., Karamac, M., Kosinska, A., 2009. Antioxidant activity and free radical-scavenging capacity of ethanolic extracts of thyme, oregano and marjoram. European Journal of Lipid Science and Technology, 111: 1111-1117. 12. Anekonda, T.S. i Reddy, P.H., 2005. Can herbs provide a new generation of drugs for treating Alzheimer's disease? Brain Research Reviews, 50: 361-376. 13. Angelov, G., Penchev, P., Condoret, J.S., 2007. Optimization of operational conditions of ethanol extraction of rosmarinic acid from lemon balm (Melissa officinalis L.). Scientific Paper on Chemistry, 35: 71-76. 14. Areias, F.M., Valentao, P., Andrade, P.B., Ferreres, F., Seabra, R.M., 2001. Phenolic fingerprint of peppermint leaves. Food Chemistry, 73: 307-311. 15. Arthur, J.R., Boyne, R., 1985. Superoxide dismutase and glutathione peroxidase activities in neutrophils from selenium deficient and copper deficient cattle. Life Sciences, 36: 1569-1575. 16. Awad, R., Muhammad, A., Durst, T., Trudeau, V.L., Arnason, J.T., 2009. Bioassy-guided fractionation of lemon balm (Melissa officinalis L.) using in vitro measure of GABA transaminase activity. Phytotherapy Research, 23: 1075-1081. 17. Babaei, M., Abarghoei, M.E., Ansari, R., Vafaei, A.A., Taherian, A.A., Akhavan, M.M., Toussy, G., Mousari, S., 2008. Antispazmodic effect of hydroalcoholic extract of Thymus vulgaris on Guinea-pig Ileum. Natural Products Research, 4(28):1143-1150. 18. Barnes, J., Anderson, L.A., Phillipson, J.D., 2005. Herbal Medicines. 2nd ed. London: Pharmaceutical Press. 19. Behnia, M., Haghighi, A., Komeylizadeh, H., Tabaei, S.S., Abadi, A., 2008. Inhibitory Effects of Iranian Thymus vulgaris Extracts on in Vitro Growth of Entamoeba histolytica. The Korean Journal of Parasitology, 46(3):153156. 20. Berastegi, I., Legarra, S., Ciriano, M.G., Rehecho, S., Calvo, M.I., Cavero, R.Y., NavarroBlasco, I., Ansorena, D., Astiasara, I., 2011. High in omega-3 fatty acids bologna-type sausages stabilized with an aqueous-ethanl extract of Melissa officinalis. Meat Science, 88: 705-711.
93
Neda Laki
21. Bergmayer, U.H., 1974. Methoden Der Enzimatishen Analyse. Weinhem: Verlag Chemies, 483-484. 22. Bisset, N.G. i Wichtl, M. ur., 2001. Herbal Drugs and Phytopharmaceuticals. London, New York, Washington D.C: CRC Press, Boca Raton. 23. Blanco, M.C.S.G., Ming, L.C., Marques, M.O.M., Bovi, O.A., 2002. Drying temperature effects in peppermint essential oil content and composition. Acta Horticulturae, 569: 95-98. 24. Blumenthal, R., 1999. The Complete German Commission E Monographs. Austin, Texas: American Botanical Council. 25. Boin, B., 2004. Antimikrobna i antioksidantna aktivnost etarskih ulja vrsta familije Lamiaceae. Magistarska teza, Prirodno-matematiki fakultet, Novi Sad: Univerzitet u Novom Sadu. 26. Boin, B., Mimica-Duki, N., Simin, N., Anakov, G., 2006. Characterization of the volatile composition of essential oils of some Lamiaceae spices and the antimicrobial and antioxidant activities of the entire oils. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54: 1822-1828. 27. Boin, B., Mimica-Duki, N., Samojlik, I., Jovin, E., 2007. Antimicrobial and antioxidant properties of rosemary and sage (Rosmarinus officinalis L. and Salvia officinalis L., Lamiaceae) essential oils. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55: 7879-7885. 28. Boin, B., Mimica-Duki, N., Samojlik, I., Anakov, G., Igi, R., 2008. Phenolics as antioxidants in garlic (Allium sativum L., Alliaceae). Food Chemistry, 111: 925-929. 29. Boin, B., 2009. Biohemijska i farmakoloka ispitivanja vrsta roda Allium L. (sect. Allium). Doktorska disertacija, Prirodno-matematiki fakultet, Novi Sad: Univerzitet u Novom Sadu. 30. British Herbal Pharmacopoeia, 1996. Exeter: British Herbal Medicine Association. 31. British Pharmacopoeia, 2002. London: The Stationary Office. 32. Buege, A.L., Aust, D, 1978. Microsomal lipid peroxidation. U: S. Fleisher, L. Parker, ur. Methods in Enzimology. New York: Academic Press, 306-310. 33. Burda, S., Oleszek, W., 2001. Antioxidant and antiradical activities of flavonoids. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49: 2774-2779. 34. Burt, S., 2004. Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods-a review. International Journal of Food Microbiology, 94: 223-253. 35. Capecka, E., Mareczek, A., Leja, M., 2005. Antioxidant activity of fresh and dry herbs of some Lamiaceae species. Food Chemistry, 93: 223-226.
94
Neda Laki
36. Carobrez, A.P., Bertoglio, L.J., 2005. Ethological and temporal analyses of anxiety-like behavior: The elevated plus-maze model 20 years on. Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 29: 1193-1205. 37. Carr, M., Bekku, N., Yoshimura, H., 2006. Identification of anxiolytic ingredients in ginseng root using elevated plus-maze test in mice. European Journal of Pharmacology, 531: 160-165. 38. Carvalho, C.O., Chagas, A.C.S., Cotinguiba, F., Furlan, M., Brito, L.G., Chaves, F.C.M., Stephan, M.P., Bizzo, H.R., Amarante, A.F.T., 2012. The antihelmintic effect of plant extracts on the Haemonchus contortus and Strongyloides venezuelensis. Veterinary Parasitology, 183: 260-268. 39. Cavaliere, C., Rea, P., Lynch, M,E,, Blumenthal, M., 2009. Herbal Supplement Sales Experience Slight Increase in 2008. HerbalGram, 82: 58-61. 40. Cermak, R., Wolffram, S., 2006. The potential of flavonoids to influence drug metabolism and pharmacokinetics by local gastrointestinal mechanisms. Current Drug Metabolism, 7: 729744. 41. Chun, H., Jun, W.J., Shin, D.H., Hong, B.S., Cho, H.Y., Yang, H.C., 2001. Purification and characterization of anti-complementary polysaccharide from leaves of Thymus vulgaris L. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 49: 762-764. 42. Cioffi, G., Pesca, M.S., De Caprariis, P., Braca, A., Severino, L., De Tommasi, N., 2010. Phenolic compounds in olive oil and olive pomace from Cilento (Campenia, Italy) and their antioxidant activity. Food Chemistry, 121(1):105-111. 43. Conforti, F., Statti G. A., Tundis, R., Loizzo, M.R., Menichini, F., 2007. In vitro activities of Citrus medica L. cv. Diamante (Diamante citron) relevant to treatment of diabetes and Alzheimer's disease. Phytotherapy Research, 21: 427-433. 44. Cryan, J.F., Mombereau, C., Vassout, A., 2005. The tail suspension test as a model for assessing antidepressant activity: Review of pharmacological and genetic studies in mice. Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 29: 571-625. 45. etkovi, G., Savatovi, S., anadanovi-Brunet, J., ilas, S., Vuli, J., Mandi, A., etojevi-Simin, D., 2012. Valorisation of phenolic composition, antioxidant and cell growth activities of tomato waste. Food Chemistry, 133: 938-945.
