Metodevalidering af ELISA

Assay Validation of ELISA

Underviser: Christina
Hold: Anita, Signe, Jane
Dato for udfrelse:
Dato for aflevering af rapport:
Underskrifter:

Dato for tilbagelevering:____________________________________________________________

Dato for eventuel genaflevering:______________________________________________________
Dato for godkendelse:______________________________________________________________

Indholdsfortegnelse
HYPOTESE....................................................................................................3
TEORI.........................................................................................................3

Metodevalidering af ELISA
VALIDERING..................................................................................................5
FREMGANGSMDE............................................................................................7
OPTIMERING..................................................................................................9
PRISER......................................................................................................10
RESULTATER................................................................................................10
DISKUSSION:................................................................................................16
KONKLUSION:...............................................................................................19

Hypotese
En ekstern virksomhed kontakter os, for at f et tilbud p en kvantitativ analyse af alkalisk
phosphatase p Elisa. Derfor skal det dokumenteres at der benyttes en metode, der p lborg

Metodevalidering af ELISA
Universitet Esbjergs laboratorie kan leve op til kundens krav til prcision og njagtighed og det
skal undersges hvad omkostningerne vil blive.

Teori
Processen bestr af tre dele: vkst og oprensning af bakterier, SDS-PAGE og Elisa. Fokus vil
primrt vre p Elisa, men de andre omrder vil blive berrt kort.
Vkst, oprensning og udfldning
Alkalisk phophatase1, er et protein der findes i det periplasmatiske rum i E.coli2. Dette skal isoleres
for at anvendes til analyt i Elisa. Ved at ndre p saltkoncentrationen eller temperatur lyseres
cellevggen i E.coli og AP frigives. AP er hydrofilt og udfldes med ammoniumchlorid, fordi
ammoniumchloridet fortrnger vandet fra AP, som herved klumper sammen og udfldes.
Ammoniumchlorid bortrenses med dialyse. Princippet bag dialysen er, at der inde i dialyseslangen
er et hjt osmotisk tryk pga. ammoniumchlorid. Derfor vil ammoniumchlorid transporteres igennem
den semipermeable dialyseslange til den omkringliggende vske med lavt osmotisk tryk.
SDS-PAGE
For at sikre, at den fremstillede prve bestr af AP, benyttes Natriumdodecylsuldat
polyakrylamidgelelektroforese3. Frst koges prve tilsat SDS-buffer for at f brudt de svovlbroer
der holder proteinerne fast i en indviklet sammenkrllet struktur. Prven denatureres af SDS-buffer,
s det ndres fra en sammenkrllet struktur til udrettet tilstand og afskrmer proteinets ladning.
Derved er der kun en komponent der pvirker vandringslngden i gelen: molvgten. Ved at sende
strm igennem gelen vil molekylerne blive flyttet, jo strre molekyle jo hurtigere vil det bevge
sig. P den mde adskilles proteiner i prven afhngig af hvor stor molekylevgt de har.
Vandringslngden vil efter tilstning af farvestof vise sig som et blot bnd, som sammenlignes med
en kendt standard, markren, som indeholder en lang rkke proteiner. Det forventes at der vil
komme et bnd svarende til 49 kDa, da det er her AP skal vre. P SDS-PAGE loades desuden en
standard af AP, for at verificere den fremstillede prve. Ved at sammenligne intensiteten mellem
1 Alkalisk phosphatase forkortes til AP i resten af rapporten
2 E. Coli stamme HO1069
3 SDS-PAGE

