Terry A.

BROWN

BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI

T. A. Brown, BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Zanichelli editore S.p.A Copyright 2007

T. Maniatis

Molecular cloning

Manuale di laboratorio

Clonaggio di geni.
Sequenziamento del DNA.
Espressione di proteine ricombinanti.
Studio dellattivit dei geni.

Clonaggio di un gene

Purificazione di singoli frammenti di DNA mediante clonaggio

Vettori derivati da plasmidi batterici

Plasmids are self-replicating, extrachromosomal DNA molecules found in virtually all bacterial
species. In nature, plasmids occur in exuberant profusion, varying in structure, size, mode of
replication, number of copies per bacterial cell, ability to propagate in different bacteria,
transferability between bacterial species, and perhaps most important, in the traits they carry.
Most prokaryotic plasmids are double-stranded circular DNA
molecules; however, linear plasmids have been identified in both grampositive and gram-negative bacteria. The size of plasmids varies widely, from
several kilobases to hundreds of kilobases. Replication of plasmids depends on host-cell proteins
but also may require plasmid-encoded functions. Plasmid replication may be
synchronized with the bacterial cell cycle, resulting in a low number of
plasmid molecules per bacterial cell, or independent of the host cell
cycle, allowing for the proliferation of hundreds of plasmid copies per
cell. Some plasmids freely transfer their DNA across bacterial species, some only transfer their
DNA into bacteria of the same species, and some do not transfer their DNA at all. Plasmids
carry genes that specify a wide variety of functions including: resistance to antibiotics,
resistance to heavy metals, sensitivity to mutagens, sensitivity or resistance to
bacteriophages, production of restriction enzymes, production of rare amino acids,
production of toxins, determination of virulence, catabolism of complicated organic
molecules, ability to form symbiotic relationships, and ability to transfer DNA across
kingdoms.

Starting in the 1970s, vectors for

propagation,
manipulation,
and
delivery of specific DNA sequences
were constructed with fragments from
naturally
occurring
plasmids,
primarily Escherichia coli plasmids.

Plasmid Vectors

All plasmid vectors contain three common

features:
a replicator
a selectable marker
a cloning site

The replicator is a stretch of DNA that

contains the site at which DNA replication
begins (the origin of replication or ori), and
that also includes genes encoding whatever
plasmid-encoded RNAs and proteins are
necessary for replication.

Replicators classification is based on the

number of plasmid molecules mantained per
bacterial cell under some set of standard growth
conditions. The so-called copy number of the
plasmid.
High copy number plasmids: > 20 mol/cell
Low copy number plasmids: < 20 mol/cell

High-copy-number plasmids tend to be under relaxed control of

replication. These relaxed plasmids initiate DNA replication in a
process controlled by plasmid-encoded functions (see Mechanism of
Replication and Copy-Number Control), and replication does not
depend on the unstable host replication initiation proteins synthesized
at the start of the bacterial cell cycle.

Low-copy-number plasmids are usually under stringent control.

Initiation of replication of these plasmids depends on unstable
proteins synthesized at the start of the bacterial cell cycle and thus is
synchronized with the replication of the bacterial chromosome . As
copy number decreases, random segregation of plasmid copies is not
sufficient to ensure that each daughter cell acquires a copy of the
plasmid. However, most low-copy-number plasmids carry genes
that guarantee their maintenance in the bacterial population.
population

While there are many different replicators, the

majority of plasmid vectors used in routine
recombinant DNA work contain one of the functionally
similar replicators derived from plasmids ColE1 or
pMB1 (for example, the popular pBluescript series
contain a ColE1 origin, and the pUC plasmids are
derived from pMB1). The ColE1 replicator is a 600nucleotide DNA fragment that contains the origin of
replication (ori), encodes an RNA primer, and encodes
two negative regulators of replication initiation. All
enzymatic functions for replication of the plasmid are
provided by the bacterial host.

Plasmid replication begins with transcription of an

RNA primer upstream of the ori (RNAII; see Fig. 1.1)
by the host RNA polymerase. RNAII is elongated
through and terminated downstream of the ori.
Interaction of a specific secondary structure in the
nascent RNAII transcript with the DNA template
results in formation of a persistent hybrid between
RNAII and the DNA template such that RNAII remains
paired with the DNA template at the ori. The RNAII
transcript is cleaved by RNAseH at the ori sequence.
This processed RNAII primer is extended by DNA
polymerase I to initiate plasmid replication. Regulation
of the proper RNAII secondary structure controls
initiation of DNA replication and is responsible for
determining the number of plasmid molecules per cell.

Both ColE1 and pMB1 plasmids are

high-copy-number plasmids,
maintained at between 15 and 25 copies
per bacterial cell, respectively. The copy
number of these plasmids is regulated
by an antisense RNA transcript, RNAI,
and the protein ROP, the product of the
rop gene. RNAI and the ROP protein
act in concert to intercept formation of
the proper RNAII secondary structure.
RNAI is exactly complementary to the
5 end of the RNAII transcript. RNAI
base pairs with the 5 end of RNAII,
preventing the formation of the specific
secondary structure necessary for
establishment of a persistent hybrid
between RNAII and the DNA template
that is a prerequisite for maturation of
the RNAII primer.

PLASMID INCOMPATIBILITY
For experiments that require that more than one plasmid
vector be maintained in a bacterial cell at the same time,
another critical feature of plasmid replicators is whether
or not two plasmid replicators are compatible. Two
plasmids are said to be incompatible with one another, and
hence belong to the same incompatibility group, if they
cannot stably co-exist. Plasmids are generally
incompatible if they share any function required for the
regulation of plasmid replication.

SELECTABLE MARKERS
In order to guarantee that a plasmid vector is taken up by and
maintained in bacterial cells, there must be a way to select for
plasmid-containing cells. Genes encoding resistance to
antibiotics such as ampicillin, tetracycline, kanamycin and
chloramphenicol are the most common bacterial selectable
markers for plasmid vectors. Typically, cells are transformed
with plasmid DNA and then plated out on LB plates that contain
the proper antibiotic. Only the bacterial cells containing the
plasmid will grow on the selective medium; the antibioticresistance phenotype conferred is dominant to the antibioticsensitive phenotype of cells that do not possess the plasmid
vector. Another dominant selectable marker that is occasionally
used is the immunity to infection by phage lambda (lambda
repressor)

Due plasmidi sono incompatibili se conferiscono

la resistenza allo lo stesso antibiotico.

