TRANSCRIEREA (BIOSINTEZA RNA) Spre deosebire de replicare, care antreneaza simultan Intregul cromozom, transcrierea vizea7a numa anuite portiun 5 de DNA, si anume acelea care codific’ proteinele necesare G- celulei la momentul dat. Structura RNA este conclude: ya dictatd de structura matricei. in vivo, transcrierea este asi- metricS, adicd intr-o anumitd regiune se copiaz o singur’ T cateni de DNA, desemnati drept_caten3 sens, spre ct deosebire de cea netranscris’ — catend antisens. c in 1961, Sol Spiegelman elaboreaza metoda hibridiza- Cc rii, ce const& in incalzirea dublului helix DNA; depagind TH temratura de topire, el trece intr-o forma unicatenara. La a ricitea lent a solufiei, catenele reasociaza’ si formeazi dublul : : helix cu ostructurd nativa. Dublulhelixse formeazinumaiin Catena Catena cazul in care catenele de DNA provin din organismeleunei = RNA = DNA specii sau ale specie inrudite. Dac& secventa bazelor din pissey 224, seevetele mRNA ecomplementari, apoi in combinarea catenelorde fempiementare DNAsi RNA trebuie sa formeze fragmentehibrid DNA- —_formeazi hibridul RNA- RNA (fig. 2.24). ‘DNA’ Experimentele au demonstrat c& succesiunea bazelor azotate in mRNA sunt complementare succesiunii DNA mattice. in 1960. fost descoperiti enzima ce sinte~ tizeaz3 RNA corespunzitor suecesiunii din DNA mattice. Pentru sinteza mRNA sunt necesare: 1. Matricea DNA — de preferinta dublu helix; 2. Precursori activati—cele 4 ribonucleotide — ATP, GTP, CTP, UTP; 3. Toni de Mg’* sau Mn"; 4. Enzima RNAp, ca si DNAp, necesita zincul pentru functionare; 5, Sinteztae loc iracecayi directic S*’ —» 3°, E unalog yi mecanisinul de elongatie alantului nucleotidic favonizant atacului nucleofil al fosfatului intern din urmiitorul ribonu- cleotidtrifosfat de grupa 3'-OH ai catenei crescinde. Forta motrice a procesului e hidroliza pirofosfatului tiv. Particularitatile procesului de sintezi RNA: a) RNAp nu necesita prezenta primerului: : b) DNA matricea se pastreaza intact c) RNAp nu posedi proprietiti nucleazice. La eucariote deosebim trei RNAp: RNAp-I ce asigura 2 sinteza rRNA 28 si 188; RNAp-II-mRNA siacele RNA care Figura225.Structna pot fi mareate la capete; RNAp-III asigura sinteza (RNA gi 7 = 58 rRNA, precum si RNA mult mai mici. RNA-polimeraza foloseste informatia inscris& in DNA matrice, acest fapteste argumentat experimental (succesiunea bazelor in mRNA intocmai copia complementari a succesiunii lor in DNA matriceal). RNAp este 0 enzim’ compusi din citeva subunititi — (6,0,Bf'), adic’ e 0 holoenzima (fig.2.25). Sigma subunitatea alege segmentul de initiere, Enzima fiira sigma = 130-poartd denumirea de «core» ferment (ferment minim): o:subunitatile sunt centrele catalitice, p' — se leagd de DNA, iar fi subunitatea fixeaza substratul — ribonucleotidtrifosfatii. Sinteza decurge tn mod similar, implicind urmatoarele etape: 1 Initierea sintezei —incepe in anumite fragmente de DNA, cu o secventa specifica ce poarta denumirea de promotor. in promotor participa aproximativ 40 de nucleotide sideosebim dou’ locusuri—unul de recunoastere, depistat cuajutorul subunit sigma, sioaltl seeventi—locusul de legarelaxiia RNA-polimerazei. Sigma amplificd afinitatea enzimei pentru acest locus de 10* ori in raport cu alte locusuri de pe DNA. 1.0 importanga deoscbita i se atribuic locusului de recunoastere (7 nucleotide) situat laodistanta de 25 nucleotide de locusul de legare si circa 10 nucleotide de punetul de initiere (+1), Punetul de start al transcrierii va dicta capatul 5’ al transcriptului primar RNA. Promotorii suntsituati inamonte sinotafi cu minus (conventional). Secvengele in aval fafa de punctul de start sunt notate cu plus.Se considera cd secvenfa Pribnow la procariote sau Hogness la eucariote e responsabild de exactitatea initierii (fig. 2.26). Punetul de iniiere A. Promotorul procariot oni ois 2 Seevente Pribnow “UTR, __ Transcript RNA B, Promotorul evcariot Hogness Since ae (NAP T 40.200 bp 25.3509 mam CCC CAAT ox GCeasete CAAT casete TATA easete Quik, “Transcript RNA Punetul start C.Promotoruleucariot —} 450 +70 +80 +90 (5stRNA) —— 5 Transcript Figura 2.26. Secventele ipice in promotor la pro-siewcariote 2. Sigma activeaza identificarea secventelor de RNA-polimeraza. 