Metodevalidering af ELISA
bndene fra en kendt standard og prve, kan koncentrationen i prven estimeres, hvilket kan
benyttes til at bestemme hvor meget prven skal fortyndes til undersgelse p Elisa.
Elisa
I dette forsg er der valgt at arbejde ud fra indirekte nonkompetitiv metoden.
Princippet bag Elisa er illustreret p bilag 1, side. . Formlet med Elisa er at mle kvantitativt p
mngden af protein i en prve. Prven blandes i en coating buffer, som holder pH stabilDerp
anbringes prven i plastikbrnde bestende af et materiale, som kan fasthfte proteinerne. Derved
isoleres proteinerne fra resten af prven. Hvor godt proteinet binder sig til brnden afhnger af pH
og dermed af coatingbufferen. Det er vigtigt at coatingbufferen ikke indeholder Tween 20, da de
ligesom proteinet kan binde sig til brnden, hvilket medfrer at der blokeres for proteinet. Imens
prven skal have tid til at diffundere jvnt ud til brndene holdes temperaturen stabil, for at
beskytte prven fra denaturering af proteinerne.
De frie pladser i brnden blokeres med en blokeringsbuffer indeholdende Tween 20, for at forhindre
andre stoffer i at binde sig til brnden og interferere med reaktionsforlbet. Herefter skal der
tilsttes et primrt antistof4 der er specifik over for proteinet. Et sekundrt antistof, som er
specifikt overfor det primre tilsttes. Det sekundre antistof 5 tilsttes fordi det indeholder et
enzym6, som kan oxidere H2O2 ved hjlp fra en hydrogendonor, hvilket medfrer et farveskift.
Denne reaktion sker ved at der tilsttes TMB som indeholder H 2O2 og hydrogendonor. Reaktionen
medfrer, at der bliver dannet en bl farve, hvis intensitet afhnger af koncentrationen af enzymet
og dermed af koncentrationen af proteinet i prven.
Elisa er en meget flsom metode og flsomheden kan beskrives som et ml for hvor meget
absorbansen ndres ved ndring af koncentrationen, dvs. den kan beskrives som:

A
. Dette
c

svarer til hldningen p standardkurven.

Flsomheden er afhngig af hvilket mleomrde der arbejdes i, jo mere stejl kurven er, desto strre
er flsomheden. Strre flsomhed kan give mere njagtige resultater, men ogs strre risiko for
4 Kanin -alkalisk phosphatase
5 Ged Anti-kaninIgG-peroxidase-konjugerert
6 HRP

Metodevalidering af ELISA
fejlkilder. Under opsttelse af metoden skal der tages hensyn til, hvor stor flsomhed der nskes til
den specifikke opgave.
Elisa bruges til at teste sygdomme, som eksempelvis HIV, den kan skelne to proteiner, som kun er
forskellige p en enkel aminosyres plads. Det som gr metoden meget flsom, er at der bliver
anvendt antistoffer til pvisning. Disse antistoffer binder sig til specifikke antigener, eller andet de
er specifikke overfor. Elisa er ekstremt flsom overfor forurening, dette betyder at det er vigtigt at
der altid udskiftes pipette spids i mellem hver eneste brnd, for at sikre sig for andre ting der kan g
ind og pvirke resultatet. Det er vigtigt at pH er indstillet korrekt og at diverse buffere har den helt
rigtige koncentration, ellers kan dette giver falske resultater.
En anden vigtig faktor er inkuberingstiderne, det er ved denne tid at antistoffet og prven klber sig
fast til brnden, hvis denne inkuberingstid ikke str i den tid det fremgr i protokollen, vil
antistofferne muligvis ikke have nede at stte sig fast til brnden og derved vil de blive vasket ud i
vasketrinnet. Dette vil give et falsk resultat.

Validering
Der vil blive arbejdet med flgende valideringsparametre:
-

Njagtighed (7-dobbelt bestemmelse t-test)

Prcision (RSD)
Linearitet (standardrkke)
Flsomhed
Robusthed
LOD
LOQ
Specificitet
Genfinding

Njagtighed
Njagtighed fremstilles som en 7-dobbeltbestemmelse af en kendt koncentration p 0,025 ng/L
fremstillet fra standarden. Det drligste punkt fra rkken er fjernet, da der er 8 brnde i en rkke.
En mling der ser ud til at afvige meget fra de vrige mlinger undersges ved en q-test, for at se
om de skal beregnes som outlayers og dermed udelades. Hvorvidt resultatet er njagtigt ses ud fra
en t-test, hvor den mlte vrdi sammenlignes med referencevrdien. Hvis den udregnede t-vrdi

