Rettet Rapport Igen

Isolering af genet Asb11 og
transformering af celler
Underviser: CAAN
Dato for udfrelse:
Hold: Anita, Malene og Mette D
Dato for aflevering af rapport:
Underskrifter:
Punkterne herunder er forbeholdt underviseren.

Dato for tilbagelevering:
__________________________________________________________________
Dato for eventuel genaflevering:
____________________________________________________________
Dato for godkendelse:
____________________________________________________________________
Anita N
Mette D
Malene H
Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Indholdsfortegnelse
Forml............................................................................................................................ 4
Teori................................................................................................................................ 4
Alkalisk phosphatase ved coomassie, bradford og westernblot..................................4
Undersgelse af ASB11-GFP i Westernblot..................................................................5
Lysering af humane celler........................................................................................ 6
Proteiner................................................................................................................... 6
SDS-page................................................................................................................. 7
Coomassie farvning.................................................................................................. 9
Bradford metoden.................................................................................................... 9
Western blotting..................................................................................................... 10
Protein oprensning via beads.................................................................................... 12
Celledyrkning af U2OS.............................................................................................. 12
Transfektion............................................................................................................... 14
Transformation.......................................................................................................... 15
Kloning af humant Asb11 via Polymerase Chain reaction (PCR)................................17
PCR........................................................................................................................ 17
Skring af DNA med restriktionsenzymer.............................................................18
Gelelektroforese..................................................................................................... 19
Fremgangsmde........................................................................................................... 20
Alkalisk phosphatase i western blotting....................................................................20
Asb11-GFP i western blotting.................................................................................... 24
Celledyrning af U2OS................................................................................................ 26
Transfektion............................................................................................................... 27
Calcium kompetente celler........................................................................................ 28
Transformation.......................................................................................................... 29
Kloning af humant Asb11.......................................................................................... 31
Reagenser og materialer.............................................................................................. 33
Delforsg - Bovint Alkalisk phosphatase enzymkinetik.................................................36
Teori.......................................................................................................................... 36
Enzymer................................................................................................................. 37
Fremgangsmde........................................................................................................... 40
Reagenser og materialer.............................................................................................. 40
Resultatbehandling....................................................................................................... 41
Side 2 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Alkalisk phosphatase i western blotting....................................................................41

-
Western blot........................................................................................................ 41
-
Bradford metoden og coomassiefarvning........................................................41
Sammenligning af de to resultaterne........................................................................42
Asb11-GFP i western blotting.................................................................................... 43
Protein oprensning via beads................................................................................43
Tranformation............................................................................................................ 44
Kloning af humant Asb11.......................................................................................... 45
Delforsg:.................................................................................................................. 48
Alkalisk phosphatase enzymkinetik........................................................................48
Rkke 1................................................................................................................. 48
Rkke 2................................................................................................................. 49
Diskussion.................................................................................................................... 52
Konklusion.................................................................................................................... 52
Side 3 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Forml
Formlet med velserne er at klone genet der koder for humant Asb11, ved hjlp af
PCR. Herefter gres E.coli celler kompetente ved CaCl 2-behandling, og disse
transformeres med en vektor der indeholder genet. E.coli cellerne opformere plasmid
DNA med det klonede gen, som bruges til transfektion af U2OS celler. Disse skal dog
frst dyrkes. Bagefter lyseres U2OS cellerne, og proteinekspressionen af Asb11-GFP
undersges ved coomassiefarvning og westernblot at SDS-page gelen. Ydermere
undersges stabiliteten af alkalisk phosphatase ved forskellige lyseringsmetoder af
U2OS celler. Alkalisk phoshatases aktivitet undersges ogs ved enzymkinetik, og om
de pvirkes af co-faktorer og inhibitorer.
Teori
Alkalisk phosphatase ved coomassie, bradford og westernblot
Alkalisk phosphatase er et enzym der findes i bde mennesker og bakterier. Enzymet
udtrykkes i alle celler i mennesket, men specielt meget i knoglemarven. U2OS celler er
velegnet nr man vil undersge dette protein, da disse er cancerceller fra benvv. Det
er derfor relativ let at hste proteinet fra disse celler. For hje eller for lave
koncentrationer af proteinet i mennesker, kan tyde p sygdom. Da alkalisk
phosphatase udtrykkes specielt meget i leveren og knoglemarven, kan for hje
koncentrationer tyde p problemer i leveren og knoglerne. For lave vrdier kan tyde
p zinkmangel, da alkalisk phosphatase har dette som co-faktorer. Som navnet
antyder, fungere alkalisk phosphatase bedst ved en hj pH, dog er der en lille forskel
p alkalisk phophatase i mennesker og bakterier. I bakterier er optimum pH omkring 8,
mens optimum i mennesker er omrking 9,8. Alkalisk phosphatase har brug for cofaktorer for at fungere, disse co-faktorer er zink og magnesium. Ydermere er alkalisk
phophatse en di-mer, hvilket betyder at der skal sidde to sammen for at vre aktiv.
Figur 1 Dephospholyrering med alkalisk phosphatase
Side 4 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Proteinet vejer 57 kD, men sat sammen med en anden vejer det 114 kD. Man kunne
derfor tro at det vil migrere til 114 kD p en SDS-page gel, men dette er ikke tilfldet.
Under behandlingen med SDS vil de adskilles, og man vil f to bnd ved 57 kD.
Alkalisk phosphatase kan dephospholyrere andre molekyler, det vil sige at enzymet er
i stand til at fjerne en phosphat-gruppe fra et molekyle. Dette bruges mange steder i
genteknologien fx nr man vil indstte et gen i et plasmid. Her dephosphorlyrere
plasmidet (vektoren) s den ikke lukker sig sammen. Det nskede gen m ikke vre
dephosphorlyreret, da det i s fald ikke vil vre i stand til at klistre sig sammen med
plasmidets ender.
Stabiliteten af dette protein vil blive undersgt ved to forskellige lyseringsmetoder, 2X
LSB og Trition-x-100. 2X LSB bufferen er en mildere buffer end Triton-x-100, og
proteinet vil med 2X LSB vre mere beskyttet end ved Triton-x-100. Proteinerne vil
herefter blive undersgt, frst ved adskillelse med SDS-page. Herefter vil halvdelen af
gelen coomassie farves, hvor alle proteiner vil blive farvet. Her vil der ogs vre en
standard af alkalisk phosphatase, s bndene kan sammenlignes. Den anden halvdel
vil blive undersgt ved western blotting, hvor det specifikke protein enten pvises eller
afvises. Lysatet fra Triton-x-100 prven, vil blive undersgt for indhold af alkalisk
phophatase ved bradford metoden.
Side 5 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Undersgelse af Asb11-GFP i Westernblot.

Der findes Asb11 isoformer, og der er derfor forskellige udgaver af denne. Her
undersges -Asb11 som bestr af 323 aminosyrer. Asb11 er med til at nedbryde
andre proteiner, da det er en del af ubiquitin-ligase-komplekset. Asb11 detektere de
proteiner der skal elimineres, og stter sig p dem. Herefter kommer ubiquitin som
bliver bundet p ved hjlp af ligase og Asb11. Dette bevirker at der sttes gang i
fordjelsessystemet og proteinet elimineres.
Figur 2 Asb11-ligase-ubiquitin kompleks
Ubiquitin spiller en vigtig rolle i alle celler med en cellekerne, den er med til at
regulere proteinerne inde i cellen. Nr ubiquitin er blevet bundet i et kompleks
mellem protein-Asb11-ligase og ubiquitin, udsender ubiquitin et signal til cellen om at
proteinet er klar til at blive nedbrudt. Nedbrydningen kan skyldes, at der enten skal
reguleres i koncentrationen af proteinet eller at proteinet har gjort det den skulle.
Asb11 findes forskellige steder i mennesket, i muskelceller, leverceller og nerveceller.
Asb11 findes ikke naturligt i knogleceller, og det undersges derfor via western blot
om det er lykkedes at transfektere U2OS celler med Asb11. Frst lyseres cellerne,
sledes at proteinet frit kan vandre p en SDS-page. Bndet p SDS-page gelen
sammenlignes med en standard, og det antages om det er lykkedes. Bagefter
bekrftes eller afkrftes denne antagelse ved et western blot. Antistoffet der
benyttes til dette western blot, er alpha-GFP(rabbit). Dette skyldes at det gen der
nskes klonet er Asb11 sat sammen med GFP, da det p den mde lettere kommer til
udtryk. Desuden er antistoffet mod GFP hyppigere brugt end antistoffet mod ASB11.
Der er alts bde praktiske og konomiske grunde til dette.
Side 6 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Lysering af humane celler

Nr celler lyseres, delgges cellemembranen. Det er vigtigt at cellerne lyseres helt,
da man ellers kan risikere at proteinerne ikke kan isoleres eller at de gr i stykker. Der
findes flere forskellige reagenser til at lysere cellerne, det er derfor ndvendigt at gre
sig nogen overvejelser om hvilke celler man arbejder med. Der skal tages hjde for
hvilken slags cellevg ens celler har. Hvis man fx arbejder med prokaryote celler, kan
det have betydning om de er grampositive eller gramnegative. Da de grampositive har
et tykt mureinlag, mens de gramnegative har en mindre mureinlag men til gengld et
periplasmalag. Hvis der arbejdes med eukaryote celler, kan der enten vre en
cellevg som ved planteceller. Men der kan ogs vre en plasmamembran som ved
dyreceller. Det skal derfor overvejes hvilken reagens der er bedst til netop de celler
man arbejder med. Ved en dyrecelle bestr plasmamembranen hovedsageligt af
phosphoslipider, hvor der er et hydrofilt ydre, mens der er et hydrofobt indre.
Lyseringsbufferen skal alts her kunne lysere phosphorlipidernes bindinger. Ydermere
skal der ogs tages hensyn til hvilket protein man vil undersge, da nogen
lyseringsbuffere nedbryder visse proteiner. Et typisk vaskemiddel er Triton-x-100, dette
gr ind og delgger lipid-lipid bindingerne i plasmamembranen, men denaturere ikke
proteinet. Dette er dog en hrdere metode end 2X LSB bufferen.
Proteiner
Et protein bestr af en kde af uforgrenede aminosyre, der er bundet sammen af
peptidbindinger. Disse aminosyrer kan have forskellige sidegrupper, der kan best af
kortere eller lngere kder. Proteinerne kan have flere forskellige strukturer, disse
opdeles i de primre, sekundre, tertire og kvantenre. Den primre struktur
udgres af rkken af aminosyrer, den sekundre er den mde aminosyrerne er i
forhold til hinanden. Aminosyrerne bindes sammen af hydrogenbindinger, og kan have
former som alfa-helix eller beta-sheets. Den tertire er en lidt mere overordnet
struktur, her kan der bde ses beta-sheets, alfa-helix og loops. Den kvantenre
struktur er kun til stede, hvis flere proteiner binder sig sammen, et eksempel p dette
er hmoglobin. Aminosyrers generelle form er (se figur) og har en
carboxylsyregruppe, aminosyregruppe og en radikal. Proteiner har specifikke
isoelektriske pH, ved denne pH er de ud af til neutrale. Dette betyder at
carboxylsyregruppen har afgivet en proton, og aminosyregruppen har optaget en
proton, til sammen giver det en neutral ladning. Hvis proteinet befinder sig i en
oplsning med en pH der er hjere end det isoelektriskepunkt vil det vre negativt
Side 7 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
ladet, og hvis pH er lavere vil det vre positivt ladet.

