Sadraj

1. Uvod

.....................................................................

2. Southern i Northern blotting

.....................................................................

2.1. Priprema uzorka

.....................................................................

2.2. Gel elektroforeza

.....................................................................

2.3. Blotting

.....................................................................

2.5. Hibridizacija

.....................................................................

2.6. Detekcija i kvantifikacija

.....................................................................

2.7. Primjena Southern blottinga

.....................................................................

2.8. Primjena Northern blottinga

.....................................................................

3. Western blotting

.....................................................................

3.1. Priprema uzorka

.....................................................................

3.2. Gel elektroforeza

.....................................................................

3.3. Blotting

.....................................................................

10

3.4. Imunodetekcija

.....................................................................

11

3.5. Analiza podataka, kvantifikacija

.....................................................................

15

3.6. Primjena Western blottinga

.....................................................................

15

4. Literatura

.....................................................................

16

1. UVOD
U ranim 1970-im godinama pojavila se mogunost mapiranja cijelih genoma budui da su
prethodno stvoreni uslovi kao to je otkrie restrikcionih enzima, razvoj rekombinantnih DNK
tehnologija i kloniranje gena. Ipak, identifikacija pojedinanih gena nije bila mogua sve do
1975. godine kada je Edward Southern uveo posebnu metodu i pokazao da se DNK moe
elektroforetski frakcionirati, prenijeti na nitroceluloznu podlogu, tome se dodati probe sa
radioaktivno markiranim DNK sekvencama koje bi se u postupku hibridizacije vezale za
svoje komplementarne sekvence iz uzorka na membrani. Godine 1977. analiza genske
ekspresije je rapidno uznapredovala, kada su George Stark i saradnici replicirali konfiguraciju
Southern blotting metode u pokuaju da prenesu celularnu RNK na hemijski aktiviran
celulozni papir. Ta metoda je dobila naziv Northern blotting. Dvije godine kasnije, Stark je
razvio metodu blottinga proteina oslanjajui se na kapilarni prijenos sa gela na aktiviranu
celulozu. Danas se preferira bri pristup Towbina koji se bazira na elektroblottingu proteina
na nitroceluloznu membranu (Schlickeiser i Pleyer, 2007).
Dakle, Southern blotting slui za detekciju DNK pomou hibridizacije sa DNK ili RNK
probama, Northern blotting na istom principu omoguava detekciju RNK, dok Western
blotting slui za detekciju proteina sa komplementarnim antitijelima. Sve tri metode
podrazumijevaju separaciju molekula elektroforezom, prijenos na membranu koja podrava
detekciju fragmenata sa odreenom DNK sekvencom, odreenom vrstom RNK ili proteina.

2. SOUTHERN I NORTHERN BLOTTING

2.1. Priprema uzorka

Southern blotting se primjenjuje za uzorke u kojim se eli analizirati genomska DNK,
plazmid ili DNK bakteriofaga. Za genomsku DNK cilj je dobiti molekule koje nisu obimno
fragmentirane nasuminom restrikcijom. Stanice se moraju otvoriti pod relativno blagim
uslovima. Za stanice kulture tkiva i uzorke krvi obino je dovoljna inkubacija u puferu koji
sadri deterdent kao to je natrijum-dodecilsulfat (SDS) da bi se naruile stanine membrane
i oslobodile molekule DNK. Stanini zid bakterija moe se naruiti kombinacijom lizozoma i
2