CLONING SITE (polylinker)

Today's plasmid vectors contain a multiple cloning site (MCS) or polylinker
cloning region that can include >20 tandemly arranged restriction
endonuclease sites. The sites in the polylinker are almost always designed to
be unique within the vector sequence so that cutting the vector with a
restriction endonuclease in the polylinker and cloning foreign DNA into this
site does not disrupt other critical features of the vector. The plethora of
sites in the polylinker ensures that the appropriate enzyme sites will be
available for cloning most DNA fragments, provides unique reference
restriction sites for rapid restriction mapping of the insert, and generally
allows for a great deal of flexibility when manipulating the cloned DNA. The
sequences that directly flank the polylinker site are often useful for
manipulation or analysis of insert DNA. Many polylinker sites are flanked
by sequences for which there are commercially available complementary
oligonucleotides, for example the M13 reverse, 20, and 40 primers, that
can be used for priming polymerase chain reactions (PCR) or DNA
sequencing reactions. Such primers are useful tools for amplification or
sequencing of any DNA fragment inserted into the polylinker. Some
polylinkers are bordered by 8-bp-cutter restriction sites, like Not1. These
sites occur infrequently in DNA and thus allow for the easy excision of an
intact insert fragment from the plasmid vector.

Plasmidi integrativi (episomi) e non integrativi

Purificazione del DNA plasmidico (Miniprep)

mediante lisi alcalina

Alternativa alla precipitazione con EtanoloCloroformio: purificazione su colonna di silice

Kit miniprep commerciale

Vantaggi:
Resa maggiore

DNA plasmidico pi puro

Rapidit

Svantaggi:
Costo pi elevato

Principali dotazione ed
attrezzature di laboratorio
Provette eppendorf

Provette Falcon

Micropipette e puntali

Cappa Biologica

Enzimi utilizzati nella

manipolazione degli acidi nucleici
Polimerasi (RNA e DNA polimerasi)
Enzimi di modificazione (fosfatasi, chinasi, ligasi ecc.)
Nucleasi (esonucleasi ed endonucleasi)
Enzimi di restrizione

Nick Translation
(permette di marcare con nucleotidi modificati)

EcoR I

Isolamento del DNA genomico

Il protocollo di isolamento e purificazione del DNA
genomico dipende dallorganismo e quindi dalle
caratteristiche delle cellule da cui si intende ottenerlo.
I batteri (procarioti) sono privi di nucleo, il genoma
costituito solitamente da un singolo cromosoma presente
nel citoplasma e la cellula possiede una parete cellulare.
Nelle cellule eucariote il materiale genetico contenuto
nel nucleo e la cellula pu avere la parete cellulare (cellule
vegetali) o non averla (cellule animali).

Purificazione del DNA genomico da procarioti

Tutti i protocolli di purificazione del DNA genomico dei
procarioti si basano sulla differenza di solubilit
comportamento in relazione alla forza ionica della
soluzione del DNA genomico rispetto a quello plasmidico.
I protocolli pi utilizzati prevedono inizialmente la lisi
delle
cellule
seguita
dalla
degradazione
e
dallallontanamento del RNA e delle proteine per mezzo di
RNAasi e proteasi ed estrazione con fenolo-cloroformio.
Il DNA genomico viene quindi separato da quello
plasmidico mediante precipitazione frazionata con etanolo
o mediante lutilizzo di resine a scambio anionico.

Cromatografia a scambio anionico

La fase stazionaria (resina)
contiene
gruppi
carichi
positivamente
(ammine
quaternarie). In condizioni di
bassa forza ionica, il DNA con
elevata carica negativa si lega
per interazione elettrostatica
alla resina mentre gli altri
componenti neutri o carichi
positivamente non si legano.
Cambiando il pH o la forza
ionica della soluzione si ha
leluizione del DNA stesso.

Isolamento del RNA totale

RNA normalmente costituito da un filamento
singolo molto meno stabile del DNA, si degrada
facilmente anche per lazione degli enzimi ad attivit
RNAsica rilasciati in seguito alla lisi cellulare.
La purificazione del RNA viene condotta lavorando
sempre a bassa temperatura (4 C)e con soluzioni
trattate con DEPC (dietilpirocarbonato, inibitore
delle RNAsi).

Il protocollo comunemente utilizzato prevede la lisi cellulare mediante

trattamento con detergenti o omogenizzazione meccanica (macinazione
in azoto liquido nel caso di materiale vegetale) ed il trattamento con un
TRIZOL, un composto a base fenolica in grado di inattivare gli enzimi
degradativi (RNAsi) e capace di denaturare e far precipitare la maggior
parte dei componenti cellulari ed in particolare le proteine ed il DNA.
Il campione viene quindi centrifugato, il surnatante trattato con DNAsi
per eliminare il DNA eventualmente presente.
Si effettua quindi un trattamento con la miscela fenolo-cloroformio per
rimuovere ulteriormente i contaminanti ed infine l RNA viene
precipitato aggiungendo etanolo.
LRNA purificato viene quindi risospeso in acqua DEPC.

Esistono anche in questo caso dei kit commerciali che si basano

sullutilizzo di resine in grado di legare lRNA e che di solito
garantiscono una resa pi alta ed un prodotto finale pi puro.

Quantificazione del DNA

Direttamente da gel di agarosio: quantit minima
rilevabile: circa 10 ng.
Assorbimento a 260 nm: 1 unit di assorbanza:
DNA a doppia elica: 1 Unit assorbimento = 50ug/ml
Concentrazione DNA (ug/ml) = A260nm x 50ug/ml

Spettro di assorbimento del DNA

1.5

Assorbanza

effetto
ipercromico

1.0

0.5

220 240 260 280 300 320

lunghezza donda (nm)

Per determinare la purezza del campione si calcola il rapporto

tra lassorbimento a 260 nm (DNA) e a 280 nm (proteine). In una
preparazione pura questo rapporto > di 1.7.

Isolamento del RNA messaggero da cellule eucariote

L RNA totale costituito da una miscela di RNA
ribosomale, di trasporto e messaggero. Questultimo di
notevole interesse nel campo delle biotecnologie, in
quanto contiene linformazione genetica che, nel caso
degli eucarioti, spesso non possibile ottenere
direttamente dalla sequenza del DNA genomico.
Sono stati messi a punto dei protocolli che permettono
di isolare solo lRNA messaggero a partire da RNA
totale o direttamente dal tessuto.

