CAPITOLUL I, PROTEINELE. ENZIMELE STRUCTURA $I FUNCTIA BIOLOGICA A PROTEINELOR “Majoritatea covirsitoare a modificiilor biochimice inorganismele vii sunt determinate de proteine: Viata enemijlocitlegaté de procesul de reinnoire a proteinelor si reprezint ‘modul de existent a corpului proteic” (F. Enghels). Anume proteinele sunt consttuentele chimice cu cel mai inalt grad de complexitate, varietate molecular, care reprezinti specificitate de specie, de organ. Denumirea de proteina provine de la cuvintul grec proteios, care inseamna de prim rang, pentru viata, folosit ca termen pentru prima dati in 1838 de catre savantul german Miilder, Proteineleformeaz clasa desubstanfe dintre cele mai raspindite si deo varietate functional’ exceptional’, Proteinele indeplinese urmiitoarele fiuncyii fundamentale iminente organismelor vii: 1. Auun pronuntat si important rol structural, constituind baza structurilor celulare, membranare, precum sia organitelor celulare, materialul intercelular al tesuturilor gi organelor. Proteinele structurale sunt: colagenul, elastina, keratina, fibroina. Ele asigura diversitatea si specificitatea de forma a tuturor fiinyelor vii. 2. Exetcitd cataliza fermentativa, Toate varietatile de reactii biochimice si tot specificul transformatilor din organismele vi sunt determinate de enzime care sunt, de fapt, proteine. Actualmente, sunt depistate mii de fermenti, multi dintre care separati fn forma cristalicS. 3. Functiile contractils gi locomotoare (dinamica) sunt asigurate de proteinele respective: actina, miozina, tubulina ~ proteina microfilamentelor ce determind procesele de bazi in celula. Miscarea coordonati la nivel microscopic (procesul mitozei) la fel e determinata de aceste proteine. 4, Functia de transport si de depozitare a unor compusi chimici ca: ‘oni meta- lici, vitamine etc. Hemoglobina aprovizioneaza cu oxigen tesuturile, iar o proteind inrudita, miogiobina, il depoziteazi in muschi. Transferina si feritina asigur’ transportul sidepozitarea fierului in singe, ficat. Lipoproteinele plasmei transport’ lipidele, Un grup specific de proteine se afla in membrane, transferind prin membrand in celuli diferiti ingredient. 5. Funetia de protejare fat de corpi stain, virusuri, bacterii, macromolecule easigurati de proteinele specifice eliminate, in majoritate, de limfocite. Reaetiile imunologice sunt determinate de imunoglobuline (proteine efectiv specifice). Astfel de proteine ca fibrinogenul, trombina 5.2. iaw parte la procesul de coagulare a singelui, protejind organismul de impactul lezArii vaselor sanguine. 6, Funetia reglatoare contribuie la reglementarea cresteri gi diferentierii celule- Jor. fntr-un anumit interval de timp in viata organismului se produce expresia numai la 0 parte mica din genom celulei. Functia dati o indeplinesc asa-numitele proteine-represor, care inhibi portiuni specifice in DNA celular. Aici pot fi atasate siproteinele ce reglearé activitatea fiziologic’ celular, -12-7.0 grupi specifica de proteine poate stoca, transmite si genera diverse mesaje chimice, impulsuri nervoase, servind drept receptori (rodopsina- proteina fotore- ceptorie in retina ochiului) sau transmigitori ai impulsului nervos in sinapse etc. 8. Functia fizico-chimic& a proteinelore capabili si mentind constantele singe- lui-homeostazia (albuminele determing presiunea oncotic% -canttatea, volumul lichidului fn vasele sanguine). 9. Proteinele indeplinesc gi funcfii insolite, De exemplu, singele pestilor antarctici conjine proteine cu proprietati de antigel, protejind pestii de inghet. Locul de fixare 1 aripilor Ia unele inseete confine rizelind - protein’ purtatoare a unei elasticitii ideale. Din plantele afticane s-a extras oproteind foarte dulee- monelina, ce nu favorizeazi obezitatea, find folositi pe larg in raf alimentard. 10.0 grupa interesanta siimportanta 0 alcatuiese proteinele alimentate si de rezervi proteinele laptelui, ovalbumina, semintele unor plante (soe, griu ete), remarcindu- se prin deosebitul lor rol energetic. ‘inmomentul actual se studiaza mii de proteine, structura si functia sutelor dintre care suntcunoscute, Astizi deseori putem auzi despre obfinerea unor proteine noi cu fuhctit exceptionale. Dupazecide ani de investigatii, un grup de savanti de la Universitatea HARVARD (America) au obtinut (1985) 0 proteing pur’, susceptibili de formarea vaselor sanguine la om -angiogenina, compusi din 123 de aminoacizi ce constitue unsingur lant. Folosind metodele ingineriei genetice, a fost reconstituiti gena care regleazi in organismul uman producerea angiogeninei. Investigatile prognozeazi sinteza Uunor preparate care vor ameliora circulafia sanguin in muschiul cardiac, contracarind infaretul,insultul, vorcontribui lacicatrizarealeziunilor, ulcerului etc. Blocada angiogeninei, ins, poate fi uti in tratamentul cancerului, bolilor in care apar vase mici nedorite - psoriazis, rinopatie diabeticd, artrita reumatoida; la supravegherea natalitifii, preparatele contraceptive fiind inhibitori ai acestei proteine. E uimitor faptul ca toate proteinele cu diversele lor proprietifi