The EMBO J o u r n a l v o l . 1 1 n o . 9 pp.

3237 - 324 4 , 1 9 9 2
C o n v er s i o n o f hu ma n i n t er l eu k i n -4 i n t o a hi g h a f f i n i t y
a n t a g o n i s t b y a s i n g l e a mi n o a c i d r epl a c emen t
N . K r u s e, H . -P . To n y ' a n d W . S eb a l d 2
Theo d o r -Bo v er i -I n s t i t u t f U i r Bi o w i s s en s c ha f t en ( Bi o z en t r u m) d er
U n i v er s i t a t W u r z b u r g , P hy s i o l o g i s c he C hemi e I I , Am H u b l a n d ,
D -8 70 0 W u r z b u r g a n d ' Med i z i n i s c he P o l i k l i n i k d er U n i v er s i t S t ,
K l i n i k s t r . 6 -8 , 8 70 0 W u r z b u r g , G er ma n y
2C o r r es po n d i n g a u t ho r
C o mmu n i c a t ed b y H . Mi c hel
I n t er l eu k i n -4 ( I L 1 4 ) r epr es en t s a pr o t o t y pi c l y mpho k i n e
( f o r a r ec en t r ev i ew s ee P a u l , 1 9 9 1 ) . I t pr o mo t es
d i f f er en t i a t i o n o f B-c el l s a n d t he pr o l i f er a t i o n o f T- a n d
B-c el l , a n d o t her c el l t y pes o f t he l y mpho i d s y s t em. An
a n t a g o n i s t o f hu ma n I L -4 w a s d i s c o v er ed d u r i n g t he
s t u d i es pr es en t ed her e a f t er Ty r l 24 o f t he r ec o mb i n a n t
pr o t ei n ha d b een s u b s t i t u t ed b y a n a s pa r t i c a c i d r es i d u e.
Thi s I L -4 v a r i a n t , Y 1 24 D , b o u n d w i t h hi g h a f f i n i t y t o
t he I L -4 r ec ept o r ( K D = 31 0 pM) , b u t r et a i n ed n o
d et ec t a b l e pr o l i f er a t i v e a c t i v i t y f o r T-c el l s a n d i n hi b i t ed
I L -4 -d epen d en t T-c el l pr o l i f er a t i o n c o mpet i t i v el y
( K ; = 6 20 pM) . The l o s s o f ef f i c a c y i n v a r i a n t Y 1 24 D
w a s es t i ma t ed t o b e > 1 0 0 -f o l d o n t he b a s i s o f a w ea k
pa r t i a l a g o n i s t a c t i v i t y f o r t he v er y s en s i t i v e i n d u c t i o n
o f C D 23 po s i t i v e B-c el l s . The s u b s i t u t i o n o f Ty r l 24 b y
ei t her phen y l a l a n i n e, hi s t i d i n e, a s pa r a g i n e, l y s i n e o r
g l y c i n e r es u l t ed i n pa r t i a l a g o n i s t v a r i a n t s w i t h u n a l t er ed
r ec ept o r b i n d i n g a f f i n i t y a n d r el a t i v el y s ma l l d ef i c i en c i es
i n ef f i c a c y . Thes e r es u l t s d emo n s t r a t e t ha t hi g h a f f i n i t y
b i n d i n g a n d s i g n a l g en er a t i o n c a n b e u n c o u pl ed ef f i c i en t l y
i n a l i g a n d o f a r ec ept o r b el o n g i n g t o t he r ec en t l y
i d en t i f i ed hema t o po i et i n r ec ept o r f a mi l y . I n a d d i t i o n w e
s ho w f o r t he f i r s t t i me, t ha t a po w er f u l a n t a g o n i s t a c t i n g
o n t he I L 4 r ec ept o r s y s t em c a n b e d er i v ed f r o m t he I L 4
pr o t ei n .
K ey w o r d s : d r u g d es i g n / pa r t i a l a g o n i s t s / r ec ept o r s i g n a l l i n g
I n t r o d u c t i o n
I n t er l eu k i n -4 ( I L -4 ) r epr es en t s a t y pi c a l i mmu n o r eg u l a t o r y
l y mpho k i n e ( f o r r ev i ew s ee P a u l a n d Oha r a , 1 9 8 7;
F i n k el ma n et a l . , 1 9 9 0 ; P a u l , 1 9 9 1 ) . I t i s pr o d u c ed ma i n l y
b y a c t i v a t ed T-c el l s a n d ma s t c el l s a n d ha s a w i d e r a n g e o f
b i o l o g i c a l a c t i v i t i es o n v a r i o u s c el l t y pes o f t he l y mpho i d
s y s t em. B-c el l s a r e s t i mu l a t ed i n v i t r o t o expr es s c l a s s I I
ma j o r hi s t o c o mpa t i b i l i t y c o mpl ex ( MH C H ) mo l ec u l es , t he
I g E l o w a f f i n i t y r ec ept o r ( F c eR I I , C D 23) a n d i mmu n o -
g l o b u l i n s c l a s s E a n d G I . D N A s y n t hes i s i s i n d u c ed i n
a c t i v a t ed B-c el l s , a s w el l a s i n ma t u r e T-c el l s , f o et a l
t hy mo c y t es , ma s t c el l s a n d o t her s .
Mi c e t r ea t ed w i t h n eu t r a l i z i n g a n t i b o d i es d i r ec t ed a g a i n s t
I L -4 o r a g a i n s t t he I L -4 r ec ept o r ( F i n k el ma n et a l . , 1 9 9 0 ;
U r b a n , J r et a l . , 1 9 9 1 ) , a s w el l a s mi c e b ea r i n g a n i n a c t i v a t ed
I L -4 g en e ( K u hn et a l . , 1 9 9 1 ) , a r e u n a b l e t o pr o d u c e I g E
a n d s ho w r ed u c ed s er u m l ev el s o f I g G 1 a f t er c ha l l en g e w i t h
( ) Oxf o r d U n i v er s i t y P r es s
t he r el ev a n t s t i mu l i . Thi s i n d i c a t es a phy s i o l o g i c a l r o l e o f
I L -4 a t l ea s t i n t he r eg u l a t i o n o f I g E l ev el s , mo s t l i k el y b y
a c t i n g a s a n i s o t y pe s w i t c hi n g f a c t o r . C o n s eq u en t l y , I L -4
ma y exer t a pa t ho phy s i o l o g i c a l r o l e i n t he g en er a t i o n o f
d i s ea s e s t a t es , a s f o r exa mpl e hy per -I g E s y n d r o me o r I g E-
med i a t ed a l l er g i c c o n d i t i o n s ( s ee F i n k el ma n et a l . , 1 9 9 0 ;
Tepper et a l . , 1 9 9 0 ) .
I L -4 f u n c t i o n i s med i a t ed b y i t s b i n d i n g t o pl a s ma
memb r a n e r ec ept o r s o c c u r r i n g a t t he r el a t i v el y s ma l l
n u mb er s o f 1 5 0 -25 0 0 mo l ec u l es per t a r g et c el l ( C a b r i l l a t
et a l . , 1 9 8 7; P a r k et a l . , 1 9 8 7) . A s i n g l e d i s s o c i a t i o n
c o n s t a n t o f
-
1 0 0 pM ha s b een d et er mi n ed f o r t hi s i n t er -
a c t i o n . The I L -4 r ec ept o r pr o b a b l y c o mpr i s es o n l y a s i n g l e
po l y pept i d e c ha i n o f
-
8 0 0 a mi n o a c i d r es i d u es a s s u g g es t ed
b y c hemi c a l c r o s s l i n k i n g exper i men t s u s i n g 1 25 I l a b el l ed
I L -4 ( Mo s l ey et a l . , 1 9 8 9 ; G a l i z z i et a l . , 1 9 9 0 ; H a r a d a
et a l . , 1 9 9 0 ; I d z er d a et a l . , 1 9 9 0 ) . Bi n d i n g t o I L -4 i n v i t r o
i s n o t i n f l u en c ed b y s t r u c t u r a l el emen t s a pa r t f r o m t he
ext r a c el l u l a r po r t i o n o f t he r ec ept o r , s i n c e s i mi l a r
d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s w er e f o u n d f o r a s s o c i a t i o n w i t h I L -4
w i t h t he en t i r e r ec ept o r a n d o n l y t he l i g a n d b i n d i n g d o ma i n
i n t he c a s e o f b o t h t he mo u s e a n d t he hu ma n pr o t ei n
( Ma l i s z ew s k i et a l . , 1 9 9 0 ; G a r r o n e et a l . , 1 9 9 1 ) . At pr e-
s en t i t i s u n c l ea r i f a s ec o n d pr o t ei n a g g r eg a t es w i t h t he
r ec ept o r a f t er I L -4 -i n d u c ed a c t i v a t i o n . The I L -4 r ec ept o r i s
ev o l u t i o n a r i l y r el a t ed t o t he l a r g e f a mi l y o f hema t o po i et i n
r ec ept o r s , i n c l u d i n g r ec ept o r s ( o r r ec ept o r s u b u n i t s ) f o r
i n t er l eu k i n s -2, 3, 4 , 5 , 6 a n d 7, f o r G M- a n d G -C S F a n d
a l s o f o r er y t hr o po i et i n , g r o w t h ho r mo n e a n d pr o l a c t i n e
( Ba z a n , 1 9 9 0 a , b ; C o s ma n et a l . , 1 9 9 0 ) . Al l t hes e pr o t ei n s
s ho w pa r t i c u l a r ho mo l o g i es i n t he a mi n o a c i d s eq u en c e o f
t hei r ext r a c el l u l a r l i g a n d b i n d i n g d o ma i n s .
N MR s t u d i es r ev ea l ed a t hr ee-d i men s i o n a l s t r u c t u r e o f
hu ma n I L -4 c o mpr i s i n g a f o u r -hel i x b u n d l e mo t i f w i t h a n
u p-u p-d o w n -d o w n c o n n ec t i v i t y ( R ed f i el d et a l . , 1 9 9 1 )
s i mi l a r t o b o t h hu ma n a n d po r c i n e g r o w t h ho r mo n e ( Ab d el -
Meg u i d et a l . , 1 9 8 7; D e V o s et a l . , 1 9 9 2) . Ot her l i g a n d s
b i n d i n g t o memb er s o f t he ha ema t o po i et i n r ec ept o r f a mi l y
a l s o a ppea r t o b e hel i c a l l y o r g a n i z ed pr o t ei n s ( s ee Ba z a n ,
1 9 9 0 a , b ) . The c r y s t a l s t r u c t u r e o f hu ma n I L -2 s ho w s a f o u r -
hel i x b u n d l e ( Br a n d hu b er et a l . , 1 9 8 7) a l b ei t w i t h a
c o n n ec t i v i t y d i f f er en t f r o m I L -4 . The a mi n o a c i d s eq u en c es
o f t hes e l i g a n d s d i s pl a y n o c l ea r ho mo l o g i es . A pu z z l i n g
s i mi l a r i t y , ho w ev er , i s a ppa r en t i n t he pa t t er n o f a mi n o a c i d
r es i d u es f o r mi n g o n e s u r f a c e o f a pu t a t i v e a mphi pa t hi c hel i x
a t t he C -t er mi n u s o f t hes e pr o t ei n s ( S a n d er s o n et a l . , 1 9 8 8 ;
s ee Ba z a n , 1 9 9 0 b ) . S eq u en c e po s i t i o n s i n v o l v ed i n r ec ept o r
b i n d i n g ha v e b een i d en t i f i ed i n s ev er a l l i g a n d s o f t he
ha ema t o po i et i n r ec ept o r f a mi l y , e. g . i n I L -2 ( C o l l i n s et a l . ,
1 9 8 8 ; W ei g el et a l . , 1 9 8 9 ; Z u r a w s k i a n d Z u r a w s k i ,
1 9 8 9 ) , g r o w t h ho r mo n e ( C u n n i n g ha m a n d W el l s , 1 9 9 1 ;
C u n n i n g ha m et a l . , 1 9 9 1 ) , G M-C S F a n d I L -5 ( S ha n a f el t
et a l . , 1 9 9 1 ) . Ami n o a c i d r es i d u es i n v o l v ed i n s i g n a l
g en er a t i o n , ho w ev er , ha v e b een mo r e d i f f i c u l t t o i d en t i f y .
