VISOKA ZDRAVSTVENO-SANITARNA KOLA STRUKOVNIH STUDIJA

SEMINARSKI RAD

TEMA: TEHNOLOGIJA REKOMBINOVANE DNK

POSTUPCI ZA UNOS REKOMBINOVANE DNK U ELIJU

SADRAJ:

1. Uvod- nauka budunosti.......................................................1 2. Biotehnologija - opti pojam.................................................2 3. Tehnologija rekombinovane DNK 3.1. Molekularno kloniranje...............................................4 3.1.1. Restrikcioni enzimi i ligaze......................................5 3.1.2. Vektori..................................................................6 3.1.3. Postupci za unos rekombinovane DNK u eliju...........7
3.1.3.1. 3.1.3.2. 3.1.3.3. 3.1.3.4. 3.1.3.5. 3.1.3.6. Transformacija.............................................................. Elektroporacija............................................................. Mikroprecipitacija........................................................ Mikroinjekcija............................................................. Lipozomi..................................................................... Genski pitolji.............................................................

3.2. 3.3.

Zakljuak.................................................................. Literatura...................................................................

1. UVOD Nauka budunosti

B i o t e h n o l o g i j a j e n o v a n a u k a - n o v i p r e d me t z n a t i e l je i i s t r a i v a n j a , o d neprocenjivog je znaaja za n ove proizvode i novi nain primene u poljoprivredi,medicini, u oblasti ivotne sredine. Sa ekonomskog aspekta, znaajna je za razvoj industrije. Obuhvata mnoge oblast i, od genetskog inenjeringa do bioinformatike,genoma, biosenzora... Svi procesi i tehnologije biotehnologije su sredstvo za bolje razumevanje ivih organizama i jedan od naina za menjanje tih organizama kako bi se poboljalo zdravlje, opstanak i karakteristike ivih organizama. Vie od 10 hiljadag o d i n a l ju d i mi je n ja ju b i l jk e , i v o t i n je i i v o t n u s r e d i n u u n a s t o ja n ju d a d o u d o najboljih rjeenja. Biotehnologija se kao nova nauna disciplina pojavila pre dve i po decenije i to istovremeno u Bostonu, San Francisku i Kembridu gde su naunici doli do odreenih otkria. Od tada do danas biotehnologija se rairila na gotovo sve delove sveta, prisutna je u Evropi, na Dalekom Istoku, Azij. U Americi ona postoji u 42 drave. Najvanija oblast je zdravlje, pa strunjaci nastoje da otkriju razloge bolesti, da ree njihovo poreklo i zato ljudski organizam reaguje na njih, kao i nain n a k o ji o n e m o g u d a s e t r e t i r a ju . D a n a s u s v e t u p o s t o ji o k o 1 3 0 l e k o v a k o ji s u proizvod biotehnologije. To je prvo polje interesovanja, sljedee je poljoprivreda, a zatim i hrana. U sreditu interesovanja su sloene tehnoloke intervencije na ljudskoj vrsti ali i svi oni eksperimenti u biosferi kao ivotnom prostoru. Visok nivo dostignua u genetici, rezultati koji prevazilaze sva oekivanja su razlozi zbog kojih je neophodno etiko vrednovanje bioinenjeringa.

2. BIOTEHNOLOGIJA - OPTI POJAM

Pod biotehnologijom se podrazumeva integrisana primena prirodnih i inenjenerskih naunih disciplina. Cilj je da se organizmi i delovi organizama upotrebe za dobijanje proizvoda za dobrobit oveanstva, ili se primene za razne biotehnoloke postupke. Biotehnologija spada u kljune tehnologije 21 . veka. Ona je multidisciplinarna nauka koja je povezala vie nauka: genetiku, mikrobiologiju, molekularnu biologiju, biohemiju, embriologij u, elijsku biologiju. Biotehnologija se u svojim oblastima primene deli na nekoliko grana: -Crvena biotehnologija -Zelena biotehnologija -Siva biotechnologija -Bela biotehnologija -Plava biotehnologija. Crvena biotehnologija (medicina) va i za glavno podruje primene biotehnologije. Biotehnoloki postupci igraju rastuu ulogu kod razvoja novih lekova. Isto tako kod dijagnostike (DNA-ipovi,biosenzori) su za biotehnologiju od velikog znaaja. Crvena biotehnologija ima najiru prihvaenost i vai kao kljuna tehnologija i motor razvoja za brojne druge privredne grane. Zelena biotehnologija obuhvata podruje primjene savremene zatite bilja. Ovde se biotehnolokim metodama ciljano uvode otporna sredstva protiv insekata, gljiva, virusa i herbicida. Od posebnog znaaja za oblast zelene biotehnologije je genska tehnika. Ona ini osnovu metode prenoenja odreene vrste gena sa jedne vrste biljke na drugu kako bi se omoguilo da razviju otpornost. Siva biotehnologija bavi se oblau tehnike zatite ivotne sredine. Ovde biotehnoloki postupci pomau pri saniranju zemljita, tretmanu otpadnih voda, preiavanju izduvnih gasova, preiavanju vazduha, kao i kod odvajanja otpada i ostataka. Bela biotehnologija obuhvata podruje primjene unutar hemijske industrije. Zadatak bele biotehnologije je da se, supstance poput npr. alkohola, vitamina, aminokiselina, antibiotika ili enzima proizvode sa to manjim troenjem resursa i to manjim optereivanjem ivotne sredine. Plava biotehnologija stavlja teite na tehniku primenu procesa i organizama biologije mora. Uii interesovanja su bioloki organizmi svetskih mora.