95
Neda Laki
46. Dai, F., Miao, Q., Zhou, B., Yang, L., Liu, Z., 2006. Protective effects of flavonols and their glycosides against free radical-induced oxidative hemolysis of red blood cells. Life Sciences, 78: 2488-2493. 47. Dastmalchi, K., Dorman, D., Oinonen P.P., Darwis, Y., Laakso, I., Hiltunen, R., 2008. Chemical composition and in vitro antioxidative activity of a lemon balm (Melissa officinalis L.) extrct. LWT, 41: 391-400. 48. Dastmalchi, K., Ollilainen, V., Lackman, P., Boije af Genns, G., Damien Dorman., H.J., Jrvinen, P., Yli-Kauhaluoma, J., Hiltunen, R., 2009. Acetylcholinesterase inhibitory guided fractionation of Melissa officinalis L. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 17: 867-871. 49. Depkevicius, A., Van Beek, T.A., Lelyveld, G.P., Van Veldhuizen, A., De Groot, A., Linssen, J.P.H., Venskutonis, R., 2002. Isolation and structure elucidation of radical scavengers from Thymus vulgaris leaves. Journal of Natural Products, 65: 892-896. 50. Dere, E., Huston, J.P., De Souza Silva, M.A., 2007. The pharmacology, neuroanatomy and neurogenetics of the one-trial object recognition in rodents. Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 31: 673-704. 51. Dias, M.I., Barros, L., Sousa, M.J., Ferreira, I., 2012. Systematic comparison of nutraceuticals and antioxidant potential of cultivated, in vitro cultured and commercial Melissa officinalis samples. Food and Chemical Toxicology, 50: 1866-1873. 52. Dikli, N., 1974. Rod Melissa L. 1753. U: M. Josifovi, urednik. Flora SR Srbije. Beograd: SANU, Vol.6., 454-455. 53. Ding, H., Chou, T., Liang, C., 2010. Antioxidant and antimelanogenic properties of rosmarinic acid methyl ester from Origanum vulgare. Food Chemistry, 123: 254-262. 54. Dorman, H.J.D., Peltoketo, A., Hiltunen, R., Tikkanen, M.J., 2003. Characterisation of the antioxidant properties of de-odourised aqueous extracts from selected Lamiaceae herbs. Food Chemistry, 83: 255-262. 55. Dorman, H.J.D., Kosar, M., Kahlos, K., Holm, Y., Hiltunen, R., 2003a. Antioxidant properties and composition of aqueous extracts from Mentha species, hybrids, varietes and cultivars. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51: 4563-4569. 56. Dragland, S., Senoo, H., Wake, K., Holte, K., Blomhoff, R., 2003. Several culinary and msdicinal herbs are important sources of dietary antioxidants. Journal Natural Products, 133: 182-190.
96
Neda Laki
57. Duke, J.A., 1985. Handbook of Medicinal Herbs. London: CRC press, Boca Raton. 58. Emamghoreishi, M., Talebianpour, M.S., 2009. Antidepressant effect of Melissa officinalis in the forced swimming test. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 17(1): 42-47. 59. ESCOP, 2003. ESCOP monographs. 2nd ed. Exeter: in colaboration with Georg Thieme, Stuttgart, New York. 60. European Medicines Agency (EMEA), 2007. Community Herbal Monograph on Melissa officinalis L., folium. [online]. Dostupno na:
<http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Herbal__Community_herbal_monograph/2010/01/WC500059284.pdf > [Preuzeto: 05.10.2012.]. 61. European Medicines Agency (EMEA), 2007. Community Herbal Monograph on Mentha x piperita L., folium. [online]. Dostupno na: 62. <http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Herbal__Community_herbal_monograph/2010/01/WC500059392.pdf> [Preuzeto: 05.10.2012.]. 63. European Medicines Agency (EMEA), 2007. Community Herbal Monograph on Thymus vulgaris L. and Thymus zygis L., herba. [online]. Dostupno na: <
http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Herbal__Community_herbal_monograph/2009/12/WC500018076.pdf> [Preuzeto: 05.10.2012.]. 64. European Pharmacopeia. 2002. 4th ed. Strasbourg Cedex: Council of Europe, Vol. 2.8.12: 183184. 65. European Pharmacopoea. 2007. 6th ed. Strasbourgh: European Directorate for the Quality of Medicines & Health Care, Council of Europe, Vol. 1 (General Monographs). 66. Farah, A., Danangelo, C.M., 2006. Phenolic compounds in coffee. Brazilian Journal of Plant Physiology, 18: 23-36. 67. Farkas, S., Berzsenyi, P., Karpati, E., Kocsis, P., Tarnawa, I., 2005. Simple pharmacological test battery to assess efficacy and side effects profile of centrally acting muscle relaxant drugs. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, 52: 264-273. 68. Fecka, I., Raj, D., Krauze-Baranowska, M., 2007. Quantitative determination of four water soluble compounds in herbal drugs from Lamiaceae using different chromatographic techniques. Chromatographia, 66: 87-93.
97
Neda Laki