I n o r d er t o a d d r es s t hi s i s s u e, c o n t r i b u t i o n s o f pa r t i c u l a r
3237
N . K r u s e, H . -P . To n y a n d W . S eb a l d
a mi n o a c i d s t o r ec ept o r a f f i n i t y a n d b i o l o g i c a l a c t i v i t y ,
r es pec t i v el y , ha v e t o b e d i s t i n g u i s ha b l e. As y et , u n c o u pl i n g
o f r ec ept o r b i n d i n g f r o m b i o l o g i c a l ef f ec t s ha s b een o b s er v ed
t o s o me ext en t o n l y i n t he c a s e o f c er t a i n mu t a n t d er i v a t i v es
o f b o t h hu ma n a n d mu r i n e I L -2 ( L i a n g et a l . , 1 9 8 8 ;
Z u r a w s k i et a l . , 1 9 9 0 ) .
R ec en t l y w e ha v e g en er a t ed a s et o f mu t a n t v a r i a n t s o f
hu ma n I L -4 w i t h s i n g l e s u b s t i t u t i o n s a t t he po s i t i o n s o f a l l
c y s t ei n y l a n d a r o ma t i c r es i d u es ( K r u s e et a l . , 1 9 9 1 ) . On e
o f t hes e v a r i a n t s , Y 1 24 D , w a s c o mpl et el y i n a c t i v e ev en a t
mi c r o mo l a r c o n c en t r a t i o n s d u r i n g a T-c el l pr o l i f er a t i o n
a s s a y . S u b s eq u en t l y , w e r ea l i z ed t ha t v a r i a n t Y 1 24 D
ef f i c i en t l y i n hi b i t s I L 4 i n d u c ed T-c el l pr o l i f er a t i o n . Thi s
pr o mo t ed t he g en er a t i o n o f I L -4 v a r i a n t s i n w hi c h Ty r l 24
w a s s u b s t i t u t ed b y r es i d u es d i f f er i n g i n s i z e, po l a r i t y o r
c ha r g e, r es pec t i v el y . The r ec ept o r b i n d i n g a f f i n i t y o f t hes e
i s o l a t ed mu t a n t pr o t ei n s w a s d et er mi n ed , a s w el l a s t hei r
b i o l o g i c a l a c t i v i t i es i n t w o i n v i t r o a s s a y s d i f f er i n g i n
s en s i t i v i t y b y n ea r l y t w o o r d er s o f ma g n i t u d e. The r es u l t s
o f t hes e exper i men t s i n d i c a t ed t ha t t he n a t u r e o f t he s i d e
c ha i n a t po s i t i o n 1 24 o f hu ma n I L -4 d r a ma t i c a l l y a f f ec t s
s i g n a l g en er a t i o n a n d b i o l o g i c a l a c t i v i t y , w hi l e t he i n f l u en c e
o n r ec ept o r b i n d i n g i s ma r g i n a l .
The d emo n s t r a t i o n o f t he f ea s i b i l i t y t o o b t a i n a n ef f i c i en t
a n t a g o n i s t o f t he I L 4 r ec ept o r s y s t em ha s s ev er a l i mpo r t a n t
i mpl i c a t i o n s . F i r s t , i n hi b i t o r y I L -4 v a r i a n t s r epr es en t
po t en t i a l d r u g s hel pf u l f o r exa mpl e i n t he t r ea t men t o f I g E-
med i a t ed d i s ea s es ( s ee e. g . F i n k el ma n et a l . , 1 9 9 0 ; P a u l ,
1 9 9 1 ) s i mi l a r t o t her a peu t i c mo n o c l o n a l a n t i b o d i es a g a i n s t
I L -4 o r t o t he s o l u b l e ext r a c el l u l a r I L -4 r ec ept o r d o ma i n
( Ma l i s z ew s k i et a l . , 1 9 9 0 ; G a r r o n e et a l . , 1 9 9 1 ) . S ec o n d l y ,
a n t a g o n i s t i c l i g a n d s ma y pr o v e v a l u a b l e t o o l s f o r t he
i n v es t i g a t i o n o f I L -4 r ec ept o r -med i a t ed s i g n a l t r a n s d u c i n g
mec ha n i s ms . Thi r d l y , c o n s i d er i n g t he ho mo l o g i es a n d
s i mi l a r i t i es men t i o n ed a b o v e, i t i s a n i n t r i g u i n g po s s i b i l i t y
t ha t s i mi l a r a n t a g o n i s t i c v a r i a n t s w i l l b e f o u n d f o r o t her
l i g a n d s o f t hi s r ec ept o r f a mi l y ( s ee a l s o Z u r a w s k i et a l . ,
1 9 9 0 ) .
R es u l t s
R ed u c ed ef f i c a c y o f I L 4 v a r i a n t s i n T-c el l pr o l i f er a t i o n
R ec o mb i n a n t hu ma n I L -4 pr o mo t ed D N A s y n t hes i s i n
pr es t i mu l a t ed T-c el l s w i t h a ha l f -ma xi ma l r es po n s e a t a
c o n c en t r a t i o n ( EC 5 0 )
o f 230 pM ( F i g u r e 1 ) . S u b s t i t u t i o n o f
Ty r l 24 b y a s pa r t i c a c i d n ea r t he C -t er mi n u s o f t he
1 29 -r es i d u e I 1 4 r es u l t ed i n t he mu t a n t pr o t ei n Y 1 24 D , w hi c h
ha d n o mea s u r a b l e a c t i v i t y i n t he T-c el l pr o l i f er a t i o n a s s a y
( s ee a l s o K u r u s e et a l . , 1 9 9 1 ) . S u b s t i t u t i o n o f Ty r l 24 b y
a s er i es o f o t her a mi n o a c i d r es i d u es c a u s ed l es s pr o n o u n c ed
a l t er a t i o n s . As t he mu t a n t pr o t ei n Y 1 24 F ha d t he s a me
b i o a c t i v i t y a s w i l d t y pe I L 4 ( s ee Ta b l e I f o r s t a t i s t i c a l
ev a l u a t i o n s ) , t he hy d r o xy l g r o u p o f Ty r l 24 i s n o t es s en t i a l .
H i s 1 24 c a u s ed a s ma l l b u t s i g n i f i c a n t r ed u c t i o n o f t he
ma xi ma l r es po n s e. As pa r a g i n e, l y s i n e o r g l y c i n e a t t hi s
po s i t i o n r ed u c ed t he po t en c y t o 29 -1 3% o f w i l d t y pe I L -4 .
A c o mpa r i s o n o f mu t a n t pr o t ei n s Y 1 24 N a n d Y 1 24 D c l ea r l y
d emo n s t r a t ed t ha t t he i n t r o d u c t i o n o f a n eg a t i v e c ha r g e
c a u s ed t he mo s t d r a ma t i c ef f ec t o n I L -4 a c t i v i t y .
R ema r k a b l y , t he ha l f -ma xi ma l r es po n s e o f t he r es i d u a l
a c t i v i t y ( EC 5 0 ) o f t he mu t a n t pr o t ei n s r ema i n ed w i t hi n t he
s a me c o n c en t r a t i o n r a n g e ( 1 30 -230 pM) a s f o u n d f o r w i l d
t y pe I L -4 . Thi s i s a t y pi c a l c ha r a c t er i s t i c o f pa r t i a l a g o n i s t s
f o r w hi c h b i n d i n g a n d s i g n a l g en er a t i o n ( ef f i c a c y ) a r e
3238
I D
1 0 0
a
I L -4 .
0 Y l 1 24 F
8 0
. 0 E Y 1 24 H
( D
6 0
v , Y 1
24 N
Q L E
4 0
_ Y 1 24 K
~~2~20 AYY 24 G A
0 220 X
1 1 Y 1 2 1 D I Ai t l i i i
1 1 0 1 0 0 1 0 0 0
I L 4 o r mu t a n t pr o t ei n ( pM)
F i g . 1 . P r o l i f er a t i o n o f pr es t i mu l a t ed T-c el l s ( P H A b l a s t s ) i n r es po n s e
t o i n c r ea s i n g c o n c en t r a t i o n s o f I L -4 ( M) a n d mu t a n t pr o t ei n s Y 1 24 F
( O) , Y 1 24 H ( V ) , Y 1 24 N ( V ) , Y 1 24 K ( A) , Y 1 24 G ( A) a n d
Y 1 24 D ( 0 ) .
pa r t i a l l y u n c o u pl ed ( R u f f o l o , J r , 1 9 8 2; Bl a c k , 1 9 8 9 ) . The
u n a l t er ed EC 5 0 v a l u es f o r t he v a r i a n t s f u r t her s u g g es t t ha t
t he r es po n s e i s l i mi t ed b y r ec ept o r o c c u pa n c y ( R u f f o l o , J r ,
1 9 8 2) . Mu t a n t pr o t ei n s a f f ec t ed i n r ec ept o r b i n d i n g ( s ee e. g .
C o l l i n s et a l . , 1 9 8 8 ; W ei g el et a l . , 1 9 8 9 ; Z u r a w s k i a n d
Z u r a w s k i , 1 9 8 9 ; C u n n i n g ha m a n d W el l s , 1 9 9 1 ;
C u n n i n g ha m et a l . , 1 9 9 1 ; S ha n a f el t et a l . , 1 9 9 1 ) s ho w a
d i f f er en t b eha v i o u r s u c h t ha t t hey pr o d u c e a ma xi ma l
r es po n s e s i mi l a r t o t he w i l d t y pe i f a ppl i ed i n s u f f i c i en t
c o n c en t r a t i o n s .
P a r t i a l a g o n i s m o f I L -4 v a r i a n t s i n B-c el l d i f f er en t i a t i o n
C o mpa r ed w i t h t he T-c el l pr o l i f er a t i o n a s s a y , mu c h l o w er
c o n c en t r a t i o n s o f I L -4 w er e s u f f i c i en t t o s t i mu l a t e B-c el l s
f o r t he i n d u c t i o n o f C D 23 ( F c eR I I ) , t he l o w a f f i n i t y I g E
r ec ept o r ( K i k u t a n i et a l . , 1 9 8 6 ; D eF r a n c e et a l . , 1 9 8 7) .
Af t er s t i mu l a t i o n , t he n u mb er o f C D 23 po s i t i v e c el l s
i n c r ea s ed w i t h EC 5 0 o f -0 . 4 pM f o r I L 4 ( F i g u r e 2A) ( s ee
a l s o S o l a r i et a l . , 1 9 8 9 ) . I n t hi s v er y s en s i t i v e a s s a y , mu t a n t
pr o t ei n Y 1 24 D b eha v ed a s a pa r t i a l a g o n i s t . The n u mb er
o f B-c el l s t ha t w er e s t i mu l a t ed b y Y 1 24 D t o expr es s C D 23
w a s u p t o 4 5 % o f t ha t f o u n d f o r w i l d t y pe I L -4 , w i t h a n
EC 5 0 o f 21 0 pM. V er y hi g h I L -4 c o n c en t r a t i o n s d i d n o t
i n c r ea s e t he n u mb er o f C D 23 po s i t i v e c el l s f u r t her , b u t
s t i mu l a t ed hi g her mea n C D 23 expr es s i o n i n t he r es po n d i n g
c el l s a s a l s o d et er mi n ed b y F AC S a n a l y s i s . The mea n EC 5 0
w a s 5 pM I L -4 i n d i f f er en t exper i men t s ( s ee Ta b l e I ) . Mu t a n t
pr o t ei n Y 1 24 D i n d u c ed a ma xi ma l r es po n s e o f 8 % c o mpa r ed
w i t h w i l d t y pe I L -4 ( F i g u r e 2B) . H a l f -ma xi ma l r es po n s e
o c c u r r ed a t 31 0 pM Y 1 24 D . Thes e r es u l t s c l ea r l y es t a b l i s hed
t ha t t he mu t a n t pr o t ei n Y 1 24 D ha s a v er y w ea k pa r t i a l
a g o n i s t a c t i v i t y t ha t w a s d et ec t a b l e o n l y i n t he s en s i t i v e B-
c el l a s s a y . The ef f ec t i v e c o n c en t r a t i o n f o r t he ha l f -ma xi ma l
r es po n s e o f 21 0 pM a n d 31 0 pM, ho w ev er , w a s i n t he r a n g e
o f t he EC 5 0 f o u n d f o r I L -4 a n d t he o t her mu t a n t pr o t ei n s
i n t he T-c el l s y s t em.