Metodevalidering af ELISA
ikke falder indenfor acceptomrdet betyder det, at der er bias. Dette regnes ud ved at trkke
gennemsnittet i den 7-dobbeltbestemmelse fra referencevrdien.
Prcision
Prcisionen kan bestemmes ud fra %RSD eller ved at opstille et konfidensinterval. Det undersges
ud fra en standardrkke fremstillet p baggrund af triplikater, samt ud fra den 7dobbeltbestemmelse. Der er beregnet %RSD for at se prcisionen, da der arbejdes med hje
afvigelser, dvs. normalvis fra 10-20% p Elisa metoden og det var ikke muligt at finde intervallerne
for s hje tal.
For at opn en god prcision undersges arbejdes der s vidt muligt under repeterbare forhold.
Optimalt set burde samme person udfre de fleste af pladerne, dette er dog ikke muligt her.
Derudover lgges vgt p at anvende de samme materialer, samme udstyr og helt samme
procedure ud over den faktor der forsges optimeret. Der anvendes afvejede pipetter til fortynding
af standardstof og antistoffer, samt til fremstilling af standardrkken for at opn en god prcision.
Linearitet
Der er ud fra standardrkken fremstillet en kurve, for at kunne finde det linere mleomrde. Der
er fjernet punkter fra den hjeste ende af mleomrdet indtil der var en hj R-vrdi, at omrdet
kunne betegnes som linert.
Flsomhed
Flsomheden aflses som standardkurvens hldning. Der optimeres ikke videre med denne vrdi,
da det gres ved fx at ndre p apparaturet, hvilket ikke er relevant her.
Robusthed
Robustheden er undersgt ved at forskellige personer har fremstillet pladerne, samt forskellige
prvekoncentrationer og behandling af prver. Dette vil samtidig give oplysninger om
reproducerbarheden.

LOD

Metodevalidering af ELISA
Limit of detection er et kvalitativt udtryk, som angiver den mindst mulige koncentration der skal
vre i prven, for at proteinet kan registreres ud fra metoden. Det antages at blindvrdien er 0. Der
fremstilles 7 enkeltmlinger mlinger med repeterbarhedsbetingelserne opfyldt. Dkningsfaktoren
vlges til 3, svarende til 95% konfidensinterval.
LOQ
Limit og quantification er et kvantitativt udtryk, som angiver den mindst mulige koncentration der
skal vre i prven, for at proteinet kan kvantificeres ud fra metoden. Her antages at blindvrdien er
0 og der anvendes dkningsfaktor 10.
Specificitet
Specificiteten undersges ved at forsge at oprense protein fra B. cereus og undersge hvorvidt
dette kan registreres ved hjlp af den valgte metode med de valgte antistoffer.
Genfinding
For at undersge, hvorvidt der kan vre andre stoffer, der interfererer med resultatet, fremstilles en
spiket prve. Der mles p en mngde prve med og uden spike. Der er valgt AP standard med en
kendt koncentration p 0,025 ng/L som spike. Den spikede prve er fremstillet af coating, hvor
der tilsttes en kendt mngde standard og holdes op imod en blindprve.

Fremgangsmde
Fremgangsmden tager udgangspunkt i velsesvejledningerne p stedet(se bilag) og er tilpasset
dette projekt. P bilag XXXX ses et detaljeret flowdiagram over fremgangsmden, som kun kort
beskrives i dette afsnit.
E.coli opformeres i Luria Broth i varmeskab og cellerne hstes ved hjlp af centrifugering. De
oprenses med Tris-base og fldes med ammoniumchlorid, som herefter bortelimineres ved hjlp af
dialyse med TMZP. Undervejs i processen tages 2 gange fra til SDS-PAGE.
Den frdige prve skal verificeres p SDS-PAGE. Arbejdet med gelen foregr i stinkskab med
handsker indtil efter elektroforesen er frdig. Der anvendes en markr i frste brnd, en kendt
standard i 2. brnd, prve i 3. brnd og ufrdig prve i 4. og 5. brnd. Der loades 10 L markr og

