Linkpings universitet

IFM/Kemi

BIOKEMI 1
NKEA08
Laborationskompendium
med sidhnvisningar till kurslitteratur samt
vningsuppgifter

HT-2013

Innehllsfreteckning
Sidhnvisningar till Berg, Tymoczko, Stryer Biochemistry 7th ed.

Att kunna till duggan

Titrerkurva fr alanin

Cellstruktur

4-6

Metaboliskt schema

Proteiner, uppgifter till lektionen

Kolhydratmetabolism, uppgifter till lektionen

Fettsyrametabolism och reglering, uppgifter till lektionen

10-11

Laborationsrapport: innehll och inlmningsregler

12

Absorptionsspektrometri

13-15

Preparation av hemoglobin med bl.a. gelfiltrering

16-20

Bestmning av ett proteins molekylvikt med SDS-PAGE

21-24

Kalibrering av automatpipett

25-27

Alkoholdehydrogenas (ADH): Bestmning av reakionshastigheten

28-30

vningstenta med svar: 2012-12-21

31-34

LINKPINGS UNIVERSITET
IFM/Kemi

120528

BIOKEMI 1
SIDHNVISNINGAR TILL BERG, TYMOCZKO, STRYER: BIOCHEMISTRY, 7th ed.

FRELSNING

SIDOR

Introduktion: Biokemi
Proteiner
Kolhydrater
Lipider och cellmembraner
DNA

1-5
18, 25-27
329-330, 337-338
357-360, 367
113-115

Aminosyror

25-33

Primr- och sekundrstruktur

33-35, 81-85, 36-43

Tertir- och kvartrstruktur

45-56

Proteinrening

67-76

Enzymer

227-239, 299-300, 312-315

Bioenergetik

443-463, 546-549

Glykolysen

469-474, 476-477, 479-485, 488-490

Glukoneogenesen

495-503, 637-643, 649-652

Citronsyracykeln

515-525, 527-535

Andningskedjan och ATP-as

543-545, 549-560, 561-568

Lipidmetabolism I: -oxidationen

663-672, 677-680

Lipidmetabolism II: Fettsyrasyntesen

680-687

Reglering av enzymaktivitet: versikt

Kovalent modif.
Hormonverkan
Glukagonverkan

299-300
307-311
415-422
646-648, 652-655, 690-691

Nukleinsyrornas uppbyggnad och replikation

113-122, 850-854, 867-869

Transkription och translation

125-135, 921-925, 927-930, 931-940

Att kunna till Duggan!

1. Fullstndigt namn och trebokstavkoden fr de 20 aminosyrorna
2. Strukturen fr de 20 aminosyrorna

3. Indelning av aminosyrorna vid pH 7 i opolra, polra oladdade, plusoch negativt laddade.

4. Jmfra olika aminosyrors polaritet

5. Ungefrliga pKa-vrden:
-COO- bunden till -kolet
-NH3+ bundet till -kolet
-COO- i R-grupper
R-grupper i Lys och Arg
R-gruppen i His
R-gruppen i Cys

2
9
4
10-12
6
8

6. Veta att Cys kan bilda S-S bryggor

Titrerkurva fr alanin

Prokaryot cell
Prokaryoter, eller bakterier r vanligtvis en-celliga
organismer.
Prokaryoter saknar krna (deras DNA r packat i
en krnregion I cytoplasman)
Escherichia coli (E. coli) en av de mest
vlstuderade av alla levande organismer.
E. coli celler r ~0.5m diameter, 1.5m lnga

Eukaryot cell
Eukaryoter: vxter, djur, svampar
Har en membranombunden krna som innehller
kromosomer.
r normalt 1000 ggr strre i volym n prokaryota
celler.
Har membranombundna organeller.

E. coli cell

Eukaryotic cell (animal)

Proteinlektion:
Under lektionen kommer uppgift 8, 11, 12, 15, 17 och 20 p sid.
63-64 i boken att gs igenom. Frutom dessa uppgifter gr vi ven
igenom fljande tre uppgifter:
1. Vilken nettoladdning fr fljande tetrapeptid vid pH 7?
Ala-Lys-Asp-Ser
2. Hur pverkas ett proteins primr, sekundr, tertir och ev.
kvartrstruktur vid denaturering?
3. Lista skillnaderna mellan sekundrstrukturmotiven, -helix och
-flak.

KOLHYDRATMETABOLISMEN:
1. Hur mycket ATP fristts vid glykolysen och vad sker med pyruvat
(i) vid aeroba frhllanden?
(ii) anaeroba frhllanden?
2. Hur skiljer sig glykolysen och glukoneogenesen t och vad r det som styr om
respektive process r aktiv?
3. Vad innebr substratnivfosforylering?
4. Vilken reaktion binder samman glykolysen och citronsyracykeln?
5. Redogr fr hur mycket GTP, NADH och FADH2 som bildas per varv i
citronsyracykeln.
6. Vilka reaktioner gr citronsyracykeln energetiskt frdelaktig?
7. Ge exempel p andra biomolekyler som kan bildas frn citronsyracykelintermedirer.
8. Beskriv versiktligt hur e- frn NADH vandrar mot den slutliga e--acceptorn O2.
9. Frklara varfr oxidation av NADH motsvarar 2.5 ATP medan oxidation av FADH2
motsvarar 1.5 ATP.
10. Vad gr cytokromer till bra elektronbrare?

FETTSYRAMETABOLISMEN:
1. Ange korrekt svarsalternativ (a eller b):
(i) Fettsyrasyntesen sker
(ii)

Fettsyrasyntesen

a. i mitokondrien.
b. i cytosolen.
a. krver ATP.
b. genererar ATP.

(iii) Fettsyranedbrytningen katalyseras av

a. flera separata enzymer.

b. ett enzymkomplex.

(iv)

Vid fettsyrasyntesen bildas fettsyran

a. frn metylnden till

karboxylnden.
b. frn karboxylnden till
metylnden.

