Sekundarni metabolizam u mikroorganizama

biosinteza antibiotika
Inovacije u fermatacionoj tehnologiji su uveliko ubrzane 1940-ih pojavom,
proizvodnjom prvog antibiotika, penicilina.Ubrzana proizvodnja penicilina je
stimulisana i potrebama tokom II S.R.U ovom period fermataciona
tehnologija malih razmjera povrinskih kultura je zamijenjena
fermeracijama velikih razmjera u tenim kulturama.Takoer su slijedila
poboljanja u hranjivoj podlozi i mikrobnim sojevima.Antibiotici su
vjerovatno jedni od najvanijih produkata industrijskih mikroorganizama, a
ujedno i najznaajnije otkrie moderne medicine.
Drugi veoma vani medincinski proizvodi produkti mikrobnih fermentacija
su: alkaloidi, steroidi, toksini, vakcine, zajedno sa vitaminima (primarni
metaboliti), odreenim enzimima (produkti gen.in.), ivim preparacijama
mikrobnim elije koje se koriste kao probiotici.
Genetiko inenjerstvo je takoe omoguilo proizvodnju velikog broja
proteina i peptida pomou mikroorganizama (inzulin, ineterferoni, ljudski
hormon rasta, monokolonalna antitijela).Veliki broj dijagnostikih sredstava
se takoe dobivaju od MO. U zadnjih 70-ak godina, antibiotici su imali veliki
uticaj na poboljanje ljudskog zdravlja.Proizvodi su plijesni ili bakterija,
naroito aktinomiceta.Trenutno je izolovano preko 4000 antibiotika iz
mikrobnih izvora, mada je samo njih 100-ak odobreno za upotrebu u
klinikoj praksi.Ostali antibiotici ne ispunjavaju odreene vane kriterije
kao to su selektivnost, toksinost za ljude ili ivotinje, visoki trokovi
proizvodnje.Postoji vie od 30.000 sintetskih ili polusintentiskih AB.
Prirodni anitbiotici su u potpunosti produkti mikrobne fermentacije.
U zadnje vrijeme, sve je vei broj semi-sintetskih antibiotika, dobivenih
dijelom fermentacijom, a dijelom hemijskom modfikacijom bonih lanaca.
Dodatno, postoje je u potpunosti sintetski antibiotici koji se koriste u
klinikoj praksi za suzbijanje infekcije i u hemoterapiji (npr. sulfonamidi i
kinoloni).Neki anitiobitici (npr. hloramfenikol) su se izvorno proizvodili
fermentacijom, ali je sada njihova proizvodnja jeftinija hemijskim putem.
Definicija antibiotika
Antibiotici su tvari koje proizvode mikroorganizmi (plijesni i bakterije) a
koje u niskim koncentracijama sprjeavaju ili inhibiraju rast drugih
mikroorganizama (antibiotici prirodnog porijekla).
Derivati koji se u potpunosti ili djelomino proizvode hemijskim putem
metodama rekombinantne DNA tehnologije (polusintetski ili sintetski
antibiotici). Najpoznatiji i vjerojatno najvie medicinski korisni antibiotici su
-laktami, penicilini i cefalosporini, uz aminoglikozide (streptomicin)
i tetracikline (irokog spektra). Plijesni iz rodova Penicillium i
Cephalosporium su glavni izvor beta-laktamskih antibiotika. Od bakterija,
Actinomyces i Streptomyces vrste izluuju razne vrste antibiotika
ukljuujui aminoglikozide, makrolide i tetracikline. Bacillus vrste, koje
formiraju endospore, izluuju polipeptidne antibiotike polimiksine i
bacitracin. Neki antibiotici takoer imaju drugu primjenu osim