Visse steder p proteinet findes epitoperne, disse er genkendelsessteder for
antistoffer. En epitop bestr af 4-7 aminosyre, de kan vre placeret lige efter
hinanden, eller fx i et loop hvor de sidder tt p hinanden. Et antistof kan genkende
denne sekvens, og binder sig til epitopen, dette kaldes antistof-antigen-kompleks.
Disse bindinger bestr af svage bindinger som fx hydrogenbindinger og van der
waalske krfter. Bindingen mellem epitop og antistof bestr til dels ogs af formen, p
rkken af aminosyre. For at simplificere
dette kan man forestille sig at epitopen er en
trekant, og antistoffet kan genkende denne.
Dog kan der forekomme krydsreaktioner, fx
en lidt anderledes trekant kan binde sig til
antistoffet. Nr man vil detektere om et
bestemt protein er tilstede, bruges der ofte
et sekundrt antistof, som en konjugeret
med et enzym. Det sekundre antistof
genkender det primre antistof, og vil
Figur 3 Generel
opbygning af aminosyre
Figur 4 Antistof genkendelse af epitop
bagefter tilstte et substrat, hvor enzymet omdanner dette til et farvekompleks. Man
skal huske at det primre og det sekundre antistof skal vre fremstillet i samme
slags dyr, fx kanin (IgGRabbit).
SDS-page
SDS-page er en elektroforese der bruges til proteiner, og er meget anvendelig da stort
set alle proteiner er oplselige i sulfosben (SDS-oplsningen). Selve krslen tager
kort tid, og selv f g af en prve er nok. Gelen til SDS-page er lavet af polyacrylamid,
og findes i forskellige koncentrationer. Afhngigt af hvilke proteiner der nskes adskilt,
kan der anvendes forskellige %acrylamid. Ved at ge koncentrationen af
polyacrylamid, gres porrestrrelsen mindre og derved fs en god adskillelse af lette
proteiner. Koncentrationen kan varieres mellem 3-30%, men det mest brugte er
mellem 5- 15 %. Hvis man kender vgten af sine proteiner p forhnd, er det let at
vlge den rette koncentration. Hvis man til gengld ikke kender vgten af sine
proteiner, kan der kres en gradientgel. Som navnet antyder, er koncentrationen af
polyacrylamid varieret ned gennem gelen. Gelen starter med en lav koncentration fx
5% og ned gennem gelen, i samme retning som vandringen af proteiner, ges
Side 8 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
koncentrationen og ender p fx 20%. Dette gr at man kan bestemme

molekylevgten over et strre omrde, og derefter krer prven p en gel der passer
til den molekylevgt man har. Fr elektroforesen kres, behandles prven
(proteinerne) med SDS, som er en
sulfosbe. Oplsningen tilsttes til
prven, og varmes op til 70-80C. Herved
denaturere proteinerne, hvilket vil sige at
de mister deres struktur (strukturer). Dog
fldes proteinerne ikke ud, men bliver
omgivet at negativt ladede SDS-molekyler
og bliver rette ud. Nr proteinerne er
omgivet af denne negative kappe,
kommer dets egen ladning ikke til udtryk.
Det vil sige at oplsningens pH ikke
lngere pvirker proteinet, og alle proteinerne i oplsningen vil have den samme
ladning. Dette er en stor fordel, hvis der er flere forskellige proteiner, da de i s fald
alle vil vandre fra minus til plus, p grund af den negative kappe. Derfor er
adskillelsen kun baseret p molvgten af proteinet. Udover dette bruges der tit et
reduktionsmiddel til at fjerne S-S broerne, der ellers ogs er med til at give proteinets
struktur. Svovlbroen bliver erstattet af 2 SH pr. svovlbro. Det mest anvendte
reduktionsmiddel er dithiotheitol (DDT). I nogen geler og buffere, er der tilsat SDS.
Som ved agarose elektroforese, vil prven
Figur 5 Protein behandlet med SDS og DDT
ogs her vandre mod anoden (den positive

ende). SDS-gelen er stbt mellem to plastplader, og str lodret ned i et kar, hvor der
er buffer i bunden. Prverne loades i brnde og vandre herefter, afhngigt at
molekylestrrelsen, ned mod katoden, og bliver adskilt. De proteiner der vejer mindst,
vandre lngst. Vandringen afhnger alts af molekylevgten, og vandringslngden
er proportional med molekylevgten. Ved at medtage en markr, med kendte
molekylevgt kan man bagefter beregne molekylevgten ret prcist. For at opn en
optimal separering, er det vigtigt ikke at loade en for hj koncentration af prven, det
anbefales at der loades en koncentration p 5-10 ug. Hvis der loades en for hj
koncentration vil separeringen flyde sammen. Hvis der loades en for lille
koncentration, kan man risikere at nogen komponenter slet ikke kommer til udtryk p
gelen. Hvis man ikke kender koncentrationen er man nd til at prve sig frem, men
man kan med fordel oprense eller fortynde prven og kre den p samme gel, af
Side 9 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
konomiske grunde. Hvis ens prve har en for lav koncentration, kan man
opkoncentrere den enten ved dialyse, ammoniumsulfatfldning eller frysetrring.
Efter en SDS-page er udfrt, kan man farve proteinerne uspecifikt med
coomassiefarvning, eller man kan lave forskellige slags blotting.
Figur 6: Eksempel p overload
Figur 6 Migrering af
molekyler i SDS-gel
Coomassie farvning
Coomassie farvning er en metode til at synliggre proteiner. Coomassie farven binder

sig uspecifikt til proteiner, det vil sige at den binder sig til alle proteiner, uanset type.
Coomassie er en meget brugt metode til bestemmelse af proteinindholdet i en prve,
og kan mle ned til 10 ug/mL. Bindingen mellem farve og protein sker ved svage
bindinger bl.a. ionbinding. Farvebindingen kan mles p et specielt apparat tilkoblet
et spektrofotometer, ved 595 nm. Det er ikke altid muligt at lave en standardkurve ud
fra det protein man undersger, derfor kan man benytte BSA (Bovint serum albumin)
som standardkurve. Forholdet mellem farvekoncentration og proteinkoncentration er
ikke helt linert, og der vil alts fremkomme en linje der buer lidt af. Imidlertid binder
BSA mere farve end proteiner gennemsnitligt gr, og kan derfor give et lidt hjere
resultat end hvad der reelt er tilstede. Man kan i stedet vlge at bruge ovalbumin, et
glykoprotein der udgr hovedbestanddelen af ggevide. Ovalbumin binder nsten
det sammen som et gennemsnitligt protein.
Bradford metoden
Bradformetoden er en spektrofotometrisk metode til at bestemme proteinindholdet i
en given prve. De to mest hyppigt brugte coomassie farver er
coomassie brilliant blue 250 G og coomassie brilliant blue
250 R. Ved en pH der er mindre end 0, vil coomassie farven
vre rd (nr man har R-varianten) og kunne mles ved 470
nm. Ved pH=1 vil vsken vre grn (hvis man har Gvarianten) og denne vil kunne mles ved 620 nm. Hvis pH er hjere end 2, vil farven
vre lys bl. Grunden til farvendringen findes i den mde farvemolekylet er ladet
Side 10 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
under de forskellige pH-stadier. Princippet i Bradfordmetoden er at coomassie farven

vil binde sig til proteinerne, og absorbtionsmaksimummet vil ndre sig fra 465 nm til
595 nm. Coomassiefarven er rd i sure oplsninger, men nr der er protein tilstede, vil
coomassie farven donere dets frie elektron til proteinet. Optagelsen af denne elektron
bevirker at proteinet vil g fra dets oprindelige form, til en form hvor dets hydrofobe
ende vender udad. Proteinets hydrofobe ende og farvens upolre omrde bindes
sammen ved hjlp af van der waals krfter, og farven er ikke lngere rd men bl.
Ydermere bliver farven og proteinet bundet sammen af ionbindinger. Bindingerne
mellem disse stabilisere den bl farve, som herefter kan mles. Det gode ved
bradfordmetoden er at den er hurtig, nem og bliver ikke pvirket s meget af andre
kemikalier i prven, som andre assays gr. Oplsningen mles p et spektrofotometer,
og der opstilles en kurve hvor absorbtionsmngden er proportional med
koncentrationen af proteinet.
Western blotting
Western blotting (immunoblotting) er en analyseteknik, hvorved man kan undersge
for specifikke proteiner. Dette sker ved at man bruger antistoffer, som er specifikke og
alts kun genkender et protein. Blotting defineres som en teknik, hvorved
makromolekyler kan overfres til en membran, enten direkte eller via en gel. For at
undersge for et specifikt protein er det ndvendigt frst at kre en SDS-gel, hvorved
proteinerne bliver adskilt. Dette kan ogs gres ved isoelektrisk fokusering. Herefter
skal proteinerne overfres til en membran, der findes flere forskellige teknikker til
dette, men den mest brugte er elektroblotting. Den mest brugte teknik er semi-dry
elektroblotting, her laves en skaldt sandwich med membran, gel og filterpapir. Der p
hldes buffer som har en hj pH-vrdi, hvilket bevirker at proteinerne bliver negativt
ladet. De vil herefter, nr der sttes strm til, vandre mod anoden (den positive
ende), og proteinerne bliver fanget p membranen. Nogen geler er lettere at
elektroblotte end andre fx er det ved urinstofsgeler og fokuseringsgeler lettere at f
overfrt proteinerne, end det er ved fx en SDS-gel. Dette hnger sammen med deres
lavere koncentration af acrylamid. Desuden er det lettere at overfre fra en ensartet
gel, i forhold til en gradientgel. I bufferen er der ethanol eller methanol, dette hjlper
med at oplse SDS-kappen rundt om proteinerne, s disse kan blive genkendt af et
antistof. Desuden er det med til at binde proteinerne til membranen, som bliver
bundet irreversibelt. Som membran anvendes nitrocellulose ofte, dette skyldes den
hje bindingskapacitet og hje kapacitet for makromolekyler. Ydermere er den let at
Side 11 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
farve med fx coomassie brilliant blue. Ulemperne ved nitrocllulosen er at den er meget
skrbelig, og har svrt ved at binde sm molekyler (mindre end 20,000 dalton). Efter
overfrslen af proteiner, skal membranen blokeres med ligegyldige molekyler.
Membranens overskydende proteinbindingskapacitet er herved blokeret, dette hindre
at der sker uspecifikke bindinger, som ellers kunne interferere p ens resultater. Mlk
vlges ofte som blokeringsvske, da den er billig og effektiv. Til mlken bruges ofte
en tweenbuffer, men man skal vre opmrksom p at den ikke blokeres for lnge
med dette. Ved for lang tids inkubering med tween kan denne g ind og binde de
samme steder som proteinerne, og dermed konkurrere med disse om pladsen. Det
anbefales at der ikke vaskes med denne i lngere tid end 20 min for en 2 % tween
oplsning. Blokeringen fremmer ofte denatureringen af proteinernes determinanter
(genkendelsessteder for antistoffet), som kan vre blevet delagt under behandlingen
med SDS. Herefter behandles membranen med en primrt antistof, der skal
genkende det protein man undersger for. Det kan vre en fordel at farve gelen
uspecifikt, og herved f oplysninger om hvor effektiv overfrslen har vret, og om
proteinmnstret fra gelen ogs er p membranen. ved farvning af gelen med fx
ponceau S og aniline blue kan man bagefter anvende specifikke antistoffer til at
genkende specifikke proteiner. Dog bruges specifik detektion ofte ogs uden farvning
af gel. Nr man skal til at detektere om de nskede proteiner er tilstede i ens prve, er
man ndt til at gre sig nogen tanker om valget af antistof. Et antistof bestr at 4
polypeptidkder, to tunge og to lette. Opbygningen bestr af de to tunge kder,
hvor den frste del er et konstant omrde. Det betyder at dette omrde er
nogenlunde ens i alle antistoffer (immunogloboliner (IgG)). Herefter kommer et lille
knk, hvor de lette kder sidder p, dette omrde er det variable omrde, som
varierer fra antistof til antistof. Helt yderst er det hypervariable omrde, som navnet
antyder er dette omrde meget forskelligt fra antistof til antistof, og det er her
antistoffet binder sig til en epitop (antigen). Der findes polyklonale og monoklonale
antistoffer. Monoklonale antistoffer er mere specifikke, idet de kun genkender n
epitop. Dette skyldes at de er lavet ud fra en enkel B-celle kultur, og alts er kloner af
denne. Specificiteten til epitopen er alts den samme. Specificiteten udtrykker hvor
god evne antistoffet har til kun at genkende og binde sig til en bestemt epitop. S
hvis den har god specificitet vil den hovedsageligt binde sig til en bestemt epitop, og
ikke krydsreagere med andre. Under forbehandling til SDS-page bliver prven
behandlet med en SDS-oplsning, hvilket bevirker at proteinerne denaturere. Dette
glder ogs de steder epitoperne sidder. Hvis proteinets epitop er get i stykker
Side 12 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
under behandlingen med SDS-buffer, kan et monoklonalt antistof ikke genkende