si. functii, sunt constituite din aceiasi 20 aminoacizi fundamentali, incepind cu cea mai simpla bacterie si pina la om. Se stie cd separat fiecare aminoacid nu are nici functie biologica. Care ecauiza c&o protein’ are proprietate catalitic’, alta hormonala, cealalté - anticorp? Prin ce se deosebesc ele din punct de vedere chimic? Raspunsul e foarte simplu: proteinele se deosebesc prin faptul cd pentru fiecare in parte e caracteristicd numai o singurd secvenja de aminoacizi. Aminoacizii sunt alfabetul structurii proteice. Prin legarea in lanturi polipeptidice, variate ca lungime i succesiune a unitatilor, se poate objine un numa infinit de imbindri de compusi. Fiecare specie contine mii de proteine, dar specii exista circa 10 milioane. Putem oare asigura aceste proteine ‘numat cu 20 ammoaciz1? O analizd matematicd simpli arati cd pentru un polipeptid din 20 aminoacizi diferiti, nici unul dintre care nu se repeti micar de 2 ori, numirul de variafii este de 20x19x18 5.a.m.d., ~ 2x10!*. Masa moleculei e de 2600 Da. Dar daci hum o proteina cu masa de 34000 Da, unde 12 aminoacizi sunt reprezentati in acelagi raport, atunci c&patim 10° de combinatii. Daca in componenta lor vor fi inclusi 20 aminoacizi inacelasi raport, numdrul vacreste enorm, Daciar exista numai “Becite © molecula din ficcare protein’ posibit’, apoi greutatea lor ar fi mai mare decit aplanetei noastre. Variati din acesti 20 aminoacizi pot fi atitde multe, incit ar fi suficiente nu numai pentru proteinele existente azi, dar si pentru cele care vor apare in viitor. Potrivit calculelor specialistilor, azi pe paint exist 0,001 de specii dintre cele ‘cunoscute cindva, Unitatea structurala de baza a proteinelor sunt aminoacizit. Primul aminoacid deseris in 1806 a fost asparagina, iar ultimul -treonina-a fost identificat de abia in 1936. Fiecare aminoacid are denumirea sa traditional (conform originii lui), rationalt (chimicd), abreviere din tei litere si simbol deo litera. Aminoacizii sunt derivatiiacizilor grasi saturafi-aminoderivafi. Awo structuri in care, cuacelasi atom de carbon este legaté grupa carboxilic’ si aminica. Aminoaciziisedeosebesc intre ci prin natura acestui ra ®. | Anume radicalul R la diferiti aminoacizi difer’ dupa structura, NH sarcing electric, solubilitate in apa. Dupa proprietatea de a interactiona cu H,O la un pH'=7,0, deosebim 4 grupe de aminoacizi tab.1.1): 1. Aminoacizi cu radicali hidrofobi, nepolari -hidrocacburi. Reprezentanti: alanina, valina, leucina, izoleucina, prolina, metionina, fenilalanina, triptofanul. 2. Aminoacizii cu radicali polari, dar fri sarcin’ electricS. Ei formeazd legituri de hidrogen cu molecule de H,O. Reprezentanti: serina, tirozina, treonina - polaritatea edeterminati de grupa OF; asparagina si glutamina - de grupa NHL; cisteina -de SH, iar la glicind-radicalul (H) cen compenscaza polaritatea grupelor NH, $i COOH. 3. Aminoacizii cu radicali incdrcati negativ (acidul aspartic si glutamic). 4, Aminoacizii cu radicali inedrcati pozitiv (lizina, arginina - grupa guanidinicd si histidina - grupa imidazolicé) instructura_unor proteine se remarci gi aminoacizi nefundamentali in compo- nen{a colagenului: 4-hidroxiproling, 5-hidroxilizind; in miozin’ - metillizind: in protrombina - acidul carbaxiglutamic; in elastina ~ desmozind formata din 4 molecule de lizin. Acesti aminoacizi se mai numese aminoacizi minori (tab. 1.2). Semai intiInese aminoacizi cu alte functii ca: ornitina, citrulina, Pealanina, ete (tab. 1.2). Solubilitatea aminoacizilor in apa este influiengata de prezenta sdrurilor. Cea ‘mai mic& solubilitate in apa o au cistina si tirozina (0,04 g/100 g a.d.), mult mai mare - prolina si oxiprolina (154 2/100 g ad.) Fort solubili sunt arginina, lina i cisteina la pl in apa distilata si 20°C (tab. 1.3), Prolina este singurul aminoacid cu solubilitate bund alcool, ccilalti aminoacizi se dizolvi foarte grcu. Toti aminoacizii sunt ujor solubili in solutii stab acide sau alcaline. De remarcat cd triptofanul pur in solutii acide este stabil, in timp ce in amestecuri sau in hidrolizate proteice usor se oxideaza. ‘Tofi aminoacizii fundamentali, cu exceptia glicinei, poseda un carbon asimetric (centru chiralic) care este Cot (exceptie prezint3 izoleucina si treonina care au 2 centre chiralice CB (2x 2=4)). Formulele de configuratie ale enantiomerilor unui aminoacid oarecare, repre- 1 R-CH—COOH +14-“Tabelul 1.1 Structura si denumirile aminoacttilor proteinogeni 1.Grupa acizilor hidrofobi nepolari. ‘Alanina (Ala) A Valina (Val) V Leucina (Leu) L ‘Acid ceaminopeopionic Acid -aminoizovaerianie Acid d-aminoizcapronic + i * HyN—CH—COo—-HSN—CH—Coo”HN—CH—COO | CH; joes He cH, 1yC—CH—CH Tzoleucina (Ile) 1 Metionina (Met) M Prolina (Pro) P ‘Aci ceamino-B-meivalrianic Acid a-amino-S-metlicbutni Acid pirolidin-0-carboxiic H;N—CH—COO™ HyN—CH—Coo” HyN-———CH—Coo" | CH—CH; ( 3 Cth cus CH,—CH3 Gia S—CH; Fenilalanina (Phe) F Triptofan (Trp) W Acid c-amino-f-fenilpropionic ‘Acid c-amino--indolilpropionie HyN—CH-COo” HyN—CH—COo Ch cH, NH 2.Grupa acizilor cu sarcind negativa, cates Acid Seminars H3N—CH—COo” HN —CH—COo™ | “5 f c=0 gi & -15-3. Grupa acizilor hidrofili Asparagina (Asn) N ‘Acid a-amino- Beamidosuccinie HjN—CH—COO™ fe CONE, 0 Serina (Ser) S ‘Acid a-amino- Brhidroxipropionie H3N—CH—-COo™ CH on Glicina Gly) G Acid aminoacetic Sele H Glutamina Gin) Q Acid 0 -amino- 1 -amidogluarie H;N—CH—Coo" | Ch i CH { coe ° ina (Cys) C Acid dcaning Brtiopropionic H,N—CH—COO" | Cth SH 4,Grupa acizilor cu sarin pozitiva. Lizina (Lys) K Acid 0,¢-diaminocapronic HyN—CH~COO" Arginina (Arg) R ‘Acid ceamino-B-guaniino valeinie HyN—CH Coo" CH CH Cis NH Nit-C=NH -16- ‘Tabelul 11 (continuare) ‘Treonina (Thr) T Acid ct-amino- Brhidroxibutire HyN—CH—CO0" CH—-CH; OH Tirozina (Tye) Y Acid p-hidroxiferi- alaninie Hy;N—CH—COoo™ Histidina (His) H Acid ce-amino-B-imidazolil propionic HsN-Tabelul 1.2 Aminoacieil neproteinogent Homoserina acid a amino- Y-hidroxibutisie Norvatina acid c-aminovalerianic H)N-CH—COOH —H;N~CH—-COOH CH ‘ Hy I CHy—OH Ch CH; Citratina Norleucina acid c-aminocapronic acid o.-amino- 8 -carbamilovalerianie H)N—CH—COOH — -HyN—CH—COOH I Gh Hy, Ge ya, ff —NH—-c’.sCCH: Ci“ NH-CO 2 CH; Acid y-carboxiglutamic cid p -aminobenzoie N= GH COOH COOH CH; tn, ae O #%, SH HOOC COOH NH esta HO~CH—CH)—N(CH,)s Hy COO’ 665146 NIVERSITATEA BE STAT” DE MEDICINA Gh FARMACIE NICOLAE TESTEMITEANUT BIBLIOTECA Ormitina acid ct, -diaminovalerianie H,N~CH—COOH Cth Ch CHy-Nth Hidroxilizina acid 0,¢ - diamino- 8 -hidroxicapronic H)N—CH—COOH cH Hy d-on H;~NH2 Hidroxiprotina acid pirolidin-y - hidroxi- 1 catboxilic HN—CH—cooH oe | 2 “cH I On B-Alanina acid f-aminopropionie HyN~CH;~CHy~COOH‘Tabelul 12 (Continuare) Selenocisteina Acid 6 -aminolevulinic HyN—CH—COOH O=€—Cliy- Cit, COOH Hs CH, SeH hu, nici Homeisteina acid -arino- H,N—CH— COOH ‘Y-tiobutiric bn, H,N—CHI- COOH bn bn by, CH, bu-Nu—cy SH Desmina v qat-coon HN (CH))3 NH) HOOC—CH~(CHIF (CH): —CH—COOH N ns HCOOH NH, Acid 7 -aminobutirc, GABA Cis Cy CH ‘COOH NE,‘Tabelul 1.3 Solubittetea im ape disitatd (e/g) la pl specific $i 20°C zentate in sistemul D-L, in care substanta de referina este aldchida glicerica dextrogir’, sunt redate in felul urmator. coo- coo" nt =e HOOK —e fu, Q L-aminoacid R D-aminoacid Literele se refer numai la configuratia absolutd: in cazul D-izomerului gruparea NH, se afli in dreapta, iara L-izomerului ~in stinga. in structura proteinelor se intiinesc numat L- aminoacizi, doar pentru ei exist sisteme enzimatice, care prezinta specificitate de substrat, grafie cireia se asigurii metabolizarea lor. La valori de pH neutre aminoacizii in solutie se afl’ in forma de ioni bipolari (Zwitterion). Grupa amina e protoionizatd (NH,"), iar cea carboxilic’ (COO) - disociata.0 Ho-¢ H,N—C-H R Form neutri Forma de ion bipolar (amon) Jonizatia aminoacizilor depinde de valorile pH. in solutit acide grupa COOH este neionizaté, iar cea amind - ionizati (NH, ). " 4 coo + HY R—C—COOH fe I+ NH NH, in solutii bazice situatia e contrara, ionizata e grupa carboxilic’ (COO). i t R-C—COO + OH = RC -COO + H,0 NH; NH) in arhitectonica moleculei proteice deosebim patru niveluri structurale. STRUCTURA PRIMARA Cum se leagé aminoaciziiin proteine? Procesul decurge in felul urmator: o-grupa carboxilicd a unui aminoacid se uneste cu ot-aminogrupa ltui aminoacid, formind legdiura eptidicd, cu eliberarea unei molecule de apa. g 4 H,N—CH—C *+ N—CH—COOH Tal | 40 R, OH H Ry I BINS Ga GoScoen: R HR Echilibrul acesteireactiiinclind mai multspre procesul de hidrotiza, dar nude sintez. =20-Deaceea procesul de sintez necesiti energie, pe cind hidroliza decurge cu degajarea ci. La unirea multor aminoacizi cu legaturile peptidice se formeaza un lant (cateni) polipeptidie, avind o structurd linia. Lantulare o anumiti directie, S-a stabilit conditional c& el ncepe cu eapatul purtitor de aminogrupi, capitul N. Descrierea unei secvenje de aminoacizi inant incepe anume de Ia acest capzit terminal. Aminoacidul, care in legatura peptidic3 participa cu grupa sa COOH, capata sfirsitul - il; aminoacidul final, care confine grupa COOH liber’, mu-si schimba denumirea, formind capatul C-terminal. Asadar, langul polipeptidic are un schelet cu o structuri strict, repetat’ si ccatene laterale diferite, Pe Ae, ee ee ee Rye ERS ELRS HR, Rs Succesiunea aminoacizilor determina structura primarit a proteinelor, fiind baza informatiei genetice. in unele proteine catenele laterale se unesc intre ele cu legaturi sulfidice, care se formeaza la oxidarea resturilor de cisteina. Alte legaturi covalente in structura proteinelornu se itilnesc. Astfel de tip de legdturi intre aminoacizi in molecula proteici\l-a stabilit,n 1888, savantul rus A. Danilevschi; dar numai in 1902 E.Fischer a intat aria polipeptidica. Azi stiinta poseda argumente convingatoare ale prezentei acestei structuti: 1. Analiza roentgenostructurala a permis = detarainaestebboutuireperijedredulordsaminoaciat 7?N—E—-NB—-E-NH, ‘in lantul polipeptidic si conformatia lui. oO ° 2. Argumentarea de baz este posibilitatea de Biuretul sintezi a proteinelor purificate, precum gi a polipeptidelor cu structurd cunoscuta, care poseda activitate biologic’, la fel ca si proteinele native, ; 3. Proteinele, ca sicompusul biuret, dau o coloratic albastr’-violeta in prezenta CuSO,, inmediu alcalin, ceea ce co dovada a prezentei legaturii peptidice. Fiecare proteina are o structura unic’, 0 succesiune precisa de aminoacizi. in 1953, Frederic Sanger descifteaz4 aminoacizi in lanjurile polipeptidice ale hormonului insulin’, Prima data a fost dcterminata suecesiunea aminoacizilor, stabilindu-se c& aceasta e determinata genetic. Sinteza tuturor proteinelor din aminoacizi are mecanism similar. Care este necesitatea determinarii acestor succesiuni in proteine? Avem posibilitatea dea stabil: 1, Baza molecular’ a activititi biologice a proteinetor. 