anitmikrobne terapije.
Na primjer, aktinomicin i mitomicin (Streptomyces peucetius i S.
caepitosus) koriste se kao antitumorni agensi; dok se neki koriste za
suzbijanje mikrobnih bolesti usjevnih biljaka, ili kao pomagalo u
biohemijskim i molekularno biolokim istraivanjima.
Neki anitbiotici koji su se koristili u stonoj hrani kao promotori rasta, a
takoe se koriste ili e se koristiti u ljudskoj upotrebi su povueni iz stone
hrane zbog bojazi od razvoja rezistencije (npr. bacitracin).
ANTIBIOTICI PROIZVODI SEKUNDARNOG
METABOLIZMA MIKROORGANIZAMA
Antibiotici, kao prirodni proizvodi metabolizma mikroorganizama,
pripadaju grupi sekundarnih metabolita koji imaju visoku fizioloku
aktivnost prema odreenim grupama mikroorganizama (bakterije, plijesni,
protozoe, virusi) ili zloudnih tumora, spreavajui im rast ili unitavajui
ih.Veina mikroorganizama koji proizvode antibiotike takoe formiraju
spore ili neki drugi dormantni oblik. Istraivanja ukazuju da postoji veza
izmeu sporulacije i proizvodnje antibiotika. Hemijska struktura im je
neuobiajena u usporedbi s intermedijerima (meuproizvodima
metabolizma), a proizvode se pri specifinoj brzini rasta nioj od
maksimalne i njihova proizvodnja nije esencijalna za rast
mikroorganizma producenta u istoj kulturi (dr. alkaloidi).
Sekundarni metaboliti nastaju krajem eksponencijalne faze i tokom
stacionarne faze rasta diskontinualnog (arznog) procesa fermentacije.
Meutim, proizvodnja antibiotika je presudna za preivljavanje i
kompetitivnu prednost proizvodnog mikroorganizma u njegovom prirodnom
okoliu.
Karakteristike sekundarnih metabolita
Odreeni sekundarni metabolit je produkt samo jedne skupine organizama.
Nije neophodan za rast i razmnoavanje. Proizvodnja sekundarnog
metabolita je uveliko ovisna o uslovima rasta, posebno od sastava
podloge. Izvedeni iz primarnih metabolita, a ne iz supstrata. Produkcija
sekundarnih metabolita moe se drastino poveati, za razliku od
primarnih metabolita. Enzimi ukljueni u proizvodnju sekundarnih
metabolita se razlikuju od enzima za proizvodnju primarnih metabolita
Vane kriterije kliniki korisnih antibiotika
Najvanije svojstvo kliniki korisnih antibiotika je selektivna toksinost,
tj. agens koji inhibira ili ubija patogene mikroogranizme, ali ne ispoljava
toksine efekte prema domainu.
Selektivna toksinost se lake ostvaruje u tretmanu bakterijski uzrokovane
bolesti zbog strukturnih i funkcionalnih razlika izmeu prokariotiskih i
eukariotskih elija domaina (npr. nedostatak elijskog zida, veliina
ribozoma, specifinost metabolizma).
Nomenklatura i klasifikacija antibiotika
Antibiotici su esto kompleksne organske molekule (niske molekulske mase), pa
su nazivi prema dogovorenoj nomenklaturi predugaki. U upotrebi su uobiajena
imena (prema mikroorganizmu producentu ili osnovnoj hemijskoj strukturi s

nastavkomin).
Antibiotici su vrlo raznovrsni po hemijskoj grai, biolokim, hemijskim i fizikalnim
svojstvima te ne postoji standardna klasifikacija odnosno podjela prema nekom
odreenom svojstvu.
Uobiajeni naini podjele prema:
1. spektru djelovanja,
2. prema uinku,
3. hemijskoj strukturi,
4. mehanizmu djelovanja.
1. Podjela antibiotika
Prema spektru djelovanja - tj vrsti bakterija ili drugih organizama na koje djeluju
odreeni antibiotik, antibiotici se dijele na one irokog spektra (G+ i G-), uskog
spektra (G-) ili ogranienog spektra (efektivan samo za jedan odreeni
organizam ili bolest). Ova podjela je vana sa stajalita medicine i od pomoi je u
terapijskoj primjeni antibiotika.
2. Prema uinku (stupnju djelovanja)
Prema uinku, nainu djelovanja dijele se na bakteriostatske i baktericidne.
3. Prema hemijskoj strukturi
Beta-laktamski antibiotici: penicilini, cefalosporini, karbapenemi (Imipenem),
monobaktami (aztreonam).
Glikopeptidi: vankomicin, teikoplanin.
Aminoglikozidi: streptomicin, gentamicin, kanamicin, tobramicin.
Makrolidi (Azalidi): eritromicin, azitromicin, klaritromicin.
Linkozamidi: linkomicin, klindamicin.
Kinoloni: ciprofloksacin, norfloksacin.
Tetraciklini: doksiciklin, tetraciklin, tigeciklin.
Sulfonamidi: sulfonamid, trimetoprim.
Streptogramini: kuinupristin/dalfopristin.
Oksazolidini: linezolid.
Polimiksini: bacitracin.
Podjela po hemijskoj strukturi daje najbolji uvid u karakteristike svake grupe
antibiotika, i povezanost izmeu hemijske grae i bioloke aktivnosti ovih
spojeva.
4. Mehanizmu djelovanja
Podjela prema mjestu djelovanja u eliji mikroorganizama
Po mehanizmu djelovanja (inhibicije) antibiotici se dijele na 4 osnovne grupe:
Inhibicija sinteze elijskog zida
Inihibitori elijske membrane
Inhibitori sinteze proteina
Inhibitori nukleinskih kiselina
MEHANIZAM DJELOVANJA ANTIBIOTIKA
Omoguava racionalniji pristup pronalaenju novih i modificiranju postojeih