dette. Dette kan bevirke at man fr forkerte resultater, da proteinet alts godt kan
vre til stede, men ikke detekteres. Polyklonale antistoffer kan til gengld genkende
forskellige epitoper p det samme antigen, det vil derfor betyde at hvis en del af
proteinet er denatureret vil et polyklonalt antistof kunne genkende en anden epitop p
antigenet, og derved stadig give en positiv rekation. Dette skyldes at polyklonale, som
navnet ogs antyder, er lavet i flere forskellige B-celle kulturer, og de kan derfor have
forskellige specificitet og affinitet til epitopen. Affiniteten beskriver hvor stor
tilbjelighed antistoffet og antigenet har for at reagere med hinanden. Efter
membranen er blevet behandlet med det primre antistof, skal denne vaskes for at f
resterne af det primre antistof skyllet vk. Man vasker efter alle steps for at undg
at uspecifikke proteiner binder sig til membranen. ofte vasker man med PBS-tween, da
man herved opretholder blokaden af membranen. Det sekundre antistof er oftest et
enzymkonjugeret antistof, det vil sige at det er sat sammen med et enzym. Efter
membranen er blevet inkuberet med sekundrt antistof, kan man behandle den med
et farvelst substrat. Afhngigt af hvilket enzym der er konjugeret med det
sekundre antistof, kan man f et farveudslag. Dette vil herefter kunne aflses
direkte p gelen, de steder proteinet er tilstede. Et enzym der er meget brugt til dette
er peroxidase, som giver en lysebl farve efter behandling med substrat.
Farvedannelsen sker ved at enzymet reagere med substratet, og omdanner dette til en
farve. Enzymet peroxidase vil, hvis det er tilstede, overfrer hydrogen fra en
hydrogendoner til H2O2.
Figur 7 Farvekompleks dannelse via peroxidase
Protein oprensning via beads.

Frst lyseres cellerne der indeholder det nskede protein, lyseringen gr at cellernes
membran gr i stykker. Lysatet med det nskede protein, behandles med et antistof,
rettet mod det nskede protein. I dette tilflde er det nskede protein Asb11-GFP, og
der anvendes et GFP antistof. Antistoffet vil genkende GFP, som er fusioneret med
Asb11, dermed er en positiv reaktion med antistoffet ogs en positiv reaktion p at der
Side 13 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
er Asb11. Beadsene skal fr brug, vaskes i en buffer. Herefter tilsttes lysatet, efter
grundig blanding p en hjul, til beadsene. Blandingen inkuberes nu p hjulet, for at
blive blandet grundigt. Teorien er at beadsene vil binde GFP-antistoffet til sig, og
dermed og fusionsproduktet. Prven bliver herefter vasket, for at fjerne forskellige
rester og andre proteiner. Dette gres x antal gange, for at f et s rent produkt som
muligt. Nr beadsene med prven er blevet vasket, tilsttes en elueringsbuffer, hvis
forml er at f beadsene til at give slip p GFP igen. Nr dette er gjort, kan
supernantanten loades p en SDS-page gel. Gelen kan herefter coomassie farves, og
oprenset protein og ikke-oprenset protein bnd kan sammenlignes.
Celledyrkning af U2OS
Celledyrkning er en metode til at f levende celler fra flercellede organismer til at
overleve og udve deres funktion udenfor kroppen, som de har vret en del af.
Der findes to grundlggende metoder til at dyrke celler. De kan enten dyrkes p en
mde hvor de klber sig fast til en overflade (adherent culture), eller de kan dyrkes s
de flyder frit rundt (suspension culture). Valget af metode og medie kommer an p
hvilke celler der arbejdes med. Den adherente metode har den fordel at det, under
mikroskop, er let at se cellernes konfluens. Alts hvor stor en procentdel cellerne
udgr af dyrkningsomrdet. Til gengld kan det vre svrt at opformere en strre
mngde celler. Ved suspensionsmetoden er det let at opformere en stor mngde
celler, da denne metode ikke er begrnset af en bestemt overflade. Til gengld er
det svrere at bestemme koncentrationen af celler og morfologien af disse. Ved
menneskeceller udtages sterilt en celleprve ud fra et organ eller et vv. Der vil ofte
vre unskede celler, men disse kan fjernes ved hjlp af enzymer. Celleprven vil
blive udsat for forskellige adskillelses- og oprensningsprocedure. Efter at celleprven
er oprenset, bliver den overfrt til dyrkningsmediet. Dyrkningsmedier indeholder
vkstfaktorer, ssom hormoner og vitaminer. Cellerne dyrkes in vitro, hvilket vil sige
at de dyrkes uden for en organisme fx i et reagensglas. Nr celler dyrkes in vivo,
dyrkes de i en organisme, dette kan fx vre en mus. Ved at dyrke dem in vitro kan
man kontrollere temperaturen, mediet, pH og CO2.
Der arbejdes med en U2OS human osterosarcoma cellelinje, de dyrkes adherent. Dette
er en sekundr cellelinje. Forskellen p primre og sekundre cellelinjer er at de
primre er almindelige celler fra dyr, mens de sekundre ofte er krftceller. De
primre celler kan dele sig et antal gange hvorefter de dr, dette betegnes ogs som
antal passager de kan dyrkes. Grunden til at de dr, er at hver gang de deler sig,
Side 14 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
mister de nogen baser i hver ende at DNA-strengen.

P et tidspunkt vil der derfor vre mistet s mange
baser, at det gr ind i den kodende sekvens. Nr den
kodende sekvens ikke har alle de baser den skal have,
kan den have ndret egenskab, og dette kan
resultere i dd. En krftcelle er til gengld en celle
der deler sig uhmmet. Dog vil der i laboratorieforsg
vre sat en grnse for hvor mange passagerer den
m g igennem, da der hele tiden vil ske mutationer
Figur 8: Fibroblastisk
struktur
som kan pvirke resultatet. Der vil ske flere mutationer i en krftcelle end i en
almindelig celle, fordi krftceller deler sig flere gange p kortere tid. Krftceller har
aneuploidt kromosomtal, det vil sige at der er ubalance i antallet af kromosomer. De
deler sig s hurtigt at der sker fejl nr kromosomerne skal deles, der kan fx ske det at
et kromosom bliver replikeret to gange, hvor det kun skulle have vret en enkel gang.
Der kan ogs ske det at nogen kromosomer slet ikke bliver replikeret. U2OS cellers
morfologi ses som fibroblaster. Disse er celler der sidder fast p bunden, men er
udstrakt og er dipol. Nr man kigger i mikroskop vil der dog ogs vre runde celler,
der ikke hfter til underlaget, dette kan enten skyldes at de er dde eller at de er i
gang med celledeling.
For U2OS cellerne er fordoblingstiden p 24 timer og kan dyrkes i ca. 30 passager.
Cellerne er lette at dyrke og har en konfluens p 10-100%, men den optimale
konfluens for cellerne er 20-80%. De vokser bedst nr der er andre celler ved siden af,
men der m ikke vre s mange at de bliver stressede og udskiller toxiner.
Cellerne skal dyrkes i Dulbeccos Modifield Eagles Medium (DMEM) med 10% FBS og
100 u/mL penicillin og 100 u/mL streptomycin. Desuden er der tilsat phenolrdt til
mediet, som pH indikator. Omslags punktet for phenolrdt er 6,8-8,4. Hvis pH kommer
over 8,4 vil mediet blive lilla, mens en pH p under 6,8 vil resultere i at mediet bliver
gult. Optimal pH for cellerne ligger p ca. 7,4 man vil derfor kunne se om pH er i orden
ved at kigge p farven af mediet. Mediet indeholder FBS, fordi dette indeholder
hormoner, vitaminer og andre vkstfaktorer. Der tilsttes ogs penicillin da der ellers
ville vre hj celledd. Nr man splitter cellerne foregr dette s sterilt som muligt,
men der skal ikke meget til for at kontaminere en cellekultur. Der tilsttes derfor
penicillin for at drbe skadende bakterier. Cellerne dyrkes i en temperatur p 37 oC,
Side 15 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
hvor CO2 atmosfren er p 5%. Sammenstningen af gasserne i dyrkningskamrene