3. De asemenea ia parte la desfacerea dublului helix al DNA pentru ca aceasta si serveasca drept matrice si conlucreazi la formarea primei legaturi fosfodiesterice in noua catenda RNA. Complexul de initiere e format, sigma-subunitate ¢ disociata de la holoferment si corfermentul continu procesul de elongare. Sigma se atageaza la alt corferment si ia parte lainitierea unui altciclu de transeriere fig. 2.27). 1. Blongarea decurge dupa acelasi mecanism descris mai sus. O molecullide RNAp sintetizeazi tot transcriptul —fenomenul e procesiy si activeazi cu o vitezi de SO cleotide pe secunds (fig. 2.28), RNAp nu controlea7a catena sintetizata, reducindu- -131-| 3037 © Enzimacor __ a Figura 2.27. Initierca rranserierii si formarea complexului de niiere.Reciclarea factoralui sigma Catena parent se precizia. Se comite o greseali la 10° nucleotide san de 10° mai multe decit in DNA. IIL Finalizarea transcrieri: se reglea- Zi foarte fin, la nivelul unor secvente nu- cleotidice specifice de pe catena DNA ce contin un numar mare de G, C, T, recu- noscute de RNAp Un ral insportant il jo- ci proteina p (rho), care se asociazit cu cenzima si se misc cu ea. La identificarea semnaleleor de terminare coboari de pe matrice, incetind actiunea enzimei si producind transeriptul cu folosirea ener- gici ATP. Transeriptul obtinut ¢ autocomplementar si poate forma pe- rechi de baze, cea ce genereaza struc- ‘uri simetice,favorizind expulzarea hui din puvees (fig. 2.29). acai catena se extinde in directia 5! — 3, este evident cd enzima RNA- polimeraza se misc pe DNA in directia 3) —» 9 (antiparalel). ala (©) Directiatranscripie} Figura 2.28, Transeripra ta Ecol. a) RNAp si procesele ce sunt eawzate de activtate ei, b) directa elongarii, -132-Dup’ procesul de transcriere con- tinui formarea moleculelor functional active de RNA — asa-numitul procesing, care consti in urmatoarele: 1. «Cap»-area. La capatul 5' este —aata aditionati guanozina metilati. in proces sunt utilizate ca substrat GTP, iar donator de grupe CH, este adenozilmetionina. Sunt implicate enzimele: fosfohidrolaza, guanil transferaza si metil tansferazele. 2.Poliadenilarea, La3'—osecven- amare de A (100-200). Acest fe- nomen are loc pind la terminarea sintezei intregii molecule (e catalizat de poli-A~ polimeraza). Astfel de “coada” e necesard pentru exportul moleculelor de RNA din nucleu. 3. Semodificd bazele si resturile glucidice—2'-OH este metilat& (1:100) de S'~ adenozilmetionina, la procatiote—G-dimetil-adenina, se atesté in (RNA, de altel sipseudouridilatl, ibotimidilatul. 4, Modificarea intensiva pe care o sufera transcriptul primar consti in scurtarea lui ‘S-a constatat ci mRNA nuclear este mult mai lung decit acelasi MRNA ajuns in citoplasma. S-a ajuns la concluzia ck RNAp realizeaza o reproducere primari identic’ cu intreaga gend, apoi intronii sunt excizati si exonii se leag’ intre ei formind mRNA matur, traductibil (fig 2.30). | DNA intron Figura 2.29, Terminarea independenti de Rho comeum | comp pina mel pir 4 Segventenecodifeate 8 CClivate, poliadenilarea sisplaisingal i V/ MRNA 5) Senn AAA 9 Figura 2.30, Formarea teanseriptului primar si maturigarea RNAm la eucariote -133-Secventele intronilor au dimensiuni de 10-100 ori mai mari decit exonii Cum se manifesta excizia intronilor? Asa-numitul splicing are loc in mucteul celule. a) unele enzime specifice identifica seevenfele de baze la jonetiunea intron-exon (excizia pe introni este o excizieincorecta siconduce la generarea unui RNA inactiv ce contine un intron rezidual. in unele B-talasemii are loc descresterea sintezei a lanurilor B-globina); ’b) inexcizia intronilor un rol important fi revine unei categorii de RNA nuclear cu ‘mas moleculara mic, desemnat RNA U (snRNAS),care are oseeventiabazelor complementarii cu secventele de la capetele tiecdru: tron, Intronn sunt scosi de RNA nuclear i capetele exonilor corect juxtapuse, apoi sunt sudate intr-un aparat enzi- matic specializat (fig. 2.31); Intron, OH a tee Re berate ta ° {ua} FR SAS i RNA di 5 ‘UpU! OH") Figura 231. Sudarea exonitor si excicia intonitor de snRNAS ) Thomas Cech a stabilit ¢& pentru excizia intronilor sisudarea exonilor in epru- beta enevoie numai de RNA, ioni Mg™* si guanozin. Molecula in spatiu ocupi atare pozitie, incitcapetele secventei de introni se localizea7A foarte aproape. Excizia $i sudarea decursd in regim autocatalitic, unde singura