EDTA. Drugi mikroorganizmi sa otpornijim staninim zidom, npr. gljivice i kvasac, mogu se
tretirati sa enzimima koji e naruiti strukturu zida. Isto vrijedi i za biljne stanice, s tim da se
njihov zid narui mehanikim postupkom mljevenja tkiva koja su bila zaleena u tenom
nitrogenu. Nakon disrupcije stanice, proces ekstrakcije genomske DNK se nastavlja s ciljem
da se uklone sve vee biomolekule prisutne u prvobitnom ekstraktu. Proteaze se mogu dodati
u pufer kako bi se pokrenula degradacija proteina, ali se deproteinizacija rutinski izvodi sa
fenolnom ekstrakcijom (dodavanjem fenola ili 1:1 mjeavinom fenola i hloroforma), to
rezultira precipitacijom proteina. Nakon centrifugiranja, precipitirani proteini migriraju u
meufazu izmeu organske i vodene faze, pri emu nukleinske kiseline ostaju u vodenoj fazi.
Za biljne ekstrakte potrebno je dodatno preiavanje pomou cetiltrimetilamoniumbromidom (CTAB). Kada su u pitanju plazmidi ili DNK bakteriofaga, onda se esto
upotrebljava postupak koji se sastoji u tretiranju staninog ekstrakta sa bazama koje
precipitiraju linearnu DNK, ali ostavlja plazmide u otopini. DNK bakteriofaga se obino
dobiva direktno iz estica bakteriofaga koje lue inficirane bakterije, a proces preiavanja je
pojednostavljen injenicom da se te estice sastoje samo od DNK i proteina (Brown, 2001).
U tehnici Northern blotting prvi korak je ekstrakcija ukupne RNK iz tkiva koristei kaotropne
reagense koji dovode do disrupcije stanice, denaturacije proteina (ukljuujui RNK-aze) i
otapanja RNK. Nekada se mora ukljuiti jo jedan korak u izolaciji mRNK iz ukupne RNK
to e poveati osjetljivost. Bitno je napomenuti da je RNK hemijski i bioloki puno labilnija
od DNK. Gledano s praktine strane, velika osjetljivost RNK prema RN-azama, te brojnost i
stabilnost tih enzima znai da se mora obratiti panja prilikom pripreme intaktnih RNK
molekula i eliminacije RNaza. Osim toga, samo mali procenat ukupne RNK ini mRNK, tako
da blotting cijele RNK nije dovoljno osjetljiv nain za analizu rijetkih mRNK. Iako se esto
moe detektovati ciljna mRNK u uzorku ukupne RNK, vea osjetljivost se postie ako se
izolira poly A+ mRNK frakcija, pa se pristupi Northern blottingu. Oko 10 g ukupne RNK je
dovoljno za detekciju obimnog signala, a samo nekoliko g poly A+ RNK (ekvivalentno sa
neto vie od 100 g ukupne RNK) za detekciju rijetkih signala (UNC School of Medicine,
2013). Nakon toga, DNK i RNK, zavisno od metode, odvajaju se prema molekulskoj masi gel
elektroforezom, a zatim se vri blotting na membrane.

2.2. Gel elektroforeza

Prilikom Southern blottinga, gel, najee agarozni, se prethodno mora tretirati prvo
kiselinom da bi se dobili manji fragmenti DNK koji e se bre kretati gelom i baznom
otopinom koja e denaturirati dvostruke lance DNK molekule. Pucanje vodikovih veza
osigurava vezivanje lanaca za membranu i dostupnost baza polinukleotida za hibridizaciju sa
probama (UNC School of Medicine, 2013).
Huang i saradnici (2010) su pokazali da se kratki DNK fragmenti kao to je nukleozomalna
DNK mogu uinkovitije i bre analizirati kada se umjesto agaroznih gelova visoke
koncentracije koristi agarozni gel niske koncentracije sa malom zonom visoko koncentriranog
gela.
Jedna od veih razlika Southern i Northern blottinga je to RNK esto stvaraju sekundarne
strukture koje uveliko mijenjaju njenu mobilnost na agaroznom gelu. Stoga, da bi se pravilno
eluirale, RNK se obino odvajaju na formaldehid agaroznom gelu. Kao alternativa moe
posluiti i glioksal koji daje toksine pare kao formaldehid, ali je bitno kontrolirati pH tokom
elektroforeze da bi se sprijeila disocijacija glioksal/RNK kompleksa (UNC School of
Medicine, 2013).
2.3. Blotting
Izbor membrana kod Southern blottinga svodi se na nitrocelulozne ili najlonske. Ako se
koristi nitrocelulozna membrana, u tom sluaju se nakon alkalne otopine vri neutralizacija
tako to se gel uroni u Tris pufer. Sastavi se aparatura ija je jedna od komponenti i prijenosni
pufer pod nazivom 20 x SSC (NaCl, Na-citrat). Nakon blottinga, aparatura se rasklopi, a
membrana koja se ispire sa 2 x SSC ostavi se na suenje (Brown, 2001). Nitroceluloza e se u
zasienoj slanoj otopini vezati za nukleinske kiseline vrsto, ali nekovalentno. To vezivanje se
stabilizira grijanjem na 80 C tokom 2 sata, meutim poto nije kovalentno dolazi do gubitka
signala. Ove membrane su i vrlo krhke, ali imaju jednu vanu prednost, a to je da ima manje
sporedne hibridizacije, naroito sa probama obiljeenim sa neradioaktivnim markerima.
Najlonski filteri se preferiraju, jer su vri, otporniji na izlaganje bazama, a blokiraju se
pomou SDS, to pojednostavljuje korak pre-hibridizacije. Nukleinske kiseline se mogu
kovalentno vezati za najlonske membrane to se ostvaruje pomou UV zraenja, a to
sprijeava ispiranje nukleinskih kiselina tokom daljeg postupka. Najlonske membrane mogu