skal svarer til det som findes i legemets vv.
Transfektion
Transfektion er en almindelig metode inden for molekylrebiologien, hvor genetisk
materiale optages af celler i en kultur. Ved transfektion anvendes eukaryote celler,
mens der ved transformation benyttes prokaryote celler. Det genetiske materiale er
ofte manipuleret plasmid eller antikvarenige RNA. Transfektion anvendes til at tilfre
cellerne et bestemt protein, en bestemt egenskab eller mindske cellernes produktion
af et specifikt protein. Det bruges bl.a. nr effektiviteten af et genprodukt skal
studeres, hvor det er proteinet der koder for genet. Det bruges ogs til at undersge
mutationer og til at undersge hvilken virkning et bestemt protein har i cellen. Der
findes mange forskellige metoder til transfektion, men det kommer an p celletypen
og hvilket budget man har. Mikroinjektion er en metode, hvor man indfre en ganske
tynd glas kanyle ind i cellen, og sprjter det nskede DNA ind. Elektroporation er en
anden metode, den gr ud p at man tilfre strm til en oplsning af celler og DNA.
Herefter vil phosphorlipiderne i cellemembranen blive forstyrret, og der opstr en
porre ind i cellen. Via det elektriske potentiale hen over cellemembranen, vil DNAet
passere ind i cellen. Dog vil der her vre risiko for stor celledd, og at membranen
ikke kan lukkes ordentlig igen. Den mest effektive metode til mindre mngder af
celler, er behandling med kemikalier, men her findes ogs mange muligheder.
PEI str for polyethylenimine og er et meget billigt alternativ til de forskellige metoder.
I transfektion bruges den linere for PEI, som bestr af gentagende enheder af
aminogrupper med en CH2CH2 spacer.
Side 16 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
DNA er negativt ladet ved fysiologisk pH, som er den pH der

findes i mennesker. Den negative ladning skyldes
phosphatgrupperne i DNAets rygrad. PEI kondenser DNA i
positiv ladede partikler som binder til den anioniske
celleoverfalde. Herefter bliver PEI(DNA komplekset) optaget i
cellen ved hjlp af endocytose. Endocytose er en transport
form for cellerne, hvorved de kan erhverve sig ernring og
vand. Cellemembranen vil krnges indad, og det der skal
transporteres ind i cellen vil blive omsluttet af membranen.
Denne indposning (vesikel) vil blive snret af, s der ikke er en
bning ud mod omgivelserne. Vesiklen bliver herved
transporteret ind i cellen, uden at delgge cellemembranen.
Men nr vesiklen er kommet ind i plasmidet vil den briste pga. det osmostiske tryk. PEI
transfektion kan give en effektivitet op til 90%. Dog er PEI cytotoxisk og kan derfor
vre celledrbende ved humane celler, man skal derfor passe p bde cellerne og
personen der foretager transfektionen - s derfor skal man vre yderst forsigtigt med
PEI. Dette er meget giftigt!
Nr man skal tilstte PEI til U2OS celler vil det vre bedst hvis PEI tilsttes en
celledensitet p ca. 40%. Da 6 g PEI er optimalt for en 6 cm dish med en PEI/DNA
forhold p 3:1.
Transformation
Transformation er nr en prokaryot celle optager et DNA stykke. Bakterier optager
naturligt DNA fra deres omgivelser, dog ved meget lav frekvens. DNAet der er i det
omkring liggende milj, kan stamme fra bakterier der er get til grunde. Det er en
vigtig egenskab for bakterier at kunne optage fremmed DNA, da de ved formering
deler sig til to identiske celler. Herved opstr der ingen naturlig variation i
arvematerialet, s for at forge bakteriens overlevelses evne er mutationer, optagelse
af DNA fra det omkring liggende milj og overfrsel af DNA fra en bakterie til en anden
via bakteriofager vigtige egenskaber. Nr det nskes at en bakterie skal optage et
bestemt stykke DNA, er man frst ndt til at gre bakterierne kompetente. Dette kan
man gre ved at bruge CaCl2, ved tilsttelse af dette bliver cellevggen
gennemtrngelige (permeable). Her bliver cellerne frst udsat for kulde (0C) og
derefter for varmeshok (ca. 42C). Denne behandling er meget skadeligt for cellerne
Side 17 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
og man m ikke resuspender eller banke p eppendorfrret. Ved denne proces ges
bakterierne, som kan optage plasmidet.
Plasmidet har et kanamycion-resistengen, hvor det kun er de celler, som har optaget
plasmidet der kan vokse p LB plader med kanamycin. Dette kan ses dagen efter, hvor
det kun er de celler der har optaget plasmidet, det er vokset op som kolonier. Hvis
pladerne har vret inkuberet i for lang, kan der komme sm falske kolonier, disse
kolonier kaldes satelitkolonier, de indeholder ikke Asb11 genet. Nr de nskede
kolonier er kommet frem skal de testes for tilstedevrelse for Asb11 genet ved en PCR
reaktion, hvor kolonierne bliver brugt som template. Samtidig bliver resterne fra
pipettespidsen inkuberet i LB-kana rr, s disse kan bruges til videre undersgelse,
ved positiv reaktion ved PCR.
Side 18 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Kloning af humant Asb11 via Polymerase Chain reaction (PCR)

Ved kloning omgr man det naturlige, alts den knnede formering. Selve
kloningsteknikken (gensplejsning) handler om at overfre arvematerialet fra en
organisme til en anden. Kloning er nr et DNA-fragment, der koder for et bestemt gen,
indsttes i en mikroorganisme. Hermed dyrkes det, da mikroorganismer formere sig
ved at dele sig, og danne to genetisk ens celler.
Kloner er en population af individer som er genetisk ens.
Kloningsteknikken foregr i flgende trin:
-
Donor-DNAet skal overfres til en vektor, og det rekombinante DNAmolekyle
bliver fremstillet.
Det rekombinante DNA bliver overfrt til vrtorganismen.
De transformerede mikroorganismer bliver opformeret og selekteret.
Her nskes det at kopiere cDNAet som koder Asb11 genet. cDNA (copy DNA) er et
DNA-fragment uden introns. Introns er sekvenser af baser, der ikke koder for et gen.
Der benyttes cDNA da DNA-fragmenter der skal indsttes i en vektor ikke m vre for
lange. cDNA kan fremstilles ved at kre RT-PCR (reverse transcriptase- PCR), hvor der
benyttes en mRNA streng. I eukaryoter sker der en proces, hvor der ved dannelsen af
mRNA, ogs klippes introns vk. Ved RT-PCR tilsttes der, udover det almindelige,
ogs enzymet reverse transcriptase. Dette katalysere syntesen af DNA ud fra en
mRNA streng. Herved bliver det nskede cDNA opformeret.
PCR
Polymerase Chain Reaction forkortes PCR. Det er en metode til opformering af DNA.
Der bliver kopieret et stykke DNA, til mange stykker. Dette gr det muligt at kunne
analysere helt ned til enkelte celler. DNAet som kopieres bliver udvalgt af primeren.
Primeren bestr af korte DNA-stykker. Primeren gr ind og stter sig p de to DNAstrenge, og fr afgrnset DNA stykket der opformeres. Selve PCR processen er som
flger: frst bliver det dobbelt strengede DNA splittet fra hinanden (denaturering ved
en temp. p ca. 90C) herefter snkes temperaturen(annealing temperatur), og de to
primer stter sig p hver sin DNA-streng. Herefter hves temperaturen igen til ca.
72C, her gr polymerasen i gang, og pstter baserne. Dette gentages et antal
gange (antal cykles) hvor der sker det samme, og man ender med meget af den
samme DNA-sekvens, som fx kan kode for et gen. Smelte temperaturen bestemmes
Side 19 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
ved at tlle antal baser, hvor C og G bidrager med 4C og A og T bidrager med 2C.
Formlen for dette er tm= 4 x (G+C) + 2 x (A+T). Smeltetemperaturen bliver bestemt
af det antal baser primeren stter sig p. Annealing temperaturen skal ligge ca. 3-4C
under smeltetemperaturen. Ved PCR kan man komme ud for at primerne har
komplimentre sekvenser, enten til hinanden eller til sig selv, og de derfor klistre
sammen, dette kaldes primer dimer.
Skring af DNA med restriktionsenzymer

Restriktionsenzymer er vigtige nr der arbejdes med DNA. Restriktionsenzymer
genkender specifikke basesekvenser i den dobbeltstrenget DNA, derefter klipper den
begge strenge p det bestemte sted. Dette sted betegnes som det specifikke
skringssite.
Restriktionsenzymer kan genkende et basesekvens med nukleotider mellem 4-8
basepar. Sdan en sekvens vil vre symmetrisk, eksempelvis:
5 GGATCC 3
3CCTAGG 5
Ved at man aflsser sekvensen fra 5, vil de vre ens p begge sider, dette kaldes
ogs palindromisk sekvens.
I vektoren(plasmidet) er der et sted der betegnes MCS(multiple cloning site) eller
polylinker. Dette sted har som minimum 2 restriktionssites, men meget ofte flere. MCS
er sat ind i plasmidet, for at gre kloningen lettere. Nr man vlger hvilket
restriktionsenzym man skal bruge, skal man vlge et der kun sidder i dette site, da
restriktionsenzymet ellers ville klippe 2 eller flere steder i plasmider. Dette vil resultere
i at man har sm DNA fragmenter i stedet for et plasmid. Nr man kloner, skal man
ogs huske at kigge p ORF (Open Reading Frame). Hver DNA-sekvens har 3 open
reading frames, alts 3 mder den kan lses p. Man kan flytte reading framen en
base fremad, og dette kan gres to gange. Man vlger den der er lngst fordi man
generelt set siger man at der skal mindst 100 aminosyre til at udtrykke et protein. .
Vektoren skal indeholde promotors, der starter replikations processen. Ofte anvendes
fx CMV, som er en strk promoter, der fortller cellen af den skal kopiere non-stop.
Hvis promotoren er inducible, betyder det at der skal et bestemt stof til at tnde
Side 20 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
den. Vektoren skal ogs have et ribosombindingsled, som er det sted hvor den
nskede DNA-sekvens stter sig. Der skal ogs bruges et termineringsdel, der fungere
som stop. Herefter kan vrtsorganismens RNA-polymerase lse sekvensen, og
overstte det til RNA, som s bliver oversat til det pgldende protein. For at
vektoren og DNA-fragmentet kan sttes sammen, skal de vre skret med de samme
restriktionsenzymer, i dette tilflde benyttes BamH1 og EcoR1. Herved har det
nskede gen fet komplimentre baser til der hvor der er skret i vektoren. For at
vektoren ikke skal klistre sammen igen, dephosphorlyres dennes ender, da
phosphoren fungere som en slags klister. Det er vigtigt at PCR produktet ikke fr
samme behandling, da det i s fald ikke ville vre i stand til at klistre sig ind i
vektoren. Bagefter tilsttes der T4-ligase, der fungere som lim i DNA rygraden. Den
3 primer der benyttes i denne velse, er designet sledes at Asb11 genet kommer til
at sidde foran genet der koder for GFP. Dette bevirker at de to fusioneres sammen, og
man ender med et protein der hedder Asb11-GFP. Senere hen vil man kunne detektere
GFP med antistoffer.
Gelelektroforese
Gelelektroforese metoden benyttes til at separere DNA, RNA eller et protein gennem
en gel ved hjlp af en elektrisk strm (Se figur 2). Desuden er adskillelsen af
forskellige DNA og proteiner ogs brugbar nr det undersges om den nskede DNAfrekvens er blevet opformeret. Ved agarosegelelektroforese kan det kontroleres om
den nskede DNA-frekvens er tilstede, da denne vil best af et bestemt antal basepar.
DNA er ved fysiologisk pH (ca 7) negativt ladet, og vil i et elektrisk felt bevge sig
mod anoden. De mindste stykker DNA vil i en agarosegel, bevge sig lngst ned p
gelen. Vandringslngden bestemmes bde af hvor mange basepar DNA-fragmentet
bestr af, men ogs af konformationen. Konformationen af DNA er mden den er
foldet sammen p, det kan bde vre ben cirkulr, liner, eller supercoiled.
Hvis DNA-fragmenterne ikke har samme konformation, kan der vre forskel i
vandringslngden, selvom de har samme molvgt. Supercoiled struktur vil vandre
lngst, da den er mest kompakt, og derved har lettere ved at komme igennem
gelen. Her har vi opformeret cDNA, og det burde derfor vre linert. Markren til en
agarosegel bestr oftest af linert DNA med forskellige molvgte, det er derfor
vigtigt at det DNA der undersges ogs er linert. Nr man har bekrftet at det
korrekte DNA-fragment er tilstede, kan der arbejdes videre med prven. Man har
herved mindsket risikoen for at bruge fejldannet DNA.
Side 21 af 67
1- supercoiled.
2- ben cirkulr
3 liner.
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Side 22 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Fremgangsmde
Alkalisk phosphatase i western blotting
Side 23 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Side 24 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Side 25 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Asb11-GFP i western blotting
Side 26 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Side 27 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Celledyrning af U2OS
Side 28 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Transfektion
Side 29 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Calcium kompetente celler
Side 30 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Transformation
Side 31 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Side 32 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Kloning af humant Asb11
Side 33 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Side 34 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Side 35 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Reagenser og materialer
Alkalisk Phosphatase i Western Blotting / Asb11-GFP I Western Blotting
Primr + sekundr antistof
Bradford Reagens (5X)
PBS buffer
Phosphate Buffered Saline
PBS buffer + 0,05% Tween-20