69. Fecka, I., Turek, S., 2008. Determination of polyphenolic compounds in commercial herbal drugs and spices from Lamiaceae: thyme, wild thyme and sweet marjoram by chromatographic techniques. Food Chemistry, 108: 1039-1053. 70. Fernandes, R (1972): Melissa L., U Tutin, T. G., Heywood, H. V., Burges, N. A., Moore, D.M., Valentine, D. H., Walters, S. M., Webb, D. A., eds., Flora Europaea III (Diapensiaceae to Myoporaceae): 162-163. Cambridge University Press, Cambridge. 71. Ferrari, C.K., 2004. Functional foods, herbs and nutraceuticals: towards biochemical mechanism of healthy aging. Biogerontology, 5(5):275-289. 72. Ferreira, A., Proenca, C., Serralheiro. M.L.M., Araujo, M.E.M., 2006. The in vitro screening for acetylcholinesterase inhibition and antioxidant activity of medicinal plants from Portugal. Journal of Ethnopharmacology, 108: 31-37. 73. FDA, 2010. US Food and Drug Administration. www.cfsan.fda.gov/~dms/eafus.html. 74. Formulae magistrales et reagentia [editorial], 1979. Beograd; 213-215. 75. Fukai, T., Oku, Y., Hano, Y., Terada, S., 2004. Antimicrobila activites of hydrophilic 2arylbenzofurans and an isoflavone against vancomycin-resistant enterococci and methicilinresistant Staphylococcus aureus, Planta Medica, 70: 685-687. 76. Fukumato, L., Mazza, G., 2000. Assesing antioxidant and prooxidant activities of phenolic compounds. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44 (8): 3597-3604. 77. Furtado, M.A., Almeida, C.F., Furtado, R.A., Cunha, W.R., Tavares, D.C., 2008. Antimutagenicity of rosmarinic acid in Swiss mice evaluated by the micronucleus assay. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 657: 150-154. 78. Galeotti, N., Ghelardini, C., Manneelli L.C., Mazzanti, G., Baghiroli, L., Bartolini, A., 2001. Local anaestethic activity of (+)- and (-)- menthol. Planta Medica, 67: 174-176. 79. Garcia-Garcia, R., Lopez-Malo, A., Palou, E., 2011. Bactericidal action of binary and ternary mixtures of carvacrol, thymol, and eugenol against Listeria innocua. Journal of Food Science, 76: 95-100. 80. Geil, P., Shane-McWhorter, L., 2008. Dietary supplements in the management of diabetes: potential risk and benefits. Journal of American Dietetic Association, 108, S59-S65. 81. Giveon, S.M., Liberman, N., Klang, S., Kahan, E., 2004. Are people who use natural drugs aware of their potentially harmful side effects and reporting to family physician. Patient Education and Counseling, 53: 511.
98
Neda Laki
82. Glatzle, D., Vuillenmir, J.P., Weber, F., Decker, K., 1974. Gluthatione reductase test with whole blood a convenient procedure for the assesment of the riboflavine status in humans. Experimentia, 30(6): 565-638. 83. Gorunovi, M., Luki, P., 2004. Farmakognozija. Beograd: Farmaceutski fakultet Univerziteta u Beogradu; 450-452. 84. Guimares, R., Barros, L., Carvalho, A.M., Ferreira, I., 2011. Infusions and decoctions of mixed herbs used in folk medicine: synergism of antioxidant potential. Phytotherapy Research, 25: 1209-1214. 85. Gulluce, M., Sahin, F., Sokmen, M., Ozer, H., Daferera, D., Sokmen, A., Polission, M., Adiguzel, A., Ozkan, H., 2007. Animicrobial and antioxidant properties of the essential oil and methanol extract from Mentha longifolia L. ssp. longifolia. Food Chemistry, 103: 1449-1456. 86. Habig, W.H., Pabst, M.J., Jakoby, W.B., 1974. Gluthatione-S-transferases. The Journal of Biological Chemistry, 249: 7130-7139. 87. Hagenbuch, N., Feldon, J., Yee, B.B., 2006. Use of the elevated plus-maze test with opaque or transparent walls in the detection of mouse strain differences and the anxiolytic effects of diazepam. Behavioural Pharmacology, 17(1): 31-41. 88. Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C., ed. 1999. Free radicals in biology and medicine. Oxford University Press Inc: New York. 89. Halliwell, B., Whiteman, M., 2004. Masuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and do the results mean? British Journal of Pharmacology, 142: 231-255. 90. Halliwell, B., 2006. Oxidative stress and neurodegeneration: where are we now? Journal of Neurochemistry, 97: 1634-1658. 91. Harley, R.M. (1972): Mentha L., U Tutin, T. G., Heywood, H. V., Burges, N. A., Moore, D.M., Valentine, D. H., Walters, S. M., Webb, D. A., eds., Flora Europaea III (Diapensiaceae to Myoporaceae): 183-186. Cambridge University Press, Cambridge. 92. Hartog, G., Haenen, G., Vegt, E., Vijgh, W., Bast, A., 2003. Superoxide dismutase: the balance between prevention and induction of oxidative damage. Chemico-Biological Interactions, 145: 33-39.
99
Neda Laki
93. Heinrich, M., Barnes, J., Gibbons, S., Williamson, E.M., 2004. Fundamentals of Pharmacognosy and Phytotherapy. Edinburgh, London, New York, Oxford, Philadelphia, St Louis, Sydney, Toronto: Churchill Livingstone. 94. Hernandez, M.F., Fale, P.L.V., Araujo, M.E.M., Serralheiro, M.L.M., 2010.
Acetylcholinesterase inhibition and antioxidant activity of the water extracts of several Hypericum species. Food Chemistry, 120: 1076-1082. 95. Herode, S.S., Hadolin, M., kerget, M., Knez, ., 2003. Solvent extraction study of antioxidants from balm (Melissa officinalis L.) leaves. Food Chemistry, 80(2): 275-282. 96. Heyser, C.J., Chemero, A., 2012. Novel object exploration in mice: Not all objects are created equal. Behavioral Precesses, 89: 232-238. 97. Houghton, P.J., Howes, M.J. Lee, C.C., Steventon, G., 2007. Uses and abuses of in vitro tests in ethnopharmacology: visualizing an elephant. Journal of Ethnopharmacology, 110: 391-400. 98. Howes, M.J.R., Perry, N.S.L., Houghton, P.J., 2003. Plants with traditional uses and activities relevant to the management of Alzheimer's disease and other cognitive disorders. Phytotherapy Research, 17: 1-18. 99. Hussain, K., Majeed, M.T., Ismail, Z., Sadikun, A., Ibrahim, P. Traditional and complementary medicines: Quality assessment strategies and safe usage. Southern Med Review, 2(1): 19-23. 100. Ibarra, A., Feuillere, N., Roller, M., Lesburgere, E., Beracochea, D., 2010. Effects of chronic administration of Melissa officinalis L. extract on anxiety-like reactivity and on circadian and exploratory activities in mice. Phytomedicine, 17: 397-403. 101. Inoue, T., Sugimoto, Y., Masuda, H., Kamei, C., 2001. Effects of peppermint extracts on experimental allergic rhinitis in rats. Biological & Pharmaceutical Bulletin, 24: 92-95. 102. Iordache, A., Culea, M., Gherman, C., Cozar, O., 2009. Characterization of some plant extracts by GC-MS. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research B, 267: 338-342. 103. Jakovljevi, V., 2006. Eksperimentalna farmakologija u nauno-istraivakom radu. Petrovaradin-Novi Sad: Alfa graf. 104. Jalas, J., 1971. Notes on Thymus L. (Labitae) in Europe, I: supraspecific classification and nomenclature. Botanical Journal of Linnean Society, 64: 199-215.