biti bez naboja ili sa imobiliziranim pozitivnim nabojem na povrini, a kao takve imaju vii
afinitet ka nukleinskim kiselinama koje su anioni (National diagnostics, 2011).
Najee metode za Northern i Southern blotting zasnivaju se na kapilarnim silama i prijenosu
pomou vakuuma. Ponekad se koristi i elektroblotting, ali se mora biti paljiv da ne bi dolo
do topljenja agaroznog gela.

Naslagani papiri
Membrana
Gel
Gaza

Blok koji slui kao oslonac

Pufer

Slika 1. Pufer za prijenos se povlai iz gela i membrane u naslagane papire. Tok pufera eluira
molekule nukleinske kiseline sa gela na membranu pri emu e se ouvati raspored traka. (National
diagnostics, 2011).
Pufer
Gel

Membrana

Slika 2. Vakuum blotting takoer koristi tok pufera da oslika trake na membranu. Membrana se
stavlja na poroznu podlogu, prekrije se gelom, stvore se uslovi za vakuum i doda se pufer. Ova vrsta
blottinga je brza, traje 1 - 3 sata. (National diagnostics, 2011).

Elektroblotting DNK ili RNK sa agaroznog gela se najee koriste u "polusuhoj" aparaturi,
izmeu pljosnatih vrstih elektroda od metala ili granita. Potencijal se uvodi okomito na gel
uzrokujui eluiranje fragmenata nukleinskih kiselina na membranu. Elektroblotting se vie
koristi sa poliakrilamidnim gelom, koji nije pogodan za metodu sa vakuumom ili kapilarnim
silama.

2.5. Hibridizacija
Hibridizacija se bazira na principu da dva polinukleotida formiraju stabilan hibrid
sparivanjem baza ako su njihove sekvence nukleotida potpuno ili djelimino komplementarne.
Za Southern blotting bilo koja DNK molekula koja je komplementarna sa restrikcionim
fragmentom moe se koristiti kao proba. Proba moe biti i restrikcioni fragment ili DNK
molekula dobivena pomou PCR, ili cDNK dobivena sintezom DNK od mRNA. Sintetski
oligonukleotidi takoer se esto koriste kao probe za hibridizaciju. Drugi est tip proba su one
koje nastaju od RNK, jer imaju niz prednosti u odnosu na DNK. U praktinom smislu, to se
najvie odnosi na lahkou sinteze veih koliina RNK, ali i da RNK sadre samo jedan lanac,
pa efektivna koncentracija probe ne opada tokom hibridizacije kao to je sluaj sa DNK
molekulom uslijed sparivanja baza. Hibridizacija se izvodi u visoko slanom puferu koji sadri
deterdent, obino 2 x SSC + 1% SDS. Bitno je da se mora dovoljno DNK hibridizirati sa
ciljnim restrikcionim fragmentom kako bi nastao jasan signal. Za najzahtjevnije zadatke kao
to je detekcija jedne kopije gena u genomskoj DNK postizanje dovoljne osjetljivosti moe
biti problematino, ak i kada se nanese maksimalna koliina DNK na gel i kada se proba
oznai do njene maksimalne specifine aktivnosti. Dodatne oteavajue okolnosti su kada se
umjesto 32P koristi 35S, koji je inae pogodan za prostije DNK kao to je restriktiran plazmid
ili klon bakteriofaga. Isto vai i u sluaju kada se koristi neradioaktivna proba. Kritian faktor
je i specifinost reakcije. Ako se hibridizirajue podruje probe ne podudara sa ciljnim
fragmentom, onda mora bar imati segment velike slinosti tako da se moe formirati hibrid.
Problem je u tome to se probe mogu hibridizirati i sa bilo kojim DNK fragmentom, koji je i
djelimino komplementaran. Sastav pufera je takoer znaajan, jer stabilnost hibrida ovisi o
jonskoj jaini i prisustvu destabilizirajuih agenasa. Temperatura je vana, jer taka topljenja
potpuno sparenog hibrida je vea nego za hibride kod kojih su neke baze ostale nesparene u
sluaju da DNK i proba nisu potpuno komplementarne (Brown, 2001). Bez obzira na nain
prijenosa, Northern hibridizacije se obino izvode u prisustvu 50% formamida da bi se snizila
temperatura topljenja hibrida, tako da se RNK ne izlae visokoj toploti kroz due vrijeme
(UNC School of Medicine, 2013). Za RNK hibridizaciju, minimalni broj baza koji e
osigurati specifinost je 25, pod uslovom da je komplementarnost potpuna.