2. Principiile ce stau la baza formérii lantului polipeptidic - la actiunea biologic& activi aleZtuese structuri specifice bazale.3. Modificdtrile in succesiunea aminoacizilor pot conduce la tulburiri ale funetiei pro- teinelor i,in consecint, la aparitia maladiilor. De menfionat ci modificarea unui singur aminoacid provoaes tulburari grave in metabolism. Evoluea7a o direetie noua in medic ni - patologia moleculara. 4, Succesiunea resturilor de aminoacizi funizeazitinformatii sugestive despre evolutia procesului la nivel molecular. Care sunt principiile de descifvare a succesiumii aminoacizilor? 1. Proteina trebuie sa fie hidrolizata pina la aminoacizi, incalzind-o la 110°C timp de24 ore in 6 N HCI. Hidrolizatul e separat prin metoda cromatografiet ionice cu polisterol sulfonizat. Aminoaciziifractionat se determina prin reactia cu ninhidrind: ‘o-aminoaeizii confer o culoare albastra intensiva, prolina (iminoacid) -galbend, + HaN—CH—COOH —= R Ninidrina 9 9 “~ hoa Tema L = o é J +CO, +RCHO+H,0 ~~ ot Ae “Purpura Rubemann™ Metoda aplicat este deosebit de efectiv. Cantitatea de aminoacizi e proportional densitati opticea solute dupa inedzire cu ninhidrind. Dacii cantitatea de aminoacizi este minima, se foloseste fluorescamina. Comparind rezultatele obtinute cu amestecul standard, determin compozitia aminoacidicé. a proteinei $i anume: compozitia, nu insd succesiunea aminoacizilor 2. Procedeul de identificare a terminalelor N_si Ca fost utilizat de F. Sanger pentru stabilirea grupei NH, de c&tre dinitrofluorbenzen, ce reactioneaz& cu NH, formind compusi (de cufoare galbena) ai acestei substante. Lewaturae stabil si se pistreaz la hidroliza legiturii peptidice; compusul c determinat cromatografic. 20-No, NO, We NO, + R-CH —~ HF+ o=dw _ Nu R-CH mbm 2.4-dinitrofenil - derivat alpolpeptidak! + Gy AD gy Phe Arg nc— di coo 2 ddinitrofenil-derivat al estului aminoterminal Atunci cind aminoacizii constituie camttiti mici,¢ folositun altreagent -clorura de dabsil, care, reacfionind cu grupa NH, ,confera compusului sulfamidic o culoareintensiva, HC, Ss =I SO;Cl + HsN—CH—CHr Hc? I CH; 0 Clorura de dabsil {Hel HAC. 2 N=N- oie ca = I HC? bn, 3 [une HC, Can 'N- SOs NEPA e =o" + HC’ i Gly, Asp Gly Dabsil-alanina oo 9 Phe Arg Determinarea cepitului N-terminal prin marcarca eu clorurd de dabsil -23-Resturile C-terminale ale catenelor polipeptidice se identified in felul urmator: polipeptida se incubeaza cu carboxipeptidaza (COP), care hidrolizeaza legatura peptidicd la capatul C-terminal, compusul fiind determinat cromatografic. Carboxipeptidaza-A este inactiva la COOH ale argininei, lizinei si prolinei. Carboxi- peptidaza-B scindeazi COOH ce apartine lizinei si arginine’. Metoda chimici: proteina se incubeaza cu hidrazing la 100°C, in lipsa apei, rezulta hidrazide ale aminoacizilor, excluzind COOH-terminal, careramine liber. Acestaminoacid este identificat cromatografic, Unalt principiu consti in seindarea lantului polipeptidie in fragmente, explori diferite metode: a) hidroliza catalitica limitata sub actiunea enzimelor specifice- tripsina (scindeaz legaturile peptidice formate de grupa COOH a Lys si Arg, indiferent de lungimea gi suecesiunea aminoacizilor in kan), b)metode chimice specifice, de exemplu, bromura cianidica (CNBr) seindeazé legitura peptidici format de COOH a metioninei. Aceasti metodi e prea dificil. eri Edman propune metoda de determinare a succesiunii fragmentelor peptidice sau aminoacizilor. in metoda elaborati de F Sanger hidrolizatul nu poate fi folosit dublu din cauza ca peptida se hidrolizeaza complet. Peri Edman a reusit si marcheze capitul N-terminal si scindarea lui de la peptid, producindu-se fara scindarea altor legaturi peptidice. Metoda consta in scindarea fiecirui rest de aminoacid din cap%tul N-terminal. In acest caz se foloseste fenilizotiocianatul care reaetioneazi cu NH, rezultind formarea feniltiohidantoina -compusulti 7 0 N I " Cr + BN—CH—C —Ohy—Asp—Phe—Arg—Gly—COG Fenilzotiocianatul CHS H \ pH=9,0 tit N—C—NH—CH—CO—Gly—Asp —Phe—Arg—Gly—COO bu, | s i | or © 4. HaN—Giy—Asp—Phe—Are—Giy—COO NH Ke fi OCfI-CH; Degradarea dupa Edmannmediu slab acid are loc disocierea compusului cictic, iar peptida rimast emai mic& cuun est deaminoacid, Produsul este identificat romatografic. Degradatea dup’ Edman este repetatd, in fine, se ajunge la etapa in care succesiunea in fragmente de peptide e clara, dar nu e identificata