V a r i a n t Y 1 24 G i n d u c ed a ma xi ma l n u mb er o f C D 23
po s i t i v e B-c el l s ( 9 9 %) a n d a ma xi ma l mea n C D 23 c o n t en t
( 77%) s i mi l a r t o I L -4 ( = 1 0 0 %) . The EC 5 0 f o r t hes e
r es po n s es , ho w ev er , w er e f o u n d t o b e i n c r ea s ed s ev er a l -f o l d
t o
5
S a n d 4 0 pM, r es pec t i v el y ( F i g u r es 2A a n d B, s ee a l s o
Ta b l e I ) . S eemi n g l y , t hes e a r e t he pr o per t i es o f a v a r i a n t
d ef ec t i v e i n r ec ept o r b i n d i n g . H o w ev er , Y 1 24 G s ho w s
n o r ma l r ec ept o r a f f i n i t y d u r i n g c o mpet i t i v e r a d i o l i g a n d
b i n d i n g t o B-l y mpho ma c el l s a n d n o r ma l EC 5 0 d u r i n g t he
H u ma n I L -4 a n t a g o n i s t mu t a n t pr o t ei n s
Ta b l e I . Ef f ec t i v e c o n c en t r a t i o n ( EC 5 0 )
a n d ma xi ma l r es po n s e ( R ma x) o f I L -4 a n d I 1 -4 v a r i a n t s ev a l u a t ed f r o m T- a n d B-c el l a s s a y s
P r o t ei n T-c el l pr o l i f er a t i o n B-c el l ( s pl een )
EC 5 0 ( pM) R ma x ( %) Mea n C D 23 c o n t en t N u mb er o f C D 23 po s i t i v e c el l s
EC 5 0 ( pM) R ma x ( %) EC 5 0 ( pM) R ma x ( %)
I L 4 230 ( 1 4 0 -39 0 ) 1 0 0 + 7 5 ( 2. 5 -1 0 ) 1 0 0 + 1 1 0 . 4 ( 0 . 1 -1 . 6 ) 1 0 0 6
V a r i a n t Y 1 24 F 1 5 0 ( 1 1 0 -21 0 ) 9 7 6
V a r i a n t Y 1 24 H 1 9 0 ( 1 30 -29 0 ) 8 2 5
V a r i a n t Y 1 24 N 220 ( 1 70 -29 0 ) 29 7
V a r i a n t Y 1 24 K 230 ( 21 0 -25 0 ) 20 4
V a r i a n t Y 1 24 G 1 30 ( 1 20 -1 4 0 ) 1 3 4 -4 0 -77 -5 -9 9
V a r i a n t Y 1 24 D < 0 . 5 0 . 7 31 0 ( 1 6 0 -6 20 ) 8 3 -21 0 ( 1 20 -36 0 ) 4 5 6
EC 5 0
v a l u es w er e d i s t r i b u t ed l o g n o r ma l . N u mb er s i n b r a c k et s w er e c a l c u l a t ed f r o m l o g EC 5 0
l o g S D .
R ma x v a l u es + S D w er e r el a t ed t o R ma x o f I L -4 a s 1 0 0 %.
Appr o xi ma t e v a l u es ( -) w er e o b t a i n ed f r o m a s i n g l e exper i men t .
T-c el l pr o l i f er a t i o n a s s a y ( s ee Ta b l es I a n d I I ) . Thu s , t he
pr o per t i es o f pa r t i a l a g o n i s t Y 1 24 G a r e c o n s i s t en t w i t h a n
I L -4 r ec ept o r s y s t em i n B-c el l s o per a t i n g a t l o w o c c u pa n c y
d u r i n g C D 23 i n d u c t i o n . I n t hi s c a s e, t he EC 5 0 v a l u es f o r
a pa r t i a l a g o n i s t a r e expec t ed t o i n c r ea s e pr o po r t i o n a l l y t o
t he l o s s o f ef f i c a c y ( R u f f o l o , J r , 1 9 8 2) .
The C D 23 po s i t i v e c el l s r epr es en t ed 6 7 % o f t he t o t a l c el l s
a n a l y s ed b y F AC S . Thi s per c en t a g e r ema i n ed c o n s t a n t a t
a l l s a t u r a t i o n l ev el s . Thu s , t he i n d u c t i o n o f t he n u mb er o f
C D 23 po s i t i v e c el l s a n d t he i n d u c t i o n o f mea n C D 23 c o n t en t
mo s t pr o b a b l y r ef l ec t ed t w o a s pec t s o f t he s a me pr o c es s i n
t he s a me c el l po pu l a t i o n . Of t w o a l t er n a t i v es -ei t her ea c h
i n d u c ed c el l i mmed i a t el y d ev el o ps a f u l l C D 23 c o n t en t o r
t he w ho l e po pu l a t i o n i s f i r s t i n d u c ed t o d ev el o p a l o w C D 23
c o n t en t w hi c h u po n hi g her s t i mu l a t i o n i s i n c r ea s ed -t he
s ec o n d i s c o n s i s t en t w i t h t he o b s er v ed d a t a .
C o mpet i t i v e r ec ept o r b i n d i n g
The d o s e-r es po n s e c u r v es s u g g es t t ha t t he a mi n o a c i d
exc ha n g es a t po s i t i o n 1 24 d i d n o t d r a ma t i c a l l y a l t er t he
r ec ept o r a f f i n i t y o f t he mu t a n t pr o t ei n s c o mpa r ed w i t h w i l d
t y pe I L -4 . Thi s ha s b een c o r r o b o r a t ed b y r a d i o l i g a n d
r ec ept o r b i n d i n g exper i men t s ( F i g u r e 3) . I L -4 , a s w el l a s
t he mu t a n t pr o t ei n s s t u d i ed her e, c o mpet ed ef f i c i en t l y w i t h
i o d i n a t ed I L -4 f o r t he I L -4 r ec ept o r s pr es en t o n t he B-
l y mpho ma c el l l i n e R a j i ( C a b r i l l a t et a l . , 1 9 8 7; P a r k et a l . ,
1 9 8 7) a s s ho w n i n F i g u r e 3 f o r Y 1 24 G a n d Y 1 24 D . The
d i s pl a c emen t c u r v es o f a l l v a r i a n t s , w i t h t he exc ept i o n o f
Y 1 24 D , w er e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f er en t f r o m t ha t o f I L -4
( s ee a l s o Ta b l e I I ) . H a l f -ma xi ma l d i s pl a c emen t o f i o d i n a t ed
I L -4 r eq u i r ed a 3. 4 -f o l d hi g her c o n c en t r a t i o n o f mu t a n t
pr o t ei n Y 1 24 D c o mpa r ed w i t h t ha t o f I L -4 . C o r r es po n d i n g
c o mpet i t i v e b i n d i n g s t u d i es per f o r med w i t h b o t h P H A-
a c t i v a t ed T-c el l s a n d a c t i v a t ed t o n s i l l a r B-c el l s y i el d ed s i mi l a r
r el a t i v e I C 5 0
v a l u es ( Ta b l e I I ) . ( U n f o r t u n a t el y , t he l a r g e
n u mb er s o f a c t i v a t ed B-c el l s n ec es s a r y f o r r a d i o l i g a n d
b i n d i n g c o u l d n o t r o u t i n el y b e o b t a i n ed f r o m hu ma n s pl een ) .
The c o n c en t r a t i o n o f 1 n M [ ' 25 1 ] I L -4 d u r i n g t he
c o mpet i t i v e b i n d i n g exper i men t s w a s
-
1 0 -f o l d hi g her t ha n
t he d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t . Thu s , t he K D o f t he c o mpet i n g
l i g a n d s c o u l d n o t b e d et er mi n ed f r o m t he I C 5 0 ( Mu n s o n ,
1 9 8 3) . The K D Of [ 25 1 I ] I L 4 d et er mi n ed i n d epen d en t l y ( s ee
Ma t er i a l s a n d met ho d s ) w a s 9 1 pM f o r t he B-l y mpho ma c el l s
a n d 8 1 pM f o r t he P H A-a c t i v a t ed T-c el l s . As s u mi n g a
r ec ept o r d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t K D o f
-
1 0 0 pM
f o r I L -4
( s ee a l s o C a b r i l l a t et a l . , 1 9 8 7; P a r k et a l . , 1 9 8 7) , mu t a n t
pr o t ei n Y 1 24 D a c c o r d i n g l y ha d a K D o f 31 0 pM.
m
C l
0
Q .
4 )
C r -
F 0
0
C L
c o
0
C .
0 )
0
C
1 0 0
0
0 .
0
2D 8 0
a
. E 6 0
E 4 0
0
C
o
20
0 )
8 0
0
0
0 0 @ 1 0 0 -
.
I L
-4
0
A-
*0
m 2 8 0 *_^ Y 1 24 D
6 0
6 0
0 ~~~~~~~b
0
E
4 0 -
C I O
c mJ
0 . 0 1 0 . 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0
I L A o r mu t a n t pr o t ei n ( pM)
F i g . 2. I n d u c t i o n o f t he l o w a f f i n i t y F c c r ec ept o r ( C D 23) o n B-c el l s i n
r es po n s e t o i n c r ea s i n g c o n c en t r a t i o n s o f I L L 4 ( U ) o r mu t a n t pr o t ei n s
Y 1 24 G ( A) a n d Y 1 24 D ( 0 ) . ( a ) N u mb er o f C D 23 po s i t i v e B-c el l s a s
per c en t o f ma xi ma l r es po n s e. ( b ) Mea n C D 23 c o n t en t o f B-c el l s .
Ac t i v a t ed hu ma n B- a n d T-c el l s b o t h expo s e 5 0 0 -1 0 0 0
mo l ec u l es o f I L -4 r ec ept o r a t t hei r s u r f a c e s ho w i n g a K D
o f 1 0 0 pM i n t er ms o f I L 4 b i n d i n g ( s ee a b o v e) . Ther ef o r e
t he pr o l i f er a t i v e r es po n s e o f T-c el l s a ppea r s t o c l o s el y f o l l o w
t he r ec ept o r o c c u pa n c y . As s u mi n g t ha t i n t he B-c el l a s s a y s
t he b i o l o g i c a l r es po n s e i s s o l el y med i a t ed b y t he r ec ept o r
w i t h a K D o f 1 0 0 pM, t he i n d u c t i o n o f C D 23 r eq u i r es t he
o c c u pa n c y o f o n l y a f ew per c en t o f t he r ec ept o r s b y I L -4 .