Metodevalidering af ELISA
standard samt 20L prve og ufrdig prve. SDS-PAGE kres p Amersham elektroforese med
tris-glycin buffer som running buffer.
Elisa foregr over 2 dgn, da coatingen skal vre i brndende natten over. Til coatingen benyttes en
afvejet multichannel pipette med stor fokus p prcision. Efter inkubation i kleskabet tmmes
brndene forsigtigt og vaskes i vaskebuffer med Tween 20 med Elisa-vasker. Der tilsttes primrt
antistof med multipipette, som skal have ca. 40 minutter til at inkubere. Herefter tilsttes sekundrt
antistof ligeledes med ca. 40 minutters inkubation. Tempereret TMB tilsttes med fast interval som
mles prcis med stopur. Herefter dkkes pladen med stanniol indtil en passende farveintensitet er
opnet og der tilsttes stopvske. Resultaterne aflses ved 450 nm p Elisa reader.
Der er foretaget en del ndringer i fremgangsmden i forhold til flowdiagram, bilag 2 . side.. I
punkt 3 skal de store frdig podet flasker vre p rystebord. Da laboratoriet ikke har et rystebord til
rdighed til s store mngder mtte flaskerne st i varmeskab og rystes manuelt. For at optimere
yderligere burde vre benyttet flaske med bafta, men disse var ikke til rdighed til de store
mngder bouillon.
Punkt 4 blev ndret, da vi havde s stor en volumen at den ikke kunne centrifugeres p n gang.
Dette resulterede i at prven blev overfrt fra den store 5-litersflaske til flere centrifugerr 50 mL.
P denne mde kunne vi centrifugere 8 rr af gangen og samle pellet i et rr til sidst. Rrene kunne
ikke autoklaveres, da materialet de er fremstillet af ikke tler s hj temperatur og derfor er der
risiko for, at rester fra en tidligere prve kan give en fejlkilde. For at minimere risikoen blev rrene
sprittet af fr brug.
Punkt 7 blev undladt, da vi glemte det. Her blev pellet kun vasket og rystet mellem hver vask, der
blev vasket med alt vores blanding. Dette burde ikke have betydning for resultatet da pellet gerne
skulle vre vasket nogenlunde ren for urenheder blot ved at blive rystet.
Herefter blev pellet sat p is fra torsdag til mandag, grundet tidsmangel var vi ndt til at stoppe
processen. Herudover forlb resten af fremgangsmden som beskrevet i flowdiagrammet. Prven
blev dialyseret to gange, da der efter frste dialyse ikke forekom nogen synlig effekt, og det var
forventet at voluminet af prven ville vre reduceret betydeligt.

Metodevalidering af ELISA
Elisa forlb som fremgangsmden, bortset fra designet af hvilke standarder der skulle i hvilke
brnde. Da der ikke var nogen fremstillet prve at mle p blev der udelukkende fremstillet plader
med standard AP.

Optimering
17.09.2014
Frste plade blev fremstillet med standardstof fortyndet i coating buffer. Da der ikke var nogen
prve fra oprensningen er der opsat blind, standardrkke og spiket blind. Den frste plade lykkedes
ikke. Ved tilstning af TMB-one fremkom der ingen farveskift. Det blev konkluderet at TMB kom
direkte fra kleskabet, hvor det skulle vre tempereret i mrke. For en udskrift med resultaterne
henvises til bilag. Der blev fremstillet to plader ud fra samme opstning til nste dag.
18.09.2014
De to plader blev fremstillet efter forskrifterne, disse plader viste pn bl farve og godkendte
resultater. For udskrift se bilag.. De nste to plader blev fremstillet med standard blandet i
fortyndingsbuffer, samt antistoffer opblandet i coating buffer. Dvs. der var blevet byttet om p
bufferne i forhold til den korrekte fremgangsmde. Det var et bevidst valg at blande p den mde,
da det pga. en misforstelse var blevet tolket som mere korrekt.
19.09.2014-23.09.2014
Ingen plader gav noget synligt farveskift, samt drlig prcision og njagtighed. Proceduren blev
gentaget i denne tidsperiode. Efter at have fremstillet flere fejlslagne plader blev det forsgt at
undlade at lave standardrkken, og njes med den kendte koncentration sammen med en blind, for
at gre proceduren mere simpel og dermed opn bedre resultater. Der blev forsgt at tilstte
koncentration p 0,025 ng/L i hver brnd. Resultaterne var fortsat ubrugelige. Herefter blev
forsgt at tilstte 1,6 ng/L og stadig uden det hjalp.