RNA —segmental intron —denotit ‘comportamentul enzimei. Guanozina initiaz procesul, iar Mg?” stabilizeazi structura de RNA -autosplicing. Astfel de RNA a fost denumit ribozim. Ribozimul de 10" ori mai repede scindeaza legatura fosfodiestericd deeit prin hidroliza nefermentativa. -134-Prezenta RNA catalizii e demonstrat in multe studi. S-a depistat, bundioarii, o enzima (Escherichia coli 5.2.) RNA-aza P cu o funetie specified —la maturizarea tRNA taie din molecula precursoare un fragment la un capat. Enzima e compusd din compartment proteic sinucleotidic. in unele conditi, enzimaeste efectiva si firi componenta proteicd si nu contrar, cum era de asteptat. Unele compartimente ale enzimei pot scinda nu RNA, ci polizaharide— ceva nou in enzimologie. Demult s-a observat ci extragerea moleculelor mari intacte de RNA e dificil. $inumai dupa descoperirea ribozimelor, s-aclarificat e3 RNA-aza activ’ este atributul constant al moleculelor de RNA. Ribozinul scindeaz§ molecula de RNA conform combinatiei = CUCU =, ceea ce se poate aplica in practic pentru scindarea RNA virotica sia celei de SIDA. Transcriptia si translatia au loc in diferite compartimente ale celulei. Replicarea, transcriptia pot fi modulate prin intermediul diferitelor substante. Efectul preparatelor medicinale sunt ilustrate in figura 2.32. Cronomicina Profla [chinimieina Et Hedamicina ‘Dauornicina Netropsina Nogalamicina Mlinicion Distamicina Cloroquina Negare lcomicina MiraclD f\ Aetdnanidine ‘Kancanomicina ino-/Steptonigrina | |, Alcoa! Lteeskirina sce; aoe fenetl Antramicina ) No Nucleaids “SU / swf oN Rifampicin”——cramanitina Bazelialogge —\.Araserna Sweptovaricina Nucleotide Metotexat igura 232, Locul aclunll unor medicamente .Ofixare noncovalents cu DNA, ce impiedied replicarea ‘Se leaga rigid in duplex, jometionind cu guanina si inhibind activitatea DNA ea matice pentru RNA limeraza (inka transcrip). Actioneaza similar: doxorubicina (adriamicina), cronomicina A yi amicina. Se fxeuzi de DNA, flr a modifi sructura helsului Medlicamente ce rip punt in DNA. Preparate ce formeazi legturi covalente itr spralcle de DNA. Substante ce fxindu-se in bifurcatie impiedicdreplicarea, Inia sigma s beta subunit de RNAp,ingrenindinitierea procesuui de transripfic. Ine RNA-polimeraza II (-amanitna etc): preparaele ce contin plating (cisplatin yi carboplatina) 1c jormare legaturdortransversalein DNA Structura subnucleozomic’ acromatinei se mentine in procesele de transcriere si \licare.Dret matrice serveste complexul DNA histonic, dar nu DNA liber. RNA tse impacheteazi in complexe ribonucleoproteidice. DNA netranscriptibil (linker) ia parte la procesul_ de reglare a transcrierii, servind t promotor pentru RNAp ILElementele mai importante sunt blocurile TATA si CAAT situate a o distangiide 25- 100 pn dela punctul de inifiere. Este descrisa prezenta unor elemente reglatoare localizate in diferite regiuni ale DNA, numite enhancers sisilancers. Se presupune o modalitate anume in impachetarea RNA. Dupai cum impachetarea DNA in cromatin e meniti si determine functionarea ei normal in celul’, procesul (insuficient studiat) condensariiRNA cu proteinele nucleicee necesar pentru decurgerea perfect a procesingului primar—RNA transcript cu transportul lor in citozol. Se stie cAnnmai 5% din masa totallia RNA transcript piriseste nuclenl celular. Semnalele specifice care servese ca permis pentru parsirea nucleului nu suntidentificate. E do- vedit faptul ci astfel de semnale aparin procesul de splicing al RNA. S-a argumentat c& daca in secventa nucleotidica nu sunt intronii, RNA transcript va imine in nucleu. Particularitifile transcrierii a eucariote Procesul de transcriere la eucariote este foarte complex, desi in principiu decurge dup’ acelasi mecanism ca gi a procariote. a) Daca la procariote toate tipurile de RNA sunt sintetizate de acceasi RNA- polimerazi, la eucariote intervin mai multe tipuri, ficcare transcriind seturi diferite de gene. De asemenea, dacd la procariote RNA-polimeraza era formata din 5 subunitati la eucarivte acestea sunt constituile din 9-11 subunitai Insinteza RNA la eucariote intervin patru tipuri de polimeraze: trei expuse mai sus $1 alpatrulea tip - RNA-polimeraza mitocondrialA ce sintetizeazi toate tipurile de RNA mitocondral RNA-polimeraza II si RNA-polimeraza III