W e s u g g es t t ha t o n l y i n c a s e o f t he ' ema s c u l a t ed ' ( Bl a c k ,
1 9 8 9 ) Y 1 24 D mu t a n t pr o t ei n , t he r ec ept o r ha d t o b e
ma xi ma l l y s a t u r a t ed i n o r d er t o g en er a t e a s ma l l pa r t i a l
r es po n s e. I t r ema i n s u n c l ea r , ho w ev er , i f t he a s s a y per i o d s
3239
N . K r u s e, H . -P . To n y a n d W . S eb a l d
Ta b l e I I . C o mpet i t i v e r a d i o l i g a n d b i n d i n g ( I C 5 0 ) , r ec ept o r d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t ( K D ) a n d c o mpet i t i v e i n hi b i t o r c o n s t a n t ( K i ) o f I L -4 a n d I L -4 v a r i a n t s
ev a l u a t ed f r o m B- a n d T-c el l a s s a y s
P r o t ei n P H A-a c t i v a t ed T-c el l s B-c el l s T-c el l pr o l i f er a t i o n B-c el l ( s pl een )
I C 5 0 ( %) K D ( pM) L y mpho ma ( R a j i )
To n s i l l a r
K i ( pM)
mea n C D 23 n u mb er o f C D 23
c o n t en t po s i t i v e c el l s
I C 5 0
( %) K D ( pM) I C 5 0
( %)
K i
( pM)
I L -4 1 0 0 ( 8 0 -1 30 ) 8 1 7 1 0 0 ( 70 -1 5 0 ) 9 1 5 - 1 0 0
V a r i a n t Y 1 24 F 75 ( 70 -8 0 )
V a r i a n t Y 1 24 H 8 0 ( 70 -9 0 )
V a r i a n t Y 1 24 N 1 1 0 ( 1 0 0 -1 20 )
V a r i a n t Y 1 24 K 1 1 0 ( 1 0 0 -1 20 )
V a r i a n t Y 1 24 G 6 8 ( 6 0 -8 0 )
V a r i a n t Y 1 24 D 320 ( 230 -4 5 0 ) 34 0 ( 28 0 -4 1 0 ) -30 0 6 20 ( 39 0 -9 9 0 ) 8 1 0 ( 6 20 -1 0 5 0 ) 1 0 0 0 ( 320 -320 0 )
0 6 4 0 a
-
6 30 a
I C 5 0
a n d
K i
v a l u es w er e d i s t r i b u t ed l o g n o r ma l . The I C 5 0 o f t he v a r i a n t s w er e r el a t ed t o t he I C 5 0 o f I L -4 a s 1 0 0 %. N u mb er s i n b r a c k et s w er e
c a l c u l a t ed f r o m l o g I C 5 0
+ l o g S D o r l o g
K i
l o g S D .
K D v a l u es + S D w er e c a l c u l a t ed f r o m S c a t c ha r d a n a l y s es .
a To n s i l l a r B-c el l s w er e u s ed i n o n e exper i men t .
o f s ev er a l d a y s c o n v en t i o n a l l y u s ed a l l o w f o r a s t r a i g ht
c o mpa r i s o n b et w een r ec ept o r o c c u pa n c y a n d r es po n s e.
An t a g o n i s t a c t i v i t y o f I L -4 v a r i a n t Y 1 24 D
The r es u l t s pr es en t ed a b o v e l ea d t o t he pr ed i c t i o n t ha t t he
mu t a n t pr o t ei n Y 1 24 D f u n c t i o n s a s a pu r e a n t a g o n i s t i n t he
T-c el l s y s t em a n d a s a pa r t i a l a n t a g o n i s t o f I L -4 i n t he mu c h
mo r e s en s i t i v e B-c el l s y s t em. Thi s ha s b een a c t u a l l y
d emo n s t r a t ed b y c o mpet i t i o n exper i men t s ( F i g u r e 4 ) .
I L -4 -s t i mu l a t ed pr o l i f er a t i o n o f T-c el l s w a s c o mpet i t i v el y
i n hi b i t ed b y mu t a n t pr o t ei n Y 1 24 D ( F i g u r e 4 A) . F r o m t he
a ppa r en t EC 5 0 i n t he pr es en c e o f d i f f er en t c o n c en t r a t i o n s o f
Y 1 24 D a n i n hi b i t o r c o n s t a n t K i
o f 6 20 pM c o u l d b e
c a l c u l a t ed ( s ee Ta b l e I 1 ) . A s i mi l a r
K i
o f 8 1 0 pM w a s
d et er mi n ed d u r i n g c o mpet i t i t o n o f I L -4 -d epen d en t C D 23
i n d u c t i o n o n B-c el l s ( F i g u r e 4 B) . I n c l u d ed i n Ta b l e I I i s a l s o
t he i n hi b i t o r y c o n s t a n t K i
o f 1 0 0 0 pM f o r t he i n d u c t i o n o f
t he n u mb er o f C D 23 po s i t i v e B-c el l s ( F i g u r e 4 C ) . The l a t t er
v a l u e s ho w s a hi g h v a r i a b i l i t y d u e t o t he pr o n o u n c ed pa r t i a l
a g o n i s t a c t i v i t y o f v a r i a n t Y 1 24 D d u r i n g t hi s r es po n s e
( 4 5 %) . F o r t he pa r t i a l a g o n i s t s Y 1 24 G , Y 1 24 N , Y 1 24 K a n d
ev en f o r Y 1 24 H , a n d i n c o mpl et e i n hi b i t i o n o f I L -4 a c t i v i t y
w a s es t a b l i s hed i n t he T-c el l pr o l i f er a t i o n a s s a y d o w n t o t he
l ev el d et er mi n ed b y t hei r r es pec t i v e pa r t i a l a g o n i s t a c t i v i t i es
( s ee F i g u r e 1 ) . The c a l c u l a t ed K , v a l u es w er e i n t he r a n g e
o f 20 0 pM ( d a t a n o t s ho w n ) .
A c o mpa r i s o n o f t he d o s e -r es po n s e c u r v es i n F i g u r e 4 A,
B a n d C s ho w s t ha t t he s l o pes o f t he T-c el l r es po n s es a r e
s t eeper . The s a me d i f f er en c e w a s o b s er v ed f o r t he
exper i men t a l r es u l t s pr es en t ed i n F i g u r es 1 a n d 2A, a n d B.
The b i n d i n g c u r v e o f [ 1 25 1 ] I L -4 t o B-l y mpho ma c el l s o r
a c t i v a t ed T-c el l s ha s a s l o pe w i t h a c a l c u l a t ed H i l l c o ef f i c i en t
o f 0 . 8 1 -1 . 1 5 ( d a t a n o t s ho w n ) s i mi l a r t o t he B-c el l
r es po n s es ( 0 . 9 1 -1 . 4 ) . The H i l l c o ef f i c i en t c a l c u l a t ed f o r
t he s l o pe o f t he d o s e-r es po n s e c u r v e f o r I L -4 -d epen d en t
T-c el l pr o l i f er a t i o n i s -2-f o l d hi g her ( 2-2. 7) . I n t he
c o mpet i t i v e i n hi b i t i o n exper i men t s , t he s l o pe w a s r ed u c ed
-2-f o l d i n t he pr es en c e o f a n t a g o n i s t Y 1 24 D , b o t h i n t he
T-c el l ( 1 . 3-1 . 5 ) a n d i n t he B-c el l ( 0 . 5 -0 . 6 ) a s s a y s . The
s i g n i f i c a n c e o f t hes e d i f f er en c es i s s t i l l u n c l ea r . They mi g ht
a l s o i n d i c a t e s pec i f i c a s pec t s o f r ec ept o r a c t i v a t i o n , b u t w e
c a n n o t pr es en t l y r u l e o u t a n o r i g i n f r o m exper i men t a l
c o n d i t i o n s .
;
' 8 0^ Y 1 24 G
C M
8 r
Y l
24 D
; E
6 0
4 -
0
0 . 0
o
20 H
0 . 0 1 0 . 1 1 1 0 1 0 0
I L -4 o r mu t a n t pr o t ei n ( n M)
F i g . 3. C o mpet i t i o n f o r b i n d i n g t o t he I L -4 r ec ept o r o f R a j i c el l s
b et w een r a d i o l a b el l ed I L -4 a n d I L -4 ( U ) o r mu t a n t pr o t ei n s
Y 1 24 G
( A) o r Y 1 24 D ( )
D i s c u s s i o n
The r es u l t s pr es en t ed her e i n d i c a t e c o n c l u s i v el y t ha t Ty r l 24
o f I L 4 i s o f c r u c i a l i mpo r t a n c e f o r t he po t en c y o f t he
l y mpho k i n e f o r s i g n a l g en er a t i o n , b u t n o t f o r t he b i n d i n g
o f I L -4 t o i t s r ec ept o r . W her ea s b i o l o g i c a l a c t i v i t y w a s
s ev er el y i mpa i r ed i n s ev er a l s u b s t i t u t i o n mu t a n t s a t po s i t i o n
1 24 ( s ee b el o w ) , b i n d i n g o f t hi s v a r i a n t l i g a n d s t o I L 4
r ec ept o r w a s n o t a t a l l o r o n l y ma r g i n a l l y a f f ec t ed . As
c o mpi l ed i n Ta b l es I a n d I I , t hi s i s s ho w n f i r s t b y r a d i o l i g a n d
r ec ept o r b i n d i n g exper i men t s u s i n g t he I L -4 r ec ept o r o f t he
B-l y mpho ma c el l l i n e R a j i ( P a r k et a l . , 1 9 8 7) , o r o f b o t h
a c t i v a t ed T- a n d B-c el l s , s ec o n d l y , b y d et er mi n i n g t he EC 5 0
o f t he pa r t i a l a g o n i s t a c t i v i t i es i n b o t h t he B-c el l a n d t he T-
c el l a s s a y a n d t hi r d l y , b y d et er mi n i n g t he c o mpet i t i v e
i n hi b i t o r c o n s t a n t s , K i ,
i n b o t h c el l u l a r s y s t ems .
The i mpa i r men t o f b i o l o g i c a l a c t i v i t y , i . e. t he l o s s o f
ef f i c a c y o f I L 4 , s t r o n g l y d epen d s o n t he n a t u r e o f t he s i d e
c ha i n i n t r o d u c ed a t po s i t i o n 1 24 . I n t he T-c el l a s s a y , ef f i c a c y
i s r ed u c ed
-
5 -f o l d w i t h s i d e c ha i n s o f a s pa r a g i n e, l y s i n e
a n d g l y c i n e, r es pec t i v el y , a n d > 1 0 0 -f o l d w i t h a n a s pa r t y l
s i d e c ha i n ( s ee Ta b l e I ) . I n t er es t i n g l y , t he l o s s o f ef f i c a c y
a ppea r s t o b e l es s pr o n o u n c ed d u r i n g t he B-c el l
d i f f er en t i a t i o n a s s a y s . Thi s , ho w ev er , c o r r es po n d s t o t he
324 0
H u ma n I L -4 a n t a g o n i s t mu t a n t pr o t ei n s
D
1 20
X
1 0 0
o
8 0
E c - 0
6 0
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4 0
-6
0 ,
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0
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1 20
9 1 0 0
0 0
8
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U 1 )
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( I )
2
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1 20
1 0 0
8 0
6 0
4 0
20
0
1 0 c
1
0 . 1
F i g . 4 . C o mpet i t i v e i n hi b i t i o n o f I L
( a ) I L -4 -i n d u c ed C D 23 c o n t en t o f B
o f C D 23 po s i t i v e B-c el l s ( c ) b y mu t
c o n c en t r a t i o n s o f 0 n m ( U ) , 0 . 6 7 n
( A) . The r es u l t s i n ( B) a n d ( C ) a r e
a g o n i s t a c t i v i t i es o f v a r i a n t Y 1 24 D .
-
4 0 -f o l d l o w er
EC 5 0
o f I L -4
o r t he 5 0 0 -f o l d l o w er
EC 5 0
f a
c el l s w hen c o mpa r ed w i t h t h
Thes e a ppa r en t d i s c r epa n c
expl a i n ed i n t er ms o f r ec ept
- 20 0 pM f o r T-c el l pr o l i f ei
r ec ept o r d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t
ma y b e l i mi t ed b y t he n u mb e
B-c el l r es po n s e a ppea r s t o b e
f o l l o w i n g r ec ept o r a c t i v a t i o n .
t he EC , O o f 5 pM ( 0 . 4 pM'
c o r r es po n d t o a r ec ept o r o c c u
c o n t en t ) o r 0 . 4 % ( n u mb er
c a l c u l a t i o n a n d i t s u n d er l y i n g a s s u mpt i o n s a r e d et a i l ed i n
Ma t er i a l s a n d met ho d s . The l o w er ef f i c a c y o f t he I L -4
M) v a r i a n t s c a n t hu s b e
pa r t i a l l y c o mpen s a t ed
f o r
b y hi g her
Xj */
r ec ept o r
s a t u r a t i o n . I n c a s e o f mu t a n t
pr o t ei n Y 1 24 D
ma xi ma l r es po n s e i s 8 % ( 4 5 %) w i t h a n EC 5 0
o r 31 0
pM
1 )
/ / / /
( 21 0 pM) f o r mea n C D 23 i n d u c t i o n ( C D 23 po s i t i v e c el l s ) .