2.6. Detekcija i kvantifikacija

Nakon ispiranja, membrana se podvrgava procesu detekcije koji ovisi o vrsti koritenog
markera. Detekcija se bazira na radioaktivnim ili neradioaktivnim metodama. Stvaranje boje,
hemiluminiscencija i fluorescencija su neke od neradioaktivnih metoda. U sluaju
hemiluminiscentne detekcije, razgradnja hemiluminiscentnog supstrata se katalizira alkalnom
fosfatazom ili peroksidazom hrena, sa emisijom svjetlosti. Ti enzimi se mogu konjugirati
direktno sa probom, ili ee proba se markira sa ligandom koji lokalizira antitijelo na koje je
vezan enzim. Denzitometrija je jedan od naina kvantifikacije (Trayhurn, 1996).

2. 7. Primjena Southern blottinga

Southern blotting se koristi u genetskom mapiranju, razvoju istraivanja, dijagnostici i
forenzici. Ova metoda je neophodna za potvrdu identiteta kloniranog fragmenta ili
identifikaciju subfragmenta od interesa unutar klonirane DNK, a moe se koristiti i za
genomsku DNK, s tim to je u tom sluaju Southern blottting uvod u tehnike kao to je
analiza polimorfizma duine restrikcionih fragmenata (RFLP), analiza (Brown, 2001) koja je
potrebna u konstrukciji genomskih mapa. Kada se genomske DNK razliitih individua
tretiraju sa istim restrikcionim enzimom, ne mora doi do nastanka jednakog seta fragmenata,
jer su neka restrikciona mjesta polimorfna. Ona se mogu koristiti kao markeri za genetsko
mapiranje i smatrani su vanim u stvaranju prve pregledne humane genske mape, obzirom da
ima 105 RFLP u humanom genomu. Southern blotting se vrlo esto koristi za mjerenje duine
telomera, a u istraivanju koje su proveli Gao i saradnici (2013), ova metoda se pokazala ak
bolja od Real-time PCR metode. Praenje DNK replikacije posredovane sa E1 i E2
proteinima takoer je omogueno ovim dvjema metodama, a Morgan i Taylor (2005) su dali
smjernice o izboru metode. Mellars i Gomez (2011) su Southern blotting primijenili za
detekciju mutacija, a metoda je posebno zanimljiva i u detekciji genetiki modificiranih
organizama u hrani (Ahmed, 2002).

2. 8. Primjena Northern blottinga

Northern blot je metoda koju su razvili James Alwine i George Stark, a koristi se u
molekularnoj biologiji za istraivanje genske ekspresije u uzorku putem detekcije RNK. Sa
7

Northern blottingom mogue je pratiti celularnu kontrolu struktura i funkcija, tako to se

odreuju nivoi ekspresije odreenog gena tokom diferencijacije, morfogeneze, ali i tokom
razliitih oboljenja.
Northern blotting je izmeu ostalog metoda za:

detekciju specifinih RNK sekvenci;

analizu genske ekspresije na nivou mRNK;

odreivanje veliine mRNK transkripta;

analizu degradacije, splicinga i vremena poluivota RNK;

potvrdu transgenih/knockout mieva (ivotinja).