(v)

Lipas katalyserar

a. bildandet av fettsyror.
b. nedbrytning av triacylglycerol.

(vi)

Lipasaktiviteten regleras

a. hormonellt.
b. av allostera effektorer.

(vii) Enzymet som reglerar hastigheten fr fettsyrasyntesen heter

a. acetylCoAdehydrogenas
b. acetylCoAkarboxylas
(viii) Insulin

a. aktiverar fettsyrasyntesen.
b. inaktiverar fettsyrasyntesen.

2. Ange om det behvs oxidationsmedel eller reduktionsmedel fr fettsyranedbrytningen och ange vilket/vilka.
3. Rita upp fettsyran 18:29,12 (linolsyra).
4. Varfr omvandlas acetylCoA till malonylCoA innan fettsyrasyntesen och det
mekanistiska motivet dekarboxylering terfinns i en annan metabol process vilken
process och vilken reaktion syftas?
5. Cellerna r beroende av transportmolekyler fr att alla metabola system ska fungera.
a) Vilken transportr krvs fr fettsyranedbrytningen, vad transporteras och vart?
b) Vilken transportr krvs fr fettsyrasyntesen, vad transporteras och vart?
6. a) Om du fick rdet att helt avst frn kolhydrater, hur skulle det d pverka din
frmga att bryta ner fett? Vad skulle bildas?
b) Om du d fick rdet att se till att ta fettsyror med ett udda antal kolatomer,
skulle det pverka din situation?
7. Berkna hur mycket ATP som erhllits efter fullstndig nedbrytning av laurat
(dodekanoat, 12C).

10

REGLERINGEN:
8. Fosforylering/defosforylering r vanligt vid reglering av enzymaktivitet.
a) Vad kallas ett enzym som fosforylerar ett annat protein?
b) Vad kallas ett enzym som defosforylerar ett annat protein?
c) Vilket mne fungerar som fosfatdonator vid fosforyleringar?
9. Nmn ngra olika stt att reglera nyckelenzymers aktiviteter.
10. Hur kan fosforylering/defosforylering vara s effektivt nr det gller att reglera ett
enzyms aktivitet?
11. Skissa schematiskt p signalvgen frn aktivering av receptor till aktivering av effektorer
(t ex ett enzym) och ge exempel p second messengers.
12. Vissa proteiner r inaktiva om inte en serin eller treonin fosforylerats. I vissa fall har
dock dessa proteiner kunnat aktiveras genom att serinen eller treoninen genom
lgesspecifik mutagenes bytts ut mot en glutamat (glutaminsyras anjon). Frklara varfr.
13. En muterad form av G-subenheten av ett G-protein gr GDP/GTP-utbyten ven i
frnvaro av en aktiverad receptor. Hur pverkar detta signaleringsvgen?
14. Vid muskelarbete utsndras adrenalin fr att stimulera nedbrytning av glukos fr att ge
muskeln energi. Glukos finns lagrat som glykogen. Adrenalin pverkar -adrenerga
receptorn vilket leder till aktivering av G och cAMP. cAMP-fosfodiesteras r ett enzym
som omvandlar cAMP till AMP. Hur pverkar inhibitorer av cAMP-fosfodiesteras
glukosmobiliseringen i musklerna?

11

Laborationsrapporter:
P Biokemi kursens hemsida:
https://www.ifm.liu.se/edu/coursescms/NKEA08//
hittar du instruktioner avseende rapportens innehll samt regler
fr inlmning.
Laborationsrapporter skickas in p fljande mailadress:
nkea08@ifm.liu.se

P hemsidan finns ven en exempelrapport dr du se hur en

rapport i biokemi kan vara uktformad.

12

LINKPINGS UNIVERSITET
IFM/Kemi

060918

ABSORPTIONSSPEKTROMETRI

ALLMNT
En ljusstrle med en viss intensitet, som passerar genom ett medium, frlorar alltid en del
av sin intensitet beroende p absorption frorsakad av joner och molekyler i mediet.
Denna absorption r i allmnhet vglngdsberoende. Man kan drfr registrera en
specifik absorption mer exakt (signifikant), om ljusstrlen r monokromatisk, dvs ljuset
bestr av endast en vglngd. Eftersom ljusabsorptionen r karakteristisk fr de mnen
som ingr i mediet, kommer ljusstrlens intensitetsminskning att st i relation till
koncentrationen av de absorberande mnena samt lngden av strlens vg genom mediet.
Matematiskt kan absorptionen uttryckas genom Lambert-Beers lag:
A = log Io / I = l c
A = absorbans
Io = det infallande ljusets intensitet
I = det utgende ljusets intensitet
= den molra absorptiviteten (extinktionskoefficienten, M-1 cm-1)
l = lngden av strlens vg genom mediet (cm)
c = koncentrationen av det absorberande mnet (M)
Termen I / Io benmns transmittans, T, och uttrycks i %, d.v.s. I / Io . 100.
Vid samma vglngd r absorbanser additiva, d.v.s. i en lsning med n st absorberande
mnen r Atot = A1 + A2 + ........An
Ur Lambert-Beers lag fs ven att absorbansen r linjrt beroende av det absorberande
mnets koncentration. Detta gller dock inte om koncentrationen av mnet r alltfr hg.
Den molra absorptiviteten r en konstant som pverkas av bl.a. vglngd, pH,
lsningsmedlets polaritet och geometriska egenskaper hos den absorberande molekylen.
Ofta anvnds Lambert-Beers lag direkt vid t.ex. koncentrationsberkningar fr en viss
absorberande substans. Man knner d absorptiviteten och ven l som vanligtvis r 1 cm
(standardkyvett), varvid man kan rkna fram c fr en erhllen absorbans A.