Ac c o r d i n g t o t hes e d a t a , t he l o s s o f ef f i c a c y i s 1 25 - t o
a
/ ^ /
30 0 -f o l d . D u r i n g t he T-c el l pr o l i f er a t i o n a s s a y s ,
t he mea n
er r o r o f t he c o n t r o l w a s 0 . 5 % o f t he ma xi ma l
r es po n s e
o f
I L -4 . The r es po n s es o f v a r i a n t Y 1 24 D w er e w i t hi n t he mea n
er r o r o f t he c o n t r o l . Thu s , t he ef f i c a c y o f Y 1 24 D i s a t l ea s t
l 1 1 1 1 1
l l 20 0 -f o l d l o w er t ha n t ha t o f I L 4 i n t hi s s y s t em. Al t ho u g h
1 0 0 0 1 0 0 0 0 t hes e c a l c u l a t i o n s a r e r o u g h es t i ma t es d er i v ed f r o m l o n g t er m
a s s a y s , mea s u r i n g c o mpl ex pr o l i f er a t i o n a n d d i f f er en t i a t i o n
pr o c es s es , a t l ea s t t hey s ho u l d pr o v i d e i n f o r ma t i o n c o n c er n -
i n g t he u pper l i mi t . ( An a l t er n a t i v e expl a n a t i o n o f t he r es u l t s
i n v o l v i n g a v er y s ma l l s u b po pu l a t i o n o f
r ec ept o r s , e. g .
20 -5 0 mo l ec u l es / c el l , w i t h a
v er y
l o w d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t
i n t he r a n g e o f 1 pM i n t he B-c el l s a ppea r s r a t her
u n l i k el y ,
o /
<
s i n c e t he a n t a g o n i s t Y 1 24 D i n hi b i t s w i t h t he s a me
i n hi b i t o r y
b z /
c o n s t a n t o f 6 20 -1 0 0 0 pM b o t h B- a n d T-c el l s . )
b The i d en t i f i c a t i o n o f a w ho l e pa n el o f pa r t i a l a g o n i s t s
s u g g es t s t ha t t he r es i d u e a t po s i t i o n 1 24 i s d i r ec t l y
i n v o l v ed
i n s i g n a l g en er a t i n g i n t er a c t i o n s . The a mi n o a c i d
exc ha n g e
i n mu t a n t pr o t ei n Y 1 24 D , ho w ev er , pr o d u c es a n
u n expec t ed l y l a r g e
ef f ec t . Thu s , a d d i t i o n a l c o n f o r ma t i o n
1 0 1 0 0 1 0 0 0 ef f ec t s a ppea r t o b e po s s i b l e i n t hi s c a s e. I t ma y b e r el ev a n t
i n t hi s r es pec t t ha t v a r i a n t Y 1 24 D d o es n o t ea s i l y c r y s t a l l i z e
( T. Mu l l er a n d W . S eb a l d , u n pu b l i s hed
o b s er v a t i o n )
i n
c o n t r a s t t o I L -4 ( C o o k et a l . , 1 9 9 1 ) . I t r ema i n s t o b e
es t a b l i s hed i f f u r t her r es i d u es i n t he I L -4 mo l ec u l e, t o g et her
w i t h Ty r l 24 , f o r m a s i t e d i s t i n c t f r o m a I L -4
r ec ept o r
b i n d i n g s i t e, w hi c h i s i n v o l v ed i n s i g n a l g en er a t i o n .
Ac c o r d i n g t o t he a v a i l a b l e s t r u c t u r a l i n f o r ma t i o n
( R ed f i el d
c
C
et a l . , 1 9 9 1 ; s ee a l s o D i ed er i c hs et a l . , 1 9 9 1 )
r es i d u es a t
t he C -t er mi n a l en d o f hel i x D a r e c l o s e t o Ty r l 24 . C y s 1 27
f o r ms a d i s u l f i d e b o n d t o C y s 3. Thu s , s i d e c ha i n s o f hel i x
A ma y a l s o b e i n pr o xi mi t y t o Ty r l 24 . I t i s
i n t er es t i n g
t o
n o t e t ha t f o r hu ma n G M-C S F , w hi c h ha s t he s a me f o l d a s
1
1 0 1 0 0 I L -4 ,
a
r ec ept o r b i n d i n g s i t e w a s po s t u l a t ed c o n s i s t i n g
o f
t w o pept i d e s t r et c hes c en t er ed a r o u n d Ar g 24 ( hel i x A)
a n d
I L -4 ( pM) Met 79 ( hel i x C ) ( D i ed er i c hs et a l . , 1 9 9 1 ) . Ac c o r d i n g
t o t he
G M-C S F c r y s t a l s t r u c t u r e, t hi s b i n d i n g s i t e w o u l d b e
4 -d epen d en t T-c el l pr o l i f er a t i o n . s pa t i a l l y f a r a w a y f r o m t he C -t er mi n u s o f hel i x D .
-c el l s ( b ) a n d I L -4 -i n d u c ed n u mb er Ty r l 24 o f hu ma n I L -4 i s f o u n d a t t he
c o r r es po n d i n g
t a n t pr o t ei n Y 1 24 D a t po s i t i o n o f mu r i n e I L -4 ( S a n d er s o n et a l . , 1 9 8 8 ) . I t o c c u r s
M( O) , 2 n M ( A) , a n d 6 . 7 n M a t t he en d o f hel i x D ( R ed f i el d et a l . , 1 9 9 1 ) , o n l y s i x r es i d u es
c o r r ec t ed b y s u b t r a c t i n g pa r t i a l f r o m t he C -t er mi n u s . I t ha s b een n o t ed ( Ba z a n , 1 9 9 0 b ;
S a n d er s o n , 1 9 8 8 ) t ha t t hi s C -t er mi n a l s eg men t ha s f ea t u r es
i n c o mmo n w i t h o t her k n o w n l i g a n d s o f t he
ha ema t o po i et i n
f o r t he mea n C D 23 i n d u c t i o n r ec ept o r f a mi l y . Ami n o a c i d s u b s t i t u t i o n s o f G l u 1 4 1 o f
r i n d u c t i o n o f C D 23 po s i t i v e mu r i n eI L -2 ( Z u r a w s k i et a l . , 1 9 9 0 ) , w ho s e po s i t i o n a ppea r s
i e
T-c el l r es po n s e. t o b e eq u i v a l en t t o Ty r l 24 o f hu ma n
I L -4 , y i el d ed
a s er i es
-i es i n I L -4 ef f i c a c y c a n b e o f pa r t i a l a g o n i s t s . I n pa r t i c u l a r , mu r i n e I L -2 v a r i a n t
Q 1 4 1 D
t o r o c c u pa n c y . The
EC 5 0
o f w a s i n a c t i v e o r o n l y w ea k l y a c t i v e i n
pr o l i f er a t i o n a s s a y s
r a t i o n i s s i mi l a r t o t he I L -4 u s i n g v a r i o u s c el l l i n es . H o w ev er , hi g h a f f i n i t y b i n d i n g
w a s
t .
Ac c o r d i n g l y , t hi s r es po n s e l o s t a n d n o c o mpet i t i v e i n hi b i t i o n o f
I L -2-d epen d en t
: r o f a c t i v a t ed r ec ept o r s . The pr o l i f er a t i o n o f H T2 c el l s c o u l d b e f o u n d ev en a t a
l i mi t ed b y a s i g n a l l i n g s t ep 5 x 1 0 4 -f o l d mo l a r exc es s o f v a r i a n t
Q 1 4 1 D .
V a r i a n t
hi s s t ep t hen w o u l d d et er mi n e Q 1 4 1 D o f mu r i n e I L -2 i s a c a pa b l e a n t a g o n i s t ,
ho w ev er ,
i n t hes e pr o c es s es , w hi c h a g a i n s t mu t a n t pr o t ei n s o f I L -2 w i t h
r ec ept o r -b i n d i n g d ef ec t s .
pa n c y o f -5 % ( mea n C D 23 mI L -2 v a r i a n t s w i t h s u b s t i t u t i o n s o f G l u 1 4 1 b y a s pa r a g i n e
f C D 23 po s i t i v e c el l s ) . The ( c l a s s I ) , l y s i n e ( c l a s s I I ) , a s pa r t i c a c i d
( c l a s s H I )
a n d
g l y c i n e
324 1
-
* Y 1 24 D ( On M)
- o
Y 1 24 D ( 0 . 6 7n l
_ A Y 1 24 D ( 2n M)
_ & Y 1 24 D ( 6 . 7n MJ
I I 1 1 1
I 1
N . K r u s e, H . -P . To n y a n d W . S eb a l d
( c l a s s I V ) , c o u l d b e g r o u ped i n t o f o u r c l a s s es a c c o r d i n g t o
t hei r d i f f er i n g pa r t i a l a g o n i s t a c t i v i t i es . Thi s i s u n l i k e t he
v a r i a n t s o f hu ma n I L -4 , w her e s u b s t i t u t i o n s o f Ty r l 24 b y
a s pa r a g i n e, l y s i n e a n d g l y c i n e pr o d u c ed v er y s i mi l a r a g o n i s t
a c t i v i t i es ( s ee F i g u r e 1 , Ta b l e I ) . Thu s , i t r ema i n s u n c l ea r
i n ho w f a r t he g en er a t i o n o f pa r t i a l a g o n i s m b y a n a s pa r t y l
s i d e c ha i n a t t he hu ma n I L -4 Y 1 24 a n d a t t he mu r i n e I L -2
Q 1 4 1 po s i t i o n s i n d i c a t es c o mpa r a b l e s t r u c t u r a l r eq u i r emen t s .
Tw o n o n -o v er l a ppi n g b i n d i n g s i t es w er e i d en t i f i ed i n
hu ma n g r o w t h ho r mo n e ( C u n n i n g ha m a n d W el l s , 1 9 9 1 ;
C u n n i n g ha m et a l . , 1 9 9 1 ; D e V o s et a l . , 1 9 9 2) t ha t a r e
o c c u pi ed i n a s eq u en t i a l ma n n er b y t w o g r o w t h ho r mo n e
r ec ept o r mo l ec u l es . S i t e 1 c o mpr i s es t he C -t er mi n u s o f hel i x
D ( C u n n i n g ha m et a l . , 1 9 9 1 ) . The eq u i v a l en t o f I L -4 Ty r l 24
mi g ht b e hu ma n g r o w t h ho r mo n e V a l 1 8 5 , w hi c h i s l o c a t ed
a t t he en d o f hel i x D a n d w hi c h i s pa r t o f s i t e 1 . The
b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f a g r o w t h ho r mo n e v a r i a n t V 1 8 5 D ha s
n o t y et b een a s s es s ed . I t w a s po s t u l a t ed ( C u n n i n g ha m et a l . ,
1 9 9 1 ) t ha t n o n -d i mer i z i n g v a r i a n t s o f g r o w t h ho r mo n e,
w hi c h ha v e l o s t t he a b i l i t y t o b i n d t w o r ec ept o r mo l ec u l es ,
s ho u l d s ho w a n t a g o n i s t i c pr o per t i es .