antibiotika.
1. Antibiotici inhibitori biosinteze elijskog zida
(penicilini, cefalosporini, cikloserin, bacitracin)
- Onemoguavanje umreavanja peptidoglikanskog sloja elijskog zida bakterija
to dovodi do autolize elije.
2. Antibiotici koji se veu na citoplazmatsku membranu:
(polipeptidni antibiotici: bacitracin, gramicidin, polimiksin, nistatin)
- Dovode do disfunkcije citoplazmatske membrane (osmotska barijera) i
nekontroliranog prolaza otopljenih molekula u i iz elije.
3. Antibiotici inhibitori biosinteze proteina
(antibiotici irokog spektra djelovanja tetraciklini, streptomicin, kloramfenikol,
aminoglikozidi, makrolidi, linkozamidi)
- Onemoguavaju proces oitavanja amino kiselina i sintezu peptida sa mRNA u
ribozomima.
4. Antibiotici inhibitori funkcije (sinteze) DNA/nukleinskih kiselina:
(kinoloni, rifampicin; antitumorni antibiotici aktinomicin, bleomicin, daunomicin)
- Onemoguavaju sintezu nukleozida, replikaciju DNA, transkripciju mRNA na DNA
kalupu (template).
INHIBICIJA SINTEZE ELIJSKOG ZIDA
Inhibitori sinteze elijskog zida u biti ciljaju neke od koraka sinteze
peptidoglikana.
Beta-laktamski antibiotici (penicilinini i cefalosporini) su najbolji primjeri.
Preko 100 beta-laktama, veinom penicilina i cefalosporina su odobreni za ljudsku
upotrebu i oni ine skoro pola svih antibiotika koji se proizvode irom svijeta.
Ova grupa je posebno interesantna zbog svoje sigurne upotrebe i visoke
selektivnosti za bakterijske elije.
Penicilin
Peniclin je prvi otkriveni antibiotik i prvi antibiotik odobren za kliniku upotrebu.
Prirodni penicilini (penicilin G i penicilin V) su produkti fermentacije Penicillum
chrysogenum.
Penicilin G i V su uskog spektra jer ne djeluju na G- tapie.
Veina penicilina su derivati 6-aminopenicilinske kiseline (6-APA) i kao svi betalaktami sadre beta-laktamski prsten koji je esencijalan za njihovu aktivnost.
Boni lanci takoe daju odreene karakteristike antibiotiku, kao npr. otpornost
na enzimsku degradaciju, mehanizam za penetraciju elijskog zida.
Penicilin G je nestabilan u acidnom okruenju (niski stomani pH) tako da se ne
moe administrirati oralno a da bude efikasan.
Polisintetski oblici su proizvedeni sa poboljanim karakteristikama u odnosu na
prirodne peniciline.
Glavni dio molekule 6-aminopenicilinska kiselina se proizvodi fermentacijom koji
se kasnije hemijski modifikujem dodatkom raznih bonih lanaca, rezultirajui

antibiotikom sa poboljanim svojstvima (vei spektar djelovanja, otpornost na

niske pH).
Penicilini inhibiraju sintezu peptidoglikana i nemaju efekta na ve postojei
elijski zid.
Oni ispoljavaju bakteriocidno dejstvo na elije koje rastu, koje postaju osjetljive
na osmotski stres i dolazi do autolize elija.
Penicilini onemoguavanje umreavanja peptidoglikanskog sloja elijskog zida
bakterija jer su strukturno slini peptidima koji prirodno vre ovu dunost
(supstratski analog), to rezultira formiranjem labavog/nestabilnog
peptidoglikana i dovodi do autolize elije.
Cefalosporini
Cephalosporium (Acremonium) vrste proizvode cefalosporin antibiotike.
Cefalosporini imaju u biti isti mehanizam djelovanja kao i penicilini.
Oni su nisko toksini i imaju irok spektar dejstva u poreenju na prirodne
peniciline.
Obino se koriste kod pacijenata koji su alergini na penicilin.
Vankomicin
Vankomicin je produkt Streptomyces orientalis
Postao je vaan kliniki antibiotik od pojave MRSA (meticilin rezistentnog
Staphylococcus aureus).
Inhibira sintezu peptidoglikana, tako to onemoguava inkoroporaciju malih
peptida koji su vani za umreavanje peptidoglikanskog sloja.
Bacitracin
Bacillus (subtilis) vrsta proizvode peptidni antibiotik bacitracin. Bacitracin takoe
preventira sintezu peptidoglikana. Inhibira oslobaanje peptidoglikanskih
podjedinica iz nosaa lipidnih molekula koje ih prenose preko citoplazmatske
membrane. Visoko toksian, koristi se uglavnom za topiko lijeenje, a ne za
sistemsku primjenu.
INHIBITORI CITOPLAZMATSKE MEMBRANE
Kod bakterija, integritet citoplazmatske membrane je vitalan kako za transport
nutrijenasa tako i za stvaranje energije. Vanjska membrane kod G- bakterija ima
jo i zatitnu ulogu. Agensi koji remete ove membrane takoe ubijaju mikrobne
elije. Antimikrobna jedinjenja koji imaju mehanizam djelovanja su rijetko
specifini samo za prokaritoske elije, jer i eukariotske elije su sline u strukturi i
kompozicji.
Polimiksin je jedini kliniki znaajan antibakterijski antibiotik iji mehanizam
djelovanja je usmjeren prema inhibiciji elijskih membrana. Svoje svojstvo
ispoljava tako to se vee za membranske fosfolipide i tako interferira sa
funkcijom membrane. Spektar djelovanja su mu G- bakterije, a uglavnom se
koristi topiki zbog tetnih nuspojava. Proizvod od Bacillus polymyxa
(Paenibacillus polymyxa). Antifungalni inhibitori elijske membrane
Fungalne infekcije (plijesni i gljive) je obino mnogo tee lijeiti nego bakterijske
infekcije. Slinost sa elijama domaina (oba eukarioti) ograniava selektivnost