AKTIVITETSMTNINGAR
Ett frfarande som ofta anvnds inom biokemin r att spektrofotometriskt flja en
enzymkatalyserad reaktion, i vilken substrat eller produkt absorberar ljus av en viss
vglngd. Det r d mjligt att tillmpa ovannmnda mtningsmetod.
13

Absorbansminskningen (-kningen) r drvid linjrt beroende av den hastighet, varmed

substratkoncentrationen minskar (produktkoncentrationen kar), d.v.s.
A / t = l c / t
Reaktionshastigheten v uttrycks vanligen i mol omsatt substrat per minut:
v = A . reaktionsvolymen (l) / t . . l
SPEKTRUM
Om man vill underska ett mnes absorption vid olika vglngder, kan man kontinuerligt
registrera absorptionen som funktion av vglngden. Denna funktion kallas mnets
absorptionsspektrum. Tillvgagngssttet brukar kallas vglngdsscanning av engelskans
scan, som betyder underska.

DIFFERENSSPEKTRUM
Tv olika mnen har inte identiska absorptionsspektra. Om skillnaderna r sm, kan de
vara svra att upptcka genom mtning av absorptionstopparnas lgen. I sdana fall
registrerar man med en speciell teknik skillnaden mellan tv spektra, vilket ger ett s.k.
differensspektrum. Med hg knslighet kan mycket sm skillnader mellan tv spektra
upptckas.

APPARATUR
En apparat som mter absorptionen i ett medium kallas spektrofotometer, och den arbetar
p fljande stt. Ljus frn en lampa, deuteriumlampa fr UV-omrdet, volframlampa fr
det synliga omrdet, passerar en monokromator, ett spegelsystem med ett gitter, som
delar upp ljuset i olika vglngder. Beroende p hur gittret vrids kan en spalt vlja ut en
ljusstrle med specifik vglngd. Denna monokromatiska ljusstrle trffar drefter
kyvetten, som r en noggrant tillverkad behllare av kvarts, glas eller plast.
Kvartskyvetter r dyrbara men kan anvndas fr bde UV-ljus och synligt ljus medan de
billigare kyvetterna av glas bara fungerar i det synliga omrdet. Numera finns
plastkyvetter som kan anvndas ner till 260 nm. Den utgende strlen registreras av en
ljusknslig fotomultiplikator, som avger en spnning proportionell mot ljusstrlens
intensitet. Spnningen rknas om och presenteras som ett absorbansutslag
(transsmittansutlsag), digitalt eller p en skrivare.
Spektrofotometrar r ofta av dubbelstrletyp (splitbeam), dvs en ljusstrle med en viss
vglngd skickas vxelvis genom referenskyvett och provkyvett. Detta sker med hjlp av
choppern, en roterande skiva med omvxlande genomskinliga sektorer och
spegelsektorer. I detta fall mts absorbansskillnaden mellan kyvetterna. Numera finns
14

ven enkelstrliga instrument, som med hjlp av datateknik kan justera fr referensens
absorbans.
Om man vill flja en enzymatisk reaktion, dr inte bara substrat eller produkt utan ocks
reaktionsmediet absorberar, kan mediets absorbans subtraheras bort genom att man fyller
bde prov- och referenskyvett med mediet och nollstller fotometern innan frsket. Den
absorbanskning som sedan registreras beror enbart p den reaktion man vill mta.

15

Preparation av hemoglobin med hjlp av gelfiltrering

Teori
Vid preparation av ett protein anvnds en rad olika metoder fr att specifikt rena fram det
nskade proteinet. I vrt fall ska hemoglobin frn ntblod isoleras med hjlp av
centrifugering, utsaltning och gelfiltrering. Efter reningen registreras proteinets
absorption fr att mngden preparerat hemoglobin ska kunna berknas.
I blod finns hemoglobin, Hb, i de rda blodkropparna, erytrocyterna, vilka omges av ett
semipermeabelt membran. Hemoglobin kan drfr ltt separeras frn proteinerna i
blodplasman genom nedcentrifugering av blodkropparna. Fr att frbttra reningen
tvttas blodkropparna med 0.9 % (isoton) NaCl-lsning. Det r mycket viktigt att denna
lsning har rtt salthalt. Om koncentrationen av NaCl r fr lg sker hemolys, dvs.
vattnet trnger in genom membranet fr att utjmna skillnaden i koncentration, varvid
blodkroppen sprngs. Detta utnyttjas senare under preparationen fr att frigra
hemoglobin ur de tvttade erytrocyterna. Om NaCl-koncentrationen r fr hg,
skrumpnar cellerna d vatten gr ut genom membranet.
Proteiner i vattenlsning r hydratiserade. Genom tillsats av stora mngder salt kan detta
konkurrera med proteinet om vattnet, varvid proteinerna bildar strre aggregat, som inte
lngre kan vara i lsning. Salter med envrda an- och katjoner, t.ex. KCl, r ganska
ineffektiva vid utfllning av proteiner, medan de med hgre valens, t.ex. (NH4)2SO4, ger
mycket hgre jonstyrkor och vanligen r mycket effektiva som fllningsmedel.
Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4) r ett salt som ofta anvnds vid proteinutfllning bl.a. p
grund av sin stora lslighet. En mttad lsning av (NH4)2SO4 har koncentrationen 4 M.
Vid tillsats av 385 mg (NH4)2SO4 per ml hemolysat kommer hemoglobinet att falla ut.
Vissa mer lsliga proteiner blir dock kvar i saltlsningen. Genom centrifugering kan
hemoglobin separeras frn dessa. Fllningen lses i vatten infr det sista reningssteget d
hemoglobinet ska separeras frn kvarvarande proteinfroreningar och frn saltet med s.k.
gelfiltrering.
Gelfiltrering r en metod, med vilken man kan separera freningar med avseende p
storlek och form. Gelen bestr av en tvrbunden glukospolymer, som r formad till sm
kulor. Graden av tvrbundenhet, dvs. porstorleken, och kulornas storlek kan varieras.
Molekyler, som r strre n de strsta porerna i gelen, kan inte penetrera gelpartiklarna.
De passerar drfr genom gelbdden med den rrliga fasen utanfr partiklarna och
elueras med den s.k. voidvolymen, mellanrumslsningen. Mindre molekyler trnger
dremot in i gelpartiklarna och retarderas (bromsas) i olika grad beroende p storlek och
form. Molekyler elueras drfr i ordning efter minskande molekylstorlek och kan samlas
upp i fraktioner, helt eller delvis separerade frn varandra.