Isolamento del RNA messaggero da cellule eucariote

Il metodo pi semplice per
isolare il mRNA eucariotico
consiste nellutilizzare la coda di
polialanina allestremit 3. Si
utilizzano degli oligonuicleotidi
sintetici di poli-T legati a dei
supporti
insolubili
(resina
polimerica o sferette di metallo).
Tramite lappaiamento selettivo
A-T possibile separare il
mRNA da tutti gli altri
componenti
presenti
nella
miscela.

Retrotrascrizione e sintesi del cDNA

L mRNA una molecola a filamento singolo poco
stabile e non pu essere replicata o manipolata
facilmente in vitro. Per numerose applicazioni nel campo
delle biotecnologie questo viene usato come stampo
per ottenere una sequenza di DNA a doppio filamento
(chiamato cDNA o DNA codificante) con la medesima
sequenza ma che pu essere facilmente maneggiato,
replicato e propagato. Questo procedimento viene
chiamato retrotrascrizione.

Per questo tipo di reazione si utilizza un enzima presente in

alcuni retrovirus chiamato trascrittasi inversa che permette di
ottenere DNA a partire da RNA.

mRNA trascrittasi inversa cDNA

La reazione sfrutta ancora una volta la coda di poliadenina
presente allestremit 3 del mRNA e prevede 2 passaggi:
1. Sintesi del filamento di DNA complementare al mRNA
mediante trascrizione inversa.
2. Sintesi del secondo filamento utilizzando una DNA
polimerasi.

Sintesi del primo filamento

Sintesi del secondo filamento (self-priming)

Sintesi del secondo filamento (RNA fragments priming)

Colture Batteriche (E. coli)

Nei laboratori si usano comunemente vari ceppi (strains)
selezionati e modificati di Escherichia coli (batterio gram
negativo non patogeno) che, a seconda del genotipo (con
mutazioni su particolari geni o introduzione di geni estranei),
vengono utilizzati per diversi scopi. In generale si possono
dividere in:
Ceppi di propagazione (clonaggio e propagazione di plasmidi)
Ceppi di espressione (espressione di proteine ricombinanti)

Terreni di coltura:
1) liquidi (crescita delle cellule, espressione di
proteine ricombinanti, ecc.).
2) solidi (selezioni di cloni mediate isolamento di
singole colonie, propagazione delle colonie o della
linea cellulare).

Terreni di colture complessi

(chimicamente non definiti)
I mezzi complessi impiegano estratti grezzi di sostanze come la caseina
(proteina del latte), proteine animali, soia, estratti di lieviti, e altre
sostanze altamente nutritive: bench chimicamente non definite. Queste
sostanze sono commercialmente disponibili in polvere e possono essere
pesate e aggiunte al mezzo di coltura. Tuttavia uno svantaggio
importante dell'uso di mezzi complessi la perdita del controllo sulla
specificit dei nutrienti del mezzo.
LB (Luria Bertani medium): 1% triptone, 0.5% estratto di lievito,
0.5% NaCl. (se le cellule contengono un plasmide con una
resistenza, si aggiunge lantibiotico opportuno per la selezione).

Utilizzati per la crescita di cellule e per lespressione

di proteine ricombinanti non modificate.

Terreni di colture minimi (chimicamente definiti)

I mezzi chimicamente definiti sono preparati aggiungendo all'acqua distillata
quantit precise di sostanze chimiche organiche o inorganiche. Perci, nota
la composizione chimica esatta di un mezzo definito. In molti casi, comunque,
la conoscenza della composizione chimica esatta non critica. In questi casi i
mezzi non definiti possono essere sufficienti, o persino vantaggiosi.

M9 minimal medium
Na2HPO4

gram (g)

KH2PO4

gram (g)

0.5

gram (g)

NH4Cl

gram (g)

ddH2O to

litre (l)

Total volume

litre (l)

NaCl

Note: autoclave. Add 10 ml filter sterilized 100 mM MgSO4, 20%

glucose, 10 mM CaCl2, 100 mM thiamine-HCl) before use.

Opportunamente addizionati di
particolari elementi, vengono
utilizzati per la selezione di
ceppi auxotrofi (incapaci di
sintetizzare un particolare
composto organico necessario
per la propria crescita) o
lespressione
di
proteine
ricombinanti
modificate
(arricchite in un particolare
aminoacido modificato (es
Seleniometionina)
o
con
varianti isotopiche (13C o 15N)).

Agar plate
(mezzo di coltura solido)
An agar plate is a sterile Petri dish that contains a growth medium
(typically agar plus nutrients)
nutrients used to culture microorganisms or
small plants.
Selective growth compounds may also be added to the media, such
as antibiotics.
antibiotics

Etidio bromuro: intercalante del DNA

inserisce nella doppia elica del DNA

Visualizzazione mediante autoradiografia

(con DNA marcato)

Determinazione del numero di basi

(dimensioni dei frammenti di DNA)

Quantificazione del DNA

Direttamente da gel di agarosio: quantit minima
rilevabile: circa 10 ng.
Assorbimento a 260 nm: 1 unit di assorbanza:
DNA a doppia elica: 1 Unit assorbimento = 50ug/ml
Concentrazione DNA (ug/ml) = A260nm x 50ug/ml

Isolamento del DNA genomico da eucarioti

I protocolli di purificazione sono simili a quelli utilizzati
per i procarioti. Le maggiori differenze riguardano la
prima parte, ossia il sistema per la lisi della cellula e la
liberazione del materiale genetico dal nucleo.
Nel caso di cellule animali, prive di parete cellulare, si
utilizzano soluzioni contenenti detergenti (SDS) in grado di
rompere la membrana cellulare e nucleare.
Nel caso delle cellule vegetali, ricoperte da una parete
resistente, si utilizza di solito la frantumazione meccanica
dopo aver congelato il tessuto in azoto liquido.

Genomic DNA purification from plant tissues

with a commercial kit

Digestione enzimatica con Enzima di restrizione

Le digestioni da preparare sono 2: il DNA genomico e il plasmide
pUC18 (purificato nella prima esercitazione).
L'acqua va messa per prima e l'enzima va aggiunto per ultimo!
19 l DNA genomico
1 l EcoRI (enzima)
2.5 l BSA 10X
2.5 l buffer 10X
_____
25 l

10 l pUC18
1 l EcoRI (enzima)
2.5 l BSA 10X
2.5 l buffer 10X
9 l H20
_____
25 l

Le digestioni vanno lasciate per 2 ore a 37C.

Blot
In molecular biology and genetics, a blot is a method of
transferring proteins, DNA or RNA, onto a carrier (for
example, a nitrocellulose PVDF or nylon membrane). In
many instances, this is done after a gel electrophoresis,
transferring the molecules from the gel onto the blotting
membrane, and other times adding the samples directly
onto the membrane. After the blotting, the transferred
proteins, DNA or RNA are then visualized by one or
more different methods.