sintetizeaza gi RNA nuclear de mici dimensiuni. Fiecare tip de RNA-polimerazi utilizeaz3 promotor diferiti, acestea find extrem de variafi pentru RNA-polimeraza II care produce sinteza mRNA. Dacii considerim pozitia de start 1 (locul unde incepe transcrierea genei structurale RNA. polimeraza It) existi mai multe regiuni care conditioneaz’ aceasta povitie: n pozitia 35 se afl caseta Hogness care este recunoscutii de RNA-polimeraza Il si prin urmare e responsabila de acuratetea transcrierii; - spre capaitul 5, la o distant mai mare de promotor se afl caseta CAAT, care se pare ci este responsabili de freeventa cu care se transcrie gena structural. Elementele de control enhancers si silancers isi exercit& actiunea mumai in urma interactiunii cu niste proteine specifice numite factori de transcriere, care induc modifica inmolecula de DNA, avind ca rezultat modificarea vitezei de transcrierea genei +) Laencariote transcrierea se realizeazi pe DNA complexat innnucleozomi, fra si fie necesarii desprinderea lui. ©) Freeventa cu care se transcrie 0 gend este foarte diferitS si depinde de necesarul de proteina codificati de gena respectiv’ Pentru majoritatea genelor transcrierea se face rar, astfel ineit transcriptaza parcurge {ntreaga gend inaine cao alt& transcriptaza si se lege. Pe alte gene insa transcrierea are oc cu freeventé mare; este vorba de genele care codificd sinteza unor proteine de care ‘organismul are nevoie in cantitate mate. [n acest caz-de gen’ se leag’ simultan mai multe ‘transcriptaze, aledtuind o aga-numiti «unitate de transeriere», -136-4) S-au depistat mecanisme alternative ale procesingului in complexul transcriptional lacucariote(fig.2.32a), Poli A seevens sy Seovesd 9 Seriensl Poll Asecveutt pa YY ‘Transcript, rimary! ‘Transcript primar wae HEE oo op Cctivareasi ive gi —_—s poliadenilarea A, } poliadeilarea A, A oh Splaisingut WD, »»». WEEE, mRNA matur (a) ‘mRNAmatur 6) Figura 2.32a, Mecanisme alfernative ale procesinguluila eucariote e) RNA now-sintetizat este impachetat imediat sub forma unor complexe ribonucleoproteice, prin asocierea cu proteinele specifice, Aceste complexe sunt similare nucleozomului, avind forme globulare. 4) Transcrierea DNA Ia eucariote, cade altfel sila procariote, poate fi opr aceasta serealizeaza (fig.2.32) - fie prin distorsionarea structurii DNA astfelincitacesta nu mai poate servica matrice; - fie prin inhibarea RNA-polimerazei Sinteza DNA pe matricea de RNA. ‘In virusii oncogeni s-a identificat o enzima care a completat conceptul exprimat prin “dogma central” a geneticii moleculare, fn care fluxul de informatie are sensul DNA —= RNA —» proteina. Enzima e revers transcriptaza -§i prezintiio DNA polimeraza RNA dependent. Ea poseda proprietatea, patrunzind in celula-gazda, dea sintetiza un hibrid DNA-RNA, adicd pe matricea de RNA a virusului genereaz4o. catena de DNA. RNA viral este degradat enzimatic, iar catena DNA se autoreplica, ddind nastere la dublul helix de DNA, ce confine informatia prezentd in RNA viral. DNA se insereaz in genomul-gazda, avind capacitatea de a se exprima ca protein. Se considera ca fiecare subiect este purtatorul unor gene oncogene neexprimate, fiindun ‘rezultatal patrunderii anumitor retrovirusi in organism int-un moment al evolutiei. in anumite conditii nefavorabile pentru organism, poate aves loc transcrierea, traducerea simalignizarea celulei. Cu ajutorul acestei enzime se poate construi artificial pe orice matrice de RNA un DNA complementar, adic& se pot objine gene sintetice care, prin fehnicile ingineriei genetice, produc mari canttiti de protein’ codificat. -137-Biosinteza RNA pe matrice de RNA Materialul cromozomial al unor virusi RNA este replicat in celula garda sub actiunea unei replicaze — RNA polimeraza— RNA dependenté. Ca rspuns Ia infectia virali, ele se sintetizeazi in celula-gazd3, au o actiune sutprinzatoare, folosind RNA virusului ce se replica. RNA sintetizat nue complementar, ci identic cu al virusulri—RNA viral (+) Catena RNA (-) va servi ca matrice pentru sinteza numeroaselor catene comple- mentare(+) virale, care (RNA viral) vor functiona ca RNA matrice pentru sinteza proteinelor virale (spre deosebire de RNA al retrovirusilor). Lo [i Proteine ;y dq RNA RNA Moleculele fice eal ‘ipl + omoloage’ RNA viral Francois Jacob “Tomas Cech