PBS buffer + 0,05% Tween-20 + 5%
mlk
4X LSB (Laemmli Sample buffer)
2X LSB (Laemmli Sample buffer)
Triton-X-100 lysisbuffer
Farveoplsning
Udleveres
+4C
5X
Udleveres
+4C
NaCl
KCl
Na2HPO4*2H2O
KH2PO4
pH 7,4
137 mM
2,7 mM
10 mM
2 mM
Frisk fremstillet p dagen

5g til 100 mL PBS + Tween
Udleveres -20C
Udleveres -20C
NaCl
150 mM
Tris-HCl pH 8
50 mM
Triton-X-100
1%
Stock:
Coomassie brilliant blue
0,2 g
Ethanol
100 mL
Opls:
Commassie stock opl
Eddikesyre, konc.
MilliQ
mL
Affarver
Runningbuffer
Teo Tricine 20X buffer
SDS Gradientgeler
RunBlue
Markr
Amersham Full-Range Rainbow
BSA
Bovine Serum Albumin
100 mL
20 mL
80
Opbevares ved stuetemperatur

20% ethanol
mL
Eddikesyre, konc.
MilliQ
mL
400
75 mL
525
Opbevares ved stuetemperatur

Udleveres
+4C
Udleveres
+4C
Udleveres
-20C
Udleveres
+4C
Side 36 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Celledyrking af U2OS celler

DMEM, 10% FBS+PEN/STREP
Trypsinoplsning
PBS
Trsteriliser
Udleveres
+4C
Udleveres
+4C
Tabletter oplses I MilliQ i henhold til
producentens oplysninger.
Bufferen autoklaveres.
5 mL stanpipetter m. hydrofob vat 5
10 mL stangpipetter m. hydrofob vat 5
Eppendorf rr
Der forfindes streile filtertips til
pipetterne
PEI transfektion af U2OS celler

PEI oplsning
pEGFP-N1
Klonet plasmid
Sterile eppendorf rr
Sterile filtertips
1 g/L
-20C
HUSK SIKKERHED
1 g/L
-20C
Trsteriliseres
Findes i laboratoriet
Kompetente celler
LB
CaCl2
CaCl2 + 15% glycerol
0.1 M
0.1 M
Transformation af E. coli
LB Broth
LB Ager
Kanamycin stock
Se instruktion p basen
Se instruktion p basen
50 mg/mL (1000X)
Udleveres

Trsteriliser
1X TAE buffer
Loadingbuffer 6X
DNA markr
Autoklaver MilliQ
Eppendorf rr
Fremstille ud fra 50X stock
Udleveres
-20C
Udleveres
-20C
Side 37 af 67
Anita N
Mette D
Malene H
Serva DNA stain
Ligeringsbuffer

Bioteknologi
Udleveres
+4C
Tris-HCl
MgCl2
ATP
DTT
18/11 - 2014
CAAN
500 mM
100 mM
10 mM
100 mM
Deles ud i rr 10 L.
ATP/buffer tler ikke gentagene
optninger.
Side 38 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Delforsg - Bovint Alkalisk phosphatase enzymkinetik

Teori
Phosphorylering og dephosphorylering af proteiner er udbredt i alle organismer og har
nogle tilfldige funktioner. Dephosphorylering er en meget kritisk reaktion i
cellersignaleringsprocesserne, hvor phoaphataser er involveret i en lang rkke
sygdomme. Disse sygedomme er paget sygdom, osteomalaci og engelske syge,
osteosarkom og knogemetstaer. Knoglemetasraser er en sekundr rsag til alkalisk
phosphatase ved knoglesygdom. Det kan forrsages bryst-, lunge- og prostatakrft.
Disse sygdomme kan opdages hvis man har knoglesmerter, hvelse eller fraktur.
Bovint (kvg) alkalisk phosphatase er i stand til at katalysere hydrolysen af

phosphorsyreresterne fra substratet, dvs. at den kan spalte under med virkningen af
vand. Enzymet er derfor en hydrolase, og er temmelig stabil. Alkalisk phosphatse skal
bruge co-faktorer i form af zink og magnesium. Enzymkinetikken flger MichaelisMenen kinetikken og kan hmmes af sit eget produkt, som er uorganisk phosphat P i.
O
O 2N
O
P
+ H2O
AP
O
O 2N
OH
+
HO
O
P
Side 39 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Man bruger det kunstige substrat PNPP (p-Nitrophenyl Phosphate Disodium salt) nr
denne bindes til alkalisk phosphatase, vil det spaltes til 4-nitrohenol og phosphat. 4nitrophenol er gult og dannelsen af dette kan mles p et spektrofotometer ved 405
nm, da 4-nitrophenol flger Lambert-Beers lov.
Enzymer
Nogen proteiner fungere som enzymer, og enzymer fungere som katalysatorer, som
gr en reaktion hurtigere. For at en kemisk reaktion kan foreg skal G vre negativ,
og man er derfor nd til at tilfre energi, for at reaktionen kan starte, dette betegnes
aktiveringsenergi. Enzymer gr at der ikke skal tilfres nr s meget
aktiveringsenergi, som ved en reaktion uden katalysator. Enzymer er meget specifikke
enten
- reaktionsspecifikke : hvor de kun kan katalysere en reaktion, men med lidt forskellige
substrater
- substrat og reaktionsspecifikke: hvor de kun kan katalysere en reaktion, med kun et
substrat.
Der er to grundmodeller for hvordan enzym og substrat passer sammen. Der er nglei-ls, hvor de passer perfekt sammen, og s er der induced-fit hvor enzymet ndre
formen at det active site nr substratet binder sig. Herved bliver substratet bundet
tttere til enzymet, som bagefter vender tilbage til sin original form. Det sted substrat
og enzym binder sig sammen, betegnes som det active site. Bindingen mellem disse
bestr, ud over formen, ogs af hydrofobe, ladning og hydrogenbindinger. Til det
active site kan der ogs binde sig inhibitorer, som er stoffer der hmmer enzymets
aktivitet. Hmningen kan enten vre irreversible, hvor inhibitoren bindes kovalent, og
aktiviteten aldrig kan genvindes. Hmningen kan ogs vre reversible, hvor
inhibitoren bindes p men bagefter falder vk igen. Inden for reversible hmning,
findes der to slags, kompetitiv og non-kompetitiv.
- kompetitiv: inhibitoren stter sig i det active site, og konkurrere med substratet om
pladsen.
-non-kompetitiv: inhibitoren stter sig et andet sted end det active site, og substratet
kan stadig binde sig til det active site, men der kommer intet produkt.
Nogen enzymer har brug for co-faktorer for at kunne fungere. Det kan bde vre
molekyler (co-enzymer) eller metalioner (co-faktorer). Et enzym med en co-faktore
betegnes holoenzym, og uden betegnes de som apoenzym.Co-faktorer kan enten
vre fast bundet til enzymet, eller de kan vre bundet til enzymet for at starte
Side 40 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
processen, og bagefter falde fra igen. Typisk er metalioner bundet fast til enzymet,
hvorimod molekyler benytter begge metoder.
Substrat + Enzym Enzymsubstrat Enzym + Produkt
Reaktionshastigheden for enzymer er afhngige af temperatur, pH,
enzymkoncentration, substratkoncentration, cofaktorer og inhibitorer. pH og
temperatur har en kraftig virkning p enzymet. Ved optimum fungere enzymet godt,
men ved andre temperature og pH kan enzymet helt delgges og miste dets
virkning. Reaktionshastigheden er ogs afhngig af hvor meget substrat der er. Ved
en lav koncentration af substrat, vil der vre et linert sammenhng mellem
reaktionshastigheden og substrakoncentrationen. Dette skyldes at der er et antal
enzymer, med x antal active sites, og nr der ikke er s meget substrat, er der altid
frit i et activt site. Til gengld hvis der er meget substrat, vil reaktionshastigheden
ikke stige nr substrat koncentrationen ges, fordi alle active sites allerede er optaget.
Kurven vil her vre flad, da omdannelsen er konstant. Nr der laves en
mtningskurve, vil man f en kurve der er liner et stykke af vejen (der hvor der ikke
er meget substrat) og bagefter flader ud, fordi alle activesite er optaget. Der hvor
kurven flader ud, findes Vmax (den maximale omstningshastighed for enzymet). Ved
en mtningskurve kan Vmax og km(hastighedskonstant) estimeres, men ved et
Lineweaver-burk-plot kan de prcise vrdier beregnes.
Man kan for det meste anvende Michaelis-Menten kinetik til dette og her kunne vurder
Km og Vmax, som beskriver enzymets effektivitet.
Michaelis-Menten konstante, Km:
K m=
k 1+k 2
k +1
Denne konstant her enheden M og karakteristisk for det enkelte enzym og substrat.
Jo lavere KM er, jo strre er affiniteten.
Nr en simpel enzymatisk reaktion med et substrat er:
v i=V max
[S ]
[ S] + K M
S nr S = KM, s er vi = Vmax.
Side 41 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Nr det er man skal udregne de forskellige data, findes der er computer program. Men
fr dette blev Michaelis-Menten-ligningen skrevet p en mde, s ligningen er blevet
lineariseret.
Dette gres med Lineweaver-Burk-plot. Og det bliver:
1 KM
1
1
=
+
v V max [ S] V max
KM
er linjens hldning
V max
For x=0 er y =
1
V max
og for y=0 er x=
1
KM
Alts KM og Vmax bestemmes ved en rkke mlinger af initialhastigheden for