Common blot methods are:

Southern blot for DNA
Southwestern blot for Protein-DNA
Northern blot for RNA
Reverse Northern blot for RNA
Western blot for proteins
Far-Western blot for Protein-Protein
Eastern blotting for posttranslational modification
Far-Eastern blot for Lipids, Drugs and Hormones
Dot blot
Slot blot

Southern Blot

Il Southern Blot una tecnica usata in

biologia molecolare per rivelare la
presenza di specifiche sequenze di DNA in
una miscela complessa. Prende il nome dal
suo inventore, Edwin Mellor Southern.

Preparazione del campione per il SB

Un campione eterogeneo di dna
genomico viene trattato con enzimi di
restrizione e successivamente sottoposto
ad elettroforesi su gel d'agarosio o di
poliacrilammide.
Nel gel sar possibile osservare uno
smear, ossia una striscia continua; non
si vedranno bande nette perch il DNA
genomico digerito con l'enzima di
restrizione ha tantissimi punti di taglio,
quindi sul gel si troveranno tantissimi
frammenti che migreranno con velocit
diverse in base al diverso peso
molecolare.

Il gel viene quindi immerso in una soluzione

fortemente alcalina (NaOH) per circa 15 minuti
che permette la denaturazione del DNA.
Il gel viene quindi coperto da una membrana di
nitrocellulosa e sopra di questa viene posta una
pila di fogli assorbenti.
Per capillarit la soluzione tender ad
attraversare il gel, il foglio di nitrocellulosa e
risalir nei fogli assorbenti. I sali trascinano i
segmenti di DNA perfettamente in verticale,
depositandoli sullo strato di nitrocellulosa con il
quale i segmenti instaurano legami elettrostatici.
Da notare che in questo passaggio il DNA non sale
grazie a una forza elettrica come nella prima
elettroforesi ma solo per capillarit.

DNA southern blot & gel electrophoresis system

Identificazione della sequenza di interesse

Il foglio di nitrocellulosa viene separato dal gel e immerso in

una soluzione contenenente una sonda marcata in vario modo
(fluorescenza, radioattivit, ecc..) che ibridizza con sequenze di
DNA complementari presenti sul foglio, identificandole.
L'ibridizzazione della sonda con il DNA pu avvenire con
diversi gradi di "stringenza" a seconda delle finalit
dell'esperimento, consentendo una ibridizzazione con
specificit anche inferiore al 100%.
A seguito di lavaggio della nitrocellulosa per eliminare le
sonde non ibridate, si fa una lastra fotografica che metta in
evidenza dove la sonda ha legato il dna genomico.

Sonda fluorescente

Risultato di un Southern Blot

Northern Blot
Il Northern Blot una tecnica che permette di
visualizzare ed identificare l'RNA purificato da un
campione, in particolare per studiare l'espressione
genica.
Il nome derivato per assonanza dalla tecnica
analoga per il DNA (Southern blot).

Dal punto di vista operativo la tecnica simile al souther blot

usato per il DNA, con alcune differenze:
lRNA molto pi sensibile alle nucleasi usare tamponi
preparati con acqua DEPC e materiale autoclavato ed indossare
sempre i guanti.
l'RNA tende a formare strutture secondarie stabili in
soluzione; per fare in modo che la mobilit elettroforetica sia
solo dipendente dalla lunghezza del frammento, l'RNA deve
essere preventivamente denaturato (solitamente esponendolo ad
alte temperature). Inoltre, la corsa elettroforetica deve essere
eseguita in presenza di agenti denaturanti, solitamente
formaldeide e formammide.
il legame del RNA con la membran debole, viene quindi
stabilizzato mediante irradiazione con raggi UV che creano
legami covalenti (crosslinking).

Esempio di utilizzo di NB
per valutare lespressione
genica.

Western Blot
Il western blot o immunofissazione una tecnica biochimica
che permette di identificare una determinata proteina in una
miscela complessa mediante il riconoscimento da parte di
anticorpi specifici; in generale, per facilitare il riconoscimento,
la miscela di proteine viene prima separata in base alle loro
dimensioni (o peso molecolare) utilizzando un gel di
poliacrilammide. Successivamente le proteine vengono
trasferite su di un supporto, che comunemente una
membrana di nitrocellulosa, e quindi si procede al
riconoscimento vero e proprio della proteina mediante
l'utilizzo di un anticorpo specifico.

Sodium DodecylSulphate PoliAcrylamide

Gel Electrophoresis
SDS-PAGE
L'SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide
Gel Electrophoresis, ossia elettroforesi su gel di
poliacrilammide in presenza di sodio dodecil solfato) una
tecnica analitica che permette l'analisi di estratti proteici.
Il principio su cui si basa questa tecnica l'attivit
denaturante dell'SDS; questo un detergente composto da
una testa idrofilica ed una coda idrofobica ed in grado di
interagire con le proteine in un rapporto costante 1.4g SDS
ogni g di proteina. La separazione avviene quindi per
differenza fra pesi molecolari visto che il rapporto massa
carica per ogni proteina denaturata con SDS rimane costante.

PoliAcrylamide Gel
E' un gel costituito dalla polimerizzazione di
monomeri di acrilamide.

Pu essere continuo o discontinuo (stacking

gel + running gel).

Pu contenere SDS (gel denaturante) oppure

no (gel nativo).

Una volta corso il gel, le proteine possono essere

visualizzate mediante colorazione con blu di
Comassie oppure trasferite sulla membrana per
il Western Blot.

Esempio di gel
colorato con Blu
di Comassie

Western Blot
A differenza del Southern Blot, dove il trasferimento
avviene per capillarit, in questo caso avviene
mediante l'applicazione di un campo elettrico.

Le proteine,
cariche
negativamente
per la presenza
dell' SDS,
migrano dal gel
verso la
membrana.

La proteina di interesse viene rivelata sulla

membrana mediante l'utilizzo di un anticorpo
specifico e di un sistema di rivelazione.
I sistemi pi comuni utilizzano un anticorpo
primario ed uno secondario (che a sua volta
riconosce il primario), quest'ultimo coniugato ad
un enzima (perossidasi o fosfatasi alcalina) che, in
presenza di un opportuno substrato, d origine ad
un prodotto colorato e quindi visibile oppure ad
una reazione che emette chemioluminescenza
rilevabile per mezzo di una lastra fotografica.