Paul Zamecnik. George Palade -138-CODUL GENETIC Nofiunea de gend s-a coneretizat si am putea afirma cd gena este un fragment al DNA, transcris in molecula de mRNA ce codificd un lant polipeptidic sau are 0 semnificatie fimctionala particulard ({RNA etc). Dupi descoperirea din a.1977 a intermitengei genelor,notiunca nu s-a schimbet, inst unele fragmente ale DNA, datoriti splicingului alterativ al RNA primar— transcript, pot asigura sinteza a mai mult de 2 mRNA i, inconsecint, a mai mult de 2 proteine, fiecare cu functia sa, Rémine admis! bili idea ci'o gend determina sinteza unui lan polipeptidic. Informatia geneticd referitor la biosinteza proteinelor se transmite cu ajutorul codului genetic ce reprezinti forma de exprimare a relatiei dintre secvenja de nucleotide din DNA sisuecesiunea de aminoacizi din lantul polipeptidic.Avind 4 nucleotide si 20 de aminoacizi, este evident cd un aminoacid este reprezentat de 3 nucleotide —codul este triplet si poate oferi 64 de posibilititi pentru cei 20 de aminoacizi. $i toate tripletele sunt numite codoni. Ei (codonii) sunt identificati consecutiv de moleculele de ‘RNA, care indeplinesc rolul de adaptorin sinteza proteinelor(tab.2.1). ‘Tabelul 2.1. Codul genetic 1 1 mr (s) U iG A G G) y pam fie], [ad [ewan |e Wa tow | UCR Ser | UmA Codon UGA Codie] A UGG. uacsiem | icc tp |G au: car AUF gs [OL u auc |, | ccc coc c £ at = site |e CAA} ay |CCASAE | UG. cag. CAG ford G AUT ACU me Ae [Ose PU A |aucyte aoc], | Adc, Ace) c AUA. ACA Addis [AGL ag | A AUG Met_| Acc AAG A G au uy u G faclyy jacl cc} | Gee a@e| & Gua A GA Gy wa} A Gis. KG. Gaal KK G Proprietatile codului genetic Este un triplet in. care 61 codoni codified aminoacizii corespunzitori, 3 codific’ terminatia sintezei proteice, Codul este degenerai— unui aminoacid poate si-i corespund’ mai multi codoni: Arg, Leu, Ser, fiecare fiind codificatde cite 6 codoni, ins Met si’Trp sunt specificati de citre un singur codon (tab.2.1a). Codonii unui aminoacid sunt sinonime. Specifi- citatea codomului e determinati de primele dout litere. Degenerarea se refer la nivelul nucleotidului 3 din codon. Primele doua baze sunt constante. F.Crick a conchis ci asocierea nucleotidelor 1 si2 din codon cu nucleotidele 3 si 2 din anticodon este fixa, = 139.respectindu-se principiul complementaritati, in timp ce impachetarea nucleotidelor 3 di codon si, respectiy, 1 din anticodon este lax. Aceasta se datoreaza particularitaii nucleotidelor I din anticodon (5') de a se imperechea si cu alte nucleotide, in pofida regulilor lui Watson si Crick. Foarte des nucleotidul 1 din anticodon e inozina, care oscileaza (este baz s0vdielnica) se dispusd si inealce regulile (cfectul Wobble). } ‘NH § | J OH OW HOH 0. N ce HO OH Inozitel HO OH Tnozina Daca toate legaturile vor fi de tip W-C, atunci orice aminoacid ar fi acceptat de un singur codon, iar deblocarea din complexul de sintezi s-ar complica, ceea ce ar micgora considerabil viteza procesului de sinteza. Anume degenerarea codonului favorizeazi eliberarea din complex a tRNA. Degenerareacoduli minimalizariefecclenocivedle yyey1219, egeneraracodult ‘mutatilor si permite componenteinucleotidicea DNA generic s varieze in diapazon larg, nemodificind secvena aminoacidici in proteina codificat& de acest DNA. Aminoaciday unin Codul nu are virgule sau alte semne de a punctuatie ce ac indica inceputu si sfirstul fiecdrui ‘Ala 7 ‘codon, Citirea mesajului genetic se face neintrerupt Arg. 6 de lacodonul start pind la cel final Ast 2 Codul genetic este universal — toate ae Z 8 Cys 2 vie(uitoarele utiizeaz8 acelasi mecanism de aas an 3 informatia (abatereaprezinti codul genetic al Ghu 2 mitocondiei). Gly 4 Codul genetic nu este ambiguu (acelasi triplet His 2 nu semnificd 2aminoacizi diferiti), nu se suprapune ee 3 (prezinté exceptie la virusuri). Ds 3 Codul genetic prezintd o structurd liniard (este Met 1 colintar, adica exista o concordanti liniara intre gena Phe: 2 ‘si aminoacizii proteinei codificate). Pro 4 De remarcat ci tipletul AUG reprecinta - 2 codonul de initiere, ic cei trei UAG, UAA, UGA de Tp 1 ‘terminare (nonsens). Exist unele deosebiri in secventa ‘Tyr 2 nucleotidicd la DNA mitocondrial. Be + -140-Studiile mai recente au confirmat cd proprietajile chimice ale unor aminoacizi sunt jectate in structura codonului: ti codonit cu U (in pozitia 2) codifica aminoacizi idrofobi, iar cei ceau in pozitia2 adenina codifica aminoacizii polar sau cu sarcina; _guanina, respectiv, aminoacizi polari sau nepolati, iar uracilul in poziia 1 prezint& rifseritat ae Ct Rlspunsul a fost cApatat, studiind structura a anticorpilor si a genelor ce-i codifica (fig, : i , 2.34, 2.35). Molecula anticorpilor e “ compusadin 2 catene lungi (H) cu cite446 aminoacizi fiecare si 2 catene scurte (L), & respectiv, cu cite 214 aminoacizi fiecare. i Cy Catenele sunt unite prin legaturi disulfidice; lg legiturile S-S sunt si intracatenare. Fiecare = oe lant dispune de regiuni segmentare de fo hee? aminoacizi constante —C gio regiune varia- = domenial variabit bila — V; C-fragment ¢ compus din 3 domenii | Leesan ens see Hoi 1 domeniu L. V-regiunile au locusuri de o variabilitate extraordinar de mare, nu- Figura 2.34, Structura IgG mite hipervariabile. Fiecare lant contine cite trei locusuri — centre antigenofixatoare, compatibile cu antigenul. Fixarea e datorata legaturii dehidrogen, punfior saline, interactiuni hidrofobe, legturii Van der Waals, Locatizarea in anticorpiaregiunilor C si V ne permite s& concluzionam c& DNA -146-Figura 235. Sictura domenicd conformationalé a molecule’ de imunoglobulind cele codifica ¢ rezultatul sudairii a doud gene pentru C si V - fragmente. S-a adeverit experimental aceast’ ipotezi. Ulterior, sa stabilit c& DNA ce codifica fragmentele va- riabile atit in H, cit siin L-catene sunt compuse din gene de diferite tipuri care-si schimbi pozitia si pot forma diverse imbinari. In DNA - V -fragmentele au aproximativ 400 V gene, 12 D (Diversity), 4 J (de legaitura) gene. Combinarea acestor gene face posibila mai mult de 20000 de variante, care, la rindul lor, se modifica in secventa nucleotidici la aditionarea cu fragmentele de DNA ce codific’ regiumea C. in consecinys, pot fi formate milioane de gene diferite cu circa 10° centre antigenofixatoare responsa- bile de sinteza anticorpilor. ‘Combinatii noi de gene — 0 recombinarie artificial — pot fi create si in eprubett. Unrol decisiv I-au jucat elaboratile enzimelor de restrictie —endonucleaze ce recu- nose in molecula de DNA o secventi anumiti de baze. Enzimele cliveazi legitura fosfodiestericd de pe ambele catene intr-un loc special al secventei recunoscute— secventele cunoscute sunt palindroame. Evident, capetele rezultante pot finecoezive san coezive (contin nncleotide eomplementare) Un alt ferment este ferminal-transferaza — oenzima care posed capacitateade aadi- ASKUGRGUEEBc rc TAA uga la capetele 3-OH ale celor dou molecule . cetrebuie sudate cozi homopolimerice com- “8 0706 7 GTEUANGNGEATE plementare (poli G, poli C) (fig.2.36). Enzima revers — transciptaza — permite sinteza unui DNA recombinat pe mRNA, adéugind poli T si dezoxiribonucleotidele respective, apoi se inlaturi mRNA gi cu ajutorul DNAp I reconstruim catena comple- mentar. Gencle recombinate se includ intr-un vector poirivit (0 molecula de DNA), care se introduce intr-o celul, unde se produce replicarea si exprimarea genotipici. Ca vector se folosesc plusmidele (DNA bicatenar din citozolul majoritatii bacteriilor). Ele se deplaseaza ugor de lao celula laalta. Aceste molecule mici tree prin membrana celulei- -gazdi si potasimila cu usurinta gene straine (2.36.2). Ele se replic& autonom si rapid, ‘faptce permite amplificarea genei incluse. Selectionarea lor prin screening ne permite di identificdm genele respective (fig. 2.36). -147-oa SION Figura 2.36, Ingineria geneticd: clonarea genelor Clonarea genelor a rezolvat problema insulinei, interferonului sia multor alte (orton sel ae cn ae ey uperss boa 80 icy vidate BREE ie substante biologice active ca hormonul somatotrop etc. Interferonul reprezinta 0 glicoproteind cu 160 aminoacizi fiecare specie produce, in urma infectiei virotice, cel putin 3 tipuride interferon in: 1) leucocite; 2)TT-limfocite; 3) fibroblast tesutului conjunctiy. Fixindu-sede membrand, interferonul sti- muleazit sinteza enzimetor specifice, care-s capabilest lezeze RNA -virale sist inactiveze factorii de initiere a sintezei proteice i ribozomi. in 1980, in SUA a fost identificata si separatd gena interferonului leucocitaral omului, inclus’ apoi in £ coli pentru a o sinte- tiza in cantititi substantiale, Se preconizeazi ca celulele