succesiunea peptidelor insesi. Ultimele se determin dupa suprapunerea Aiferitelor segmente de peptide, stabilindu-se astfel segmentele de coincident. Se folosese si alti fermenti ca: chimotripsina (scindeazi legatura peptidic’ format de COOH a Phe, Tyrsi Trp), pepsina ete. Metodele descrise mai sus se refer la proteinele compuse dintr-un singur lant polipeptidic, firi prezenta legiturilor disulfidice. In caz contrar, sunt necesare metode suplimentare. Disociatia a mai multor catene polipeptidice e posibil’ sub actiunea detergentilor ca: ureea, hidroclorura de guanidind, care scindeaza legaturile necovalente, distrugind structura tertiara si cuatermar’. AH H,N—C—NH; no + HCL = fi \nH, ives idrocloura de guaniina Legaturile disulfidice se rup la oxidarea in acid performic, cu formarea resturilor de acid cisteinic 3 t NH NH I | p (a= Gis SeS=CH— + Hc? knw, =6 ‘oon 2 Cistina t \ Acid performie i i A NH CH-CHzSos + HOSS CHy-CH c=0 C=O % Acid cisteinic a Analiza structural a proteinei poate fi acceleratt prin utilizarea seeventiatorului ~aparat ce permite determinarea automata a succesiunii de aminoacizi. Proprietaile imcfionale ale proteinelor sunt determinate de conformatie, aranjamentul spatial al atomilor, esentiala fiind succesiunea ce aminoacizi, care, de fapt, sistabileste conformatia proteinei. -25-La sfirsitul anilor 1930 L-Pauling si R.Corey au inceput explorarea structurii aminoacizilor sia peptidelorcuraze X si audeterminat lungimea si unghiul standard ale legiturilor, ca apoi si prevesteasci conformatia proteinei, S-a constatat un fapt important, si anume: unitatea peptidicd posed o structura planica rigid, Atomul de hidrogen al grupei NH, ocupio pozitie trans in raport cu O, a grupei carbonilice (fig. 1.1). A= 0,1 am) > C-terminal Figura 1. Grupa peptiicd cu lungimea legdeurtor Legétura dintre carbonul grupei carbonilice gi azotul ° grupei NH din legatura . peptidica posedi un “ ¥ caracter partial de legdturd H dubla. Si, deci, rotirea in jurul acestei legituri este ingreuiatd. Lungimea ei este de 1,32A, media lungimii dintre legaturile ordinare C-N si legétura dubli C-N, Spre deosebire de cazul examinat, legatura dintre atomul de C $i atomul de Cal grupei carbonilice este ordinard. Prin urmare, in ambele parti ale legaturii peptidice rigide gradul rotiii libere este foarte mare. Fiecare aminoacid ¢ caracterizat prin unghiurile sale de rotire. Rotirea fat de aceste legaturi se noteaza prin unghiurile w si ¢ (fig. 1.2). In concluzie, structura primaré mu este aliceva decit succesiunea de aminoacizi in proteind si localizarea puntitor disulfidice. Ea reprezintd o caracteristica completa legiturilor covalente din proteina. So ee" 2° ae Figura 1.2, Determinarea unghiurilor wsi W- caracterizeacdrotiren fade tegitura ordinari CoC; > caracterizeazi rotirea fat de legatura ordinarii CON -26-STRUCTURA SECUNDARA se obtine in rezultatul interactiunii sterice a resturilor de aminoacizi localizati alitur in succesiunes linia Unele dintre aceste interactiuni au un caracter reglementat, generind astfel o anumit periodicitate. Drept exemplu ne serveste G-elicea, structura B sau structura in foaie plisata si spirala de colagen. E posibil oare ca lantul polipeptidic si obfind o structuri din portiuni repetabile? L Pauling si R.Corey, studiind un sir de conformatii potentiale, au elaborat modele moleculare exacte-una din structurile secundare mai des intilnite si dintre cele mai vantajoase, luind tn considerare rigiditatea geometric a legaturii peptide si variaiile deunghi admisibile, se dovedeste afi c-elicea (fig. 1.3). A Jessie To 1.3. Modelul -elce orienta spre dreapta 4 sunt precentati in elice numai atomii Co: 2B sunt atomit de aot () ce formeacit scheletul molecule; atomii Catsicarbonulcarbonilic - C; C- spirala completa, prin puncte sunt reprecentate legaturile de hidrogen intre NIT $1 CO xoupe, ce stabiliceush Spit Spirala are forma unui cilindru, risucit tensionat, lantul de baza formeazi partea interna cilindrului, iarradicali (lant exterior) sunt orientafi spre exterior, miscindu-se conform spiralei. Spirala este stabilizatd de legaturile de hidrogen dintre NII si CO, grupe ale lantului de baz. Grupa CO a fiecarui aminoacid se reuneste prin legitura de hidrogen cu NH, grupa aminoacidului situat in succesiune liniari cu patra resturi invans. Deci, toate grupele CO si NH ale lantului debaza suntunite intr ele prin legaturi de hidrogen, Pasul elicei contine 3,6 resturi de aminoacizi, adica aminoacizi separafi jn suecesiuni liniare de 3 - 4 resturi de aminoacizi, fiind amplasafi foarte aproape in structura spiralei, Dimpotriva, aminoacizii aflafi la dou’ resturi diferenfé unul de altul, spatial sunt plasagi opus unul fat de altul si deci, interactiunea reciproc’ devine imposibild Pasul spiralei este de 5,44 (angstrém, unitate de hungime echivalenti cu 0,1 nm, denumiti astfel in cinstea savantului.spectroscopist A. Angsirém). La ficcare rest, aminoacid avanseaza pe verticala cu 1,5A, Diametrul acestui bastonas in care se afl atomul C-o este de 10A, Sensul rasucirii lanului polipeptidic poate fiatit