100
Neda Laki
105. Jalas, J. (1972): Thymus L. U Tutin, T. G., Heywood, H. V., Burges, N. A., Moore, D.M., Valentine, D. H., Walters, S. M., Webb, D. A., eds., Flora Europaea III (Diapensiaceae to Myoporaceae): 172-182. Cambridge University Press, Cambridge. 106. Jani, R., 2004. Botanika Farmaceutika. Beograd: Slubeni list SCG. 107. Janicsak, G., Mathe, I., Miklossay-Vari, V., Blunden, G., 1999. Comparative studies of the rosmarinic and caffeic acid contents of Lamiaceae species. Biochemical Systematics and Ecology, 27: 733-738. 108. Jia, Z., Tang, M., Wu, J., 1999. The determination of flavonoids content in mulbery and scavenging effect on superoxide radicals. Food Chemistry, 64: 555-599. 109. Juhs, ., Bujkov, D., Rehk, P., iko, ., Czikkov, S., Vesel, J., 2008. Antiinflammatory effects of Thyme Essential oil in mice. Acta Veterinaria Brno, 77: 327-334. 110. Kapetanovi, I.M., Mieyal, I.I., 1979. Inhibition of acetaminophen induced hapatotoxicity by phenacetin and its alkoxy analogs. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 209: 25-30. 111. Kim, S.M., Cho, Y.S., Park, S., 2002. Cytotoxicity of menthanol extracts of edible herbs against L1210 cells with the changes of antioxidant enzymes activities. Korean Journal of Pharmacognosy, 33: 376-383. 112. Kitajima, J., Ishikawa, T., Urabe, A., 2004. A new hydroxyjasmone glucoside and its related compounds from the leaf of thyme. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 52: 1013-1014. 113. Klannik, A., Guzej, B., HadolinKolnar, M., Abramovi, H., SmoleMoina, S., 2009. In vitro antimicrobial and antioxidant activity of commercial rosemary extract formulations. Journal of Food Protection, 72: 1744-1752. 114. Klannik, A., Piskernik, S., Jerek, B., SmoleMoina, S., 2010. Evaluation of diffusion and dilution methods to determine the antibacterial activity of plant extracts. Journal of Microbiological Methods, 81: 121-126. 115. Klauniq, J.E., Kamendulis, L.M., 2004. The role of oxidative stress in carcinogenesis. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 44: 239-267. 116. Kosar, M., Dorman, H.J.D., Husnu Can Baser, K., Hiltunen, R., 2004. Screening of free radical scavenging compounds in water extracts of Mentha samples using a postcolumn derivatization method. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52: 5004-5010.
101
Neda Laki
117. Kosar, M., Dorman, H.J.D., Hiltunen, R., 2005. Effect of acid treatment on the phytochemical and antioxidant characteristics of extracts from selected Lamiaceae species. Food Chemistry, 91: 522-533. 118. Kovaevi, N., 2004. Osnovi farmakognozije. III izdanje. Beograd: Srpska kolska knjiga. 119. Kreivaitis, R., Gumbyte, M., Kazancev, K., Padgurskas, J., Makareviiene, V., 2013. A comparison of pure and natural antioxidant modified rapeseed oil storage. Industrial Crops and Products, 43: 511-516. 120. Kumar, P., Mishra, S., Malik, A., Satya, S., 2011. Insecticidal properties of Mentha species: A review. Industrial Crops and Products, 34: 802-817. 121. Labuda, C.J., Fuchs, P. N., 2001. The anxiolytic effect of acute ethanol or diazepam exposure is unaltered in - opioid receptor knockout mice. Brain Research Bulletin, 55 (6): 755760. 122. Laki, N., Mimica-Duki, N., Isak, J., Boin, B., 2010. Antioxidant properties of Galium verum L. (Rubiaceae) extracts. Central European Journal of Biology, 5(3): 331-337. 123. Lakui, B., 1995. Sekretorne strukture aromatinih biljaka. U: Jani, R., Stoi, D., MimicaDuki, N., Lakui, B., Aromatine biljke Srbije. Beograd-Gornji Milanovac: NIP DEIJE NOVINE, str. 15-40. 124. Lara, M.S., Gutierrez, J.I., Timou, M., Andres, A.I., 2011. Evaluation of two natural extracts (Rosmarinus officinalis L. and Melissa officinalis L.) as antioxidants in cooked pork patties packed in MAP. Meat Science, 88: 481-488. 125. Lavabre, M., 2004. Aromaterapija. Beograd: IP Esotheria. 126. Lee, H.J., Cho, H., Park, E., Kim, S., Lee, S., Kim, C., Kim, D.K., Kim, S., Chun, H.S., 2008. Rosmarinic acid protects human dopaminergic neuronal cells against hydrogen peroxideinduced apoptosis. Toxicology, 250: 109-115. 127. Lee, J., 2010. Caffeic acid derivatives in dried Lamiaceae and Echinacea purpurea products. Journal of Functional Foods, 2: 158-162. 128. Lin, Y., Shi, R., Wang, X., Shen, H.M., 2008. Luteolin, a flavonoid with potential for cancer prevention and therapy. Current Cancer Drug Targets, 8(7): 634-646. 129. Lin, J., Chen, Y., Lee, Y., Rolis Hou, C., Chen, F., Yang, D., 2012. Antioxidant, antiproliferative and cyclooxygenase-2 inhibitory activities of ethenolic extracts from lemon balm (Melissa officinalis L.) leaves. LWT-Food Science and Technology, 49: 1-7.
102
Neda Laki