Unato razvoju drugih naprednih metoda, brojni autori su potvrdili da je Northern blotting
standardna metoda za detekciju i kvantifikaciju nivoa RNK (Keren et al., 2011; Alvarez i
Nourbakhsh, 2011). Takoer, smatra se da je Northern blotting iznimno dobra metoda u
detekciji malih RNK molekula u koje se ubrajaju mikro RNK (miRNK) i male interferirajue
RNK (siRNK) koje se razlikuju po nainu biosinteze (Khraiwesh, 2012; Varallyay et al.,
2008). Jedan od razloga je to je ova metoda lahko dostupna i ne zahtijeva posebnu opremu.
Poboljan protokol za tu svrhu podrazumijeva RNK ekstrakciju, elektroforezu na
poliakrilamidnom gelu, northern blotting, te hibridizaciju i detekciju sa modificiranim
oligonukleotidnim probama.

3. WESTERN BLOTTING
3.1. Priprema uzorka
Priprema uzorka spada u preparativnu fazu Western blottinga. U veini sluajeva stanice se
liziraju kako bi oslobodile protein, najbolje u hladnoj prostoriji ili na ledu kako bi se
minimizirala proteoliza, defosforilacija i denaturacija, jer do tih procesa dolazi im se pone
razarati stanica. U jednostavnim postupcima stanice je mogue lizirati u puferu za nanoenje,
ali za viskoznu celularnu DNK mora se upotrijebiti ultrazvuk. Izbor pufera za lizu i
odreivanje njegovog volumena uglavnom se odredi eksperimentalnim putem. Uzorci tkiva su
sloenije strukture nego stanice, pa su potrebni vii nivoi mehanike sile da bi se oslobodili
8

proteini. Tkiva mogu sadravati i vie tipova stanica koje razliito reagiraju sa puferom.
Najjednostavniji izvor poetnog materijala za Western blotting su preieni ili semipreieni uzorci proteina. Njih je uglavnom dovoljno pomijeati sa puferom za nanoenje
koji se koristi tokom gel elektroforeze, a prednost su i male koliine uzorka. Da bi se
osiguralo da se uzorci nalaze u odgovarajuem rasponu za detekciju, potrebno je znati
koncentraciju ukupnih proteina u uzorcima. Najjednostavnija metoda je mjerenje apsorbanse
otopine lizata na 280 nm ili 205 nm. Postoje i druge analize koje se baziraju na redukciji
metalnih jona ili na vezivanju boje. U svim sluajevima promjena boje je proporcionalna
koliini proteina u uzorku. Koncentracija proteina se mjeri uporeivanjem sa koncentracijom
standarda. Nakon to se utvrdi koncentracija, uzorci se nanose na gel u puferu za diluiranje.
Pufer sadri glicerol tako da uzorci lahko utonu u udubljenja gela, a sadri i boju (bromfenolplavo) koja migrira gelom da bi pokazala napredak separacije. U veini rutinskih blottinga,
SDS i reducirajui agens su takoer prisutni u puferu, kako bi u potpunosti denaturirali
proteine. Uzorci se zagrijavaju kako bi se potpomogla denaturacija, nakon ega se mogu
odmah koristiti za analizu ili ostaviti na uvanje na -4 C ili -20 C. Kao pozitivna kontrola
obino se koristi poznat izvor ciljnog proteina, kao to je preieni protein. Pozitivna
kontrola je bitna za potvrdu identiteta ciljnog proteina, budui da e dati referentnu traku na
blotu, pokazujui oekivanu migraciju proteina i potvrditi aktivnost antitijela. Negativna
kontrola, poznata kao null cell line, potvruje da je signal specifian za eljeni protein.
Finalna komponenta gela je standard poznate molekulske mase kako bi se utvrdila veliina
proteina (Moore, 2009).
Ispiranje
stanica na ledu

Liza stanica i
oslobaanje proteina

Slika 3. Priprema uzorka za oslobaanje proteina. Izvor: Moore C (2009) Introduction to Western
Blotting.