16

I vrt fall kommer de stora hemoglobinmolekylerna (M=64 500 g/mol) inte att
retarderas.utan att flja med voidvolymen, medan de sm jonerna bromsas kraftigt vid
passage genom gelen.

Material
Blod
Slangklmmor
Graderade centrifugrr av plast
0.1 M KCl
Bordscentrifug
Gelmassa (Sephadex G-50 medium)
Pasteurpipetter, nappar
Kolonner+tillbehr
0.9 % NaCl
Mttad Ba(NO3)2
(NH4)2SO4(s)
Stativ, muffar, klmmare
Spatlar
Tejp
Vgskepp
Eppendorfrr
Mtglas
Bgare

Moment som utfrs i frvg av handledare:

Sephadex G-50 Medium fr svlla p kokande vattenbad i 0.1 M KCl under 15 minuter
eller i rumstemperatur under 3 timmar. Bddvolymen i frdigsvlld Sephadex G-50 r ca
10 ml/g torr gel. Gelen fr sedimentera och dekanteras ngra gnger fr att avlgsna sm
partiklar, som annars kommer att tppa till gelen, varvid fldeshastigheten minskar.
Gelen frvaras i 0.1 % azidlsning i kyl. Vid anvndning ska den vara rumstempererad
och drefter avluftad ca 10 minuter i sugkolv. Kolonner frsedda med glasfilter br
syradiskas och ultraljudbehandlas efter anvndning.
Lsningar som grs i frvg av handledare:
0.1 M KCl
0.9 % NaCl
mttad Ba(NO3)2

17

Utfrande
Packning av kolonn
Den svllda gelen ska packas i en glaskolonn med 1 cm diameter. Montera kolonnen
vertikalt och stng utloppet. Hll i av den uppslammande gelsuspensionen (grs av
handledare). ppna kolonnen och tillfr ekvilibreringslsning (0.1 M KCl) med hjlp av
en hvert (fldeshastighet ca 1 ml/min).
Nr gelen har sedimenterat frdigt, ska den vara fri frn luftbubblor. Lt
ekvilibreringslsning droppa igenom kolonnen under ca en halvtimme, s att gelen blir
ekvilibrerad och klar fr anvndning.
OBS! Gelen fr aldrig torrlggas, d tappar den sin separationsfrmga.
Nr laborationen r slut tms kolonnen med hjlp av tryckluft. Be din handledare om
hjlp med detta.
Preparation av hemoglobin ut helblod
Under tiden gelen ekvilibreras pbrjas preparationen av hemoglobin enligt
reningsschemat nedan.
1.5 ml helblod i ett graderat centrifugrr finns frberett. Centrifugera (vikta rren!) och
avlgsna supernatanten med en pasteurpipett. Undvik att blsa bubblor i lsningen. Rr
frsiktigt upp blodkropparna i isoton NaCl-lsning genom att frsiktigt vnda rret.
Centrifugera och avlgsna supernatanten.
Uppskatta volymen blodkroppar och tillstt dubbel volym avjonat vatten fr att
hemolysera blodkropparna. Vnd rret fr att blanda.
Vg upp 385 mg (NH4)2SO4(s) per ml hemolysat och tillstt detta till provrret med
hemoglobin. Blanda ordentligt s att allt salt verkligen lser sig. Centrifugera och
avlgsna supernatanten.
Uppskatta volymen utfllt protein. Ls fllningen i tre delar vatten. Centrifugera ner
denaturerade proteiner och andra olsliga rester. Denna ska genomg gelfiltrering fr att
avsalta och rena hemoglobin.

18

Reningsschema

19

Gelfiltrering
Lt ovanlsningen p kolonnen droppa ur s att vtskan kommer i samma niv som
gelytan. Stng kolonnen.
Applicera frsiktigt 0.5 ml av den rda proteinlsningen p toppen av gelen med hjlp
av en pasteurpipett. ppna kolonnen och lt provet sjunka in till i niv med gelen. Stng
kolonnen. Gr om proceduren, men med elueringsmedel (0.1 M KCl) i stllet fr
proteinlsning, fr att tvtta in provet.
Fyll kolonnen med KCl-lsning utan att gelen rrs upp. Justera fldeshastigheten till ca
0.5 ml/min. Anteckna hur stor volym (voidvolymen) som samlats upp nr det rda
hemoglobinet nrmar sig utloppet. Fortstt sedan uppsamlandet i 1.5 ml Eppendorfrr i
fraktioner om 1 ml. Fortstt eluera till minst 2 frglsa fraktioner erhlls. Drefter mts
absorbansen p fraktionerna.
Absorbansmtning och pvisande av NH4SO4
Bestm absorbansen vid 544 nm fr de rda fraktionerna. Hll tillbaka proven i resp.
Eppendorfrr. Om absorbansen r hgre n 1.5 mste en del av provet spdas med
avjonat vatten (exakt spdning med hjlp av mtpipett). Pvisa drefter sulfatjoner i alla
fraktioner utom den med hgst absorbans genom att tillstta en droppe mttad Ba(NO3)2lsning i varje rr. Anteckna i vilka rr det blir fllning.
OBS! Ba(NO3)2 r giftigt! Hanteras frsiktigt och endast p anvisad plats.
544 nm = 14 480 M-1cm-1

M = 64 500 g/mol

Toppfraktionen mrks upp enligt:

namn (initialer eller dylikt)
datum
innehll
koncentration eller uppmtt absorbans
Lmna toppfraktionen till handledaren fr senare reningsanalys med SDS-PAGE.
Ett kromatogram ska konstrueras utifrn absorbansvrdena. Avstt hemoglobinets
absorbans mot elueringsvolym i ml. Ta hnsyn till eventuell spdning av proverna genom
att multiplicera det avlsta absorbansvrdet med spdningsfaktorn. Ange ocks p
lmpligt vis i vilka fraktioner (NH4)2SO4 terfanns. Voidvolymen ska ing i
kromatogrammet.