Antibodies-antigen
binding

Lastra fotografica impressionata con

chemioluminescenza

HRP-conjugated antibody

Preparazione gel di agarosio 0.8%

Pesare la quantit necessaria di agarosio per un gel allo 0.8%, aggiungere il TBE 1 X e
portare a volume.
Ricetta (volume finale 80 mL):
0.6 g agarosio
8 ml TBE 10X
72 ml H20
Scaldare nel forno a microonde in una beuta senza fare bollire e mescolare ogni tanto
per sciogliere bene lagarosio. Aspettare qualche minuto e aggiungere 5 l di SyberSafe;
mescolare e versare nellapposita vaschetta precedentemente preparata.
Il gel solidificato va posto nella vaschetta di corsa senza il pettinino e coperto con 250 ml
di buffer di corsa (TBE 1X).
Campioni da caricare:
5 l di DNA ladder
25 uL DNA genomico digerito (+ 5 uL Sample Buffer)
25l pUC18 digerito (+ 5 uL Sample Buffer)
10 l pUC18 non digerito (+15 uL acqua + 5 uL Sample Buffer)
25 ul RNA totale (+ 5 uL Sample Buffer)
Impostare nellalimentatore il voltaggio per la corsa elettroforetica (90 100 V) .

Polymerase Chain Reaction (PCR)

The polymerase chain reaction (PCR) is a technique widely used
in molecular biology. It derives its name from one of its key
components, a DNA polymerase used to amplify a piece of DNA by
in vitro enzymatic replication. As PCR progresses, the DNA
generated is used as a template for replication. This sets in motion a
chain reaction in which the DNA template is exponentially
amplified. With PCR it is possible to amplify a single or few copies
of a piece of DNA across several orders of magnitude, generating
millions or more copies of the DNA piece. PCR can be extensively
modified to perform a wide array of genetic manipulations.

Developed in 1984 by Kary Mullis, PCR is now a common

and often indispensable technique used in medical and
biological research labs for a variety of applications. These
include DNA cloning for sequencing, DNA-based phylogeny,
or functional analysis of genes; the diagnosis of hereditary
diseases; the identification of genetic fingerprints (used in
forensic sciences and paternity testing); and the detection and
diagnosis of infectious diseases. In 1993 Mullis was awarded
the Nobel Prize in Chemistry for his work on PCR.

Almost all PCR applications employ a heat-stable DNA

polymerase, such as Taq polymerase, an enzyme originally
isolated from the bacterium Thermus aquaticus. This DNA
polymerase enzymatically assembles a new DNA strand from
DNA building blocks, the nucleotides, by using singlestranded DNA as a template and DNA oligonucleotides (also
called DNA primers), which are required for initiation of
DNA synthesis. The vast majority of PCR methods use
thermal cycling, i.e., alternately heating and cooling the PCR
sample to a defined series of temperature steps. These thermal
cycling steps are necessary to physically separate the strands
(at high temperatures) in a DNA double helix (DNA melting)
used as the template during DNA synthesis (at lower
temperatures) by the DNA polymerase to selectively amplify
the target DNA. The selectivity of PCR results from the use of
primers that are complementary to the DNA region targeted
for amplification under specific thermal cycling conditions.

FOR

REV

Profilo di temperatura di una PCR

Risultato di una PCR su gel di agarosio

Termociclatore: apparecchio che permette di ottenere

i cicli di temperatura necessari per la reazione di PCR.
E composto da una piastra riscaldante con
alloggiamenti per i campioni in grado garantire rapidi
cambi di temperatura.
Date le elevate temperature ce si
raggiungono durante la fase di
denaturazione (95 C), per evitare
levaporazione
del
campione
(solitamente 20-50 uL) nei vecchi
termociclatori si aggiungeva uno
strato di olio minerale nel tubo da
pcr.
I termociclatori moderni hanno una coperchio che possibile scaldare
fino ad una temperatura superiore a quella del campione (105 C) in
modo da bloccare levaporazione.

Un moderno termociclatore

E importante la scelta della temperatura corretta

Thermostable polymerases used in PCR

Ethidium bromide-stained PCR products after gel electrophoresis.

Two sets of primers were used to amplify a target sequence from
three different tissue samples. No amplification is present in sample
#1; DNA bands in sample #2 and #3 indicate successful amplification
of the target sequence. The gel also shows a positive control, and a
DNA ladder containing DNA fragments of defined length for sizing
the bands in the experimental PCRs.

Real Time PCR (RT-PCR)

In molecular biology, real-time polymerase chain reaction, also
called quantitative real time polymerase chain reaction (QPCR/qPCR) or kinetic polymerase chain reaction, is a laboratory
technique based on the polymerase chain reaction, which is used to
amplify and simultaneously quantify a targeted DNA molecule. It
enables both detection and quantification (as absolute number of
copies or relative amount when normalized to DNA input or
additional normalizing genes) of a specific sequence in a DNA
sample.

Fluorescent reporter probe method

A DNA-binding dye binds to all double-stranded (ds)DNA in PCR, causing
fluorescence of the dye. An increase in DNA product during PCR therefore leads to
an increase in fluorescence intensity and is measured at each cycle, thus allowing
DNA concentrations to be quantified. However, dsDNA dyes such as SYBR Green
will bind to all dsDNA PCR products, including nonspecific PCR products (such as
"primer dimers"). This can potentially interfere with or prevent accurate
quantification of the intended target sequence.
The reaction is prepared as usual, with the addition of fluorescent dsDNA dye.
The reaction is run in a thermocycler, and after each cycle, the levels of
fluorescence are measured with a detector; the dye only fluoresces when bound
to the dsDNA (i.e., the PCR product). With reference to a standard dilution, the
dsDNA concentration in the PCR can be determined.

Syber Green

Fluorescent reporter probe method

Using fluorescent reporter probes is the most accurate and most reliable of the
methods, but also the most expensive. It uses a sequence-specific RNA or DNA-based
probe to quantify only the DNA containing the probe sequence; therefore, use of the
reporter probe significantly increases specificity, and allows quantification even in the
presence of some non-specific DNA amplification (Fluorescent dyes reports
amplification of any DNA fragment).
It is commonly carried out with an RNA-based probe with a fluorescent reporter at
one end and a quencher of fluorescence at the opposite end of the probe. The close
proximity of the reporter to the quencher prevents detection of its fluorescence;
breakdown of the probe by the 5' to 3' exonuclease activity of the taq polymerase breaks
the reporter-quencher proximity and thus allows unquenched emission of fluorescence,
which can be detected. An increase in the product targeted by the reporter probe at each
PCR cycle therefore causes a proportional increase in fluorescence due to the
breakdown of the probe and release of the reporter.