24.09.2014
Da der var mistanke om, at problemet var knyttet til bufferne, blev der forsgt at coate pladerne
med standard og antistoffer blandet i coating buffer. Da TMB blev bl adskillige gange ved at hlde

Metodevalidering af ELISA
det op i elisa-bakken, blev pladerne droppet og i stedet for prve at bruge petriskle som beholder
til vores vsker. Derudover optimeres der en sidste gang, hvor der blev krt fire prver, pladen
bestod af to prver blandet i fortyndingsbuffer og to prver blandet i coating buffer. I begge rkker
fik prven en koncentration p 1,6 ng/L og blind var ren coating buffer. Ved tilstning af TMB var
det hurtigt synligt at i brndene med prve og coating buffer blev bl, hvor imod brndene
fortyndet i fortyndsingsbuffer ikke fik noget farve og ikke gav nogle brugbare resultater.

Priser
Kunderne sender en prve til vores laboratorie som ud fra Elisa skal undersges, derfor er vores
priser sammensat ud fra en standardrkke uden prve. For individuelle priser, se bilag XX. Det vil
koste 474,109 kr. at fremstille en standardrkke til Elisa, i denne pris er det medtaget at diverse
buffere er basis udstyr og derfor tillader vi os at lgge et belb p 30 kr. oven i prisen. Ydermere
skal pladen lses af en Elisa-reader og dette vil yderligere koste kunden 50 kr. Dette betyder prisen
for en plade koster 554,109 kr.
Den eksterne virksomhed fr et tilbud p 2000 kr. pr. analyse de vil have foretaget. I dette tilbud vil
der blive foretaget dobbelt bestemmelse af deres prven.

Resultater
Alle resultater fra Elisa-reader er printet og vedlagt som bilag (se bilag xx). Derp er resultaterne
overfrt til Excel, hvor der er indtegnet standardkurver og regnet p de forskellige
kvalitetsparametre (se bilag xxx). For udregningseksempel for de enkelte vrdier henvises til bilag
xxxx. Frst er hver af de brugbare plader gennemget, derefter vil der i nste afsnit komme en
samlet diskussion af metodens resultater.
Det er valgt at arbejde videre p de 3 plader som var brugbare 7. De resterende plader blev udladet
fra resultatsbehandling, men er vedlagt som bilag., da resultaterne var ubrugelige. Dvs.
blindvrdierne var hjere end vrdierne fra prverne, der var ingen prcision imellem triplikater
og 7-dobbeltbestemmelse, koncentrationen bde faldt og steg ned igennem standardrkken.

7 2 standardrkker og en optimeret plade

10

Metodevalidering af ELISA
Koncentrationerne blev af computeren mange steder angivet til 0 og R-vrdien for kurverne viste at
de ikke var linere, fx var der en R-vrdi p 5.
Plade 1 og 2 er for standardrkke og 7-dobbeltbestemmelse udfrt d. 19.09.2014 og plade 3 er 2
gange 7-dobbeltbestemmelse udfrt d. 29.09.2014.