130. Lopez, V., Martin, S., Gomez-Serranillos, M.P., Carretero, M.E., Jager, A.K., Calvo, M,I., 2009. Neuroprotective and Neurological Properties of Melissa officinalis. Neurochemical Research, 34: 1955-1961. 131. Lozak, A., Soltyk, K., Ostapczuk, P., Fijalek, Z., 2002. Determinatin of selected trace elements in herbs and their infusions. Science of the Total Environment, 289: 33-40. 132. Machado, T.B., Pinto, A.V., Pinto, M.C., Leal, I.C., Silva, M.G., Amaral, A.C., Kuster, R.M., Netto-dos Santos, K.R., 2003. In vitro activity of Brazilian medicinal plants, naturally occurring naphthoquinones and their analogues, against methicilin-resistant Staphylococcus aureus. International Journal of Antimicrobial Agents, 21: 279-284. 133. Maffei, M., Scannerini, S., 1992. Seasonal variations in fatty acids from non-polar lipids of developing peppermint leaves. Phytochemistry, 31: 479-484. 134. Maliakal, P.P., Wanwimolruk, S., 2001. Effect of herbal teas on hepatic drug metabolizing enzymes in rats. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 53: 1323-1329. 135. Marino, M., Bersani, C., Comi, G., 2001. Impendance measurements to study the antimicrobial activity of essential oils from Lamiaceae and Compositae. International Journal of Food Microbioliology, 67(3): 187-195. 136. Marques, V., Farah, A., 2009. Chlorogenic acids and related compounds in medicinal plants and infusions. Food Chemistry, 113: 1370-1376. 137. Mata, A.T., Proenca, C., Ferreira, A.R., Serralheiro, M.I.M, Nogueira, J.M.T., Araujo, M.E.M., 2007. Antioxidant and antiacetylcholinesterase activities of five plants used as Portuguese food spices. Food Chemistry, 103(3): 778-786 138. Mazzanti, G., Battinelli, L., Pompeo, C., Serrilli, A.M., Rossi, R., Sauzullo, I., Mengoni, F., Vullo, V., 2008. Inhibitory activity of Melissa officinalis L. extract on Herpes simplex virus type 2 replication. Natural Products Research, 22(16): 1433-1440. 139. McKay, D.L., Blumberg, J.B., 2006. A review of the bioactivity and potential health benefits of Peppermint tea (Mentha pipetita L.). Phytotherapy Research, 20(8): 619-633. 140. Mencherini, T., Picerno, P., Scesa, C., Aquino, R., 2007. Triterpene, antioxidant, and antimicrobial compounds from Melissa officinalis. Journal of Natural Products, 70: 18891894.
103
Neda Laki
141. Mencherini, T., Picerno, P., Russo, P., Meloni, M., Aquino, R., 2009. Composition of the fresh leaves and stems of Melissa officinalis and evaluation of skin irritation in a reconstitued human epidermis model. Journal of Natural Products, 72: 1512-1515. 142. Mili-Torres, V., Poa, M., Srenovi, B., Simplici, A. L., 2011. Solubilization of fullerene C60 in micellar solutions of different solubilizers. Colloids and Surfaces B, 82: 46-53. 143. Mimica-Duki, N., 1992. Ispitivanje sekundarnih biomolekula u nekim vrstama roda Mentha. Doktorska disertacija, Prirodno-matematiki fakultet, Novi Sad: Univerzitet u Novom Sadu. 144. Mimica-Duki, N., 1997. In vivo i in vitro ispitivanja antioksidantnih svojstava biljnih ekstrakata. Arhiv za Farmaciju, 5: 475-493. 145. Mimica-Duki, N., Boin, B., Sokovi, M., Mihajlovi, B., Matavulj, M., 2003. Antimicrobial and antioxidant activities of three Mentha L. species essential oils. Planta Medica, 69: 413419. 146. Mimica-Duki, N., Boin, B., 2007. Essential oil from Lamiaceae species as promising antioxidant and antimicrobial agents. Natural Product Communication, 2(4): 445-452. 147. Mimica-Duki, N., Boin, B., 2008. Mentha L. Species (Lamiaceae) as promising sources of bioactive secondary metabolites. Current Pharmaceutical Design, 14(29): 3141-3150. 148. Mian, A., Mimica-Duki, N., Mandi, A., Saka, M., Milovanovi, I., Sedej, I., 2011. Development of a rapid resolution HPLC method for the separation and determination of 17 phenolic compounds in crude plant extracts. Central European Journal of Chemistry, 9(1): 133-142. 149. Miura, K., Kikuzaki, H., Nakatani, N., 2002. Antioxidant activity of chemical components from sage (Salvia officinali L.) and thyme (Thymus vulgaris L.) measured by the oil stability index method. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50: 1845-1851. 150. Moure, A., Cruz, J.M., Franco, D., Domnguez, J.M., Sinieiro, J., Domnguez, H., Nez, M.J., Paraj, J.C., 2001. Natural antioxidants from residual sources. Food Chemistry, 72: 145171. 151. Negi, P.S., 2012. Plant extracts for the control of bacterial growth: Efficacy, stability and safety for food application. International Journal of Food Microbiology, 156: 7-17. 152. Nolkemper, S., Reichling, J., Stintzing, F.C., Carle, R., Schnitzler, P., 2006. Antiviral effect of aqueous extracts from species of the Lamiaceae family against Herpes simplex virus type 1 and type 2 in vitro. Planta Medica, 72(15): 1378-1382.
104
Neda Laki
153. Okazaki K., Kawazoe, K., Takaishi, Y., 2002. Human platelet aggregation inhibitors from thyme (Thymus vulgaris L.). Phytotherapy Research, 16: 398-399. 154. OLeary, O.F., Cryan, J.F., 2009. The Tail-Suspension Test: A Model for Characterizing Antidepressant Activity in Mice. U: T.D. Gould, ed. Mood and Anxiety Related Phenotypes in Mice, Neuromethods 42, Humana Press. Ch. 7. 155. Orhan, I., Aslan, S., Kartal, M., Sener, B., Husnu Can Baser, K., 2008. Inhibitory effect of Turkish Rosmarinus officinalis L. on acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase enzymes. Food Chemistry, 108: 663-668. 156. Orhan, I., Aslan, M., 2009. Appraisal of scopolamine-induced antiamnesic effect in mice and in vitro antiacetylcholinesterase and antioxidant activities of some traditionally used Lamiaceae plants. Journal of Ethnopharmacology, 122: 327-332. 157. Paglia, D. E., Valentine, W. N., 1967. Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 70: 158-169. 158. Palaniappan, K., Holley, R.A., 2010. Use of natural antimicrobials to increase antibiotic susceptibility of drug resistant bacteria. International Journal of Food Microbiology, 140: 164-168. 159. Parnham, M.J., Kesselring, K., 1985. Rsmarinic acid. Drugs of the future, 10: 756-757. 160. Paroji, D., Stupar, D., 2003. Istorijski osvrt na lekovito bilje i njegovu upotrebu u farmakologiji. Timoki medicinski glasnik, 28: 101-109. 161. Pearson, V.E., 2001. Galantamine: a new Alzheimer drug with past life. Annual Pharmacotherapy, 35: 1406-1413. 162. Peev, G., Penchev, P., Peshev, D., Angelov, G., 2011. Solvent extraction of rosmarinic acid from lemon balm and concentration of extracts by nanofiltration: Effect of plant pre-treatment by supercritical carbon dioxide. Chemical Engineering Research and Design, 89: 2236-2243. 163. Pereira, P., Tysca, D., Oliveira, P., Da Silva Brum, L.F., Picada, J.N., Ardenghi, P., 2005. Neurobehavioral and genotoxic aspects of rosmarinic acid. Pharmacological Research, 52: 199-203. 164. Petersen, M., Simmonds, S.J., 2003. Molecules of Interest Rosmarinic acid. Phytochemistry, 62: 121-125.