20

Bestmning av ett proteins molekylvikt och renhet med SDS-PAGE

Denna laboration gr ut p att bestmma molekylvikten fr ett protein genom att
analysera det med sodiumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektrofores, SDS-PAGE. Detta
r en mycket vanlig metod fr bestmning av ett proteins renhet. SDS-PAGE anvnds
ocks fr att bestmma ett proteins molekylvikt. Som referenser vid analysen anvnds ett
antal proteiner med knda molekylvikter. Gelfiltrering kan ocks anvndas fr detta
ndaml.
Elektrofores bygger p att laddade molekyler vandrar mot en av elektroderna d de
placeras i ett elektriskt flt. Polyakrylamidgel r en polymerisationsprodukt av akrylamid
och en frgrenare som kallas N,N-metylenbisakrylamid. Vid polymerisationen erhlls ett
kontinuerligt, tredimensionellt ntverk genom att vxande polyakrylamidkedjor binds
samman av bisakrylamiden. Fr att akrylamid ska polymerisera mste katalysatorer
anvndas s att fria radikaler bildas, vilka initierar reaktionen. Vanligen utnyttjas en
blandning av ammoniumperoxodisulfat ((NH4)2S2O8) och tetrametyletylendiamin
(TEMED) fr detta ndaml.
Polyakrylamidgelens tredimensionella och kontinuerliga ntverk har en bestmd
porstorlek och kommer i viss mn att hindra stora och avlnga molekylers vandring.
Vandringshastigheten r dessutom beroende av molekylernas nettoladdning. Proteinernas
nettoladdning beror p buffertens pH. Om t.ex. pH > pI (isoelektriska punkten fr
proteinet) r nettoladdningen negativ. Polyakrylamidgelelektrofores, PAGE, separerar
allts molekyler efter laddning, storlek och form.
Nr ett protein behandlas med SDS (sodiumdodecylsulfat) som r en detergent, frstrs
sekundr-, tertir- och eventuell kvartrstruktur, och en cigarrformad peptidkedja med
negativ nettoladdning bildas. Nettoladdningen r direkt proportionell mot proteinets
storlek och laddningsttheten blir densamma i alla protein-SDS-komplex. Detta leder till
att komplexen fr en elektroforetisk mobilitet som r omvnt proportionell mot
logaritmen fr molekylvikten, d.v.s. de mindre proteinerna vandrar snabbare n de strre.
Fr att bryta disulfidbryggor och fr att frhindra att nya bildas behandlas proteinerna
dessutom med -merkaptoetanol.
Fr bestmning av ett proteins molekylvikt anvnds ett antal referensproteiner med knda
molekylvikter vid analysen, en s kallad molekylviktsstandard. Dessa appliceras i en
separat brunn, men p samma gel som proteinet med oknd molekylvikt. Lmplig mngd
att applicera i en brunn r 10 g protein i 25 l lsning. Tnk p att slutvolymen i ert
beredda eppendorfrr med Hb blir ca 50 l nr provbuffert, -merkaptoetanol och
bromfenolbltt tillsats!
P denna laboration kommer frdiggjutna geler att anvndas. Det gr bra att gjuta
gelerna sjlv, men man mste d hantera de hlsovdliga kemikalierna, akrylamid och
bisakrylamid, i dragskp. Se riskanalysprm.

21

Molekylviktsstandarden innehller:
Fosforylas b
Serum albumin
Ovalbumin
BCAII
Trypsinhmmare
-laktalbumin

97000 g/mol
66000 g/mol
45000 g/mol
30000 g/mol
20100 g/mol
14400 g/mol

OBS! De oknda proteinerna (anonyma provet) behver inte vara samma som
referensproteinerna.

Lsningar
Fljande lsningar finns frdiga i dragskpet.

Elektrodbuffert:

30.3 g Tris, pH 8.3

144.0 g Glycin
10.0 g SDS
Avjonat vatten till 1000 ml utan att justera pH. Frvara vid + 4oC.
Spd 10 gnger fre anvndning. Blanda noga.

Provbuffert:

3.55 ml Avjonat vatten

1.25 ml 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8
2.5 ml Glycerol
2.0 ml 10% (w/v) SDS

Bromfenolbltt:

ca 0.05 g Bfb
100 ml avjonat vatten
filtrera lsningen

Infrgningslsning:

Safe stain, 1 l
0,1 g Coomassie Blue
35 mM HCl
10% EtOH
Tillstt Coomassie till ca 900 ml dest.vatten. Tillstt HCl. Tillstt
EtOH. Volymjustera. Stt p omrrning ver natt i rumstemp.
Kan teranvndas 3 gnger.

22

Bereds vid labtillfllet:

Beredning av hemoglobinprov:

40 l provbuffert
X l hemoglobinlsning (rdgr med
labhandledare)
2 l -merkaptoetanol
10 l bromfenolbltt
Blanda i ett Eppendorfrr och gr hl i locket
med en blyertspenna eller kanyl. Vrm p
kokande vattenbad i 5 minuter.

Beredning av anonymt prov:

40 l avjonat vatten
40 l provbuffert
10 l proteinlsning (anteckna provets nr o frg)
2 l -merkaptoetanol
10 l bromfenolbltt
Blanda i ett Eppendorfrr och gr hl i locket
med en blyertspenna eller kanyl. Vrm p
kokande vattenbad i 5 minuter.