de la stinga la dreapta, cit siviceversa. Toate cercetdrile c-elicei proteinelor se refer la primul tip. Cota a-elicei in proteinele studiate pind acum este imens de variabila. in unele proteine, de exemplu mioglobina si hemoglobina, -elicea sti la baza acestor structuri, insi proteina chimotripsinae lipsitd de ea complet. Elicele formes unele elemente proteice lungi, ajungind la mai mult de 1000A. Doud si mai bine spirale pot si se rasu- cceasca ca firelein fringhie groasi. Astfel de structurd se numeste superspirali io gsim indiferite proteine ca: miozina, keatina, ropomiozina, fibrina sin alte proteine sanguine etc. Asemenea structuri indeplinese un rol mecanic, formind fibre, si sunt caracteristice pentru proteinele fibrilare. L-Pauling cuR.Corey au prezis aceasta structura cu 6 ani inainte dea fiexperimental depistaté prin metoda analizei R-structurale. A fostdescoperiti erdinoul in biologia molecular, favorizind posibilititi dea prezice conformatia lantului polipeptidic, in cazal in care sunt explorate proprieiile ingredientelor. ‘nsd mu toate polipeptidele sunt capabile si formeze spirale. Exist aminoacizi dezorganizatori ai elicei in structura primard, Acesteresturi de aminoacizi impiedica sau diminueazi tendinta derisucireelicoidald a unui lant polipeptidic. S-astabilit c&: 1. Prezena prolinei intrerupe rasucirea elicoidaliia lanfului polipeptidic. Atomul de azot se include in componenfa inelului rigid din structura aminoacidului, ce exclude orice rotire cit de mic in jurul legiturii N-C. Atomul de azot care formeaza legatura peptidic’ n-are atom de hidrogen gi de aceea el nu-i capabil sa formeze legaturi de hidrogen intracatenare. In consecintd,structura spiralicd se deregleaza intotdeauna acolo undee prezent acest aminoacid, formindu-se un cot, o indoire, o ineovoiere in lant. 2. Daca in succesiunea aminoacizilor sunt alaturate multe resturi de acid glutamic, apoi la pH =7 apareo fort de respingere intre_grupele carboxilice incareate negativ, forjacarora e€ mult mai mare decit fortele stabilizatoare ale punfii de H a spiralei. Din aceeasi cauzi segmentul de cateni, cu un numar mare aldturat de resturi ale aminoacizi- lorca lizina sau arginina, cu o sarcind pozitiva, nu va avea forma clicoidalA, 3. Resturile unor aminoacizi (valina, serina, treonina, izoJeucina, asparagina), avind radicali voluminosi la C-cr, confera o oarecare stringere sterica a elicei, servind drept factori destabilizatori (grupa OH a serinei, treoninei pot forma punti de H). La fel vor reacjiona si resturle de cisteind, care formeazi punt disulfidice covalente, Ele vor lega rigid povitilelanurilor polipeptidice si in vecindtatea acestor regiuni risucinea eficoloidal nu mai poate avea loc. Rezulti c& avem4 tipuri de limita polipeptidice: i care influenfeaza asupra conformatiei catenei -28-| rigiditatea legiturii peptidice; 2. fortele electrostatice de respingere sau. atragere, daci aminoacizii le au in apropiere; 3. prezenta radicalilor voluminosi; 4, prezenta iminoacidului- protina. S-astabilit cd structura primara consti in succesiuinea aminoacizilorin lant, legaturile covalente peptidice apartinind catenelor. Structura secundara se caracterizeaza prin conformatia in spatiu a resturilor de aminoacizi in lantul polipeptidic. Exemplu clasic de .- spirala ¢ 01-spirala keratinei ce contine multi cistein’, Dup’ cantitatea de Cys se evidentiaza keratina diferitelor surse. La broasca festoasi, de exemplu, continutul de Cys este egal cu 18%. Carapacea ei nu numai ci areo duritate excelent, dar in conditi fiziologice einsolubiléin apa. Globulinele simaiales.albuminele datorité solubilititi Jorn apa, permit formarea unei solutii de 60%. Care-i cauza acestei deosebiri? o-keratinele conin aminoacizi care au grupe hidrofobe localizate pe suprafata exterioar’ a elicei, ce ocupa o pozitie fixata si sunt orientate spre faza apoasa. in proteinele globulare de asemenea avem grupe hidrofobe, dar ele sunt camuflate, n-au contact cu apa, iar pe suprafata exterioara sunt atagate ‘grupe hidrofile sau polare. "Es acelasianL. Pauling sR. Corey au descrs alt variant de structurl periodic ~asa-numita B-structurd sau structura in foaie plisatd (fig. 1.4). i phe gs sh piar. 1 o4 tg ~ Wie ae. ef gy ‘ el ot & BPA ROA ABA. Aghy P AGA AQ 5% re 3 4 a 3 ooh 8 one Figura 14 Be siractura Ea se deosebeste de ct -spirald prin: 1. Form plata, dar nu de bastonas, in fibroini, de exemplu, catenele polipeptidice sunt localizate paralel una fatd de alta, formind plise si de aceea astfel de structuri se numeste foaie plisata sau de straturi, Fibroina contine 100%, iaralte proteine - proportii variate de asemenea structuri, 2. Distanga intre doud resturi de aminoacizi e de 3,58 (nu de 1,5 ca la c-spirala) Structura-f estabilizata prin punji de hidrogen intereatenare, dar nu intracatenare ca la ot spirald. Radicalii de aminoacizi ies in ambele parti ale structuri-p. Exist c¢si B-keratinele. in nu se formeaz’ punti disulfidice intre catene, lanturile fiind directionate diferit- antiparalel. Structura B, larindulei,e determinat& de seeventa de aminoacizi in