lijeka prema patogenu. Jedan od potencijalnih targeta je ergosterol, sastavni dio

elijskih membrana kod gljiva i plijesni (holesterol kod viih eukariota). Polieni
makrolidni antibiotici (Streptomyces vrste: nistatin-S.noursei,
pimaricin/natamicin-S.natalensis, amfotericin B-S.nodosus) i sintetski azoli
(flukonazol, mikonazol itd.) imaju ovaj mehanizam djelovanja tako da se ili veu
za ergosterole i time destabiliziraju fungalnu membranu ili inhibiraju njenu
biosintezu.
INHIBITORI SINTEZE PROTEINA
Sinteza proteina je kompleksan proces, stoga postoji broj specifinih
koraka/targeta za inhibiciju odreenom grupom antibiotika. Veliki broj antibiotika
inhibira translaciju, specifino njihovo dejstvo je usmjereno ka inhibiciji ribozoma
koji igraju kljunu ulogu u ovom zavrnom koraku sinteze proteina.
Razlika izmeu ribozomskih podjedinica prokariotskih i eukariotskih elija
omoguava selektivnu toksinost ovih antibiotika samo za elije patogena
(bakterija).
Eukariotski ribozome 80S (60S i 40S podjedinice)
Prokariotski ribozome 70S (50S i 30S podjedinice)
Vani antibiotici sa ovim mehanizmom djelovanja su aminoglikozidi, makrolidi,
tetraciklini.
Aminoglikozidi streptomicin (S.griseus), kanamicin (S.kanalyceticus),
tobramicin (S. tenebrarius) su proizvodi Streptomyces vrsta; gentamicin
(Micromonospora purpurea).Oni se veu za bakterijski ribozom i tako sprjeavaju
poetak sinteze proteina (translaciju).
Makrolidi eritromicin (S.erythraeus) i oleandomicin (Streptomyces) se veu za
bakterijsku 50S podjedinicu i sprjeavaju elongaciju proteina tokom translacije.
Tetraciklini takoe proizvodi Streptomyces vrsta, a trenutno se proizvode i
semisintetski derivati ovih anitbiotika. U tetracikline spadaju tetraciklin,
hlortetraciklin, oksitetraciklin, doksiciklin. Ovo su antibiotici irokog spektra
djelovanja (G+ i G-). Blokiraju vezivanje aminoacil-tRNA za A mjesto na ribozomu.
In vitro tetraciklin inhibira sintezu proteina i sa 70S i 80S ribozoma, mada bez
obzira na ovo
uopteno/neselektivno dejstvo
ispoljava veoma malu toksinost
prema ivotinjskim
elijama.
INHIBITORI NUKLEINSKIH KISELINA
Odreeni broj antibiotika blokira rast elija remetei sintezu DNA ili RNA.
Meutim, veina ovih antibiotika nema klinike upotrebe zbog njihove
neselektivnosti, tj utiu kako na mikrobne tako i na ivotinjske elije. Jedna grupa
koja ispoljava selektivnost jesu rifamicini proizvodi Streptomyces (mediterranes)
vrsta. Najpoznatiji je rifampicin, semisintetski derivat rifamicina.
Rifampicin je specifian za bakterijsku DNA-zavisnu RNA polimerazu, a ne
djeluje na RNA polimerazu iz ivotinjskih elija niti DNA polimerazu. Rifampicin
blokira sintezu mRNA vezivajui se za beta-podjedinicu polimeraze. Od ostalih
antibiotika, vano je spomenuti novobiocin takoe produkt Streptomyces vrsta.
Ovaj antiobiotik ima kliniku upotrebu, ali obino se koristi kao rezervni lijek, kada