A n a t u r a l r ec ept o r a n t a g o n i s t w a s d et ec t ed i n t he
i n t er l eu k i n 1 s y s t em. The hu ma n pr o t ei n ( I L -i R a ) s ha r es
1 9 % i d en t i c a l a mi n o a c i d po s i t i o n s w i t h I L -l a a n d 26 %
i d en t i c a l po s i t i o n s w i t h I L -1 : a n d i s pr o b a b l y c o mpo s ed o f
1 2 f -s t r a n d s . I t b eha v es a s a pu r e a n t a g o n i s t i n b i n d i n g w i t h
hi g h a f f i n i t y t o t he I L -1 r ec ept o r ( t y pe I ) w i t ho u t ev o k i n g
a n y d et ec t a b l e r es po n s e ( Ei s en b er g et a l . , 1 9 9 0 ; H a n n u m
et a l . , 1 9 9 0 ) . Thi s i n d i c a t es t ha t i n t he I L -I s y s t em r ec ept o r
b i n d i n g a n d r ec ept o r a c t i v a t i o n a r e c o mpl et el y s epa r a b l e.
An ef f i c i en t u n c o u pl i n g o f b o t h s t eps a l s o w a s o b t a i n ed b y
s i n g l e a mi n o a c i d r epl a c emen t s i n I L -I mo l ec u l es . I L -l I $
v a r i a n t s R 1 27G ( G ehr k e et a l . , 1 9 9 0 ) a n d D 1 4 5 K ( J u et a l . ,
1 9 9 1 ) a s w el l a s a n I L -l a v a r i a n t D 1 5 1 Y ( Y a ma y o s hi et a l . ,
1 9 9 0 ) exhi b i t ed l i t t l e b i o l o g i c a l a c t i v i t y b u t b o u n d w i t h a
l a r g el y u n a l t er ed a f f i n i t y t o t he r ec ept o r . The d i s c o n t i n u o u s
r ec ept o r b i n d i n g s i t e i d en t i f i ed i n hu ma n I L -1 , B ( L a b r i o l a -
To mpk i n s et a l . , 1 9 9 1 ) c l u s t er s a r o u n d Ar g 4 a n d d o es n o t
c o mpr i s e t he po s i t i o n s d et er mi n i n g r ec ept o r a c t i v a t i o n . Thi s
c o u l d a r g u e f o r a s t r u c t u r a l s epa r a t i o n o f t w o i n d epen d en t
f u n c t i o n a l s i t es i n t he I L -1 pr o t ei n . I n t er es t i n g l y , ho w ev er ,
s i g n i f i c a n t d i f f er en c es exi s t a mo n g t ho s e a mi n o a c i d r es i d u es
o f I L -l a e, I L -l I 1 a n d l l -l R a t ha t pr o b a b l y pr o v i d e t he c o n t a c t
po i n t s i n ea c h r ec ept o r -l i g a n d c o mpl ex. Ac c o r d i n g l y , a n
a ppa r en t l y u n a l t er ed r ec ept o r a f f i n i t y o f a n en g i n eer ed
a n t a g o n i s t mi g ht a l s o r es u l t f r o m mu l t i pl e c o mpen s a t i n g
ef f ec t s a n d i t d o es n o t n ec es s a r i l y i n d i c a t e a s t r u c t u r a l
i n d epen d en c e o f t he t w o l i g a n d d o ma i n s t ha t b i n d o r a c t i v a t e
t he r ec ept o r , r es pec t i v el y .
Es pec i a l l y f o r I L -l a v a r i a n t D 1 4 1 G pu r e a g o n i s t o r pa r t i a l
a g o n i s t a c t i v i t i es w er e es t a b l i s hed i n v a r i o u s c el l u l a r
r es po n s es ( Y a ma y o s hi et a l . , 1 9 9 0 ) , w hi c h r es emb l e o u r
r es u l t s w i t h hu ma n I L -4 v a r i a n t Y 1 24 D . C o n s i d er i n g t he
f u n d a men t a l s t r u c t u r a l d i f f er en c es b et w een I L -1 a n d I L -4 ,
a s w el l a s b et w een t hei r r es pec t i v e r ec ept o r s , i t i s i n t er es t i n g
t o s pec u l a t e t ha t t he o c c u r r en c e a n d t he s t r a i g ht f o r w a r d
i d en t i f i c a t i o n o f hi g h a f f i n i t y a n t a g o n i s t s i n b o t h s y s t ems i s
c o r r el a t ed w i t h a s i n g l e c ha i n c o mpo s i t i o n o f b o t h t he
r ec ept o r s .
Ot her mo r e c o mpl ex r ec ept o r s y s t ems ma y pu t mo r e
s t r i n g en t c o n s t r a i n t s o n s t r u c t u r a l mo d i f i c a t i o n s o f t he l i g a n d .
I n t he mu l t i c ha i n I L -2 r ec ept o r s y s t em t he i n t r i n s i c a l l y hi g h
K D o f 70 n M o f t he , B s u b u n i t ( t he ho mo l o g u e o f t he I L -4
r ec ept o r ) w a s f o u n d t o d ec r ea s e t o 5 pM i n t he pr es en c e o f
t he a s u b u n i t ( s ee R i n g hei m et a l . , 1 9 9 1 ) . A d ec r ea s ed K D
o f 1 . 2 n M w a s o b s er v ed i n Y T c el l s d u e t o t he pr es en c e
o f a s t i l l po o r l y d ef i n ed ' y s u b u n i t . I n t er es t i n g l y , I L -2 v a r i a n t s
a f f ec t ed i n a s u b u n i t b i n d i n g s ho w ed a n a ppa r en t l y u n a l t er ed
EC 5 0 i n t he b i o l o g i c a l a s s a y s ( W ei g el et a l . , 1 9 8 9 ;
Z u r a w s k i a n d Z u r a w s k i , 1 9 8 9 ; J u et a l . , 1 9 9 1 ) . F o r t he
expl a n a t i o n o f t hi s pu z z l i n g b eha v i o u r a mo d el w a s r ec en t l y
pr o po s ed ( G r a n t et a l . , 1 9 9 2) a c c o r d i n g t o w hi c h t he a
s u b u n i t c o n t r i b u t es s ev er a l f u n c t i o n s t o I L -2-med i a t ed
s i g n a l l i n g t hr o u g h t he hi g h a f f i n i t y I L -2 r ec ept o r s y s t em.
I n t er es t i n g l y , t he pa r t i a l a g o n i s t a n d a n t a g o n i s t v a r i a n t s
a f f ec t ed a t po s i t i o n G l n l 4 1 o f mu r i n e I L -2 ( Z u r a w s k i et a l . ,
1 9 9 0 ) w er e d es c r i b ed t o b e d ef i c i en t i n -y s u b u n i t i n t er a c t i o n s .
They i n hi b i t ed ef f i c i en t l y , ho w ev er , t he I L -2 v a r i a n t s
d ef ec t i v e i n a s u b u n i t b i n d i n g . P o s s i b l y , t he i n t er a c t i o n o f
t he
7y
s u b u n i t a n d t he f i s u b u n i t i s c r i t i c a l f o r r ec ept o r
a c t i v a t i o n a n d a n y d i s t u r b a n c e o f t hi s i n t er a c t i o n w i l l r ed u c e
b o t h r ec ept o r b i n d i n g a n d r ec ept o r a c t i v a t i o n . Thi s c o mpl ex
s u b u n i t i n t er pl a y i n t he I L -2 r ec ept o r s y s t em t her ef o r e
c o mpl i c a t es i t s a n a l y s i s , b u t ma y a l s o pr o v i d e s pec i a l
a d v a n t a g es f o r t he en g i n eer i n g o f s el ec t i v e a g o n i s t s ( s ee
Z u r a w s k i , 1 9 9 1 ) .
I n c r ea s i n g ev i d en c e s u ppo r t s t he v i ew t ha t t he f o r ma t i o n
o f r ec ept o r ho mo d i mer s o r t he f o r mi n g o f het er o o l i g o mer s
r epr es en t s a n i mpo r t a n t s t ep i n r ec ept o r t r a n s memb r a n e
s i g n a l l i n g ( s ee S c hl es s i n g er , 1 9 8 8 ; W i l l i a ms , 1 9 8 9 ; U l l r i c h
a n d S c hl es s i n g er , 1 9 9 0 ) . Thi s l ea d s t o t he q u es t i o n ho w t he
l i g a n d t r i g g er s t hi s a g g r eg a t i o n . ' Al l o s t er i c r ec ept o r
o l i g o mer i z a t i o n ' ( S c hl es s i n g er , 1 9 8 8 ) , pr o po s ed a s a mo d el
f o r t y r o s i n e k i n a s e r ec ept o r s , i n v o l v es t w o c o n f o r ma t i o n s
o f t he ext r a c el l u l a r d o ma i n . On l y t he hi g h a f f i n i t y l i g a n d
b i n d i n g c o n f o r ma t i o n f o r ms o l i g o mer s . Br i d g i n g o f t w o
r ec ept o r pr o t ei n s b y a s i n g l e l i g a n d mo l ec u l e r epr es en t s
a n o t her po s s i b l e mec ha n i s m f o r o l i g o mer i z a t i o n ( U l l r i c h a n d
S c hl es s i n g er , 1 9 9 0 ; C u n n i n g ha m et a l . , 1 9 9 1 ) s u ppo r t ed b y
t he r ec en t f i n d i n g t ha t g r o w t h ho r mo n e f o r ms a 1 : 2 c o mpl ex
w i t h t he i s o l a t ed ext r a c el l u l a r r ec ept o r d o ma i n . F o r t he I L -4
r ec ept o r , n o ev i d en c e f o r t he o c c u r r en c e o f d i mer s o r
o l i g o mer s ha s a s y et b een pr o v i d ed . A s i n g l e c l a s s o f I L -4
r ec ept o r o r I L 4 b i n d i n g pr o t ei n ha s b een i d en t i f i ed s o f a r ,
exhi b i t i n g o n e ho mo g en eo u s d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f
-1 0 0 pM. I t r ema i n s t o b e es t a b l i s hed w het her I L -4
r ec ept o r s i g n a l l i n g i n v o l v es t he f o r ma t i o n o f a ho mo d i mer
o r w het her t he a g g r eg a t i o n w i t h o t her hi t her t o u n k n o w n
pr o t ei n s i s n ec es s a r y . The a v a i l a b i l i t y o f a n t a g o n i s t I L -4
v a r i a n t s w i l l o pen u p n ew w a y s t o a d d r es s t he q u es t i o n o f
w hi c h mec ha n i s ms o per a t e d u r i n g I L -4 r ec ept o r s i g n a l l i n g .
Ma t er i a l s a n d met ho d s
P r o d u c t i o n o f I L -4 mu t a n t pr o t ei n s
H u ma n I L -4 a n d mu t a n t pr o t ei n s w er e pr o d u c ed i n Es c her i c hi a c o l i ,
s u b j ec t ed t o a r en a t u r a t i o n s t ep a n d hi g hl y pu r i f i ed b y C M-S epha r o s e 6 B
c hr o ma t o g r a phy f o l l o w ed b y H P L C ( W ei g el et a l . , 1 9 8 9 ; K r u s e et a l . ,
1 9 9 1 ) . By mea n s o f i n v i t r o mu t a g en es i s Ty r l 24 ( K r u s e et a l . , 1 9 9 1 ) ha d
b een r epl a c ed b y phen y l a l a n i n e, hi s t i d i n e, a s pa r a g i n e, l y s i n e, g l y c i n e o r
a s pa r t i c a c i d , r es pec t i v el y , t o g en er a t e mu t a n t pr o t ei n s Y 1 24 F , Y 1 24 H ,
Y 1 24 N , Y 1 24 K , Y 1 24 G a n d Y 1 24 D . The mu t a t ed g en es r ec l o n ed i n t o t he
expr es s i o n pl a s mi d w er e s eq u en c ed i n b o t h d i r ec t i o n s ( 373A D N A
S eq u en c er , Appl i ed Bi o s y s t ems ) t o c o n f i r m t he mu t a t i o n . P r o t ei n
c o n c en t r a t i o n w a s d et er mi n ed b y mea s u r i n g a b s o r b a n c e a t 28 0 n m. I t w a s
a s s u med t ha t 1 mg I L -4 / ml ( 5 0 % Ac et o n i t r i l a n d 0 . 1 % t r i f l u o r a c et i c a c i d )
y i el d s a n a b s o r b a n c e o f 1 a t 28 0 n m ( -0
' % = 1 ) . F o r pr o t ei n
mea s u r emen t s o f v a r i a n t s d ef i c i en t i n Tr y 1 24 , t he a b s o r b a n c e a t 28 0 n m
w a s mu l t i pl i ed b y a f a c t o r o f 1 . 1 5 .