105
Neda Laki
165. Pharmacopoea Jugoslavica IV, 1984. Editio quarta. Beograd: Savezni zavod za zdravstvenu zatitu; 1034-1037. 166. Pharmacopea Jugoslavica V, 2000. Beograd: Savremena administracija. 167. Pilipenko, L.N., Oleinik, L.B., Kozhukhar, V.V., 1998. Liposoluble pigments of food plants and their extracts. Chemistry of Natural Compounds, 34: 269-271. 168. Popovi, M., Kaurinovi, M., Jakovljevi, V., Mimica-Duki, N., Bursa, M., 2007. Effects of parsley (Petroselinum crispum (Mill.) Nym. Ex A.W. Hill, Apiaceae) extracts on some biochemical parameters of oxidative stress in mice treated with CCl4. Phytotherapy Research, 21(8): 717-723. 169. Psotova, J., Svobodova, A., Kolarova, H., Walterova, D., 2006. Photoprotective properties of Prunella vulgaris and rosmarinic acid on human keratinocytes. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 84: 167-174. 170. Rang, H.P., Dale, M.M., Ritter, J.M., Moore, P.K., 2005. Farmakologija. Beograd: Data status. 171. Rani, P., Khullar, N., 2004. Antimicrobial evaluation of some medicinal plants for their antienteris potential against multi-drug resistant Salmonella typhi. Phytotherapy Research, 18: 670-673. 172. Rios, J.L., Recio, M.C., 2005. Medicinal plants and antimicrobial activity. Journal of Ethnopharmacology, 100: 80-84. 173. Sagdic, O., Ozturk, I., Ozkan, G., Yetim, H., Ekici, L., Yilmaz, M.T., 2011. RP-HPLC-DAD analysis of phenolic compounds in pomace extracts from five grape cultivars: Evaluation of their antioxidant, antiradical and antifungal activities in orange and apple juices. Food Chemistry, 126: 1749-1758. 174. Sahu, A., Rawal, N., Pangburn, M.K., 1999. Inhibition of complement by covalent attachment of rosmarinic acid to activated C3b. Biochemical Pharmacology, 57: 1439-1446. 175. Samarth, R.M., Kumar, A., 2003. Radioprotection of Swiss albino mice by plants extract Mentha piperita L. Journal of Radiation Research, 44: 101-109. 176. Samojlik, I., Petkovi, S., Mimica-Duki, N., Boin, B., 2012. Acute and chronic pretreatment with essential oil of peppermint (Mentha x piperita L., Lamiaceae) influences drug effects. Phytotherapy Research, 26(6): 820-825.
106
Neda Laki
177. Sandasi, M., Leonard, C.M., Van Vuuren, S.F., Viljoem, A.M., 2011. Peppermint (Mentha piperita) inhibits microbial biofilms in vitro. South African Journal of Botany, 77: 80-85. 178. Santo-Neto, L.L., Vilhena Toledo, M.A., Medeiros-Souza, P., Souza, G.A., 2006. The use of herbal medicine in Alzheimer's disease A systematic review. eCAM. 3(4): 441-445. 179. Sasanelli, N., Anton, A., Takacs, T., DAddabbo, T., Biro, I., Malov, X., 2009. Influence of arbuscular mycorrhizal fungi on the nematicidal properties of leaf extracts of Thymus vulgaris L. Helminthologia, 4(46): 230-240. 180. Scherer, R., Godoy, H. T., 2009. Antioxidant activity index (AAI) by the 2,2-diphenyl-1picrylhydrazyl method. Food Chemistry, 112: 654-658. 181. Schultze, W., Knig, W.A., Hilker, A., Richter, R., 1995. Melissenle. Deutsche Apotheke Zeitung, 135: 557-577. 182. Seelinger, G., Merfort, I., Wolfle, V., Schempp, C.M., 2008. Anti-cancerogenic effects of the flavonoid luteolin. Molecules, 13(10): 2628-2651. 183. Selmi, S., Sadok, S., 2008. The effect of natural antioxidant (Thymus vulgaris Linnaeus) on flesh quality of tuna (Thunnus thynnus (Linnaeus)) during chilled storage. Pan-American Journal of Aquatic Science, 3 (1): 36-45. 184. Semeena. Y., Ashok, K., 2001. Evaluation of chemoprevention of skin papilloma by Mentha piperita . Journal of Medicinal and Aromatic Plant Sciences, 22: 84-88. 185. Shati, A.A., Elsaid, F.G., 2009. Effects of water extracts of thume (Thymus vulgaris) and ginger (Zingiber Officinale Roscoe) on alcohol abuse. Food and Chemical Toxicology, 47: 1945-1949. 186. Shibata, H., Kondo, K., Katsuyama, R., Kawazoe, K., Sato, Y., Murakami, K., Takaishi, Y., Arakaki, N., Higuti, T., 2005. Alkyl gallates, intensifiers of beta-lactam susceptibility in methicilin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49: 549555. 187. Singh, R., Shushni, M.A.M., Belkheir, A., 2011. Antibacterial and antioxidant activity of Mentha piperita. Arabian Journal of Chemistry. DOI: 10.1016/j.arabjc. 2011.01.019. 188. Sohn, H.Y., Son, K.H., Kwon, G.S., Kang, S.S., 2004. Antimicrobial and cytotoxic activity of 18 prenylated flavonoids isolated from medicinal plants: Morus alba L., Morus mongolica Schneider, Broussnetia papyrifera (L.) Vent., Sophora flavescens Ait and Echinosophora koreensis Nakai. Phytomedicine, 11: 666-672.
107
Neda Laki
189. Spencer, J.P.E., 2010. The impact of fruit flavonoids on memory and cognition. British Journal of Nutrition, 104, S40-S47. 190. Spiewak, R., Skorska, C., Dutkiewicz, J., 2001. Occupational airborne contact dermatitis caused by thyme dust. Contact Dermatitis, 44(4): 235239. 191. Spigno, G., De Faveri, D.M., 2007. Antioxidants from grape stalks and marc: Influence of extraction procedure on yield, purity and antioxidant power of the extracts. Journal of Food Engineering, 78: 793-801. 192. Stahl-Biskup, E., Venskutonis, R.P., 2004. Thyme. U: K.V. Peter, ed. Handbook of herbs and spices. Cambridge: Woodhead publishing limited, Vol.2. 193. Sugaya, K., Uz, T., Kumar, V., Manev, H., 2000. New anti-inflammatory treatment strategy in Alzheimer's diseaese. The Japanese Journal of Pharmacology, 82: 85-94. 194. Sweetman, S. ed. 2002. Martindale. The Complete Drug Reference. 33rd ed. London: The Pharmaceutical Press. 