ostali antibiotici nisu uspjeli suzbiti infekciju. Kinoloni inhibiraju DNA girazu
(odgovoran za odmotavanje i stvaranje supernavoja DNA) i sintezu DNA.
Biotehnoloka proizvodnja
antibiotika penicilin
1928 engleski naunik Fleming je otkrio prvi antibiotik penicilin. Otkriven je
sasvim sluajno zapaanjem inhibitorne zone oko fungalnog kontaminanta,
Penicillum notatuma, na Staphylococcus aureus petri ploi. 1930-ih druga grupa
engleskih naunika je okarakterizovala ovu inhibitornu supstancu, penicilin i
razvija protokol za njegovu izolaciju u istoj formi. Otkrie penicilina je vodilo ka
otkriu drugim mikroorganizama koji proizvode antibiotike. U jedna od ovih ranih
otkria spada i otkrie streptomicina iz aktinomiceta tla, Streptomyces griseus.
Ovo je dalje rezultiralo otkriem velikog broja antibiotika, veine antibiotika koji
se danas koriste u medicini, a koje produciraju Streptomyces vrste. Ova otkria
su konanici dovela do velikih napredaka u medicini i fermatacionoj tehnologiji.
Kao i svi antibiotici peniclin je sekundarni metabolit, koji se proizvodi na kraju
ekponencijalne faze rasta. Njegova proizvodnja uveliko zavisi od sastava hranjive
podloge i zavisno od uslova mogua je njegova hiperprodukcija. P. notatum je
organizam koji prvobitno otkriven da proizvodi penicilin, proizvodei 1mg/L iz
povrinskih kultura. Kada je kasnije kukuruzni ekstrakt dodat u sastav podloge
prinos proizvodnje penicilina je poveana 20-25 puta. Kukuruzni ekstrakt sadri
vane izvore azota, faktore rasta, prekursore bonih lanaca, tako da je do dan
danas ostao kao vaan dodatak hranjive podloge za proizvodnju
penicilina ak i vee koliine penicilina su se dobile upotrebom srodne vrste, P.
chrysogenum koja je izvorno izolovana iz buave dinje. Proizvodnja je dalje
poveana prelaskom na tene hranjive podloge. Zahtjevi za penicilin tokon II
S.R. su stimulisali brzi razvoj kultuvacije u tenim podlogama velikih razmjera u
reaktorima sa mehanizmom za mijeanje (stirred tank reactors). Ovaj tehnoloki
napredak je naravno imao veliki
uticaj na unapreenje cijele
oblasti fermentacione
tehnologije. Od 1940-ih prinos proizvodnje
penicilina i fermentaciona produktivnost su uveliko poboljane ekstenzivnim
mutacijama i selekcijom produktivnih sojeva. Tradicionalni pristup
poboljanja prinos penicilina zasniva se na nasuminim mutacijama i selekcijom
visoko produktivnim sojeva.
Dobiveni mutanti su uzgajani u tenim podlogama/kulturama i filtrati kultura
ispitivani na penicilin.
Ova metoda je bila spora, ali uprkos tome kljuna u dramatinom poveanju
prinosa penicilina koji sada iznosi 50g/L (50 000 puta vei prinos od poetnog).
Tako, klasine ili tradicionalne metode oplemenjivanja sojeva su (bile) vanije za
poboljanje proizvodnje penicilina nego genetika manipulacija upotrebom
genetikom inenjerstva. Tehnike genetikog inenjerstva se uglavnom koriste i
uglavnom su doprinjele samoj razumijevanju kompleksnog mehanizma biosinteze
penicilina.
Proizvodnja pencilina
U toku proizvodnje penicilina, prisustva P. notatum ili P. chrysogenum, a odsustva
prekursora bonih lanaca u fermentacionoj podlozi dobivaju se prirodni penicilini,
Penicilin G i Penicilin V (otporan na niske pH). Veina dananjih penicilina su

polusintetski, proizvedeni hemijskom modifikacijom od prirodnih penicilina, koji su

dobiveni fermentacijom pomou soja P. chrysogenum. Modifikacija se postie
uklanjanjem acilne grupe, tako da ostaje 6-APA na koji se druge acilne grupe
mogu dodavati kako bi se dobio antibiotik sa novim svojstvima. Neki od ovih
semi- ili polusintetskih anitbiotika su meticilin, karbenicilin, ampicilin, koji imaju
poboljana svojstva kao to su otpornost na stomanu kiselinu (omoguavajui
oralnu administraciju), otpornost na penicilinaze, povean spektar dejstva prema
nekim G- bakterijama. Ab iz mikroorganizama se proizvode biosintezom u
bioreaktorima
Tri osnovne faze u procesu proizvodnje antibiotika su:
1. Uzgoj inokuluma: dobivanje biomase mikroorganizma u dovoljnoj
koliini i odgovarajuih fiziolokih karakteristika potrebnih za biosintezu
antibiotika
2. Kultivacija proizvodne kulture: u svrhu biosinteze antibiotika
optimiranje sljedeih parametara:
1. mikroorganizam producent
2. sastav hranjive podloge (sirovine za biosintezu)
3. osnovni uvjeti kultivacije
A. ista kultura mikroorganizma producenta
B. Aseptinost (sterilnost)
C. Temperatura
D. pH vrijednost tokom uzgoja
E. Mijeanje, aeracija
F. Suzbijanje pjene
4. vrijeme trajanja uzgoja
5. regulacijski mehanizmi u biosintezi
3. Izolacija antibiotika po zavretku biosinteze izdvajanje istog
antibiotika u medicinske svrhe ili u obliku tehnikog preparata za
krmiva. uobiajeno je prireivanje preparata u prakastom obliku (suhi
preparat), budui da je u tom obliku najstabilniji. Proiavanje antibiotika iz
komine provodi se taloenjem, ekstrakcijom organskim otapalima,
sorpcijom/desorpcijom na izmjenjivakim smolama.
Industrijski prinosi antibiotika su 20-60 g/L.
Kontrola procesa biosinteze
Radni mikroorganizam:
morfoloki pregled
biohemijske (fizioloke) karakteristike
intenzitet biosinteze antibiotika (prinos)
B Hranjivi sastojci podloge:
testiranje hranjivih sastojaka na podesnost za biosintezu
analiza hemijskog sastava i koliine
C Inokulum:
koncentracija biomase (elija, spora)
mikroskopski pregled
odravanje uvjeta uzgoja (pH, temperatura, punjenje, koliina zraka,
otopljeni kisik