3.2. Gel elektroforeza

Gel elektroforeza je tehnika pomou koje se molekule sa nabojem, kao to su proteini ili
DNK, separiraju prema fizikim osobinama tokom njihovog kretanja po gelu pod uticajem
elektrine struje (Thermo Scientific, 2013).
Nakon pripreme uzorka, dolazi do separacije upotrebom SDS-PAGE. Obzirom da su uzorci
denaturirani u puferu za aplikaciju, koji sadri SDS deterdent, protein je jednakomjerno
negativnog naboja i migrirae u elektrinom polju prema pozitivnoj elektrodi. Proteini se
primarno separiraju prema veliini. Cilj je postii takvu separaciju da se ciljni protein jasno
odvoji od ostalih komponenti, to e omoguiti identifikaciju i imunodetekciju. Procenat i
debljina gela e uticati na transfer proteina iz gela na blotting fazu, tako da tanji gel ili manji
postotak akrilamida poboljava transfer. Nakon to gel ovrsne, stavlja se u aparat, mali
volumeni proteina (5-20 l) se otope u aplikacionom puferu i dodaju se u svaki bunari. Gel
se zatim spoji sa izvorom struje i ostavi se u puferu nekoliko sati da se razdvoje proteini
(Moore, 2009).

3.3. Blotting
Nakon elektroforeze, protein se mora prenijeti sa gela na membranu putem difuzije,
kapilarnog prijenosa, konvekcionog prijenosa ubrzanog toplotom, vakuum blotting
prijenosom ili elektroelucijom (Thermo Scientific, 2013).
Elektroblotting je jedna od najpouzdanijih metoda s aspekta brzine i uinkovitosti transfera
koja se koristi u laboratorijama. Elektrino polje uzrokuje da proteini napuste gel i preu na
membranu, koja se nalazi izmeu povrine gela i pozitivne elektrode. Takav poloaj je bitan
da bi proteini migrirali na membranu. Najee se koriste nitrocelulozne i poliviniliden fluorid
(PVDF) membrane. Nitroceluloza ima odlina svojstva vezivanja proteina i retencije, ali je
krhka. PVDF ima veu mehaniku vrstou. Prije nego se sklopi aparatura za transfer,
membrana se navlai. Nitroceluloza se navlai tako to se pusti da pluta, a zatim se uroni u
destiliranu vodu ili pufer za transfer, a PVDF se navlai u metanolu. Oba tipa membrana se
nakon toga navlae u puferu za transfer i direktno nanose na povrinu gela. Iznimno je vano
da ne ostanu mjehurii zraka izmeu povrine gela i blotting membrane. Transfer pufer je
slian aplikacionom puferu, s tim da se dodaje metanol kako bi se proteini vezali na blot.

10

Elektroforetski transfer se moe vriti u mokrim ili polusuhim uslovima. Mokri uslovi su
bolji, jer osiguravaju da se gel ne isui, a preporuljiv je i za vee proteine.

Mokri prijenos
Kretanje
proteina
Polusuhi prijenos

Slika 4. Naini prijenosa u Western blotting metodi. Izvor: Moore C (2009) Introduction to Western
Blotting.

Manji proteini e bre napustiti gel, a mogu prei i na filter papir iza blotting membrane.
Blotting membrane sa manjom veliinom pora mogu se koristiti za manje proteine i peptide, a
SDS se moe smanjiti ili ukloniti iz pufera za transfer kako bi se poboljalo vezivanje za
membranu. Ukoliko postoji sumnja da e proteini proi kroz membranu, moe se staviti jo
jedna membrana. Veliki proteini sporije eluiraju i mogu ostati u gelu, pa se preporuuje mokri
transfer preko noi (Moore, 2009). Optimalan prijenos proteina obino se postie sa malom
jonskom jainom pufera i sa niskim protokom struje (Thermo Scientific, 2013). Kada se
zavri blotting, aparat se rasklopi i evaluira uinkovitost transfera. Pouzdanija metoda
11

potvrivanja je upotreba reverzibilnih boja koja identificira prisustvo proteinskih traka

direktno na membrani. Ponceaus S, crvena boja koja se nanosi u kiseloj otopini, je vrlo
pouzdana, obzirom da je kompatibilna sa skoro svim tipovima markera za imunodetekciju i
substrata. Boja Coomassie blue se ne koristi direktno prije imunodetekcije, umjesto toga
nekada se koristi nakon transfera da bi se identificirali zaostali proteini (Moore, 2009).