Ta frsiktigt bort den vita tapen och kammen frn kassetten. Spara kammen, den ska
anvndas senare. Sklj brunnarna med elektrodbuffert. Placera kassetten i kassetthllaren.
Fyll de tv buffertkamrarna med elektrodbuffert. (Grs av labhandledare) Applicera
prover och referens med automatpipett. En brunn rymmer max 30 l.
Starta och kr elektroforesen vid 200 V. Avbryt krningen nr banden med
bromfenolbltt har vandrat till slutet av gelen.
Efter avslutad elektrofores, lossa kassetten frn kassetthllaren. ppna kassettens sidor
genom att fra in och frsiktigt vrida kammens spets i var och en av inskrningarna i
sidorna. Hll plastskivan med gelen upp och ner ver en skl med avjonat vatten. Lossa
frsiktigt gelen med en spatel s att den trillar ner i sklen. Sklj gelen genom att micra i
lite avjonat vatten. Den ska bli ordentligt varm dock utan att koka. Upprepa 3 ggr och byt
vatten mellan varje. (Grs av labhandledare) Hll av vattnet efter sista vrmningen och
hll p Safe stain s att det tcker gelen ordentligt. Micra. Lt st ver natt.
Fr att avfrga gelen hll av Safe stainlsningen. Sklj gelen med avjonat vatten ett par
gnger. Till sist hll p avjonat vatten s att gelen vl tcks och lgg i en bit av en
papperservett (suger t sig frgen). Lt st ver natt eller lngre.
Stll sklen med gelen p en ljusramp och mt hur lngt referensproteinerna,
hemoglobinet frn gelfiltreringen samt det anonyma proteinet har vandrat. Konstruera ett
23

diagram dr vandringslngderna fr referensproteinerna avstts mot log M. Avls frn

diagrammet molekylvikten fr hemoglobin och fr det anonyma proteinet. Av olika
anledningar kan ett protein ibland uppvisa flera band.
Molekylvikt fr hemoglobin: 64 500 g/mol

Redovisning
Enligt anvisningar tidigare i kompendiet. Dessutom ska fljande ing:
1. Kromatogram, kommentera separationen.
2. Berkning av koncentrationen Hb i supernatanten som applicerades p gelen i
mg/ml.
3. Noggrant avritad eller fotograferad gel. Mrk ut vilka brunnar som tillhr
labgruppen.
4. Kommentera Hb:s renhet.
5. Log-diagram
6. Berkning av molekylvikt fr preparerat Hb och fr anonyma proteinet (ange
vilket nummer det hade). Jmfr med litteraturvrden och kommentera.
Utfrlig jmfrelse mellan SDS-PAGE och gelfiltrering med avseende p
molekylviktsbestmning. Utg frn teorin bakom teknikerna

24

LINKPINGS UNIVERSITET
IFM/Kemi

061017

KALIBRERING AV AUTOMATPIPETT

INTRODUKTION
I denna laboration ska du lra dig hantera ett volumetriskt instrument, automatpipetten,
p rtt stt. Fr att veta om de instrument du anvnder verkligen visar korrekt vrde och
ger den nskade volymen, mste du kalibrera dessa.
De kalibrerade pipetterna kommer du bl.a. att anvnda under spektrofotometermoment.
TEORI
Automatpipetterna kan antingen ha fast volym eller variabel volym. De variabla arbetar i
olika intervall frn 0 upp till 10 000 l, t.ex. 0,5 - 10 l, 5 - 40 l, 200 1000 l. Efter
instllning av volym (de variabla modellerna), lser man vanligen instllt vrde.
Vid varje mttillflle frses automatpipetten med en plastspets. Allmnt gller att bl
spetsar passar till pipetter i intervallet 100 1000 l, gula spetsar till 1 - 100 l. Det finns
dock flera olika typer av bl och gula spetsar, s man br frskra sig om att spetsarna
verkligen passar till den pipett man ska anvnda.
Spetsar utgr en stor kostnad p lab. Det gr att spara spetsar, om man planerar sitt
experiment. Vid t.ex. pipettering av spdningsserier pipetterar man den mest utspdda
lsningen frst. Drigenom kan man anvnda samma spets flera gnger.
HANDHAVANDE
Automatpipetter r dyrbara precisionsintrument och mste behandlas varsamt. Om de
utstts fr slag och sttar kan man inte lita p att de ger avsedd volym. En pipett med
vtska i spetsen ska aldrig lggas ner. Vtskan kan rinna in och frstra den. Om man
misstnker att vtska kommit in i pipetten, ska man lmna den till labhandledare fr
rengring .

25

PIPETTERINGSTEKNIK
1.

Fst en spets, som passar den volym du ska pipettera, p pipetten. Berr bara den
vre delen av spetsen fr att undvika kontamination.

2.

Fatta pipetten s att du med tummen, mjukt och kontrollerat, kan trycka ner kolven
p pipettens ovansida. Tryck ner till frsta stoppet och hll kvar i detta lge.

3.

Fr ner spetsen ngra millimeter i lsningen och slpp lngsamt och frsiktigt upp
kolven. Vnta ngon sekund och kontrollera att inga luftbubblor finns i
vtskepelaren.

4.

Lyft upp pipetten och stryk av tippen mot krlvggen. Om spetsen varit lngt under
vtskeytan, br den torkas av med Kleenex.

5.

Fr ner spetsen i det krl dit lsningen ska verfras. Om pipetteringen sker till en
vtska, br spetsen snkas ner ngra millimeter i denna. Tryck ner kolven till frsta
stoppet och sedan till andra fr att tmma spetsen helt.

6.

Hll kolven nedtryckt och dra upp spetsen ur lsningen.

7.

Skjut av spetsen med spetsavkastaren (finns p de flesta automatpipetter).