Altro esempio di sonda fluoroforo-quencer

La curva dellintensit della fluorescenza

rispetto al numero di cicli una sigmoide

Il valore CT in corrispondenza del primo flesso

direttamente proporzionale al numero di copie di
templato presenti.

Ad una minore quantit di templato presente corrisponder una

curva spostata verso destra (CT ad un numero di cicli maggiore)

La RT-PCR viene utilizzata

spesso
per
confrontare
lespressione di un gene di un
campione rispetto ad un controllo
(per esempio delle cellule sane
rispetto a cellule tumorali oppure
trattate con una determinata
sostanza rispetto a quelle non
trattate).
Di solito si utilizza il rapporto con
uno standard interno (per
esempio lmRNA di un gene non
influenzato dal trattamento) per
normalizzare i risultati ed
eliminare errori o differenze
dovuti al procedimento di
preparazione dei campioni.

Time-dependent effect of
hyperglycemia on mRNA (A)
and protein (B) expression of
PKC1 isozyme in the heart of
diabetic pigs. Total RNA was
extracted from hearts for realtime RT-PCR quantification,
and the relative quantity of
PKC1 mRNA was normalized
to that of GAPDH mRNA as
described in MATERIALS
AND METHODS. The protein
content of the PKC isozyme
was determined by SDS-PAGE
followed by immunoblotting
analysis

Errori della polimerasi

Polimerasi termostabili
-Taq (Termophilus aquaticus polymerase) non possiede attivita
Proofreading.
-Pfu (Pirococcus furiosus polymerase) possiede attivita Proofreading.

Clonaggio dei prodotti di PCR

TA cloning
I prodotti di PCR amplificati con la TAQ polimerasi
presentano una T allestremita 3.

PCR
In un eppendorf da 250 l preparare la seguente mix:
18.5 l
H20 sterile
2.5 l DNA plasmidico (diluizione 1:5 di una miniprep)
1.5 l
Primer FOR (25M)
1.5 l
Primer REV (25M)
2 l dNTPs (2.5mM)
33 l buffer TAQ (10X)
1 l TAQ polimerasi
___
30 l
! Prestare attenzione a non contaminare!

Programma:
Step

Temperature

Time

Initial denaturation

95C

3 minutes

Amplification (35 cycles)

95C (denaturation)

30 sec

55C (annealing)

45 sec

72C (extension)

60 sec

72C

5 minutes

Final extension

Preparazione di terreno LB solido (50ml)

Luria-Bertani (LB) medium
1% tryptone
0.5% yeast extract
0.5% NaCl
1.5% bacteriological agar
-Pesare le quantit necessarie a preparare 50 mL di terreno. Aggiungere
50 mL di acqua distillata.
-Attaccare alla bottiglia un pezzetto di nastro da autoclave.
-Sterilizzare in autoclave.

Clonaggio di Geni

Strategia per il clonaggio di frammenti di DNA

1)Digestione del frammento con endonucleasi di
restrizione.
2)Digestione del vettore e defosforilazione.
3)Ligazione.
4)Introduzione

ed

amplificazione

ricombinante in una cellula ospite.

5)Analisi delle colonie.

del

DNA

Come si inseriscono i siti di

restrizione alle estremit
dell'inserto da clonare?

Aggiunta di estremit coesive a frammenti blunt ends

Ma se il frammento contiene un sito BamH I.

Clonaggio dei prodotti di PCR

I siti di restrizione vengono introdotti con i primers

Digestione con enzimi di restrizione

Scegliere enzimi di restrizione presenti come siti unici nel polylinker
del vettore di destinazione e che non digeriscano anche il frammento di
interesse.
Utilizzando un singolo enzima per entrambe le estremit si otterranno
costrutti in cui l'inserto sar presente statisticamente nelle due
orientazioni.
Utilizzando due enzimi diversi l'inserto avr una direzione obbligata
> clonaggio direzionale.

Esempio di un
vettore di
destinazione e
sequenza del
polylinker

Defosforilazione del plasmide digerito

Trattando il plasmide digerito con una
fosfatasi (es. CIP Calf Intestine
Phosphatase) si rimuove il gruppo
fosfato allestremit 5 evitando che il
plasmide
possa richiudersi senza
linserto dando origine a falsi positivi.

Ligazione

Introduzione di DNA in cellule batteriche

Trasformazione: introduzione di DNA plasmidico in

cellule batteriche
Non tutte la specie batteriche assumono DNA con la
stessa efficienza.
In laboratorio solo poche specie (soprattutto dei
generi Bacillus e Streptococcus) possono assumono
DNA estraneo con facilit.
In condizioni normali i batteri, tra cui anche E. coli,
incorporano DNA solo in quantit limitate. Per
migliorare lefficienza della trasformazione, le cellule
devono subire un trattamento chimico e/o fisico.
Queste cellule vengono dette competenti.

Preparazione di cellule competenti con CaCl2

Cellule di E.coli immerse in una soluzione

ghiacciata di CaCl2 (ma funzionano anche altri sali
come RbCl2) assumono la capacit di legare le
molecole di plasmide sullesterno della cellula,
questo poi viene internalizzato mediante un shock
termico.

Metodo alternativo per la trasformazione: elettroporazione

Le cellule vengono mescolate con la soluzione
contenete il plasmide e sottoposte ad una repentina
scarica elettrica ad alto voltaggio che apre pori nella
membrana e permette lingresso del DNA.

Questo metodo pu essere applicato anche a cellule eucariotiche

Selezione delle cellule trasformate

Prima di piastrare su terreno selettivo, si incubano

le cellule in terreno non selettivo per permettere
lespressione degli enzimi che conferiscono la
resistenza.

Tutte le cellule che contengono un vettore, sia

ricombinante (con l'inserto) che non, danno
origine a colonie resistenti.

Identificazione delle colonie ricombinanti

(che contengono il gene o linserto di interesse)
tramite inattivazione inserzionale.

lacZ codifica
lenzima
-galattosidasi.

Colony PCR

Colony PCR

Nel caso si utilizzino vettori derivati da

DNA virale, si parla di:

Trasfezione: introduzione diretta di DNA virale

nelle cellule.
Infezione: introduzione del DNA nelle cellule da
particelle virali gi formate.

Se l'inserto contenuto in un vettore di origine

fagica, non avremo colonie di batteri che
sopravvivono ma, al contrario, placche di lisi
(costituite

da

cellule

batteriche

morte)

corrispondenti alle zone di infezione di ciascuna

particella fagica e quindi di ogni singola
molecola di DNA ricombinante.