Plade 1
Resultater for standardrkke
Koncentratio

Snit abs

Spredning

%RSD

1,6000

1,3023

0,04660

3,6

0,8000

0,8103

0,02335

2,9

0,4000

0,5410

0,04092

7,6

0,2000

0,3223

0,05978

18,5

0,1000

0,1880

0,06148

32,7

0,0500

0,1037

0,03043

29,3

0,0250

0,1203

0,12450

103,5

0,0125

0,0117

0,03061

261,6

n (ng/uL)

Kendt koncentration for 0,025 ng/L:

Snit

Spredning

%RSD

Abs: 0,0226

Abs: 0,006681

Abs: 29,6

Konc: 0,0241 Konc:

ng/ L

0,006076

Konc: 25,2
ng/

11

Metodevalidering af ELISA
Flsomhed: 1,2283ng/ L
Bias: 0,8799
Relativ mlefejl:

9,6

Deldiskussion for plade 1

Frst blev pladen vurderet visuelt. Resultaterne for pladen s pne ud, da TMB blev tilsat kom der
tydelig bl farve.
Standardrkke
Lineraritet
For at finde linearitetsomrdet er der benyttet mlingerne fra 0,05-0,4 herved fik kurven en R-vrdi
p 0,9874. Derfor kan det linre omrde ikke identificeres ud fra disse mlinger.
Prcision
De fleste %RSD-vrdier for triplikaterne i mleomrdet ligger udenfor den acceptable grnse p
20%. %RSD er hjest ved de lave koncentrationer, hvilket er forventeligt, da en fejl har relativ stor
betydning p en lille vrdi. Derfor er det alligevel acceptabelt.

Undersgelse af 7-dobbeltbestemmelse af kendt koncentration p 0,025 ng/L

Prcision
RSD-vrdien er p 25,2%, hvilket ikke er indenfor den acceptable grnse.
Njagtighed
Der blev ved hjlp af en t-test udregnet om der var bias i metoden. Iflge t-vrdien er der muligvis
bias, men det kan ikke siges med sikkerhed, da prcisionen er drlig og kurven som
koncentrationen er regnet ud fra er drlig.

12

Metodevalidering af ELISA
Plade 2
Udskrift af resultaterne ses p bilag (XXX) og for tabeller og grafer udarbejdet til databehandlingen
henvises til bilag (XXX). Pladen var fremstillet efter skabelonen p bilag (XXX) med
standardrkke og spiked prve.

Resultater for standardrkker

Koncentration

Snit

Spredning

%RSD

(ng/L)

abs

1,6000

1,616

0,163971

10,1

0,8000

1,230

0,076827

6,2

0,4000

0,692

0,119425

17,3

0,470 0,061612
Spredning %RSD
0,230 0,023896
0,011
28,2
0,087 0,023029

13,1

0,2000
Snit
0,1000
0,039
0,0500
0,0250

0,021

Kendt koncentration p 0,025 L/ng :

10,4
26,6

0,008718

41,5

0,0125
-0,014 0,002517
H0 : snit = 0 , hvor 0 = 0,025

18,4

Flsomheden : 2,5872 L/ng

t = -3,393
Acceptomrde for 95%:+/- 2,447 *
Acceptomrde for 99%: +/- 3,499 accept
Bias: 0,014
Relativ mlefejl: 56,6%

Deldiskussion for plade 2

13

Metodevalidering af ELISA
Resultaterne fra denne plade ser umiddelbart pne ud. Der fremkom hurtigt en bl farve efter TMB
var tilsat og kurven p udskriften fra computeren tilsluttet Elisa-readeren var nsten liner ved
visuel vurdering.
Standardrkke
Linearitet
Den bedste R-vrdi blev fundet i omrdet fra 0 0,2 ng/L til 0,9993(se bilag x), hvilket er
acceptabelt i forhold til Elisa metoden.
Prcision
Triplikaterne viser en acceptabel prcision.

Undersgelse af 7-dobbeltbestemmelse af kendt koncentration p 0,025 ng/L

Prcision
Disse resultater viste en %RSD hjere end de 20%, som var den vre grnse. Dvs. der har vret for
mange tilfldige fejl, metoden er ikke gennemfrt med tilstrkkelig prcision.
Njagtighed
Ved t-test blev det pvist at der er bias p metoden. Der er mindre end 1 procents sandsynlighed for
at f det korrekte resultat. Desuden ses en meget hj relativ mlefejl p 56,6% Dvs. metoden kan
ikke forventes at give et korrekt resultat.