KALIBRERING
Innan automatpipetter anvnds, br man frskra sig om att de ger rtt volym. Tyvrr r
detta ett problem, och det har frstrt mnga experiment.
Vid kalibrering av pipetter anvnder man analysvg och avjonat vatten och vger den
volym man pipetterat. Vanligen kalibrerar man en variabel pipett vid den undre och vre
grnsen fr dess kapacitet. Fr att f tillfrlitliga vrden br man gra detta ett antal
gnger fr varje volym. Detta ger en uppfattning om den slumpmssiga variationen i
pipetteringarna.
KALIBRERINGSTEKNIK
Labhandledaren visar dig frst, hur du hanterar en automatpipett. Drefter kalibrerar du
en pipett avsedd fr volymer i intervallet 40 200 l. Gr minst 5 invgningar av avjonat
vatten fr pipettens strsta resp. minsta volym. Vg p analysvg i liten E-kolv (< 50 ml)
eller i vgskepp. Anteckna mtvrdena i tabellen nedan och kontrollera att det hgsta och

26

det lgsta vrdet i en mtserie inte skiljer sig mer n 1 % frn varandra, d.v.s. 0.4 mg (0.4
l) resp. 2.0 mg (2.0 l). Lmna in tabellen med grnt frsttsblad.

AUTOMATPIPETT NUMMER:

40 l

200 l

EV. KOMMENTARER TILL HUR PIPETTEN FUNGERAR:

27

% skillnad mellan hgsta

och lgsta

LINKPINGS UNIVERSITET
IFM/Kemi

120509

ALKOHOLDEHYDROGENAS
BESTMNING AV REAKTIONSHASTIGHETEN

INLEDNING

Alkoholdehydrogenas, ADH, r ett enzym som innehller zink, och som i nrvaro av
koenzymet NAD+ reversibelt oxiderar primra och sekundra alkoholer till motsvarande
aldehyder och ketoner. ADH finns i bakterier, jst, vxter och i lever och nthinna hos
djur. Jstenzymet har praktisk betydelse vid alkoholjsning och bakning. I levern
katalyserar ADH tillsammans med andra mekanismer nedbrytningen av etanol. Det ADH
som finns i nthinnan har till funktion att reducera retinal till retinol (vitamin A). P s
stt regenereras det pigment som krvs vid synprocessen.
Alkoholdehydrogenas frn jst har en molekylvikt p 150 000 och bestr av fyra
identiska subenheter (peptidkedjor). Det katalyserar oxidationen av etanol men ven av
andra alkoholer, t.ex. propanol, butanol och metanol. Reaktionshastigheterna fr
oxidation av de tre sistnmnda alkoholerna r lgre n 50 % av den fr etanol.

TEORI
Fljande reaktion ska studeras: R-CH2OH + NAD+ R-CHO + NADH + H+
NAD+, fungerar som acceptor fr elektroner i form av hydridjoner och r ndvndig fr
enzymets funktion. Till skillnad frn NAD+ absorberar NADH ljus av vglngden 340
nm, och reaktionen kan drfr fljas med en spektrofotometer. Eftersom 1 mol alkohol r
ekvivalent med 1 mol NADH, r absorbansfrndringen per tidsenhet ett direkt mtt p
reaktionshastigheten, v. Reaktionshastigheten ska anges som antal mol substrat
(alkohol) som oxideras per minut, och kan berknas med Lambert-Beers lag:
A = .l .c
A / t = . l . c / t
v = reaktionsvolymen . c / t = reaktionsvolymen . A / t . . l
fr NADH vid 340 nm r 6.22 . 103 M-1 cm-1, l r 1 cm.
28

MATERIAL
Spektrofotometer och kyvetter
0.1 M pyrofosfat-glycinbuffert, pH 9.0. 0.5 g glycin / 300 ml buffert. Justera pH med
HCl. Frvara i rumstemperatur.
0.1 M NAD+ lst i bufferten. Frvara i isbad.
Etanol 95 %
Metanol pa
Butanol pa
Propanol pa
ADH-lsning: Spd jst-ADH (Roche 1g/34 ml 10127558001) med buffert till 0,1 mg
ADH/ml. Gr spdningen samma dag som laborationen gr och frvara lsningen i isbad.
Pipetter och tippar

UTFRANDE
Nollstll spektrofotometern vid 340 nm och med knsligheten 0-1 absorbansenheter.
Anvnd pyrofosfat-glycinbufferten som referensmedium.
a) Pipettera i kyvetten: buffert till 3 ml slutvolym
25 l NAD+
25 l EtOH
Blanda m.h.a. parafilm och torka av kyvetten med en nsduk. Stll ner kyvetten i
fotometern och tryck p START. Registrera ev. reaktion utan katalysator. Om den
uteblir, behver den inte kontrolleras i fortsttningen, men blanda nd noga fre
tillsats av ADH.
Blanda i en ny kyvett enligt a) frst och tillstt sedan 10 l ADH. Blanda snabbt och
stll tillbaka kyvetten i fotometern. Registrera absorbansfrndringen under s lng
tid att en tangent kan dras till kurvan. Tm kyvetten och sklj noga, annars kan rester
av alkohol bli kvar. Upprepa frsket ngra gnger fr att kontrollera att det gr att
f reproducerbara vrden.
Tm och sklj kyvetten. Upprepa med 25, 50, 75 resp. 100 l ADH. Ett frsk per
volym.
b) Enligt a) men tillstt 25 l propanol i stllet fr etanol. Dessa frsk grs med 100
l ADH.
Upprepa med 25 l butanol resp. metanol.

29

RESULTAT

Substrat
a) etanol
------

ADH
(l)
0
10
25
50
75
100

b) propanol
butanol
metanol

100
100
100

ADH
(mg)

A / t
-1

(min )

v
(mol / min)

v 100/v etanol
------------------------------100 %
%
%
%

Avstt v (mol/min), med etanol som substrat, mot mg ADH, ven fr frsket utan
enzym, i ett diagram ritat p dator eller mm-papper.

c) Para ihop fljande ordpar :

Enzym
Substrat
Kofaktor
Produkt

Aldehyd
ADH
Alkohol
NAD+

REDOVISNING
Enligt allmnna regler fr rapportskrivning. Ifylld tabell och diagram ver
reaktionshastigheten som funktion av enzymmngden ska ing. Glm inte att ange
enheter. Redovisa svar frn uppgift c.