reaktionen, hvor man varierer [S] og holder alt andet konstant. Enzymet skal have en
koncentration, s der er et linret reaktionsforlb i starten, s v kan bestemmes.
Enzymaktivitet er det udtryk man bruger for hastigheden, hvormed et enzym
Side 42 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
omstter sit substrat. Denne enhed mles oftest i Unit (U). 1 unit af et enzym
omdanner 1 umol substrat/ 1 min. Dog under definerede forhold som skal forsts som
de forhold, hvor enzymet arbejder optimalt. For at kunne mle enzymaktiviteten er
man nd til at kunne mle enten substratomstningen eller produktdannelsen, hvor
produktdannelsen er det letteste at mle. Hvis dette ikke kan lade sig gre, er man
nd til at koble reaktionen, sammen med en anden reaktion. Sledes at produktet fra
reaktion 1, bruges som reaktant i reaktion 2 hvor det s danner et farvet produkt der
kan mles. Nr man skal mle enzymaktivteten kan det gres p spektrofotometer
ved 405 nm. Her mler man absorbansndring pr. minut. I dette tilflde blev der mlt
1 mling pr sekund i 180 sekunder, alts 3 minutter, uden inhibitor og efter 180
sekunder blev forlbet stoppet og hldningen aflst. Herefter gentages processen,
dog med inhibitor denne gang.
Fremgangsmde
Reagenser og materialer
Bovint Alkalisk Phosphatase enzymkinetik
Buffer
1 M diethanolamine
1 mM MgCl2
pH 9,8
PNPP substrat
Tabletterne oplses i 1 M
diethanolaminebuffer.
Konc. 2,7 mM
K2HPO4
1 mM
pH 8
Side 43 af 67
Anita N
Mette D
Malene H
Enzym

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Alkalisk Phosphatase, AP
Side 44 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Resultatbehandling
Alkalisk phosphatase i western blotting
- Western blot
Membranen fra western blottet tog ikke farve, da vi
vaskede denne med substrat oplsning. Der burde
vre kommet nogen lysebl striber, der hvor alkalisk
phosphatase proteiner var.
Vi forventede at der ville komme et blt bnd, mellem
markrens 76 kDa bnd og 52 kDa bnd, da alkalisk
phosphatase har en vgt p 57 kDa. Det forventedes
ogs at bndet ved triton-x-100 lysatet ville vre
svagere end bndet ved 2XLSB, da 2XLSB beskytter
proteinet mere under lyseringen af cellerne. Derfor
burde der vre bevaret mere protein her, end ved
triton-x-100.
Figur 9 Membran fra western blot

(forventet)
Lane 1 Triton-x-100 lysat
Lane 2 2XLSB lysat
-
Bradford metoden og coomassiefarvning

Metode
Bradfordmetoden
Coomassie farvning
Resultat (koncentration)
0,88 ug/uL*
0,036 ug/uL*
Side 45 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Identifikation af alkalisk phosphatse ud fra

standarden der blev loadet.
Sammenligning af de to resultaterne
Bradford metoden gav et resultat p 0,88 ug/uL og coomassie farvningen gav et
resultat p 0,87 ug/uL. Man kan derfor godt tillade sig at sige, at det giver det samme
resultat nr det ligger s tt p hinanden som det gr. Det ses p coomassie gelen at
der er en masse bnd hele vejen ned gennem gelen, dette skyldes at coomassiefarven
binder sig uspecifikt til alle proteiner. Farveintensiteten af prverne er en smule usikre,
da det ikke har vret muligt kun at markere det specifikke bnd der tilhrer alkalisk
phosphatase. Beregning af koncentrationen har dog vist sig at ligge tt op af
resultatet fra bradfordmetoden. Bradfordmetoden bygger ogs p uspecifikke
bindinger, der bliver mlt spektrofotometrisk, og det kunne mske forventes at det
ville give en hjere absorbans, da alle proteiner bliver mlt. Dog passer resultaterne
fint sammen.
Side 46 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Asb11-GFP i western blotting

Protein oprensning via beads
Forventninger:
Uoprensede prver
Mock- i denne prve er der ingen DNA, men alle andre reagenser er tilstede. Hvis
disse reagenser giver et bnd p gelen, kan der tages hjde for dette nr der kigges
p de andre baner. Det kan ogs forventes at der er bnd fra tilfldige proteiner fra
cellerne.
Kontrol- tom vektor et tomt plasmid der er gennemtestet, og er kendt som at have
et bnd ved 26 kDa. Ydermere vil der vre tilfldige bnd fra proteinerne i cellen.
Prve- Prven forventes at have et bnd ved 63 kDa, da dette er vgten for Asb11
fusioneret med GFP. Det Forventes ogs at have andre bnd for tilfldige proteiner fra
cellen.
Positiv kontrol- forventes at have et bnd ved 63 kDa, da man er sikker p at denne
kontrol indeholder fusionsproteinet. Det forventes ogs at der vil vre tilfldige bnd
for proteiner fra cellen.
Ubehandlet U2OS Den ubehandlede prve forventes ikke at have et bnd ved 63
kDa, men til gengld at have forskellige andre bnd, for andre proteiner der findes i
cellen.
Oprensede prver
Side 47 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Ved de oprensede prver, forventes der kun et bnd de steder fusionsproteinet Asb11GFP er tilstede, alt andet burde vre blevet vasket vk under oprensningen.
Mock- Her forventes ingen bnd, da fusionsproteinet ikke er tilstede.
Kontrol- tom vektor Her forventes ingen bnd, da fusionsproteinet ikke er tilstede.
Prve- Prven forventes at have et bnd ved 63 kDa, da dette er vgten for Asb11
fusioneret med GFP. Det forventes ikke at der er andre bnd, da disse er blevet vasket
vk.
Positiv kontrol- forventes at have et bnd ved 63 kDa, da man er sikker p at denne
kontrol indeholder fusionsproteinet.
Ubehandlet U2OS Her forventes ingen bnd, da fusionsproteinet ikke er tilstede.
Side 48 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Tranformation
Side 49 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Side 50 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Vi forberedete 4 PCR rr til 4 kolonier og disse skulle s til opformering og bagefter
markr
1
= rr 1
= rr 2
= rr 3
Side 51 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
tjekkes p en agerose gel, se figur X. P billedet kan ikke se noget og derfor er der
ingen der er positive, de er alle negative.
Side 52 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Figur 1: Agerose gel
Da alle var negative, havde vi ikke noget at lave minipreps p, men vi fik noget fra en
anden gruppe. Denne minipreps gik godt. Vi fortyndende vores miniprep til 100X 1 i en
eppendorfrr.
Vi mlte vores miniprep p spektrofotometer ved 260 nm og 280 nm.
1
2
3
G.SNI
T
260 NM
0,017
0,017
0,017
0,017
280 NM
0,035
0,034
0,036
0,035
I velses vejledningen skulle der bruges 2 ug af produktet, i uL ville dette vre 23,5 uL
, men da vi kun har 15 uL tilbage kan vi kun f en koncentration p 1,3 ug. For at
kunne sammenligne med et tomt plasmid, er denne ogs nd til kun at vre 1,3 ug.
DNA koncentration2
0,085 ug/uL
2 ug af produkt3
23,5 uL
15 uL tilbage4
1,3 ug

Agerosegeler
1 Bilag 3, side 7.
2 Bilag 5, side 7.
3 Bilag 6; side 7.
4 Bilag 7, side 7.
Side 53 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Markr
Asb11 gen
NTC
Ingen template
Uspecifikke primer
PCR produkt om vores DNA er blevet opformeret

Det ses at markren er meget svag, men man kan lige se den ved siden af lane 2. I
lane 2 er det opformerede Asb11 gen, denne har en molvgt p 972 basepar. Ved
lane 3 er der intet template, og det forventes at der ikke kommer noget bnd ved
denne, da den ikke indeholder det gen der skal opformeres. I lane 4 er der uspecifikke
primers, alts primere der kopiere end anden sekvens end den vi nsker der bliver
kopieret. Vi forventer ikke at der kommer et bnd, da templaten indeholder det gen vi
gerne vil opformere. De uspecifikke primere kan alts ikke finde den sekvens de er
rettet imod, og derfor bliver der ikke kopieret noget, og man ender alts uden et bnd
i denne lane.
Vektor digest (skret med forskellige

enzymer)
Markr
Dobbelt digest
Single digest Eco RI
Single digest BanHI
No digest
Side 54 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Vores vektor skulle skres med to forskellige

restriktionsenzymer, da det gen der skal splejses
ind ellers kunne vende p hovedet eller forkert,
og det dermed ikke ville f den nskede funktion.
Der blev brugt EcoR1 og BamH1 som restikrtionsenzymer. P gelen er der medtaget
kontroller af singel digest, for at sammenligne
disse med dobbelt digest (vektoren) og for at
sikre at vores restriktionsenzymer virker. Det
ses at ved singel digest er der enkelt bnd ved
begge to, dette skyldes at vektoren kun er
blevet klippet en enkelt gang, og vektoren nu
bare er en lang streng. Ved dobbelt digest bliver
vektoren klippet to gange, og dette bevirker at der komme to streger p gelen, da
vektoren er blev delt i to streng af forskellig strrelse. Der er ogs medtaget en No
digest, alts en vektor der slet ikke er blev klippe, dette gres for at sammenligne
denne med de vektorer der er blevet klippet. Grunden til at singel diget og no digest
ligger det samme sted, kan vre at konformationen af no digest, er mere supercoiled
og derfor kan vandre lngere i gelen fordi den er mere kompakt. Det linere DNA
stykke vandre ikke nr s hurtigt som det supercoiled, og derfor ses bndene til at
vre det samme.
Det ses at vektoren er fuldstndig skret, da der er fremkommet to bnd. Det bnd
der har migreret lngst, er det lille stykke der er blevet klippet ud af vektoren. Det
Side 55 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
andet bnd, er den lidt lngere streng, der ikke er migreret nr s langt p grund af
strrelsen. Man kan dog ogs se at den lange streng fra dobbelt digest er kortere end
dem i single digest, fordi den er migreret lngere.
Ligerings mix og en kontrol af

ren vektor
Forkert markr
Vektorkontrol
Ud fra agerosegelen er der i den frste brnd en forkert markr, den rigtige markr
der skal bruges er phage lambda. I den anden brnd er vektorkontrollen, et tomt
plasmid. Ved den sidste brnd kan man aflse, ved hjlp af vektorkontrol, at der
stadig er noget rent vektor i prven. Dog ses det ogs at der er et bnd for
ligeringsmixen. Ligeringsmixet er hvor genet er blevet klistret ind i vektoren. Det er
lykkedes at fremstille et plasmid med det nskede gen, men det ses ogs at der er
noget af vektoren hvor det ikke er lykkedes at f genet ind i. Vandringen for
ligeringsmixet vil migrere til 972 + vektoren. Men da det er en forkert markr, kan
denne strrelse ikke findes. Det er ogs blevet prvet at finde markr information p
phage lambda, men dette har heller ikke vre muligt.
Side 56 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Delforsg:
Alkalisk phosphatase enzymkinetik
Rkke 1
Mtningskurve5
Ved koncentrationen 10, fik vi ingen resultat, da vi kom til at gre noget forkert p
apparatet. Derfor bliver den udelukket i rkke 1.
Mtningskurve for rkke 1
Mtningskurve
Logarithmic
(Mtningskurve)
Estimater:
Vmax0,022 absorbansndring/min
Km
230 uM
5 Bilag 1, side 3.
Side 57 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Lineweaver burk plot reciprokke vrdier
Lineweaver burk plot