modificate prin metoda ingineriei genetice si fie inocu- late si in organismul uman. Se procedeazi la incorporarea genelor functionale in locul celor defectate sau pierdute de organismul -148- en eens T'ampiciing Gena rerister 2 I tevueielink But Figura 2.361, Plasmida pBR322: contine2 gene cu rezistenta programati ta tetraciclna (et) $i ‘ampicilind (bla)uman, ca metod de tratament - genoterapia. Adaosul de material genetic este ficient cind defectul consta in insufi- cienta sau lipsa completa a unei proteine. Nu se consider’ rational cind mutatia conduce la surplus de protei- ne sau sinteza unor substante nocive precum are loc la anemia falciforma. Corectia unoratare tulburiti necesit’ ‘mu mumai ineadrarea unei gene func tionale, dar si a unei gene capabile sf inactiveze gena mutant, Savant studiaza posibilitatile inocularii genei functionale in celulele separateale pa- cientului, reincluse apoi in organism. Sperdimcdtin vitorul apropiat va de- rguey T37- Clu wala etroviuor veni posibila tratarea bolnavilor prin ‘metoda integrari genelor legate cu substanfe, ceea ce ar permite o fixare direct a genei fn celulele-fintd. Aziintegrarea in genom a genei dorite e nesemnificativa—o celulala 10, Se constati cd integrarea in genom nu e intotdeauna necesara fa expresia genei, doar e limpede ca gena integrati se va pastra multmai mult in celuld. Apoi ea e aptidease replica cu DNA cromozomial, se va transmite la alte generatii de celule si va determina sinteza produsului in decursul vietii pacientului. Pentru incorporarea genei se utilizeaz capacitatea natural a virusilor de a patrunde {ncelule side a-si aduce materialul genetic propriu, Cel mai promifator sistem de transfer al genelor incelule 0 prezinti retrovirusii, ei sunt vectorii cardinali, dar tot ei sunt, capabili sa se includa in DNA cromozomial al celulelor apte de reproducere activa. Un ‘minus extrem de mare comport& pericolul provocitii cancerului i, deci, apare o sarci- na importanti—posibilitatea de a stopa reproducerea acestor virusi. in figura 2.37 ¢ Tedat ciclul vital al retrovirusilor. S-aclaborat o metodi efectiva de receptionare a retrovirusilor, care posed atit 0 ‘membrand extern normal, cit si toate proteinele virale. Ins RNA viral nu confine informatie de sintezai a acestor proteine si locusurile secventei nucleotidelor corespun- zAtoare sunt ocupate de gena ce are a fi introdusd in celula (fig, 2.38). ‘Daca bolnavului ise integreazi celule proprii ale sistemului imun preventiy, cultivate ‘si prelucrate cu interleukina-2, se produce pitrinderea limfocitelor in tumoare, se inregistrea7d regresia celulelor cancerigene. Din 15 bolnavi tratati (dup Rozenberg), la 9 (melanomi in stare grav’) s-a stabilit regresie adit la unul - complet. in apropierea de Edinburg exista o stina cu oi transgenice (100), laptele carora ‘confine o cantitate suficienti de proteine ce favorizea74 coagularca singelui. Laptele -stor oi ¢ suficient pentru tofi bolnavii de hemofilie din Europa. La Institutul de Fiziologie din Cambridge se experimenteaza niste purcelusi neobis- Celuta infectara | RNA viel eae “Scone = 149-1. Creaea unui provi ee dice © end curt Inlocuiteayenci vile nuiti, Lori sau introdus gene ce codi- ficd_ hormonul somatotrop al animalelor ‘mari comute folosit in tratamentul diver- Sass jl Gene vieale Provinsl eee selor patologii ale omului Inbaza investigatiilor efectuate, ame- ricanii au obtinut porei ce erese foarte repede, iar carnea lor n-are slinina Aceste animale sunt slab rezistente la temperatur joase. S-au clipitat cartofi foarte rezistent la frig ete ‘An perspectiva se va modifica gi sto- matologia: se concep dinti natural in caz acd gena omului va fi introdusi in -genomul bacteriilorcare vor sintetizadinfi respectivi. Deocamdati transferarea mai multor gene e imposibil, deoarece organismul nui receptioneazi mai mult deeit 0 sin- gurl gen, Savantii modifica forma si dimensiunile multor animale. Se poate schimba si omul, Lui ise pot conferi pro- prietiti noi, pozitive, dar sidimpotriva — negative. E un domeniu interzis de experimentiri. Azi nu sunt cunoscute zgenele ce determina capacititile mintale, dar unele informatiireferitoare ka onzul bolnay suntelucidate. Includerea gene- Jorarmodifica vadit armonia organismulut uman. Lalnstitutul de Studii Biomedicalede pelings