3.4. Imunodetekcija
Imunodetekcija podrazumijeva blokiranje, inkubaciju antitijela i detekciju sa supstratom.
Blokiranje je vaan korak u ovoj fazi, jer sprijeava nespecifino vezivanje antitijela na
blotting membranu. Najee koritene otopine za blokiranje sadre 3-5% albumina goveeg
seruma (BSA) ili nemasno mlijeko u prahu (BLOTTO) u otopini fosfatnog pufera (PBS) ili
otopini TRIS pufera (TBS). esto se dodaje mala koliina Tween20 deterdenta da bi se
reduciralo bojenje pozadine i takav pufer se zove PBST ili TBST.
Nakon blokiranja i pranja, blot se inkubira u diluiranoj otopini antitijela, obino tokom
nekoliko sati na sobnoj temperaturi ili tokom noi na 4 C. Antitijela se diluiraju u puferu
(TBST ili PBST) ili u diluiranoj otopini za blokiranje. Optimalna dilucija datog antitijela sa
odreenim detekcionim sistemom mora se odrediti eksperimentalnim putem. Osjetljiviji
detekcioni sistemi zahtijevaju manje antitijela, to moe smanjiti trokove. Koritenjem manje
koliine antitijela smanjuju se interferencije pozadine.
Western blot pozitivna antitijela obino prepoznaju primarnu sekvencu aminokiselina ciljnog
proteina iz razloga to se denaturacijom narue sve vie strukture proteina. U nekim
sluajevima epitopi pak mogu biti konformacioni stvarajui trodimenzionalnu strukturu koja
e se odrati nakon denaturacije. Takoer, mogue je modificirati pufere kako bi se sauvale
odreene proteinske strukture. Poliklonalna antitijela se sastoje od mijeanog poola
imunoglobulin molekula koje se veu na nekoliko razliitih epitopa koji pripadaju jednom
antigenu. Monoklonalna antitijela se veu za jedan epitop ciljnog antigena. Oni se sastoje od
homogeno kloniranih imunoglobulin molekula. Pored tradicionalnih monoklonalnih i
poliklonalnih antitijela, u upotrebi su i antitijela dobivena genetikim ininjeringom (Moore,
2009).

12

Dodati
antitijela

Dodati
supstrat

Ciljni
protein

Slika 5. Pregled imunodetekcije. Western blot se blokira, inkubira sa antitijelima, tretira sa

supstratom kako bi ciljni protein postao vidljiv. Provode se i koraci ispiranja kako bi se uklonio
nevezani materijal i minimizirali nespecifini signali. Izvor: Moore C (2009) Introduction to Western
Blotting.
Postoje direktne i indirektne detekcione metode. U direktnim, primarno antitijelo koje se
koristi za detekciju antigena markira se sa enzimom ili fluorescentnom bojom. U prolosti su
se radioizotopi najee koristili kao markeri. Ova metoda se ne koristi esto, jer indirektna
ima nekoliko prednosti. Tu se primarno antitijelo dodaje da vee antigen, a zatim se
markirano sekundarno antitijelo usmjerava na primarno antitijelo.
Tabela 1. Komparacija direktne i indirektne metode detekcije.
Direktna metoda

Indirektna metoda

Prednosti:
Bra jer se koristi samo jedno
antitijelo
Nema opasnosti od unaksrsne reakcije
kao kod sekundarnog antitijela

Prednosti:
Sekundarno antitijelo moe
amplificirati signal
Postoji niz dostupnih sekundarnih
antitijela
Jedno sekundarno se moe koristiti sa
vie primarnih antitijela
Markiranje ne smanjuje
imunoreaktivnost primarnog antitijela

Loe strane:
Markiranje bi moglo smanjiti
imunoreaktivnost primarnog antitijela
Markirana primarna antitijela su
skupa
Mala fleksibilnost u izboru primarnog
antitijela
Mala amplifikacija signala

Loe strane:
Moe se javiti vie nespecifinih
signala uslijed vezivanja sekundarnog
antitijela za druge proteine na
membrani.
Potrebni su dodatni koraci u
poreenju sa direktnom metodom