324 2
H u ma n I L -4 a n t a g o n i s t mu t a n t pr o t ei n s
T-c el l pr o l i f er a t i o n a s s a y
( s ee Y o k o t a et a l . , 1 9 8 6 ; S o l a r i et a l . , 1 9 8 9 ) P er i pher a l b l o o d mo n o n u c l ea r
c el l s o b t a i n ed f r o m hea l t hy d o n o r s w er e pu r i f i ed b y F i c o l l -H y pa q u e
c en t r i f u g a t i o n ( P ha r ma c i a ) a n d s t o r ed i n a l i q u o t s a t -8 0 C . The t ha w ed
c el l s w er e c u l t u r ed f o r 7 d a y s w i t h 9
Ag / ml
phy t o hema g g l u t i n i n e ( P H A;
H A-1 5 , W el l c o me) a n d c o n s i s t ed a t t hi s s t a g e t o a hi g h per c en t a g e o f
a c t i v a t ed T-c el l s ( P H A-b l a s t s ) . C el l s ( 5 x 1 0 5 / mI l ) w er e i n c u b a t ed i n
0 . 2 ml a l i q u o t s w i t h l o g 2 d i l u t i o n s o f t he I L -4 pr o t ei n f o r 3 d a y s , b ef o r e
t he a mo u n t o f [ 3H ] t hy mi d i n e i n c o r po r a t ed d u r i n g t he f i n a l 4 h w a s
d et er mi n ed . Ma xi ma l r es po n s e w a s 6 -23 x 1 0 3 c . p. m. i n c o r po r a t ed
[ 3H ] t hy mi d i n e o v er a b a c k g r o u n d o f 5 5 -1 4 0 0 c . p. m. The EC 5 0
v a l u es
w er e c a l c u l a t ed f r o m t he k n o w n I L -4 c o n c en t r a t i o n o f a s t o c k s o l u t i o n a n d
t he d i l u t i o n f a c t o r y i el d i n g ha l f -ma xi ma l r es po n s e.
I n d u c t i o n o f t he l o w a f f i n i t y F c c r ec ept o r ( C D 23) o n B-c el l s
( s ee K i k u t a n i et a l . , 1 9 8 6 ; D eF r a n c e et a l . , 1 9 8 7; S o l a r i et a l . , 1 9 8 9 )
Mo n o n u c l ea r c el l s w er e pu r i f i ed f r o m t he s pl een o f a d o n o r t ha t ha d n o
ha ema t o l o g i c a l d i s ea s e b y c en t r i f u g a t i o n o v er F i c o l l -H y pa q u e. B-c el l s w er e
i s o l a t ed b y r o s et t i n g o f c o n t a mi n a t i n g c el l s w i t h o x er y t hr o c y t es c o u pl ed
w i t h mo n o c l o n a l a n t i b o d i es a n t i -C D 2, a n t i -C D 4 a n d a n t i -C D 8 P u r i f i ed
B-c el l s w er e po s i t i v e b y >9 5 % f o r C D 1 9 . To n s i l l a r B-c el l s w er e pr epa r ed
i n t he s a me w a y . B-c el l s w er e c u l t u r ed a t 1 0 6 c el l s / mi l f o r 4 0 h w i t h
1 0
i t g / ml
s o l u b l e F ( a b ' ) 2 f r a g men t s o f a f f i n i t y pu r i f i ed g o a t a n t i -hu ma n I g M
( J a c k s o n L a b o r a t o r i es -D i a n o v a , H a mb u r g , G er ma n y ) pl u s l o g 3 d i l u t i o n s
o f I L -4 o r mu t a n t pr o t ei n s . F AC S a n a l y s i s ( F AC S c a n , Bec t o n -D i c k i n s o n )
w a s d o n e a f t er d o u b l e-s t a i n i n g w i t h mo n o c l o n a l a n t i b o d i es a g a i n s t C D l 9
( L eu l 2-P E, Bec t o n -D i c k i n s o n ) a n d C D 23 ( l OB8 -F I TC , D i a n o v a ) . The
n u mb er o f C D 23 po s i t i v e c el l s a n d t he r el a t i v e mea n f l u o r es c en c e i n t en s i t y
w a s c a l c u l a t ed f r o m a hi s t o g r a m o b t a i n ed f r o m t he s i n g l e c el l a n a l y s i s o f
5 0 0 0 c el l s ev a l u a t ed o v er a 4 l o g r a n g e. B-c el l s w i t ho u t s t i mu l a t i o n w er e
C D 23 po s i t i v e b y < 1 % w i t h a r el a t i v e mea n f l u o r es c en c e i n t en s i t y o f < 1 0 .
Af t er ma xi ma l s t i mu l a t i o n 6 7 ( 6 2-72) % o f t he c el l s w er e C D 23 po s i t i v e
exhi b i t i n g a r el a t i v e mea n f l u o r es c en c e i n t en s i t y o f 79 5 1 1 .
EC 5 0
v a l u es
w er e c a l c u l a t ed f r o m t he k n o w n c o n c en t r a t i o n s o f t he I L -4 s t o c k s o l u t i o n
a n d t he d i l u t i o n f a c t o r l ea d i n g t o ha l f -ma xi ma l r es po n s e.
R ec ept o r b i n d i n g a s s a y s
[ 1 25 I ] I L -4 l a b el l ed t o a s pec i f i c r a d i o a c t i v i t y o f 0 . 22 AC i / pmo l ( C a b r i l l a t
et a l . , 1 9 8 7) w a s i n c u b a t ed a t a c o n c en t r a t i o n o f 1 n M w i t h 1 0 7/ ml R a j i
B-l y mpho ma c el l s o r a c t i v a t ed T-c el l s o r a c t i v a t ed t o n s i l l a r B-c el l s ,
r es pec t i v el y , i n 0 . 2 ml pl u s t he i n d i c a t ed c o n c en t r a t i o n s o f t he c o mpet i n g
I L -4 pr o t ei n s . The [ 1 25 I ] I L -4 r a d i o a c t i v i t y b o u n d d u r i n g a 2 h i n c u b a t i o n
per i o d a t 4 C w a s d et er mi n ed . D i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s , K D ,
w er e c a l c u l a t ed
f r o m r el a t i v e I C s e a c c o r d i n g t o R u f f o l o ( 1 9 8 2) . Mea s u r emen t s o f [ 1 25 1 ] I L -4
b i n d i n g t o r ec ept o r s o n P H A-a c t i v a t ed T-c el l s a n d a c t i v a t ed t o n s i l l a r B-
c el l s w a s per f o r med a s d es c r i b ed a b o v e b u t u s i n g v a r y i n g c o n c en t r a t i o n s
( 1 0 -1 0 0 0 pM) o f [ 1 25 I ] I L -4 i n t he a b s en c e a n d pr es en c e o f 1 0
AM
u n l a b el l ed I L -4 , r es pec t i v el y .
C o mpet i t i v e i n hi b i t i o n a s s a y s
Ac t i v a t ed T c el l s ( P H A-b l a s t s ) w er e i n c u b a t ed w i t h l o g 2 d i l u t i o n s o f I L -4
( s ee a b o v e) pl u s a c o n s t a n t a mo u n t o f mu t a n t pr o t ei n Y 1 24 D . B-c el l s ( C D 1 9
po s i t i v e c el l s ) w er e i n c u b a t ed w i t h l o g 3 d i l u t i o n s o f I L -4 ( s ee a b o v e) a t
a c o n s t a n t c o n c en t r a t i o n o f mu t a n t pr o t ei n Y 1 24 D . The C D 23 c o n t en t o f
t he c el l s w a s a n a l y s ed b y F AC S a n d ev a l u a t ed a s d es c r i b ed a b o v e. The
K i
o f v a r i a n t Y 1 24 D w a s c a l c u l a t ed f r o m t he a ppa r en t EC 5 0 v a l u es
mea s u r ed i n t he pr es en c e o f t w o d i f f er en t i n hi b i t o r c o n c en t r a t i o n s [ 1 2] a n d
[ I ' ] a c c o r d i n g t o t he r el a t i o n :
[ 1 21
-
EC 5 0 2/ EC 5 0 '
x
[ I i ]
K = EC 5 0 2/ EC 5 0 '
-
1
( R u f f o l o , 1 9 8 2)
C a l c u l a t i o n s o f r ec ept o r o c c u pa n c y a n d r el a t i v e ef f i c a c y
The r ec ept o r o c c u pa n c y y i s t he r a t i o b et w een t he c o n c en t r a t i o n s o f
l i g a n d ed
r ec ept o r [ R L ] a n d t o t a l r ec ept o r [ R e] . Ma k i n g
t he mo s t s i mpl e a s s u mpt i o n
t ha t o n e l i g a n d b i n d s t o o n e r ec ept o r
w i t h o n e
ho mo g en eo u s
d i s s o c i a t i o n
c o n s t a n t K D t hen
%
[ R L ]
x 1 0 0 _ [ L ] x 1 0 0
[ R t ] K D
+
[ L ]
I t i s f u r t her a s s u med t ha t t he d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t K D
o f 1 0 -
1 0
d et er mi n es
t he I L 4 -d epen d en t C D 23 i n d u c t i o n i n B-c el l s . Then t he
r ec ept o r o c c u pa n c y
y f o r I L 4 i s 5 % ( 0 . 4 %)
a t t he EC 5 0
o f 5
pM ( 0 . 4 pM)
f o r t he i n d u c t i o n
o f mea n C D 23 c o n t en t ( n u mb er
o f C D 23
po s i t i v e c el l s ) .
The pa r t i a l a g o n i s t Y 1 24 D pr o b a b l y
s a t u r a t es t he
r ec ept o r ( y
= 1 0 0 %)
i n B-c el l s t o pr o d u c e t he ma xi ma l pa r t i a l r es po n s e,
i . e. t he i n d u c t i o n o f
8 %
( 4 5 %) o f t he f u l l mea n C D 23 c o n t en t ( n u mb er
o f C D 23
po s i t i v e c el l s ) .
The r el a t i v e ef f i c a c y ( er )
o f t w o
l i g a n d s
i s t he r a t i o o f t he
r es po n s es R '
a n d R 2 t ha t w o u l d b e pr o d u c ed b y
t hes e
l i g a n d s
a t t he s a me
r ec ept o r
o c c u pa n c y .
R ' y 2
er = R 2
Xy
Ac c o r d i n g l y , f o r I L 4 a n d v a r i a n t Y 1 24 D t he r el a t i v e
ef f i c a c y
a mo u n t s
t o 5 0 / 8 x 1 0 0 / 5
=
1 25 ( 5 0 / 4 5
x 1 0 0 / 0 . 4
=
275 ) d u r i n g
i n d u c t i o n o f mea n
C D 23 c o n t en t ( n u mb er
o f C D 23 po s i t i v e c el l s ) .
Ac k n o w l ed g emen t s
W e t ha n k H . U . S c ha i r er , U . S c hw u l er a
a n d A. D u s c hl f o r
hel p
a n d d i s c u s s i o n .
Thi s w o r k w a s s u ppo r t ed b y
t he D eu t s c he F o r s c hu n g s g emei n s c ha f t
a n d
b y
t he F o n d s d er C hemi e.