12
10
8
Vi
Linear ()
4
2
0
0 f(x)0.02
=
R = 0
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
Koncentraatipm uM
Rkke 2
Mtningskurve6
Mtningskurve - rkke 2
0.02
0.02
Mtningskurve
Vi abs/min 0.01
Logarithmic
(Mtningskurve)
0.01
0
0
200
400
600
800
Koncentration uM
6 Bilag 2, side 5.
Side 58 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Estimater:
Vmax0,019 absorbansndring/minut
Km
195 uM
Lineweaver burk plot reciprokke vrdier
Lineweaver burk plot

f(x) = 13832.05x + 59.65
R = 0.83
plot
Linear (plot)
Oversigt over rkkerne

RKKE ESTIMATER
1
VMAX
0,022
absorbansndring/minut
KM
230 uM
RKKE
2
VMAX
LINEWEAVER BURK PLOT7

0,0087
190,4 uM
ESTIMATER
LINEWEAVER BURK PLOT8
0,019
0,018
7 Bilag 1, side 3.
8 Bilag 2, side 5.
Side 59 af 67
Anita N
Mette D
Malene H
KM

Bioteknologi
195 uM
18/11 - 2014
CAAN
231,90 uM
Er Pi en kompetetiv eller non-kompetetiv inhibitor?

Ved kompetitiv hmning, vil inhibitoren stte sig i det samme active site som
substratet. Dog kan man ved at hve koncentrationen af substrat forge substratets
chance for at f pladsen. En kompetitiv hmmer vil gre km strre, men ikke ndre
p Vmax. En hj vrdi for km betyder at der er lav affinitet mellem substrat og
enzym, og dette giver god mening da bindingen ikke lngere kun gr til substrat men
ogs til inhibitor. Ved en non-kompetitiv hmmer, stter inhibitoren sig et andet sted
p enzymet end i det active site. Det vil sige at substratet alts stadig kan stte sig
fast, dog bevirker inhibitoren at der ikke bliver dannet et produkt. Herved vil Vmax
nedsttes, da denne betegner hastigheden hvormed enzymet kan omstte substrat
til produkt. Vmax vil aldrig blive lige s stor (som Vmax er uden inhibitor) da der altid
vil vre nogen enzymer der ikke bidrager til produkt dannelsen.
Ud fra resultaterne ses det at der i rkke 1 (uden inhibitor) har Vmax = 0,008688 og
km= 190,4
I rkke 2 (med inhibitor) fr Vmax til 0,01676 og Km til 231,90
Ud fra disse tal kan der umiddelbart ikke siges noget om inhibitoren er kompetetiv
eller non-kompetetiv, men hvis man kigger p mtnings kurverne for de to rkker ses
det, at hvis man skal estimere Vmax bliver denne nogenlunde den samme, men km
ndres. Ud fra dette kan vi sige at Pi er en kompetetiv hmmer, da denne konkurrere
med substratet om det active site i enzymet, men hastigheden forbliver den samme.
Alkalisk Phosphatase har brug for en co-factor. Hvilken?
Side 60 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Alkalisk phosphatase har brug for bde Mg 2+ og Zn2+ som co-factor, fordi det
indeholder tre klasser af metal i dens bindingssteder, hvor Zn 2+ indtager den
katalytiske og strukturelle sites, mens Mg2+ ioner er bundet p det regulerende site.
Mg2+ fungere som en aktivator i optimale koncentrationer, men den bliver inhiberende
hvis den har for hje koncentrationer. Det kan vre fordi der er overskydende Mg 2+
ioner, som gr ind og skubber Zn 2+ fra det katalytiske site, da begge metalioner kan
binde sig til det samme sted.
Diskussion
A.P i Western blot:
Det lykkedes ikke at lave et western blot. Dette kan eventuelt skyldes at substratet
der skulle have bundet sig til det sekundre antistof, p en eller anden mde er holdt
op med at virke. Dette kan skyldes at det ikke har vret opbevaret korrekt, eller at det
er blevet for gammelt. For at sikre at det ikke var for kort tids inkubation med primrt
antistof, prvede vi at inkubere det en hel dag, hvorefter vi gik videre med det. Dette
gav dog stadig intet resultat, membranen forblev helt, med undtagelse af der hvor
markren var. Vi havde forventet at vi ville f et bnd ud for 57 kDa, da dette er
alkalisk phosphatases vgt. Det forventedes ogs at bndet ved triton-x-lysatet ville
vre svagere end bndet ved 2XLSB lysatet. Dette skyldes at 2xLSB lyserings
metoden, er mildere mod proteinet under lyseringen af cellerne. Ud fra resultaterne
fra ImageJ, ses det ogs at arealet for prven med 2XLSB er langt strre end det for
triton-x-100 prven, dette bekrfter vores teori om at der ville vre mere bevaret
protein i 2xLSB prven. Vi forventede derfor at der ville have vret bevaret mere
protein. Vi havde ikke forventet at der var andre bnd p membranen, da der er blevet
inkuberet med antistoffer, som er specifikke overfor netop et protein. Hvis der alligevel
var kommet et bnd, kunne det skyldes krydsreaktion, hvor et antistof binder sig til en
epitop der ikke helt passer til.
Ved coomassiefarvningen er der kommet mange bnd hele vejen ned gennem gelen,
det havde vi ogs forventet da coomassie farvning farver alle proteiner. Det har derfor
Side 61 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
vret en smule svrt kun at markere det bnd der er alkalisk phosphatase, specielt i
ImageJ. Her skal den vertikale side vre lngere end den horisontale, ellers tror den
at gelen ligger p siden. Dog har det alligevel vret muligt at beregne en
koncentration for alkalisk phosphatase. Via bradformetoden blev der lavet en
standardkurven, den blev ikke helt perfekt, men kunne alligevel bruges. Ud fra den
blev der beregnet en koncentration p trition-x-100 lysat prven, koncentrationen blev
0,88 ug/uL. Dog da prverne blev mlt, fandtes det lidt mrkeligt at prven gav s hj
en absorbans som det gjorde. Prven blev mlt flere gange, og i forskellige
fortyndinger, men absorbansen svingede voldsomt meget, s det blev besluttet at
bruge resultatet fra den frste mling, som var lige efter der var blevet mlt p
bradfordoplsningerne. Ud fra ImageJ fandtes en koncentration p 0,036 ug/uL, dette
ligger ret langt fra resultatet fra bradfordmetoden. Dette kan skyldes at der i
bradfordmetoden bliver mlt total protein indhold, da coomassiefarven farver alle
proteiner. Derimod i ImageJ bliver koncentrationen udregnet kun for alkalisk
phosphatase, og er derfor en del mindre.
Det kan konstateres at LSB metoden er bedre hvis man nsker at bevare mest muligt
protein, det kan ogs konstateres at U2OS indeholder alkalisk phosphatase i en
koncentration af 0,88 ug/uL.
Asb11-GFP coomassie farvning og oprensning

Da western blottet fra alkalisk phosphatase var fejlet af ukendte rsager, blev det
besluttet at vi ville udfrer et andet forsg med Asb11-GFP. I denne metode blev der
anvendt beads til protein oprensning, sammen med denne blev der ogs loadet
uoprensede prver. Det var meningen at SDS-page gelen skulle coomassiefarves, men
da gelerne skulle kres opstod der en rkke problemer. Da vi loadede prverne p
SDS-gelen, fld de direkte ud i gelen, og forblev ikke i brndene som det var tiltnkt.
Dette kan eventuelt skyldes at brndene var blev udsprjtet med en kanyle, for at
gre det lettere at loade prverne. Det kan tnkes at kanylen har delagt brndene.
Da gelen blev sat fast i SDS-gel karret, sagde den knk da den blev spndt fast, og
kan muligvis her vre blevet knkket. Ydermere fandt vi ud af, at karet vi benyttede
havde en ls forbindelse. Det bevirkede at der ikke blev skabt et elektrisk felt, som der
er brug for nr de negativt ladet proteiner skal vandre mod anoden (positive ende).
Der blev skiftet til et andet gel kar, men her var der ogs problemer med strmmen,
Side 62 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
og efter lang tids prven blev ogs det slukket. Det lykkedes derfor ikke at f noget
resultat fra denne velse. Det vi forventede af resultater ved coomassiefarvning af
uoprensede proteiner og oprensede proteiner, var at der ville vre betydeligt flere
bnd ved den uoprensede. Dette skyldes at coomassiefarven binder sig til alle
proteiner, og i den uoprensede prve er der mange proteiner, bde fra cellen selv, og
fra det plasmid vi har indsat i cellen. Ved den oprensede prve vil der kun vre et
bnd ved Asb11-GFP fusions proteinet, da alle andre proteiner er blevet vasket vk.
Ydermere har vi forskellige kontrol prver, og som der er forklaret i resultaterne,
forventes der forskellige bnd af forskellige vgte. Ved vores ubehandlede celler
forventer vi at der vil vre lidt forskellige bnd, som stammer fra proteiner inde i
cellen selv, men ikke noget bnd ved asb11-GFP da det ikke er naturligt i cellen. Ved
vores mock kontrol forventer vi at der igen vil vre bnd for proteiner fra cellen selv,
ikke noget asb11-GFP bnd men tilgengld vil der kunne ses et bnd for reagenserne,
hvis disse giver udslag til det. Ved den tomme vektor forventer vi kun bnd fra cellens
egen proteiner. Ved den positive kontrol forventer vi at der vil vre et bnd for asb11GFP, og samtidig vil der i de uoprensede prver vre bnd for andre proteiner for
cellen. Ved de oprensede prver vil der hverken vre bnd for asb11-GFP ved mock
kontrollen, den ubehandlede eller den tomme vektor, da de andre proteiner vil vre
vk efter vaskningen. Der vil tilgengld vre et bnd for asb11-GFP ved den positive
kontrol og ved prven, da den har asb11-GFP.
Dyrkning af U2OS celler PEI Transfektion