Linfezione fagica si realizza utilizzando fagi

preformati in vitro si visualizza sotto forma di
placche su piastre di agar coperte di batteri.

Packaging in vitro delle particelle fagiche

Espressione della mBABP ricombinante.

Induzione mediante IPTG di una coltura batterica
Il ceppo BL21 di E. coli stato precedentemente trasformato con pQE50
ingegnerizzato con il cDNA di mBABP. E stata poi preparata una coltura
batterica, cresciuta overnight a 37C.
Diluire la coltura fino a OD 600 nm =1, in un volume di 10 mL di LB
liquido in una provatta Falcon da 50 mL.
--> Prelevare un campione di 0.5 mL, centrifugarlo 1 minuto a 10000 rpm e
conservare il pellet a -20 C (pre-induzione) > etichettarlo con il nome
del gruppo.
-->Indurre con IPTG 0.5 mM (10 uL di uno stock 1000X).Portare a 37C
per 3-4 ore.
-->Al termine prendere un altro campione da 0.5 mL (post-induzione),
centrifugare e conservare il pellet a -20 C. > etichettarlo con il nome del
gruppo.

Preparazione del gel di agarosio e taglio della banda da gel

Pesare la quantit necessaria di agarosio per un gel allo 0.8%, aggiungere il TBE e portare a volume.
Ricetta (80 ml):
1.6 gagarosio
8 ml TBE 10X
72 ml H20
Scaldare nel forno a microonde senza fare bollire e mescolare ogni tanto per sciogliere bene lagarosio.
Aspettare qualche minuto e aggiungere 5 l di SyberSafe; mescolare e versare nellapposito
apparecchio precedentemente preparato.
Il gel solidificato va posto nella vaschetta di corsa senza il pettinino e coperto con 250 ml di buffer di
corsa (TBE 1X).
Caricare 1) DNA marker (5 uL) e 2) tutta la PCR (30 l) dopo aver aggiunto 6 l di Loading Buffer
(6X).
Impostare lalimentatore a 90V.

Appoggiare il gel sul transilluminatore (intensit luce al 70 %) e tagliare la

porzione di gel contenente la banda del prodotto di PCR con una lama pulita con
etanolo e trasferirla in una Eppendorf da 2 mL oppure in una Falcon da 15 mL.

Vettori non plasmidici

e vettori per organismi eucarioti
Molecole di DNA plasmidico si possono ritrovare
anche in organismi eucarioti (es. lieviti).
Hanno una diversa organizzazione dei geni e una
diversa origine di replicazione.
Possono essere usati per costruire vettori per
introdurre geni esterni in cellule eucariotiche
(lieviti, cellule di mammifero in culture ecc.)

Vettori per lieviti

Plasmidi episomici di lievito (YEp) possono esistere isolati o
integrarsi in uno dei cromosomi per ricombinazione omologa

Plasmidi integrativi di lievito

(YIP)

Vettori derivati da Batteriofagi

Organizzazione del Genoma del Batteriofago

Vettori derivati da Batteriofagi

La regione non essenziale del genoma pu essere
sostituita con un polylinker (MCS) per lintroduzione di
un gene esogeno.
Con il vettore cos ottenuto si
batteriche che produrranno forme
contenete il gene di interesse.

infettano cellule
mature del fago

Utilizzati spesso per creare librerie (collezioni di cloni

di geni) Popolazioni di fagi ciascuno con una copia di
un gene specifico.

 I VETTORI DI SOSTITUZIONE, in cui il DNA facoltativo

contenuto in un frammento di riempimento (stuffer region),
fiancheggiato da una coppia di siti di restrizione, che viene
rimpiazzato quando il DNA da clonare legato al vettore.
Allinterno della testa dei fagi non possono essere impaccate
molecole con dimensioni minori del 78 % o maggiori del 105%
della lunghezza del DNA del fago wild-type. Solitamente la
lunghezza media della sequenza di 48 kb ed quindi possibile
inserire frammenti di DNA fino a raggiungere una dimensione
finale compresa fra 36-51 Kb. Sono impiegati per la
preparazione di librerie genomice (DNA).
I VETTORI DI INSERZIONE, in cui una porzione del DNA
facoltativo stato rimossa ed stato introdotto un sito di
restrizione unico per linserimento di massimo 9-10 Kb (non
esiste limite minimo). Sono impiegati per la preparazione di
librerie cDNA.

Vettori fagici possono contenere frammenti di DNA molto

pi lunghi (fino a diverse Kb) rispetto ai vettori basati sui
plasmidi batterici.

1. Selezione diretta
2. Identificazione del clone

Esempio di selezione diretta

Identificazione di un Clone in una Libreria

Libreria collezione di frammenti di DNA (cloni)
Libreria genomica
Libreria di cDNA

Libreria Genomica
contiene frammenti di DNA genomico di una cellula
qualsiasi di un organismo, di grandi dimensioni (30-100Kb)
in modo che probabile che in ognuno sia contenuto un gene
per intero.
Costruita di solito in vettori fagici, cosmidi (permettono di
accogliere frammenti di DNA grandi) o cromosomi artificiali
(es Yeast artificial chromosome YAC).
Libreria di cDNA
contiene solo le regioni codificanti dei geni retrotrascritte a
cDNA inserti di dimensioni molto minori.
Costruita di solito in vettori batterici
Per un singolo organismo ci possono essere pi librerie di
cDNA ricavate da diversi tessuti con caratteristiche di
espressione diverse.

Cosmide particolare vettore che contiene le sequenze COS

del fago lambda. Si pu propagare come un plasmide batterico
e pu dare origine ad una serie di fagi ciascuno con un inserto
(libreria) attraverso il processo di packaging in vitro .

Produzione di una Libreria di cDNA

Metodi per Identificare il Clone

Sonde Non Radioattive

Valutazione dellabbondanza di Trascritto

Mediante Ibridazione su un Libreria di cDNA

Selezione di un Clone con Sonde di Oligonucleotidi

Marcati dedotti dalla Sequenza della Proteina codificata

Preparazione delle piastre di agar

Scaldare il terreno LB con agar nel microonde ed aspettare che si raffreddi (ma non che
solidifichi). Aggiungere 100 g/ml ampicillina (50 uL), 0.5 mM IPTG (50 uL) e 80 g/ml X-gal
(80 uL). Versare il terreno (25 mL) nella piastra. Lasciare aperta finch lagar solidifica.
Trasformazione delle cellule di di E. coli XL1Blue
Aggiungere 3 uL ad una di plasmide pUC18 ad una aliquota (100 uL) di cellule competenti.
Agitare ed incubare in ghiaccio per 30 minuti.
Effettuare lo shock termico immergendo il tubo nel bagno termostatato a 42C per 1 minuto.
Velocemente raffreddare in ghiaccio per 5 minuti.
Aggiungere 200 uL di LB liquido ed incubare a 37 C per 45 minuti (per esprimere la
resistenza all'antibiotico).
Piastrare l'intero contenuto su una piastara di LB-Amp/IPTG/XGal ed lasciarla a 37C
overnight.