D Kultivacija:
prinos antibiotika (g/ml)
produktivnost biosinteze antibiotika (g/ml x h)
prirast biomase (g/ml, g/l)
utroak hranjiva (izvor: ugljika-eeri; duika-ukupni amonijski amino;
fosfora; sumpora)
uvjeti kultivacije (pH, temperatura, aeracija, otopljeni kisik, pjenjenje
mikroskopski pregled
Kontrola sterilnosti:
podloge (uvanje, selekciju, inokulum, kultivacija,) radni mikroorganizam,
sredstva protiv pjenjenja i podeavanje pH; i aparatura za regulaciju i zrak.
Tokom itavom procesa veoma vana je koncentracija kisika, koji se odrava na
60 nmol/L/h.
Proces se odvija na temperaturi od 25-27C i pH 6,5-7,7, ali specifini uslovi zavise
od soja koji se koristi. U hranjivoj podlozi, kao izvor ugljika adaptirane su razne
sirovine koje ukljuuju: glukozu, laktozu, sukrozu, etanol, biljna ulja. 65% ugljika
se iskoristi za odravanje elije, 25% za njen rast a samo 10% za proizvodnju
penicilina.
Hranjiva podloga
U dosta sluajeva koristi se mjeavina glukoze i laktoze, gdje glukoza promovira
rast elija, dok laktoza pozitivno utjee na proizvodnju penicilina.S toga, tokom
proizvodnje penicilina o kritine je vanosti nain i vrijeme dodavanja odreenom
izvora ugljika. Kukuruzni ekstrakt izvor azota, fak.rasta, prek.bo.lanaca. Zbog,
po prirodi kiselosti kukuruznog ekstrakta potrebno je dodati i kalcijum karbonat i
fosfatni pufer za neutralizaciju hranjive podloge i optimizaciju pH za proizvodnju
penicilina. Mineralne soli, amonijak i prekursori bonih lanaca se takoe mogu
dodati, a nekada se zbog toksinosti dodaju kontinuirano u ne-inhibirajuim
koncentracijama.
Propagacija
Uzgoj inokuluma se obino inicira dodatkom liofiliziranih spora u mali
fermentor (5x10^3 spora/ml).
Micelijum plijesni se uzgaja u jedan ili dva stadija dok ne dosegne dovoljnu
koncentraciju za inokulaciju proizvodnog fermentora. Prvobitni rast ukljuuju
vegetativnu fazu rasta koja je usmjerena kao poveanju biomase koja se
odrava 2 dana. Kako bi se osigurao dobar prinos penicilina u sljedeoj fazi,
proizvodnoj fazi micelijum se uzgaja u vidu labavih peleta, dok se 6-8 sati
konstaktno dodaje izvor ugljika u malim koliinama. Na kraju fermentacije,
peniclin se izluuje u hranjivu podlogu iz koje se izdvaja. Penicilin se obino
izdvaja prvobitnim odvajanjem micelija rotacionim vakumskim filterima.
Odvojeni micelijum se pere da se odstrane ostaci penicilina koji se koriste u
stonoj hrani ili ubrivu. Antibiotik se dobiva ekstrakcijom otopine iz tene
filtrirane podloge sa prinosom od 90%, obino pri niskim pH (2-2,5) i niskim
temperaturama (0-3C). Ekstrakt se dalje preiava, antibiotik izdvaja
kristalizacijom pomou natrium i potasium acetata u vidu natriumovih ili
potasiumovih soli. Kristali penicilina se dalje preiavaju pomou isparljivih
otopina i sue (99,5% istoe).