Det lykkedes os ikke at dyrke U2OS celler. Da vores U2OS celler dde, fik vi lov til at
lne fra en anden gruppe. Grunden til dette kan eventuelt vre at da vi tilsatte friskt
medie til flasken, har vi ikke fet resuspenderet cellerne grundigt nok. Cellernes
konfluens blev tjekket to dage efter de var blevet splittet, her skulle de have haft en
konfluens p ca. 80% men de havde kun en konfluens p 40%. Herefter fik cellerne lov
til at vokse i en dag mere, men konfluensen blev ikke bedre, s det blev derfor
konkluderet at de var dde.
PEI Transfektion
Da vi blandende i eppendorf rrene blev rr 3 (vektorkontrol) og 4 (prve) tilsat PEI
efter DMEM uden serum og frst bagefter blev der tilsat DNA til den ene og tomt
plasmid til den anden. Det skulle have vret gjort omvendt, da det skulle mixes inden
Side 63 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
PEI blev tilsat. Men da det ikke lykkedes at krer en SDS-page med vores prver, fandt
vi aldrig ud af om dette har betydning for prverne.
Kompetente celler & transformation af E.coli

Der var nogle problemer med vores kompetente celler, vi fik ikke noget ved
vektorkontrollen eller ved ligeringsmixet da de havde inkuberet. S vi tjekkede om
vores celler overhovedet var kompetente, ved at transformere dem med et
ligeringsmix, hvor vi var sikre p at plasmidet indeholdte asb11-GFP genet. Efter
inkubering var der ingen kolonier, og vi kunne derfor konkludere at vores celler ikke
var kompetente. Hvor vidt cellerne overhovedet var levende vides ikke, da de blev
dyrket p et medie med kanamycin, som kun de bakterier der har optaget plasmidet,
har resistens for. S vi fik lov til at anvende nogle celler fra sidste r, som med
sikkerhed var kompetente. Dem pladede vi ud p LB-KANA plader og inkuberede
natten over, og p disse var der vokset kolonier. Vi undersgte bagefter cellerne via en
agarosegel, for at se om de indeholdte asb11-GFP genet. Men der kom ingen bnd p
gelen, s derfor var alle kolonierne negative, og indeholdte alts ikke asb11-GFP
genet. Da vi er sikre p at vores celler er kompetente, m fejlen ligge i ligeringsmixet
(se mere herom under kloning af asb11).
Kloning af Asb11
Opformering af DNA-fragmentet for asb11 skete via PCR med primerne EcoR1 og
BamH1. Det frste forsg med at opformere DNAet lykkedes ikke, dette kan skyldes
en lang rkke ting, det kan blandt andet optimeres p Mg koncentration og
annealings temperaturen. Dette blev ikke gjort i andet forsg, s det tyder mest p en
afpipeteringsfejl. Men da vi prvede anden gang gik det rigtig godt, og vi fik et meget
tydeligt bnd, ud for 972 basepar. Ved vores kontroller er der ikke kommet nogen
bnd, og dette stemmer overens med vores forventninger. I prven uden template
forventes det ikke at der kommer et bnd, da template indeholder det stykke DNA der
skal opformeres. Til denne prve er der ogs tilsat de specifikke primers, og nr disse
ikke har en sekvens de kan genkende, kan de ikke starte kopieringen af noget. I
prverne med uspecifikke primers kom der heller ikke nogen bnd i overensstemmelse
med forventningen. De uspecifikke primers kan ikke stte sig p templaten, da denne
ikke indeholder sekvensen de kan genkende, og derfor ikke kan kopiere noget.
For at vre sikre p at vi fik skret vektoren rigtigt, blev dette undersgt ved at kre
en lille smule af det i en agarosegel, sammen med kontroller. Vektoren skulle skres
Side 64 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
med to forskellige restriktionsenzymer, for at vi kan vre sikre p at det gen vi

indstter kommer til at vende rigtigt. Det kan have betydning hvis genet ikke vender
rigtigt, det kan eventuelt medfre at genet ikke er aktivt. Ved vores prve fik vi to
bnd, dette stemmer overens med forventningerne. Nr vektoren bliver skret to
steder, resultere det i to strenge, en stor og en lille, og det er dem vi kan se p gelen.
Ved vores kontroller er der kommet et bnd lngere nede p gelen. Dette skyldes at i
single digest kontrollerne bliver vektoren kun skret et sted, hvilket bevirker at det
bliver til en streng. Vi har ogs en kontrol uden digest, her bliver vektoren slet ikke
skret, men den er stadig tilstede. Grunden til at single digest kontrollerne er vandret
nsten lige s langt som no digest kontrollen kan vre at no digest kontrollen har en
vektor, og denne kan vre supercoiled, den vil derfor vandre lngere fordi den er
mere kompakt. Det linere DNA stykkes der er i single digest kontrollerne vil ikke
vandre s langt fordi det ikke er nr s kompakt. Grunden til at det lange stykke fra
prven er vandret lngere end single digest kontrollerne, er at prvens linere DNA
stykke er mindre, og dermed kan vandre lngere.
Da der skulle kres ligeringsmix (vektor og DNA) kom vi til at bruge en forkert markr.
Dog ses det ogs ud fra gelen, at det er lykkedes at fremstille noget plasmid med
genet Asb11 koblet til GFP. Dog kan vi ogs ved at sammenligne vektorkontrollen med
vores prve, se at der ogs er noget af vores vektor der er klistret sammen uden at f
genet ind i sig. Det vil alts sige at vores ligeringsmix ikke er helt perfekt, men
muligvis brugbart. Da vi har fet gode resultater i de andre agarosegeler, kan fejlen i
ligeringsmixet mske ligge i phosphorlyreringen af vektoren. Phosphorlyreringen burde
havde gjort at vektoren ikke kunne lukke sig uden PCR-produkt /genet men det har
den gjort alligevel. Der kan ogs vre sket noget under sammensmeltningen af vektor
og PCR produkt der har gjort at det ikke er blevet sammensmeltet s godt som den
kunne.
Ensymkinetik
Mlingerne af enzymaktiviteten af alkalisk phosphatase gik meget fint, med
undtagelse af den frste mling der ikke blev gemt, da vi kom til at trykke forkert p
computeren. Alligevel er det lykkedes at opstille mtningskurve og Lineweaver-burkplot, og beregne Vmax og Km.
For rkke 1 (uden inhibitor) Estimerede vi Vmax = 0,022 absorbansndring/min og
Km 230 uM. Beregnede Vmax= 0,0086 absorbansndring/min og Km 190,4 uM
Side 65 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
For rkke 2 (med inhibitor) estimerede vi Vmax = 0,019 absorbansndring/min og

Km 195 uM. Beregnede Vmax = 0,016 absorbansndring/min og Km 231,9 uM
Det var meningen at vi ud fra de beregnede vrdier, skulle vurdere om organisk
phosphat (Pi) var en kompetetiv eller non-kompetetiv hmmer. Men da de resultater
vi har fet ligger s langt fra hinanden er det svrt at konkludere noget. Men hvis
man kigger p de estimerede vrdier, ses det at Vmax er nsten den samme, men
de beregnede Km tal stiger fra 190,4 uM til 231,9 uM. S da det vides at Vmax vil
forblive den samme, mens Km vil stige hvis det er en kompetetiv hmmer, kan vi
konkludere at det er en kompetetiv hmmer. Grunden til at Vmax forbliver den
samme er, at enzymet omdanner substrat til produkt ved den samme fart som fr. Km
stiger da affiniteten til substratet falder. Ydermere fandt vi ud af at alkalisk
phosphatse har brug for cofaktorer i form af Mg og Zn, for at kunne virke optimalt. Mg
gr ind og styrke enzymet, mens Zn booster aktiviteten af enzymet.
Side 66 af 67
Anita N
Mette D
Malene H

Bioteknologi
18/11 - 2014
CAAN
Konklusion
Det lykkedes at opformere genet der koder for humant Asb11 via PCR, men det
lykkedes ikke at f dette ind i vektoren. Det lykkedes ikke at gre E.coli celler
kompetente, og heller ikke transformation med udleverede kompetente celler og
udleveret plasmid lykkedes. Det lykkedes heller ikke at undersge Asb11-GFP ved
proteinoprensning og coomassiefarvning. Det lykkedes heller ikke at dyrke U2OS
celler.
Det lykkedes delvist at undersge stabiliteten af alkalisk phosphatse ved forskellige
lyseringsmetoder af U2OS celler, westernblotting fejlede, men coomassifarvningen og
bradfordmetoden lykkedes, og gav en total protein koncentration p 0,88 ug/uL og
alkalisk phosphatase har en koncentration p 0,036 ug/uL
Det lykkedes at undersge alkalisk phosphatases enzymaktivitet til at vre:
Uden inhibitor: Vmax= 0,0086 absorbansndring/min og km 190,4 uM
Med inhibitor: Vmax= 0,016 absorbansndring/min og km 231,9 uM
Organisk phosphat er en kompetetiv hmmer for alkalisk phosphatase, da denne
hver Km vrdien. Alkalisk phosphatase skal bruge cofaktorer i form af Mg og Zn.
Side 67 af 67

Rettet Rapport Igen

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

You might also like

Rettet Rapport Igen

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Rettet Rapport Igen

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Isolering af genet Asb11 og

Dato for udfrelse:

Hold: Anita, Malene og Mette D

Dato for aflevering af rapport:

Punkterne herunder er forbeholdt underviseren.

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Alkalisk phosphatase i western blotting....................................................................41

Bradford metoden og coomassiefarvning........................................................41

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Figur 1 Dephospholyrering med alkalisk phosphatase

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Undersgelse af Asb11-GFP i Westernblot.

Figur 2 Asb11-ligase-ubiquitin kompleks

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Lysering af humane celler

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

ladet, og hvis pH er lavere vil det vre positivt ladet.

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

koncentrationen og ender p fx 20%. Dette gr at man kan bestemme

Figur 5 Protein behandlet med SDS og DDT

ogs her vandre mod anoden (den positive

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Figur 6: Eksempel p overload

Coomassie farvning er en metode til at synliggre proteiner. Coomassie farven binder

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

under de forskellige pH-stadier. Princippet i Bradfordmetoden er at coomassie farven

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

under behandlingen med SDS-buffer, kan et monoklonalt antistof ikke genkende

Figur 7 Farvekompleks dannelse via peroxidase

Protein oprensning via beads.

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

mister de nogen baser i hver ende at DNA-strengen.

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

hvor CO2 atmosfren er p 5%. Sammenstningen af gasserne i dyrkningskamrene

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

DNA er negativt ladet ved fysiologisk pH, som er den pH der

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Kloning af humant Asb11 via Polymerase Chain reaction (PCR)

Donor-DNAet skal overfres til en vektor, og det rekombinante DNAmolekyle

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Skring af DNA med restriktionsenzymer

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Asb11-GFP i western blotting

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Isolering af genet Asb11 og tranformering af celler

Calcium kompetente celler