Biotehnologija svoju primjenu nalazi u sedeim industrijama: 1. hemijska i farmaceutska industrija 2.industrija hrane i ukusa 3.industrija tretmana otpadnih voda, otpada i izduvnih gasova 4.istraivake organizacije za prirodne i medicinske nauke 5.razvoj, prodaja i savjetovanje biotehnolokih ureaja i postrojenja Biotehnologija predstavlja primenu biolokih aktivnosti za dobijanje nekog proizvoda ili ostvarivanje nekog procesa. Ona se moe podeliti na: tradicionalnu biotehnologiju koja obuhvata: 1. Oplemenjivanje biljaka i domaih ivotinja tehnikama selektivnog ukrtanja. Pravila prenosa gena tokom selektivnog ukrtanja prvi je ustanovio Georg Mendel u 19. Veku. 2. Korienje mikoroorganizama za proizvodnju hrane i pia i dr , preradu otpadnih voda,proizvodnju biogasa i sl. Upotreba mikroorganizama u najveoj meri se bazira nabiohemijskim procesima fermentacije to predstavlja anaerobnu razgradnju ugljenih hidrata do etanola ili mlene kiseline. Ttradicionalna biotehnologija je usko vezana sa njenom primenom u zatiti ivotne sredine. savremenu biotehnologiju u koju spadaju: 1. genetski inenjering 2. kloniranje 3 . inenjering tkiva Savremema biotehnologija je pojam koji se odnosi na specifine tehnologije manipulisanja genetskim materijalom. 1972 god. u San Francisku otkrivena je tehnologija rekombinovane DNK to je u potpunosti promenilo pristup biotehnologiji I dalo na njenom znaaju. Osnovno pitanje vezano za savremenu biotehnologiju jeste kako racionalno iskoristiti prednostikoje ona prua, a da se pri tome spree potencijalne negativne posljedice po oveka i njegovu ivotnu sredinu.

3. TEHNOLOGIJA REKOMBINOVANE DNK 3.1 MOLEKULARNO KLONIRANJE Molekularno kloniranje ili genetiko inenjerstvo ili tehnologija rekombinovane DNK predstavlja novu tehnologiju koja se razvila poslednjih nekoliko decenija. Pomou ove tehnologije moe se modifikovati genetika osnova elija i organizama putem manipulacija pojedinanim genima. Pomou tehnike rekombinovane DNK ljudi su stekli sposobnost precizne integracije nizova DNK koje pripadaju razliitim organizmima iste vrste ili ak razliitim biolokim vrstama. Dakle, rekombinovana DNK predstavlja molekule DNK iji se delovi, dobijeni iz razliitih organizama, vetaki spajaju. Na taj nain se mogu dobiti hibridni molekuli DNK koji se normalno nikada ne bi mogli sresti u prirodi. Kloniranje gena je najznaajniji proces u ovoj tehnologiji i odvija se kroz 4 koraka: 1) Isecanje eljenog fragmenta DNK iz molekula DNK donora pomou specifinih enzimarestrikcionih endonukleaza. 2) Spajanje dobijenog fragmenta DNK sa malim molekulom DNK koji ima sposobnost replikacije (vektor za kloniranje). Hibridni molekul DNK, nastao spajanjem fragmenta DNK sa vektorom (plasmid ili virusna DNK), naziva se rekombinovani molekul DNK. Spajanjefragmenta DNK sa vektorom vri se pomou enzima DNK ligaze. 3) Unoenje rekombinovanog molekula DNK u eliju domaina iji enzimi obezbeuju njegovu replikaciju. 4) Identifikacija elija domaina u kojima se nalazi ispitivani fragment DNK i njegovo izolovanje.
Proces molekulskog kloniranja(izvor Wikimedia) 1,2 i 3- isecanje eljenog segmenta DNK; 4 i 5- spajanje segmenata DNK sa vektorom; 6unoenje rekombinovane DNK u eliju domaina; 7-propagacija elije sa rekombinovanom DNK