Faza dobivanje polusintetskog AB

Cilj proizvodnje polusintetskih AB je proizvodnja jedinjenja sa poboljanim
svojstvima.
Nakon dobivanja kristala prirodnog penicilina, kristali prolazi kroz kolumn sa
penicilin acetilazom gdje se odstranjuje postojei boni lanac i dodaje
novi odgovarajui, zavisno od vrste polusintetskog antibiotika koji se eli
proizvesti. Poto je prinos cefalosporina direktno iz fermentacija mnogo manji
nego za penicilin, prirodni penicilin (6-APA) se koristi za dalju hemijski
modifikaciju kako bi se dobili cefalosporini.
PRIPREMA MEDICINSKIH OBLIKA ANTIBIOTIKA
Zavrni stepen u pripremi lijekova za primjenu u medicini i veterinarstvu.
Zahtjevi koji se postavljaju da bi antibiotik bio lijek; osim odgovarajue
aktivnosti prema patogenim mikroorganizmima (ili elijama karcinoma):
1. Niska toksinost antibiotika i razgradnih proizvoda na ljudski organizam.
- akutna i hronina toksinost
- Ispituje se na pokusnim ivotinjama, a izraava kao LD50 (letalna doza za 50%
pokusnih ivotinja) u mg antibiotika/kg tjelesne teine.
2. Izraen antimikrobni efekt pri minimalnim koncentracijama/tjelesnih
tekuina (oko 1g/ml).
3. Minimalna pojava rezistencije (otpornost mikroorganizama na antibiotik
naknadno steena).
4. Dobra topivost u vodi pri prihvatljivom pH
5. Stabilnost pri skladitenju, primjeni
6. Optimalni uvjeti primjene (raspodjela, izluivanje, sauvanje antimikrobnog
djelovanja u organizmu ovjeka).
7. Apirogenost ne smije izazvati groznicu (povienje tjelesne temperature za
0,6C) niti alergijske efekte.
8. Ne smije izazvati sekundarne efekte na: elije, krvni serum, leukocite
9. Ne smije izazvati nus-pojave pri lijeenju: oteenja organa ili funkcija
organizma. Npr. streptomicin (dugotrajna primjena) oteuje sluh, a
antibiotici irokog spektra (tetraciklini) unitavaju simbiotsku mikrofloru
crijeva pa se nasele kandide iz usne upljine.
Niti jedan antibiotik ne zadovoljava u potpunosti ove uslove najvie se
pribliava penicilin. Penicilin moe izazvati alergije (anafilaktiki ok), i rairena je
pojava rezistencije.
ODREIVANJE KONCENTRACIJE ANTIBIOTIKA
1. Hemijske i fizike metode
(na temelju jednog karakteristinog svojstva antibiotika)
penicilin jodometrijski, enzimski (penicilinaza)
tetraciklin spektrofotometrijski (apsorpcija vidljivog svijetla), HPLC
2. Mikrobioloke metode
Osnovica inhibicija rasta test mikroorganizma (osjetljivog na antibiotik).
Mjerenje inhibicije rasta s uzorkom (nepoznate koncentracije) i usporedba s
inhibicijom koju izaziva standard izraunavanje nepoznate koncentracije uzorka.
Difuzione metode:

- na vrstim podlogama
- mjerenje promjera zone inhibicije
Dilucione i turbidimetrijske metode:
- u tekuim podlogama
- inhibicija se mjeri stupnjem zamuenja podloge, a zamuenje je mjera rasta
mikroorganizama
IZRAAVANJE KONCENTRACIJE ANTIBIOTIKA
Koncentracija antibiotika se izraava na vie naina:
1. volumnim ili teinskim postotkom,
2. g/mL ili mg/mL,
3. i.j./mL ili i.j./mg.
Jedinica antibiotike aktivnosti, izraena kao internacionalna jedinica (i.j.), je
minimalna koncentracija antibiotika koja e inhibirati ili zaustaviti rast
odreenog broja elija standardnog soja test-mikroorganizma sadranog u jedinici
volumena hranjivog medija.
Definicije internacionalnih jedinica su razliite za svaki pojedini antibiotik.
Internacionalna jedinica antibiotike aktivnosti penicilina je minimalna koliina
antibiotika penicilina koja moe inhibirati rast standardiziranog soja
Staphylococcus aureus u 50 mL hranjivog bujona.
Tako je jedna internacionalna jedinica (i.j.) penicilina G ekvivalentna masenoj
jedinici od 0,6 g, jer 1 mg penicilina G (natrijeva sol) sadri 1667 i.j.
Internacionalna jedinica antibiotike aktivnosti streptomicina je minimalna
koliina antibiotika streptomicina koja inhibira rast standardiziranog soja
Escherichia coli u 1 mL hranjivog bujona.
Internacionalni standard sadri 780 i.j./mg streptomicin sulfata, to znai da 1 i.j.
sadri 1,282 g streptomicin sulfata.
Medicinska primjena antibiotika temelji se uglavnom na antibakterijskom
djelovanju tj. lijeenju zaraznih bolesti uzrokovanih patogenim bakterijama
(vrlo rijetko virusima).
Antifungalnim se antibioticima (nistatin) lijee kone bolesti uzrokovane
gljivicama.
Citostatici sprjeavaju rast elija zloudnih tumora
(daunomicin, bleomicin).
Nemedicinska primjena antibiotika
Krmiva u stoarstvu i peradarstvu
- stimulator rasta stoke i peradi ako se daje s hranom (krmivima)
- dodatak 20-50 g antibiotika/t krmiva
- efekt postignut dodatkom antibiotika: bri rast ivotinja, bolji prirast po
jedinici mase hrane, uteda krmiva, preventiva (spreavanje) infekcija
ivotinja posebno epidemija u velikim uzgajalitima.
-