195. Tagashira, M., Ohtake, Y., 1998. New monoterpene glucosides from aerial parts of thyme (Thymus vulgaris L.). Planta Medica, 64: 555-558. 196. Taherian, A.A., Babaei, M., Abbas, A.V., Morteza, J., Jadidi, M., Sadeghi, H., 2009. Antinociceptive effects of hydroalcoholic extract of Thymus vulgaris. Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences, 1(22): 83-89. 197. Takhtajan, A. (2009): Flowering Plants. Springer Verlag, Berlin. 198. Tucakov, J., 1997. Leenje biljem. Beograd: Rad. 199. ndeer, ., Baaran, A., Degen, G.H., Baaran, N., 2009. Antioxidant activities of major thyme ingredients and lack of (oxidative) DNA damage in V79 Chinese hamster lung fibroblast cells at low levels of carvacrol and thymol. Food and Chemical Toxicology, 8: 2037-2043. 200. Unger, M., Frank, A., 2004. Simultaneous determination of the inhibitory potency of herbal extracts on the activity of six major cytochrome P450 enzymes usinf liquid chromatography/mass spectrometry and automated online extraction. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 18: 2273-2281. 201. Voirin, B., Bayet, C., Faure, O., Jullien, F., 1999. Free flavonoid aglycones as markers of parentage in Mentha aquatica, M. citrata, M. spicata and M. x piperita. Phytochemistry, 50: 1189-1193.
108
Neda Laki
202. Voravuthikunchai, S., Lortheeranuwat, A., Jeeju, W., Sririrak, T., Phongpaichit, S., Supawita, T., 2004. Effective medicinal plants against enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Journal of Ethnopharmacology, 94: 49-54. 203. Vuida-Marlos, M., Riuiz-Navajas, Y., Fernandez-Lopez, J., Sendra, E., Sayas-Barbera, E., Perez-Alvarez, J.A., 2011. Antioxidant properties of pomegranate begasses obtained as coproducts in the juice extraction. Food Reserch International, 44: 1217-1223. 204. Vogel, G.H., Vogel, W.H. ur., 2002. Drug Discovery and Evaluation: Pharmacological assays. 2nd edition. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag. 205. Vuli, J., anadanovi-Brunet, J., etkovi, G., Tumbas, V., ilas, S., etojevi-Simin, D., anadanovi, V., 2012. Antioxidant and cell growth activities of beet root pomace extracts. Journal of Functional Foods, 4: 670-678. 206. Wake, G., Court, J., Pickering, A., Lewis, R., Wilkins, R., Perry, E., 2000. CNS acetylcholin receptor activity in European medicinal plants traditionally used to improve failing memory. Journal of Ethnopharmacology, 69: 105-114. 207. Walf, A., Frye, C., 2007. The use of elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols, Vol.2. No.2. 208. Walfson, A.E., 1948. Estimation of total protein in liver homogenate. American Journal of Clinical Pathology, 18:723. 209. Wang, M., Li, J., Ho, G.S., Peng, X., Ho, C.T., 1998. Isolation and identification of antioxidative flavonoid glycosides from Thyme (Thymus vulgaris L.). Journal of Food Lipids, 5(4): 313-21. 210. Wang, H., Kikuzaki, H., Lin, C.C., Kahyaoglu, A., Huang, M.T., Nakatani, N., i sar., 1999. Acetophenone glycosides from thyme (Thymus vulagris L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47: 1911-1914. 211. Wang, H., Provan, G. J., Halliwell, K., 2004. Determination of rosmarinic acid and caffeic acid in aromatic herbs by HPLC. Food Chemistry, 87: 307-311. 212. Wheelwright, E.G., 1997. Medicinal Plants and Their History. New York: Dover pub. 213. WHO World Health Organization. Traditional Medicine. Dostupno na:
<http://www.who.int/mediacentre/factssheets/fs134/en/ > [Preuzeto: 20 okt 2012]. 214. WHO: WORLD HEALTH ORGANISATION, 1999. WHO monographs vol 1. WHO, Geneva.
109
Neda Laki
215. Williamson, E., Driver, S., Baxter, K., ed., 2009. Stockleys Herbal Medicines Interactions. London: Pharmaceutical Press. 216. Wook Choi, B., Ryu, G., Hee Park, S., Sook Kim, E., Shin, J., Seon Roh, S., Cheol, S., Ho Lee, B., 2007. Anticholinesterase activity of plastoquinones from Sargassum sagamianum: Lead compounds for Alzheimer's disease therapy. Phytotherapy Research, 21: 423-426. 217. Zandi, P., Ahmadi, L., 2000. Antioxidant effect of plant extracts of Labiatae family. Journal of Food Science and Technology, 37(4): 436-439. 218. Zhang, Z.J., 2004. Therapeutic effects of herbal extracts and constituents in animal models of psychiatric disorders. Life Science, 75: 1659-1699. 219. Zheng, W., Wang, S.Y., 2001. Antioxidant activity and phenolic compounds in selected herbs. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 49: 5165-5170. 220. Zheljazkov, V.D., Astatkie, T., 2011. Effect of residual distillation water of 15 plants and three plant hormones on Scotch spearmint (Mentha gracilis Sole). Industrial Crops and Products, 33: 704-709. 221. Zheljazkov, V.D., Astatkie, T., 2012. Distillation waste water can modify peppermint (Mentha x piperita L.) oil composition. Industrial Crops and Products, 36: 420-426.
110
Neda Laki
8.
PRILOZI
8.1. HROMATOGRAMI ISPITIVANIH EKSTRAKATA TIMIJANA
T1
T2
T3
111
Neda Laki
T4
T5
T6
Identifikovana jedinjenja u ispitivanim ekstraktima timijana: 1-galna kiselina, 2-protokatehinska kiselina, 3-kafena kiselina, 4-hlorogenska kiselina, 5-siringinska kiselina, 6-p-kumarinska kiselina, 7-ferulna kiselina, 8-rutin, 9-rozmarinska kiselina, 10-kvercetin, 11-apigenin
112
Neda Laki
8.2. HROMATOGRAMI ISPITIVANIH EKSTRAKATA MATINJAKA
M1
M2
M3
10
113
Neda Laki
M4
M5
10
M6
Identifikovana jedinjenja u ispitivanim ekstraktima matinjaka: 1-galna kiselina, 2protokatehinska kiselina, 3-katehin, 4-kafena kiselina, 6-hlorogenska kiselina, 10-rutin, 12rozmarinska kiselina, 15-naringenin
114
Neda Laki
8.3.
HROMATOGRAMI ISPITIVANIH EKSTRAKATA PITOME NANE
N1
N2
N3
115
Neda Laki
N4
N5
N6
Identifikovana jedinjenja u ispitivanim ekstraktima pitome nane: 1-galna kiselina, 2protokatehinska kiselina, 3-katehin, 4-kafena kiselina, 6-hlorogenska kiselina, 7-siringinska kiselina, 8-epikatehin, 9-ferulna kiselina, 10-rutin, 12-rozmarinska kiselina, 15-naringenin, 18apigenin
116