Universitatea Washington, din 1991 se studiazi tripanosoma, un microorganism ce paraziteazit in organismul omului sial animalelor:Savantii examinau proteina Co (II) simRNA respectivi. RNA s-adescoperit, dar gena—nu, Insi copie fara original nu exist. Dupa analogie cu organismele inrudite, au stabilit DNA care potential ar trebui sa contind gena siau comparat-o cu RNA initial. S-a dovedit complementarii dupii toate bazele, cu exceptia U. Gena exista, dar RNA era modificati cam de 60%. S-a constatat cd asemenea ‘modified nu sunt un origina, iindea se inregistreazi si copii precise. Care este, totusi, cauza? Se consider’ cd in celuld are loc o transferare efectiva a informatiei de pe DNA, ulterior, un reactor face unele corecturi in textul MRNA, directionat specific. Evident ca in gene, copiile cdrora se corecteazi initial, lipseste semnalul de asamblare a proteinei, Rezultatul redactirii ¢ aparitia lui in mRNA. 2. Ins n colult_ unde se formar veton particle no RNA cu gent include tn os nA particule i, hee sso pecans Protein Paricule vrake ute Tormcazt Coluajiné disponibilt entre implantare Figura 2. se formeaci ectori retovirusitor inofensivé eeluleastfel proteina poate fi sintetizatd, Redactorul stiece face. Acelasi lucru s-astabilit si la speciile superioare. Functia respectiva o indeplineste RNA de corectie, care mu numai ‘cd determina locul inciziei nucleotidelor, dar si prezint& materialul respectiv. Enzimele favorizeazi acest proces datorité prezentei unei gene informative (1991). Principiul ‘ransmiterii mesajului genetic se complica intrucitva (fig, 2.39). Metoda ingineriei genetice ¢ Ropliearca Replicera utilizatd pentru crearea vaccinei ‘Teanseripia ee contra SIDA, maladie provocata de Temerome » 0 familic de virugi ce contin RNA. Towa "re RNa Virusii posed revers transcriptaze si sunt foarte instabili. Sistemul imun meee reactioneaza la proteinele superficiale [ 7 Translarea ale virusului care se modifica permanent, modificdri legate de deriva genei. Penteu crearea vacei- neiefolositvinisul variolei—cavector Figura 239. Dogma de transmitere a informatici — incluzindu-se gena SIDA. ane ‘Moss a obtinut o atare vaccin’. La maimute apar anticorpi, dar rimin neprotejate de SIDA. Efectul imun e de fata, ins nu si de protejare. Capacitatea de aparare este determinatd de alte caracteristici ale antigenului. D.Zaguria creat o vaccind pentru o alti variant’. a SIDA, dar cu acelagi impact. Pentru diagnosticul SIDA e utilizatimetoda de amplificare enzimaticd a genei SIDA. Se confirm prezenta virusului dupa ori de infectare, dac& din 5000 decelule e afectats macar una, Dupa 12 ore de la contaminare, diagnosticul se confirm’ la afectarea unei celule din 500.000. La tatamentul efectiv al SIDA contribuie azidotimidina si 2'-3' - dezoxicitidina —nucleozide ce inhibi revertaza vvinusuui, S-au sintetizat gi alte preparate asemdindtoare dupd structurd cu tranchilizantii, ce sunt inhibitori activi ai revertazei la HIV- I sinu la HIV-II (virusul african), in omida fluturelui Hyalophora cecropina s-a descoperit 0 substanta peptidied — cecropina B, ce lezeaz’ bacteriile si infecteaz omida. Biochimistii de la Universitatea din Louisiana (1990) au sintetizat un sirde peptide cu o structurd identical, deosebindu- sedupaccitiva aminoacizi, Una din aceste peptide are o fortd distrugatoare fantastic sia fost mumiti Siva-1 (dupa mumele divinitii indiene, ce nu-si cruganiciodatd dugmani Peptidele contribuie la formarea porilor intracelulari si, in consecint, apa ptrunde in celula, distrugind-o. Siva-I actioneazi si asupra membranelor celulelor mamiferelor, dar celulele nu mor, fapt determinat de prezenta citoscheletului ce pistreaz forma celulei, iu celulele caucerigene yi iu cele alectate de vitusul SIDA cituscheletul ¢ kezal, Secventa aminoacizilor din aceste peptide e identi’ cu fragmentele—semnale din fibrinogenul omului— protein’ cauzata de stres, rini, S-a stabilit cd aceste fagmente sunt mai efective decit $iva-1, ladistrugerea celulelor eancerigene. Agadar, organismul uman in stare de stres elimina. activ substante anticancerigene, antistresante si, deci, ‘este conchudent ci rezervele proprii ale organismului sunt deosebit de efective in lupta u factorii nocivi, rezerve care necesito studiere ampli si profuunda. Protcine biotoge-activi =151=