Sintesi di Oligonucleotidi con una Sequenza Specifica

Produzione di proteine a partire

da geni clonati

Sistemi di espressione
Procarioti (E. coli)
Eucarioti
Lieviti (S. cerevisiae, P. pastoris)
Cellule di insetto/baculovirus
Cellule di mammifero

Segnali importanti per lespressione in E. coli

Per
lespressione
eterologa,
bisogna
inserire la sequenza
codificante sotto il
controllo di elementi
(promotore,
Ribosome
Binding
Site,
terminatore)
utilizzati da E. Coli.
Si utilizzano vettori
di espressione (es.
pQE50).

Promotori

Forti

Costitutivi

Deboli

Inducibili

Alcuni promotori comunemente utilizzati nei vettori di espressione

Un sistema molto comune utilizza la

combinazione dei promotori Lac e T7 con IPTG
come induttore

Costruzione di costrutti per lespressione di proteine di fusione

Il segmento pu essere
un gene di E. coli per
facilitare linizio della
traduzione oppure un
tag (es 6His, come in
pQE50 o la GST
(glutatione transferasi))
che si utilizzer per la
purificazione della
proteina tramite
cromatografia di
affinit.

Cromatografia di Affinit

Espressione di proteine mutate

Problemi generali per quanto riguarda le proteine in E. coli

Per esprimere proteine

in E. coli si deve partire
da cDNA che
rappresenta solo la
sequenza codificante
(senza introni).

Co-trasformazione con plasmide per codoni rari

Inoltre spesso la proteina espressa non si ripiega

correttamente e si ritrova sotto forma di aggregati
insolubili chiamati corpi di inclusione. Ci dovuto
allincapacit dei procarioti, in alcuni casi, di favorire il
folding di proteine di origine eucariota.

Protein refolding

Espressione in organismi eucarioti inferiori

Si utilizzano promotori inducibili di geni eucarioti

S. cerevisiae
Nei lieviti
P. pastoris
Aspergillus nidulans
Nei funghi
Trichoderma reesei

Modifiche post-traduzionali
(es glicosilazione)

I sistemi di espressione eucarioti permettono di ottenere

le modifiche post-traduzionali (es. fosforilazione,
glicosilazione ecc.) anche se a volte con risultati
leggermente diversi tra i vari organismi

Espressione in cellule animali

Il sistema pi comune utilizza cellule di insetto
infettate con baculovirus.

Si utilizzano baculovirus modificati con il gene di

interesse e si infettano cellule di insetto in coltura che
produrranno la proteina di interesse
cellule di insetto infette contenente i
granuli poliedrici del virus

Espressione in vivo in animali

Clonazione di un animale

Induce lespressione
soprattutto nelle cellule che
di solito producono la
lattoglobulina

SDS PAGE
Sodium Dodecyl Sulphate PolyAcrilamide Gel Electrophoresis

Elettroforesi su gel di Poliacrilamide

Utilizzato prevalentemente per la separazione di proteine.
I gel sono preparati facendo polimerizzare monomeri di acrilammide
in presenza di piccole quantit di N,N metilenbisacrilammide.

La polimerizzazione inizia con

laggiunta di ammonio
persolfato (APS) e
N,N,N,N-tetrametiletilenediamine
(TEMED).

Acrilammide

N, N metilenebis-acrilammide

Porosit del PAG

Dipende da:
C = b x 100/ (a + b)
T = (a + b)/V

[%]

x 100 [%]

a = acrilammide
b = metilenbisacrilammide o BIS

Concentrazioni di acrilammide e
intervalli di pesi molecolari
15 %

12.000 - 45.000

10 %

15.000 - 70.000

5 %

25.000 - 200.000

3 %

fino a 1.000.000

Elettroforesi su gel di poliacrilamide

Nativa
Denaturante

Elettroforesi denaturante
La elettroforesi di proteine viene usualmente condotta in condizioni denaturanti, la
cosiddetta SDS-PAGE. In questo tipo di elettroforesi le proteine sono separate sulla
base del loro peso molecolare. Le proteine vengono denaturate usando il detergente
Sodio Dodecil Solfato (SDS),
(SDS) anche noto come Sodio Lauril Solfato, presente nella
maggior parte dei detergenti in commercio. Statisticamente, si lega un SDS ogni due
aminoacidi, interagendo soprattutto con la parte idrofobica. Per denaturare
completamente le proteine, si aggiunge SDS allo 0.1% e si alza la temperatura (5
100C).
Inoltre si aggiunge -mercaptoetanolo per
ridurre i ponti disolfuro. LSDS porta due
cariche negative a pH leggermente alcalino
e quindi rende tutta la proteina carica
negativamente ed il rapporto carica/massa
sar uguale tra le diverse proteine. E da
notare tuttavia che alcune proteine legano
lSDS in proporzioni differenti per la
presenza di maggiori o minori quantit di
residui aa. idrofobici, in tal caso la loro
mobilit elettroforetica sar parzialmente
differente da quella attesa sulla base del loro
peso molecolare.

Trattamento del campione

SDS
denatura le proteine (stessa forma a bastoncino)
conferisce la stessa densit di carica (negativa)

-Mercaptoetanolo

HS-CH2CH2OH

rompe eventuali legami disolfuro

Temperatura (100 C)
accelera la denaturazione completa

SDS-PAGE discontinua
Il gel e funzionalmente diviso in due parti: stacking gel e running gel.

La disc-elettroforesi si fa usualmente
verticale con il catodo in alto, cos che le
proteine migrano verso lanodo in basso.
Il tampone contenuto nelle due riserve
identico.

Le proteine (in SDS e -mercaptoetanolo) vengono caricate in un pozzetto. La

maggior densit fa s che non si mescoli con il tampone della corsa. Le proteine
vengono quindi concentrate nello stacking gel e separate nel running gel. In genere,
nella soluzione di proteine si inserisce un colorante tracciante per poter fermare la
elettroforesi al massimo della sua risoluzione