Disertacija

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Disertacija

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

UNIVERZITET U NOVOM SADU MEDICINSKI FAKULTET KLINIKA MEDICINA

Mentor: Doc. dr Biljana Boin

Kandidat: Neda Laki

Novi Sad, 2013. godine

UNIVERZITET U NOVOM SADU MEDICINSKI FAKULTET

KLJUNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

University of Novi Sad

ekonomskog, ve i sa ekolokog stanovita.

1.1 HIPOTEZE REZULTATA ISTRAIVANJA

3.1.1. Thymus vulgaris L. - timijan

3.1.2. Melissa officinalis L. - matinjak

Doktorska disertacija 3.1.2.4. Neeljena dejstva, kontraindikacije i upozorenja

3.1.2.7. Toksinost, genotoksinost, kancerogenost, mutagenost

3.1.3. Mentha x piperita L. pitoma nana

2. M. piperita var. sylvestris.

Doktorska disertacija 3.1.3.1. Menthae x piperitae folium list pitome nane

Slika 3.7. Flavonoidni aglikoni identifikovani u listu pitome nane i matinjaka

4.1.1. Biljni materijal

4.1.3. Eksperimentalne ivotinje

4.2. PRIPREMA UZORAKA ZA ISPITIVANJA

4.2.1. Priprema poredbenih i ekstrakata od otpadnog materijala

4.3. HEMIJSKA ISPITIVANJA

4.3.1. Odreivanje sadraja ukupnih fenola

4.3.2. Odreivanje sadraja ukupnih flavonoida

4.3.3. Visokoefikasna tena hromatografska (HPLC-DAD) analiza

4.4. ISPITIVANJE BIOHEMIJSKIH AKTIVNOSTI

4.4.1. In vitro ispitivanje antioksidantnog delovanja

4.4.1.1. Odreivanje kapaciteta neutralizacije slobodnih radikala (RSC)

Aradne probe x 100 Akontrolne probe

4.4.1.2. Odreivanje lipidne peroksidacije (LP)

4.4.2. Odreivanje inhibitornog uticaja na enzim acetilholinesterazu

acetilholinesteraze (IC50 vrednosti).

4.4.3. Odreivanje hepatoprotektivnog delovanja

4.5. MIKROBIOLOKA ISPITIVANJA

4.5.1. Priprema ekstrakata za mikrobioloka ispitivanja

4.5.2. Odreivanje koncentracije bakterijskih elija u inokulumu

4.5.3. Priprema inokuluma za mikrodilucijsku metodu

4.5.4. Odreivanje minimalne inhibitorne koncentracije mikrodilucijskom metodom

4.6. ISPITIVANJE FARMAKOLOKOG DELOVANJA

4.6.1. Farmakodinamska ispitivanja

4.6.1.1. Metoda rotirajueg tapa

% depresije = ((A x 100)/B) - 100

gde je A mereno, a B kontrolno (maksimalno) vreme (180 sec).

4.6.1.2. Test suspenzije o repu

4.6.1.3. Uzdignuti lavirint

4.6.1.4. Test prepoznavanja novog objekta

4.7. STATISTIKA OBRADA PODATAKA

5.1.1. Koliina suvog ekstrakta

srednja vrednost iz tri ponavljanja standardna devijacija

5.1.2. Odreivanje sadraja ukupnih fenola i flavonoida u ispitivanim ekstraktima

5.1.3. Rezultati HPLC-DAD analize ispitivanih ekstrakata

5.2. REZULTATI ISPITIVANJA BIOHEMIJSKIH AKTIVNOSTI 5.2.1. In vitro antioksidantno delovanje

5.2.1.1. Skevinder aktivnost - RSC

Tabela 5.8. Indeks antioksidantne aktivnosti ispitivanih ekstrakata i standardnih supstanci.

5.2.1.2. Odreivanje inhibicije lipidne peroksidacije - LP

5.2.2. In vivo antioksidantno (hepatoprotektivno) delovanje

GSH-Px (IU/g proteina) GSH-R

GSH-Px (IU/g proteina) GSH-R

14,9110,02 18,2315,06 16,186,89

(nmol MDA/mg pr.)

(nmol/mg pr. min-1)

(nmol NADPH/ mg pr. min-1)

(nmol konjugata/mg pr. min-1)