Poveanje prirasta 10 20 % uz iste uvjete

Pilii ak do 25% poveanja prirasta
Svinje, telad do 10% poveanja prirasta
Nesilice poveanje perioda nesenja jaja
Koriste se (bacitracin, tilozin, flavomicin) tj. antibiotici koji se ne koriste u

medicini zbog mogunosti nastajanja rezistentnih mikroorganizama

2001. je samo u SAD primijenjeno oko 12 000 t antibiotika u
ne-terapijske svrhe, za poticanje rasta ivotinja na farmama (perad,
goveda, svinje), a u EU je primijenjeno oko 5000 t u veterinarskoj
medicini i kao promotora rasta ivotinja na farmama.
Nemedicinska primjena antibiotika
Fitopatologija
Lijeenje bolesti biljaka uzrokovanih: virusima, bakterijama, gljivama,
protozoama
Lijeenje bolesti biljaka u rasadnicima: sjemena (izvana ili iznutra), gomolja,
lukovica, sadnica, supstrata
Nain primjene: prskanje, kvaenje, napraivanje (supstrat, biljka, sjeme)
zalijevanje (difuzija u cijelu biljku)
Koncentracije antibiotika u biljci 1 10 g/ml
Zahtjevi na antibiotik u fitopatologiji: unitava uzronike bolesti, laka
penetracija u biljku, aktivan u biljci due vrijeme, netoksian za biljku
Primjena antibiotika u prehrambenoj industriji i konzerviranju
Kvarenje hrane je uzrokovano mikroorganizmima i enzimima ili toksinima
mikroorganizama.
Mali broj mikroorganizama se brzo razmnoi u namirnicama i uzrokuje
kvarenje.
Koriste se antibiotici irokog spektra djelovanja i polipeptidni antibiotici;
antibiotici iz biljaka (fitoncidi).
Konzerviranje namirnica:
Preduga toplinska sterilizacija kvari ukus namirnica,
Dodatak antibiotika skrauje vrijeme sterilizacije (energetska uteda),
Dodatak nisina, subtilina (polipeptidi) sprjeava rast spora klostridija
(termorezistentne).
Mlijene preraevine: sprjeavanje klostridijskog napuhavanja sireva,
jogurta, pudinga i slinih namirnica (nisin).
Pivarstvo i kultivacija kvasaca: dodatak polimiksina sprjeava rast
Gram-negativnih bakterija (bolje vrenje i mogunost reciklacije kvasca).
Pojava rezistentnosti
Novi antibiotici se jo trae jer je rezistencija na antibiotike postao jedan od
glavnih problema u posljednjih nekoliko godina
Kroz zloupotrebu i prekomjerno koritenje ovih lijekova, svakodnevno se
poveava bakterijskih sojeva rezistentnih na antibiotike, to zahtijeva dalju
potragu za novim antibioticima i alternativnim sredstvima za antimikrobno
lijeenje.
Rezistencija na antibiotike: steena otpornost na antibiotike. Nastaje genetikim
promjenama u eliji mikroorganizma: spontanom mutacijom i prenoenjem
ekstrahromosomalne DNA.
Rezistencija na antibiotike nije skoranji fenomen, nego je zabiljeena ubrzo
nakon prve upotrebe prirodnih penicilina.
Upotreba antibiotika je stvorila selekcijski pritisak koji favorizira rast mutanata
otpornih na antibiotike, a koji je promoviran zloupotrebom i prekomjernom
upotrebom ovih lijekova. Tokom posljednjih 10 godina situacija je postala

alarmantna, zbog pojave patogenih sojeva koji pokazuju viestruku rezistenciju

na irok spekatar antibiotika. Jedan od najvanijih primjera je razvoj multirezistentnog soja S. aureus (MRSA). Zlatno doba' otkria antibiotika (1940-1960)
najplodnije razdoblje u biotehnolokoj proizvodnji antibiotika. 1962-2000
Inovacijski jaz - nema novih strukturnih klasa antibiotika to predstavlja ozbiljan
inovacijski jaz tokom genomske ere i veliki problem uzimajui u obzir sve vei
broj multi-rezistentnih sojeva. Zadnji antibiotik
Januar 2015 - zadnji pronaeni antibiotik Teixobactin. Novom metodom
kultivacije u tlu, izolovana bakterija koja se prije mogla kultivisati (Eleftheria
terrae). Nova bakterija proizvodi antibiotik koji ima antibaktericidno dejstvo
protiv gram-pozitivnih bakterija, Staphylococcus aureus, i Mycobacterium
tuberculosis. Nova klasa natibiotika, inhibira sintezu elijskoj zida vezui se za
lipide.
Rezistencija se jo nije razvila.