R ef er en c es
Ab d el -Meg u i d , S . S . , S hi eh, H . -S . , S mi t h, W . W . , D a y r i n g er , H . E. ,
V i o l a n d , B. N . a n d Ben t l e, L . A. ( 1 9 8 7)
P r o c . N a t l . Ac a d . S c i . U S A, 8 4 ,
6 4 34 -6 4 37.
Ba z a n , J . F . ( 1 9 9 0 a ) P r o c . N a t l . Ac a d . S c i . U S A, 8 7, 6 9 34 -6 9 38 .
Ba z a n , J . F . ( 1 9 9 0 b ) I mmu n o l o g y To d a y , 1 1 , 35 0 -35 4 .
Bl a c k , J . ( 1 9 8 9 ) S c i en c e, 24 5 , 4 8 6 -4 9 3.
Br a n d hu b er , B. J . , Bo o n e, T. , K en n ey , W . C . a n d Mc K a y , D . B. ( 1 9 8 7) S c i en c e,
238 , 1 70 7-1 70 9 .
C a b r i l l a t , J . , G a l i z z i , J . -P . , D j o s s o u , O. , Ar a i , N . , Y o k o t a , T. , Ar a i , K .
a n d
Ba n c her ea u , J . ( 1 9 8 7) Bi o c her n Bi o phy s .
R es . C o mmu n . , 1 4 9 , 9 9 5 - 1 0 0 1 .
C o l l i n s , L .
et a l . ( 1 9 8 8 )
P r o c . N a t l . Ac a d . S c i . U S A, 8 5 ,
770 9 -771 3.
C o o k , W . J . , Ea l i c k , S . E. , R ei c her t , P . , H a mmo n d , G . S . , L e, H . V . ,
N a g a b hu s ha n , T. L . , Tr o t t a , P . P .
a n d
Bu g g , C . E. ( 1 9 9 1 )
J . Mo l . Bi o l . , 21 8 ,
6 75 -6 78 .
C o s ma n , D . , L y ma n , S . D . , I d z er d a , R . L . , Bec k ma n , M. P . , P a r k , L . S . ,
G o o d w i n , R . G .
a n d Ma r c h, C . J . ( 1 9 9 0 )
Tr en d s Bi o c hem. S c i . , 1 5 ,
26 5 -270 .
C u n n i n g ha m, B. C .
a n d W el l s , J . A. ( 1 9 9 1 )
P r o c . N a t l . Ac a d . S c i . U S A, 8 8 ,
34 0 7-34 1 1 .
C u n n i n g ha m, B. C . , U l t s c h, M. ,
D e V o s , A. M. , Mu l k er r i n , M. G . ,
C l a u s er , K . R .
a n d W el l s , J . A. ( 1 9 9 1 ) S c i en c e, 25 4 , 8 21 -8 25 .
D eF r a n c e, T. et a l . ( 1 9 8 7)
J . Exp. Med . , 1 6 5 , 1 4 5 9 -1 4 6 7.
D e V o s , A. M. , U l t s c h, M. a n d K o s s i a k o f f , A. A. ( 1 9 9 2) S c i en c e, 25 5 ,
30 6 -31 2.
D i ed er i c hs , K . , Bo o n e, T. a n d K a r pl u s , P . A. ( 1 9 9 1 ) S c i en c e, 25 4 ,
1 779 -1 78 2.
Ei s en b er g , S . P . , Ev a n s , R . J . , Ar en d , W . P . , V er d er b er , E. , Br ew er , M. T. ,
H a n n u m, C . H . a n d Tho mps o n , R . C . ( 1 9 9 0 ) N a t u r e, 34 3, 34 1 -34 6 .
F i n k el ma n , F . D .
et a l . ( 1 9 9 0 )
An n u . R ev . I mmu n o l . , 8 ,
30 3-333.
G a l i z z i , J . -P . , Z u b er , C . E. , H a r a d a , N . , G o r ma n , D . M. , D j o s s o u , O. ,
K a s t el ei n , R . , Ba n c her ea u , J . , H o w a r d , M. a n d Mi y a j i ma , A. ( 1 9 9 0 ) I n t .
I mmu n o l . , 2, 6 6 9 -6 75 .
G a r r o n e, P . , D j o s s o u , O. ,
G a l i z z i , J . -P . a n d Ba n c her ea u , J . ( 1 9 9 1 )
Eu r . J .
I mmu n o l . , 21 ,
1 36 5 -1 36 9 .
G ehr k e, L . , J o b l i n g , S . A. , P a i k , L . S . K . , Mc D o n a l d , B. , R o s en w a s s er , L . J .
a n d Au r o n , P . E. ( 1 9 9 0 )
J . Bi o l . C hem. , 26 5 , 5 9 22-5 9 25 .
G r a n t , A. J . , R o es s l er , E. , J u , G . , Ts u d o , M. , S u g a mu r a , K .
a n d
W a l d ma n n , T. A. ( 1 9 9 2)
P r o c . N a t l . Ac a d . S c i . U S A, 8 9 , 21 6 5 -21 6 9 .
H a n n u m, C . H . , W i l c o x, C . J . , Ar en d , W . P . , J o s l i n , F . G . , D r i pps , D . J . ,
H ei md a l , P . L . , Ar mes , L . G . , S o mmer , A. , Ei s en b er g , S . P .
a n d
Tho mps o n , R . C . ( 1 9 9 0 ) N a t u r e, 34 3, 336 -34 0 .
H a r a d a , N . , C a s t l e, B. E. , G o r ma n , D . M. , I t o h, N . , S c hr eu r s , J . , Ba r r et t , R . L . ,
H o w a r d , M. a n d Mi y a j i ma , A. ( 1 9 9 0 )
P r o c . N a t l . Ac a d . S c i . U S A, 8 7,
8 5 7-8 6 1 .
I d z er d a , R . L .
et a l .
( 1 9 9 0 )
J .
Exp. Med . , 1 71 , 8 6 1 -8 73.
J u , G .
et a l . ( 1 9 9 1 )
P r o c . N a t l . Ac a d . S c i . U S A, 8 8 , 26 5 8 -26 6 2.
K i k u t a n i , H .
et a l .
( 1 9 8 6 ) C el l , 4 7, 6 5 7-6 6 5 .
K r u s e, N . , L ehmb ec her , T.
a n d S eb a l d , W . ( 1 9 9 1 )
F EBS L et n . , 28 6 , 5 8 -6 0 .
K u hn , R . , R a j ew s k y , K .
a n d Mu l l er , W . ( 1 9 9 1 ) S c i en c e, 25 4 , 70 7-71 0 .
L a b r i o l a -To mpk i n s , E.
et a l .
( 1 9 9 1 )
P r o c . N a t l . Ac a d . S c i . U S A, 8 8 ,
1 1 1 8 2-1 1 1 8 6 .
L i a n g , S . -M. ,
L ee, N . , Z o o n , K . C . , Ma n i s c hew i t z , J . F . , C ho l l et , A. , L i a n g ,
C . -M. a n d
Q u i n n a n , G . V . ( 1 9 8 8 )
J . Bi o l . C hem. , 26 3,
4 76 8 -4 772.
Ma l i s z ew s k i , C . R . , S a t o , T. A. ,
V a n d en Bo s , T. , W a u g h, S . ,
D o w er , S . K . ,
324 3
N . K r u s e, H . -P . To n y a n d
W . S eb a l d
S l a c k , J . , Bec k ma n n , M. P . a n d G r a b s t ei n , K . H . ( 1 9 9 0 ) J . I mmu n o l . , 1 4 4 ,
30 28 -30 33.
Mo s l ey , B. et a l . ( 1 9 8 9 ) C el l , 5 9 , 335 -34 8 .
Mu n s o n , P . J . ( 1 9 8 3) Met ho d s En z y mo l . , 9 2, 5 4 3-5 76 .
P a r k , L . S . , F r i en d , D . , S a s s en f el d , H . M. a n d U r d a l , D . L . ( 1 9 8 7) J . Exp.
Med . , 1 6 6 , 4 76 -4 8 8 .
P a u l , W . E. a n d Oha r a , J . ( 1 9 8 7) An n u . R ev . I mmu n o l . , 5 , 4 29 -4 5 9 .
P a u l , W . E. ( 1 9 9 1 ) Bl o o d , 77, 1 8 5 9 -1 8 70 .
R ed f i el d , C . , S mi t h, L . J . , Bo y d , J . , L a w r en c e, G . M. P . , Ed w a r d s , R . G . ,
S mi t h, R . A. G . a n d D o b s o n , C . M. ( 1 9 9 1 ) Bi o c hemi s t r y , 30 , 1 1 0 29 -1 1 0 35 .
R i n g hei m, G . E. , F r ei ma r k , B. D . a n d R o b b , R . J . ( 1 9 9 1 ) L y mn pho k i n e C y t o k i n e
R es . , 1 0 , 21 9 -224 .
R u f f o l o , R . R . J r ( 1 9 8 2) J . Au t o n . P ha r n i a c . , 2, 277-29 5 .
S a n d er s o n , C . J . , C a mpb el l , H . D . a n d Y o u n g , I . G . ( 1 9 8 8 ) I mmu n o l . R ev . ,
1 0 2, 29 -5 0 .
S ha n a f el t , A. B. , Mi y a j i ma , A. , K i t a mu r a , T. a n d K a s t el ei n , R . A. ( 1 9 9 1 )
EMBO J . , 1 0 , 4 1 0 5 -4 1 1 2.
S o l a r i , R . et a l . ( 1 9 8 9 ) Bi o c hem. J . , 26 2, 8 9 7-9 0 8 .
S c hl es s i n g er , J . ( 1 9 8 8 ) Tr en d s Bi o c hem. S c i . , 1 3, 4 4 3-4 4 7.
Tepper , R . I . , L ev i n s o n , D . A. , S t a n g er , B. Z . , C a mpo s -To r r es , J . , Ab b a s , A. K .
a n d L ed er , P . ( 1 9 9 0 ) C el l , 6 2, 4 5 7-4 6 7.
U l l r i c h, A. a n d S c hl es s i n g er , J . ( 1 9 9 0 ) C el l , 6 1 , 20 3-21 2.
U r b a n , J . F . J r , K a t o n a , I . M. , P a u l , W . E. a n d F i n k el ma n , F . D . ( 1 9 9 1 ) P r o c .
N a t l . Ac a d . S c i . U S A, 8 8 , 5 5 1 3-5 5 1 7.
W ei g el , U . , Mey er , M. a n d S eb a l d , W . ( 1 9 8 9 ) Eu r . J . Bi o c hem. , 1 8 0 ,
29 5 -30 0 .
W i l l i a ms , L . T. ( 1 9 8 9 ) S c i en c e, 24 3, 1 5 6 4 -1 5 70 .
Y a ma y o s hi , M. , Ohu e, M. , K a w a s hi ma , H . , K o t a n i , H . , l i d a , M. , K a w a t a , S .
a n d Y a ma d a , M. ( 1 9 9 0 ) L y mpho k i n e R es . , 9 , 4 0 5 -4 1 3.
Y o k o t a , T. , Ot s u k a , T. , Mo s ma n n , T. , Ba n c her ea u , J . , D eF r a n c e, T. ,
Bl a n c ha r d , D . , D e V r i es , J . E. , L ee, F . a n d Ar a i , K . -I . ( 1 9 8 6 ) P r o c . N a t l .
Ac a d . S c i . U S A, 8 3, 5 8 9 4 -5 8 9 8 .
Z u r a w s k i , S . M. a n d Z u r a w s k i , G . ( 1 9 8 9 ) EMBO J . , 8 , 25 8 3-25 9 0 .
Z u r a w s k i , S . M. , I ml er , J . -L . a n d Z u r a w s k i , G . ( 1 9 9 0 ) EMBO J . , 9 ,
38 9 9 -39 0 5 .
Z u r a w s k i , G . ( 1 9 9 1 ) Tr en d s Bi o t ec hn o l . , 9 , 25 0 -25 7.
R ec ei v ed o n F eb r u a r y 4 , 1 9 9 2; r ev i s ed o n Ma y 1 9 , 1 9 9 2
324 4