Plade 3
Udskrift for resultatet kan ses p bilag, side.
X

0,0039

1,7496

-0,0011

-0,0160

0,9360

-0,0160

0,0116

0,3666

0,0053

0,0182

0,1459

0,0214

%RSD

299,9

20,95

-464,2

-113,5

15,58

-134

14

Metodevalidering af ELISA
Delkonklusion plade 3
Ud fra pladen ses en hj %RSD, dvs. de ligger alle langt over 100% i blind samt i standarden
fortyndet i fortyndsingsbuffer. I standarden fortyndet i coating ses det at %RSD ligger lige p
grnsen for vores maks %RSD.
Her ud fra konkluderes det at vi har fundet det korrekt at fortynde med coating, dette er konkluderet
ud fra at alle plader med fortyndingsbuffer ikke har fet nogle accepteret vrdier. Ydermere ses det
tydeligt p denne plade, at det kun er coating der er fungeret, eftersom alle brnde er behandlet ens
og udfrt af samme person.

Diskussion:
Oprensning af AP
Det er ikke lykkes at f en opresning af AP fra E.coli og derfor har det ikke vret muligt at f en
prve til vores projekt. Da oprensning bar prg af en del forhindringer, og en stor grund til
mislykkes oprensning skyldes manglende materialer i laboratoriet. Inden projektet begyndelse er
oprensningen gennemget, og det blev forsgt at planlgge ud fra de materialer der var til rdighed
i laboratoriet. Undervejs kom der tidsmangel og derfor blev pellet frosset ned i en forlnget
weekend, og dette kan have vret en stor fejlkilde til manglende materiale, da nedfrysning kan have
beskadiget det AP som vi nsker at oprense.
Njagtighed
Plade 1 viste bias ved metoden. Der skal vre en lav %RSD, for at der skal siges at vre bias. Der
er accepteret en %RSD for Elisa som er hj for de fleste andre metoder der er arbejdet med i vort
laboratorie. Derfor er det svrt at sl fast med sikkerhed, at der er bias og ikke blot manglende
prcision. Selvom plade 1 og 2 er fremstillet under repeterbare forhold er det kun den ene der er
blevet god, dvs. flsomheden er stor.
En rsag til manglende prcision ved standardrkkerne kan vre, at der til disse to plader er
anvendt bakker til opbevaring af TMB hvor der senere i forlbet er opstet mistanke om bakkerne
ikke har vret helt fri for antistof. Bakkerne er blevet genbrugt, s der kan have siddet rester fra
tidligere projekter. Der blev foretaget en grundigt rensning med sprit efter problemet blev opdaget,

15

Metodevalidering af ELISA
men uden effekt. For at optimere yderligere kunne det derfor vre relevant at lave en ny
standardrkke hvor der blev anvendt engangsbeholdere til antistoffer og TMB.

Prcision
Der er generelt opnet en acceptabel prcision for 2 ud af 3 plader, hvor der er brugt de rigtige
buffere til coatingen. Der er nogle f mlinger der falder over den vre grnse p 20%, hvilket er
accepteret da det primrt drejer sig om de lavere koncentrationer.
Linearitet
Ud fra den brugbare plade er det linre omrde fundet til 0,0 - 0,2 ng/L. Det kunne vre
interessant at undersge omrdet imellem 0,2ng/L 0,4ng/L for at f fastlagt om det fx ville
vre muligt at mle p en prve med en koncentration p 0,3ng/L.
Ud fra resultaterne kunne der vre optimeret p standardrkke, s der blev mlt i omrdet fra 0,0 0,4 ng/L, for at minimere omkostningerne. Men da brndende sidder sammen 8 af gangen ville det
ikke mindske forbruget af dem. P den anden side vil det spare lidt tid og dermed arbejdsln og
mske vil det ogs betyde at mngden af antistoffer kan reduceres. Ved produktion af en enkelt
plade vil det ikke have stor betydning, men ved produktion af mange plader vil der vre penge at
spare, hvis antistoffer og arbejdsln kan reduceres.
Flsomhed
Flsomhed er aflst ud fra hldningen p den brugbare standardkurve. Den ene standardrkke har
givet en hjere flsomhed end den anden. Flsomheden kan optimeres ved at ndre p apparatet.
Da optimering af Elisa-readeren ikke er en del af fokus i denne rapport, er det ikke noget der er
optimeret p i laboratoriearbejdet der ligger til grund for rapporten. Skulle dette forbedre kan det
gres ved kvalificering af Elisa-readeren i forhold til metoden.
Robusthed
Til at undersge robustheden var planlagt at se p forskelle for nr to forskellige personer udfrte
pipetteringerne. Ud af de brugbare fremstillede plader er plade 1 og 2 fremstillet af en anden person