lantul polipeptidic. O conditie obligatoriee ca restutile de aminoacizi si -29-posede grupe mici. Asadar, in fibrinoina miitasei majoritatea acestor resturirevine glicinei si alaninei. Fiecare al doilea aminoacid e glicind. B-Keratinele aparfin tot proteinelor fibrilare insolubile in apd, dar sunt mai flexibile si mai greu se extind, Periodicitatea structurii se repeta peste 7A. Aceste coneluzionétri rezultd din urmatoarele experimentiri Daca ot-keratina parului este prelucratd cu unele substante si apoi supusi actiunii, aburilor, ea se extinde aproape de 2 oi fat de lungimea initial. Radiograma acestei stari e caracteristic’ fibroinei, adica igi pierde o-elicea si capata -structura, ca rezultatal ruperiilegiturilor de hidrogen, ce stabilizau c-spirala. Daca o-Keratina se ‘ceste si se ia greutatea respectiva, apoi automat se reintoarce la conformatia de ck spirala. Procesul ¢ cauzat de faptul c& in o-elice radicalul grupelor este mai mare decit fin B-structura si de aceca ultima conformatie in astfel de compusi e mai putin stabila. Aceasti proprictate a ct -keratinei se datoreaz si prezentei vadite a leg3turilor transversale disulfidice care stau la baza elasticitiiifirelor de pir (fig. 15). / / é ‘Unii aminoacizi destabilizeaza 5.3 ” f structura list printreei:Glu,Pro, ee aes me) SSS Lys, Ser, Asp. Alsi aminoacizi Mss) guys)» car") Lan? favorizeazi formarea structurii ss. aig, plisate ca: Met, Val, Ie. eee) EB lee) Ey bg Al treilea tip de strucura [gg 3 (RN) 3 eM E periodicit e spirala de colagen. | S| $ \é Aceasti structuri specifica | A B . 6 determiniiclasticitatea colagenului- Figura 1.5. Facele ondulatie permanente a pirutui: componente baz apieli,oascloz, = alee erate etabieth de gt ails Ca proteini fbrilari else gisoste, ¢."Seajndrie erence eusube puntiege Sits catrar inconditii diverse, aproape in toate D~ oxidarea grupa SH formeazi legdtur ransversale not. corganele, determinind formarea unor unitati structurale, Fiind insolubil, s-a studiat dificil si numai dupa ce s-a observat ci colagenul din tesuturile animalelor tinere poate fi extras in stare solubila, deoarece in el lipsese legiturile transversale, s-a putut stabili unitatea structurald de bazi -tropocolagenul. Ultimul e aledtuit din trei catene de aceeasi lungime si structura, care pot fi similare la uneletipuri de colagen. 1/3 din aminoacizi ii revine glicinei, cantitati deosebite constituind prolina, rarintilnita in alte proteine. Contine hidroxiprolina sihidroxilizina. Colagenul are oregularitate mare in succesiunea aminoacizilor - al treilea rest apartine glicinei. Foarte des se repetl seovente ca Gly-Pro-Hidroxipro. Spirala de cologon so caracterizeaza printr-un grad de stabilitate a lungimii, determinat de interactiunile cooperative, adic& de formarea lanturilor multiple care se amplifica reciproc (fig. 1.6). Christian Anfinsen, studiind ribonucleaza, enzima ce scindeazi RNA, a stabilit un principiu universal, fudamental in biologia moleculara si arume: succesiunea aminoacizi- Jor determina gi conformatia. -30-STRUCTURA TRIDIMENSIONALA Aceast structuri rezulti din inter- acfiunea stricta a resturilor de aminoa- cizicare in succesiunea liniara se loca- lizeazi departe unul de altul, acesta fiind mogul deimpachetare a lanqului poli- peptidic intr-un volum anumit. Forja motrice la aparitia acestei structurie interacfiunea radicalilorami- noacizilorcumoleculeledeapd. Cualte cuvinte, structura e determinata de ‘mirimea, forma, polaritatea acestor ra- % beptamerului GroEL din The rapid Jaf peor ag a : a ° - P) ones Sy 7P Hidsoliza _ATPexts Setermina elideracea a 1SADPur' s| GOES T Aten 9 Gases si sot agate ls Gro th ste locals om oninele in foldingul_proteinelor: (a) mecenisimul de aefiuneaciaperoninelorE coli GroEl (eparine familie’ proteinelor Hisp60) si GroBS. Fiecare complex GroFL poseda 2 site-uri formate din 2 inele heptamerie (masa ‘moleculara egal eu 57000 Da). GroES este, de asemence, hetamer (masa molecularaegald cu 10 (000 Da) si poate bioea unul din site-urile GroBL (@) suprafatagisectunea complexului GroET/GroBS. in imagines ‘omplexului, in interiorul eiruia se emplascaza alte proteine. oti se vede spatial intemal 37.») savantii au desfigurat proteina nativa si apoi au realizat impachetarea, oprind-o la Aiferite etape; au identificat imtermediatele dupa formarca legaturii S-S, ce apareau in procesul de impachetare si apoi dispdreau pe neobservate in molecula nativa. S-a demonstrat cd uncle fragmente formeazi asociatii temporare, altele stabile, sise pistreazi in globula nativa, avind un rol fundamental la initierea procesului de ‘impachetare a lantului. Intermediatele au fost studiate prin metoda izotopilor. Hidrogenul din grupele peptidice a fost inlocuit cu deiteriu prin incubatia lantului polipeptidic in apa grea. Apa grea substituitd apoi cu cea obignuitd favoriza includerea hidrogenului in legiturile neformate, siin continuare, procesul avansa pind la finisarea deplin’. Identificarea regiunilor cu deuteriu a developat fragmentele moleculelor ce se impachetau in primul rind, Asa s-a stabilit consecutivitatea