30

LINKPINGS UNIVERSITET
IFM/Kemi

TENTAMEN I BIOKEMI 1
NKEA08, 92KE21, 92KE27, 9KE321,
9KE361
2012-12-21 kl. 08.00-12.00

Skriv endast en uppgift per blad.

Redovisa berkningar och motivera svar.
Besvara delfrgor i tur och ordning.
Hjlpmedel: minirknare

Ansvariga lrare: Magdalena Svensson (285686, 0704-090999)

och Anki Brorsson (286648, 0762-209433)

31

1.a) Rita fljande tetrapeptid: Phe-Val-Met-Asn vid pH 7. Rita/markera huvudkedja,

sidokedjor, -kol, N- och C-terminal. Ange ven vilken nettoladdning tetrapeptiden har
vid pH 7.
(4p)
b) Rita tv H-bindningar; en som r en del av sekundrstrukturen och en annan som r en
del av tertirstrukturen.
(4p)
c) Sekundrstruktur i proteiner bestr av helixar och flak. Ange tv skillnader mellan
dessa strukturtyper.
(2p)

2.a) Med avseende p vad sker separationen av proteiner i fljande tekniker?

i) gelfiltreringskromatografi
ii) affinitetskromatografi
iii) jonbyteskromatografi

(3p)

b) Vilken r den principiella skillnaden mellan PAGE och SDS-PAGE samt vilka
konsekvenser fr det fr din analys av resultatet?
(2p)
c) Du har en peptid, Ala-Trp-Ser-Phe-Lys-Met-Glu-Arg-Gly, till vilken du tillstter
trypsin. Vad blir resultatet?
(2p)
d) Du funderar nu p att gra ngra olika mutanter av trypsin (ett vattenlsligt globulrt
protein).
i) I trypsins aktiva yta finns en Ser. Vilken aminosyra br du byta till om du vill ha
en s liten pverkan av proteinaktiviteten som mjligt? Motivera!
ii) P ytan av trypsin finns en cis-Pro. Vilken aminosyra br du byta till om du vill
ha en s stor pverkan av proteinaktiviteten som mjligt? Motivera!
iii) I det inre av trypsins struktur finns en Leu. Vilken aminosyra br du byta till fr
att det ska blir en s liten pverkan som mjligt av proteinaktiviteten?

(3p)

3. a) En enzymkatalyserad reaktion pverkas bland annat av temperaturen. Beskriv,

schematiskt, hur du skulle kunna g till vga fr att bestmma den optimala temperaturen
32

fr ett visst enzym (dvs den temperatur dr enzymet uppvisar hgst aktivivitet).
(3p)

b) Frklara fljande tv begrepp:

i) zymogenaktivering
ii) allosterisk kontroll

(4p)

c) ATP-syntas r ett multienzymkomplex som katalyserar ATP-syntes.

i) Var i cellen sker syntesen?
ii) En sidokedja till Asp hos ATP-syntas spelar en viktig roll, vilken?
(3p)
4. a) Glykolysens slutprodukt r pyruvat. Vad kan ske med pyruvat under anaeroba
frhllanden och hur mycket ATP bildas d en glukosmolekyl bryts ner under anaeroba
frhllanden?

(2p)

b) Omvandlingen frn fosfoenolpyruvat till pyruvat r det sista steget i glykolysen och
den omvnda reaktionen r inledningen p glukoneogenesen. Beskriv vad som skiljer
dessa reaktioner t och varfr detta r viktigt.

(3p)

c) Nmn tv metaboliter som kan fungera som ingngsmnen fr glukoneogenesen.

(1p)

d) Pyruvatdehydrogenaskomplexet r ett viktigt kontrollenzym fr citronsyracykeln.

Vilken reaktion katalyseras av pyruvatdehydrogenaskomplexet?

(1p)

e) Hur pverkas aktiviteten hos pyruvatdehydrogenaskomplexet om koncentrationerna

nedan gller? (motivera ditt svar)

(2p)

[NADH] > [NAD+]

[AcetylCoA] > [CoA]
[ATP] > [ADP]
f) Vilka tv viktiga syften har citronsyracykeln?

(1p)

5. Nedbrytning och syntes av fettsyror regleras hormonellt av glukagon och insulin

genom kovalent modifiering av enzymerna acetylCoAkarboxylas och lipas
a) Vilka reaktioner katalyseras av dessa enzymer?

33

(2p)

b) Vilken form av kovalent modifiering r det som sker?

c) Hur regleras enzymerna av respektive hormon (aktiveras eller inhiberas)(motivera)?
d) I en hlsokostaffr sldes chokladbitar med tillsats av karnitin. Ge en biokemisk
motivering till varfr tillverkaren anser att det r vettigt att tillstta karnitin i chokladen.
(Om karnitin administrerad p detta stt verkligen har ngon effekt frblir osagt).

(1p)
(4p)

(2p)

6. Fljande steg sker vid fettsyranedbrytningen

Oxidation
Hydratisering
Oxidation
Klyvning
a) I vilken sorts reaktion genereras NADH och FADH2

(1p)

b) Via andningskedjan genereras ATP frn NADH och FADH2. Varfr erhlls mer ATP
frn NADH jmfrt med FADH2

(4p)

c) Varfr fs en mindre mngd ATP vid nedbrytning av omttade fettsyror?

(1p)

d) DNA och RNA r uppbyggda av nukleotider som r kopplade till varandra via en 3,5
fosfodiesterbindning. Vad str 3 och 5 fr i en 3,5-fosfodiesterbindning?

(1p)

e) Vad innebr att replikationen r semikonservativ?

(1p)

f) Vilka r de vanligaste typerna av RNA och vilka funktioner har de?

(3p)

34