16

Metodevalidering af ELISA
end plade 3. Der ses ud fra plade 1 og 2 en forholdsvis tt %RSD, p henholdsvis 29,6% og 28,2%.
Plade 3 ligger lige p grnsen af en acceptable grnse p 20,95%. Da plade 3 er mlt p en
koncentration p 1,6 ng/ L og plade 1 og 2 er mlt p 0,025 ng/ L. Kan resultaterne ikke
sammenlignes. Derudover var det ogs plade 3 hvor et andet parameter blev ndret: beholder til
TMB. Da der blev brugt engangsbeholder til TMB ved plade 3 er det naturligt at prcisionen ogs
vil blive bedre, sfremt der er blevet forurenet ved plade 1 og 2. Det ville give mere informationer
om robustheden hvis plade 3 ogs havde indeholdt en standardrkke, s koncentrationen af
prverne i den 7-dobbeltebestemmelse kunne udregnes og dermed kunne resultaterne
sammenlignes.
LOD
Der er udregnet LOD for en 7-dobbeltbestemmelse med en standard p 0,025 ng/ for begge
standardrkker, og her viser det en stor forskel i vrdien for pladerne. P plade 1 ligger LOD p
0,020 ng/L, mens vrdien p plade 2 er 0,033 ng/L. Dvs. de to resultater ikke er ens. Den strste
sikkerhed fs ved at vlge den hjeste vrdi p 0,033 ng/L.
LOQ
LOQ ligger hhv. p 0,068 ng/L og 0,11 ng/L for plade 1 og 2 for en 7-dobbeltbestemmelse med
en koncentration p 0,025 ng/L. Dette ville kunne forklare unjagtigheden i resultatet, og derfor
br der vlges en hjere koncentration til den 7-dobbelte bestemmelse nr den skal bruges til at
undersge njagtigheden af metoden, for at vre sikker p at den er indenfor detektionsomrdet.
Specificitet
Det var ikke muligt at undersge specificiteten i forhold til en anden bakterie, da oprensningen af
B.cereus blev nedprioriteret pga. den tidsmssige begrnsning.
Genfinding
For at beregne genfinding skulle der fortages en spiket prve. En spiket prve bestr af en kendt
standard, tilsat en kendt mngde lav koncentration, i vores tilflde har vi kun lavet spiket prve
som en lav mngde kendt koncentrationen. Derfor har vi ikke kunne udregne genfindingen da vi
ikke har fremstillet en spiket prve.

17

Metodevalidering af ELISA
Konklusion:
De resultater der er fundet indtil nu er ikke nok til at validere hele metoden. Det linere omrde er
fundet til at ligge mellem 0,0 til 0,2 ng/L ud fra en standardkurve fremstillet i 3dobbeltbestemmelse med en acceptabel %RSD < 20% p de fleste af triplikaterne. Der er noget
usikkerhed omkring LOQ og LOD. Dette skaber tvivlssprgsml omkring njagtighedsresultaterne,
da de muligvis er foretaget udenfor LOQ. Derfor kan det konkluderes at vi p baggrund af
rapporten ikke er i stand til at levere ydelsen til en forsvarlig kvalitet, men da der er mange ting der
kan optimeres vil det sandsynligvis vre muligt at gre det ved at finde LOQ

18