3.1.1 RESTRIKCIONI ENZIMI I LIGAZE Restrikcioni enzimi preieni su iz bakterija i spadaju u grupu nukleaza, enzima koji degraduju nukleinske kiseline ( supstrat za restrikcione enzime je dvolanana DNK). Izolovanje restrikcionih enzima omoguilo je kontrolisanu fragmentaciju hromozoma,to predstavlja prvi korak u analizi DNK. Razliite vrste bakterija proizvode restrikcione enzime koji prepoznaju razliita mesta na DNK. Budui da je do sada izolovano mnotvo restrikcionih enzima, mogu se lako pronai oni koji e iz hromozoma izrezati fragment koji u sebi nosi bilo koji pojedinani gen. Svaki od enzima nosi ime na osnovu prvog slova roda i prva dva slova vrste mikroorganizma iz koga su prvi put izolovani.Tako na primer naziv restrikcionog enzima EcoRI oznaava da je on prvi put izolovan iz bakterije Escherichia coli, slovo R oznaava soj, a rimski br. I oznaava da je ovo prvi enzim izolovan iz ovog soja. (SmaI po Serratia marcescens, itd.). Utvreno je da bakterije proizvode restrikcione enzime da bi se zatitile od infekcije bakterijskim virusima. Restrikcioni enzimi prepoznaju strani molekul DNK u bakterijskoj eliji i onemoguavaju njen opstanak, vrei na taj nain svoju bioloku funkciju. Restrikcioni enzimi ne mogu prepoznati bakterijsku DNK, jer su u bakterijskom genomu mesta prepoznavanja restrikcionih enzima zatiena od degradacije specifinim modifikacionim enzimima koji vre male hemijske izmene odreenih purinskih ili pirimidinskih baza (npr. metilacijom citozina).U stranoj DNK ova mesta nisu metilovana i zato ih restrikcioni enzimi prepoznaju i degraduju virusni genom . Po mestu dejstva ove enzime delimo u dve velike grupe: 1. Restrikcione endonukleaze koje isecaju DNK sekvence unutar samog molekula DNK 2. Restrikcione egzonukleaze koje vre isecanje samo na krajevima DNK molekula DNK svakog organizma je specifina pa restrikcioni enzimi je seku uvek na istim mestima stvarajui isti broj segmenata koji se nazivaju restrikcioni fragmenti.

U veini sluajeva sekvence prepoznavanja su palindromne (to su dvostruko simetrini nizovi nukleotida koji su identini kada se oba lanca itaju u istom smeru). Tako na primer enzim EcoRI koji je izolovan iz E. coli see DNK na svakom mestu gde se pojavljuje sekvenca od est baza:GAATTC. Fragmenti DNK se nazivaju lepljivim jer se dva razliita fragmenta DNK mogu lako spojiti hibridizacijom izmeu jednolananih krajeva, ukoliko je ispunjen uslov da su obe sekvence dobijene pomou istog restrikcionog enzima, jer su tada njihovi krajevi komplementarni. Posle hibridizacije mogue je pomou enzima DNK ligaze spojiti lance DNK fosfodiestarskim vezama, i na taj nain dobiti hibridni tj. rekombinovani molekul DNK. Na ovaj nain, restrikcijom, a potom ligacijom DNK, moe se bilo koji fragment DNK putem vektora za kloniranje (to su plazmidne ili virusne DNK) ugraditi u autoreplikujui genom u kojoj e se zajedno sa vektorskom DNK umnoavati.

3.1.2 VEKTORI ZA KLONIRANJE Kao vektori se najee koriste plazmidi, mali kruni dvolanani molekuli DNK koji se nalaze u bakterijama. Oni se replikuju nezavisno od bakterijskog genoma i obino nose gene koji su vani za bakteriju, na primer gene koji determinisu osetljivost bakterija na antibiotike. Tako vi koristite te gene kao markere za izdvajanje bakterija koje su primile plazmide sa vaim fragmentom DNK od onih koji nisu. Nekada su se koristili prirodni plazmidi, a onda su poeli malo po malo da se modifikuju.. Danas su tehnike uznapredovale, pa imate svega nekoliko vrsta plazmida koji se mogu upotrebiti za razliite stvari. To je omogueno time to se u plazmid ugradi jedan region koji se naziva polylinker region i ugrade se mnogobrojna restrikciona mesta za mnogobrojne endonukleaze.. Mana im je to se u bakterijsku eliju unose transformacijom procesom u kome se u bakteriju unosi strain molekul DNK. Zbog navedenih ogranienja plazmida razvijene su metode za korienje drugih vektora. Jedan od najpoznatijih je fag. To je jedan bakteriofag iji je molekul DNK linearan. Svi geni potrebni za pakovanje virusnih partikula nalaze se na krajevima hromozoma, a srednji deo hromozoma nije povezan sa litikim ciklusom. Moemo ukloniti sredinu genoma, umesto njega staviti poprilino dugaak fragment DNK, i sve to bez ometanja litikog ciklusa faga. Ovakav fag se moe in vitro spakovati. Postoje i drugi tipovi vektora. Sve je ilo ka tome da se naprave vektori koji e moi da nose vee fragmente DNK, ime je omogueno sekvenciranje celih genoma. Tako se krenulo sa korienjem kvaevih hromozoma i vetakih bakterijskih hromozoma. Nastali su kozmidi, koji su pomirili dobre osobine plazmida i faga mogu poneti vie DNK nego plazmidi, a pakuju se in vitro kao fag.

3.1.3 POSTUPCI ZA UNOS REKOMBINOVANE DNK U ELIJU