formarii intermediatelor. S-a confirmat cd in citocromul C are loc asocierea primara a doua spirale in capetele opuse ale lantului polipeptidic. in ribonucleaz, la inceput, se formeaza B-structura situati in centrul moleculei. impachetarea poate fi determinaté si prin metode matematice, cu utilizarea functiei energiei potentiale. in computer se introduc valorile in cifre care caracterizeaza fortele de atractie intre perechile de atomi ai moleculei din lanturile polipeptidice. Apoi se iau coordonatele atomilor la care energia total a moleculei se micgoreaza pina la minim (in eventualitatea cd structurile finale au energie minima). Studiile recente clucideaza posibilitatea precizatii structurii tertiare dupa succesiunea aminoacizilor. O serie de investigatii confirma faptul c& pentru impachetare sunt necesati factori spatiali si interactiune hidrofoba. Rolul diferitelor forte variaza de la o protein la alta. E posibil ci fortele electrostatice joacd un amumit rol la stabilizarea conformatiei finale, dar nu sila formarea i Rezultanta final. a foldingului este conformerul nativ ce posed activitate biologic’. ‘Un domeniu cu o structura stabild secundara care se formeaza primar, comparativ cu cealalti parte a moleculei, enumit foldon, Asamblarea proteinelor se considera un proces tizic deo valoare biologica deosebti. ‘Modelarea computerizata a procesului confirma c& asamblarea demareaza de la lanful desfasurat care fluctueaz4 mult timp fara formarea unor contacte native esentiale. Apoi Janful atinge intimplator starea in care persist un ansamblu de contacte native. Dupa aceasti situatie, procesul de asamblare decurge foarte rapid pin la starea final -formarea structurii native. Se considera c& un pas-limit’ in asamblarea acestor catene este formarea primar a unui complex de contacte native (nivelul asamblari), care, fulgeritor, influenfeaza toata molecula. Acest mucleu nu ¢ identic cu stirile intermediare. S-a consolidat idea ca a) asamblarea incepe cu formarea unui complex determinat de contacte native; +b) restutile ce se hefud in acest nucleu sunt aranjate fa diferite distante in lant Studiile au stabilit c& nucleul asamblaii este constituit din resturi nefunctionale mai conservative - proteinele legate evolutiv posed 2 complexe de resturi conservative: unul pentru central functional si altul pentru nucleul de asamblare, Asamblarea conform conotatiei«totul saunimio» corespunde mecanismului nucleatiei si cresteri sic tipica pentru proteinele foarte mici. Asamblarea proteinelor majore trece 38.prin star intermediare. Una dintre ele este gi globula in fuziune ce se caracterizeaz& prin stare intermediar’ compacta cu structurd nativa asemanatoare, dar far structur’ tetiard rigid, prin lipsa de cooperativitate la temperatura de topire i miscarile intramoleculare rapide. O stare aseminatoare e proprie si intermediatelor. ‘S-adernonstratcAin globula in fuziune, molecula proteica pistreaza unele particularitati ale topologiei native (aranjarea reciproci a c: si B structuri), aranjarea rigida a catenelor proteice. Accasta clasifica globula ca intermediat intre catena desfagurata gi starea nativd, stare termodinamica intre cele doua. Se presupune ci molecula proteica poate cexista in trei star: nativa, globula in fuziune si cea desfagurats. S-astabilit c& globulele in fuziune, genetic, sunt un intermediat universal pentru asamblarea proteinelor. Asadar. prin folding se subintelege aranjarea spafiald corecta de novo a catenei proteice, iar refoldingul presupune aranjarea spatial dupa denaturare. ‘Studiile contemporane confirma cf proteinele auxiliare pot fi impartite in 2 grupe: ciaperonine moleculare si enzime. Prima grup constituie o clasa functional de proteine neomogene, care favorizeazii asamblarea corecti necovalenti a altor structuri polipeptidice in vivo, nefiind componente ale acestor structuri organizate, ce ii indeplinesc: functilebiologice. Sunt evaluate multe proteine cu functi asemaindtoare -proteinele socului termic formeaza o grup mare de ciaperonine. Enzimele denumite foldaze catalizeazi modificirile covalente, strict necesare la formarea conformatiilor native functionale ale diferitelor proteine. Deocamdat sunt identificate 2 enzime ca foldaze- proteindisulfid izomeraza (PDI) ce catalizeazi formarea legaturilor native disulfidice si peptidil-prolil-cis-trans-izomeraza (PPI) ce catalizeazA izomerizarea unor legitur stabil trans-peptiil-prolil in cis-conformafie, necesare pentru, asamblarea functionala a proteinclor. Ambele sunt reacti covalent, reacti-limite in etapele foldingului proteinei corespuntoare. Procesul de Folding si formarea disulfidelornative sunt procese strns legate intre ele si decurg simultan, S-aconstatat c& PDI prezintd uu numai o izomeraza ce calalizeazi formaea legatuiii disulfidice in peptidele sintetizate dar so ciaperoninsé moleculari, ce participa la procesul foldingului catenelor, Activitatea ciaperoninicd nu e dependent de cea izomerazica, Functionind ca foldaza in procesul de folding, este necesard atit activitatea izomerazic’, cit si cea ciaperoninica. =39-