13

Biotin, fluorescentne boje i konjugati enzima kao peroksidaza hrena (HRP) ili alkalna
fosfataza (AP) mogu se koristiti kao markeri. Neke od pogodnih osobina HRP su velika
aktivnost, dobra stabilnost, pristupana cijena to je ini enzimom izbora kod mnogih analiza.
Natrij-azid deaktivira HRP, pa ne smije biti prisutan u otopini za blokiranje, pranje ili
diluiranje. Marker HRP se obino detektira kolorimetrijskim ili hemiluminiscentnim
supstratima. Kolorimetrijski supstrati za HRP stvaraju smee (DAB) ili ljubiasto/crne (4CN,
TMB, NBT/BCIP) trake direktno na povrini blota. Limiti detekcije za kolorimetrijske
supstance su u rasponu nanograma (ng). Napredna hemiluminiscencija (eng, enhanced
chemiluminescence, ECL) detekcija HRP-a je izuzetno osjetljiva i omoguava vizualizaciju
ciljnog proteina na nivou pikograma do femtograma (Moore, 2009).
Hromogeni supstrati predstavljaju najjednostavnije detekcione sisteme, obzirom da
omoguavaju direktnu vizualizaciju. Naalost, ovi supstrati brzo izblijede u toku suenja
blota. Hemiluminiscentni supstrati se razlikuju od ostalih supstrata po tome to je signal
prolazni produkt enzim-supstrat reakcije i postojan je samo dok se odvija reakcija. Upotreba
antitijela konjugiranih sa fluoroforima zahtijeva manje koraka, jer nema koraka razvijanja
supstrata. Iako je protokol krai, ova metoda zahtijeva posebnu opremu. Prednost je i
koritenje vie fluorofora tokom istog eksperimenta (Thermo Scientific, 2013).

Detektibilan
signal
Supstrat

Slika 6. Detekcija sa markiranim antitijelom. Markirano antitijelo se izloi supstratu to stvara

vidljivu traku ili na povrini blota (kolorimetrijski supstrati) ili kao emisiju svjetlosti (ECL supstrati).
Izvor: Moore C (2009) Introduction to Western Blotting.

14

3.5. Analiza podataka i kvantifikacija

U veini sluajeva, trake koje odgovaraju ciljnom proteinu e postati vidljive nakon tretiranja
blota sa supstratom. Njihov identitet se potvruje poreenjem sa molekularnom masom
markera (za veliinu) i sa pozitivnom kontrolom (veliina i signal). Western blot je
semikvantitativna metoda - nudi relativno poreenje nivoa proteina, ali ne i apsolutnu mjeru
specifinog ciljnog proteina u datom eksperimentu. Signal koji nastaje nije linearan, pa se ne
treba koristiti ako se eli dobiti precizna koncentracija datog uzorka. Za tu svrhu je pogodnija
ELISA.
Za objektivne mjere signala koriste se denzitometri. Imaging software se zatim koristi za
poreenje traka detektovanih na Western blotu. ECL signal se moe detektovati i sa CCD
kamerama.
3.6. Primjena Western blottinga
Western blot se koristi u irokom dijapazonu naunih i klinikih disciplina u svrhu
dokazivanja specifinog proteina, evaluaciju ekspresije proteina u stanici, te za monitoring
frakcija proteina tokom preiavanja. esto se koriste u kombinaciji sa drugim detekcionim
tehnikama baziranim na antitijelima, kao to je ELISA ili imunohistohemija. Praktini
primjeri upotrebe obuhvataju: potvrda HIV testa, definitivni test za goveu spongioformnu
encefalopatiju i neke testove za Lyme bolest. Bertoni i sar. (2012), su u svojem istraivanju
pokazali da je Western blotting uinkovit alat u diferencijalnoj dijagnostici tuberkuloze i
parakokidiodomikoze (PCM). Za razliku od pacijenata sa tuberkulozom, svi pacijenti sa PCM
su imali anti-43-kDa komponentu antitijela to se lahko pokazalo pomou ove metode.
Pomou Western blottinga mogu se potvrditi i zoonoze (Haghpanah et al., 2010) ija se
dijagnoza primarno zasniva na imaging tehnikama. Takoer, Western blotting se pokazao
neophodnim uz imuno-testove, kako bi se poboljala dijagnoza bolesti izazvane sa Toxocara
larvama kod pacijenata sa epilepsijom (Zibaei et al., 2013). U istraivanju koje su proveli
Magi i Miliorini (2011) s ciljem da utvrde antitijela preneena od majke i antitijela koja su
novoroenad sama sintetizirala u prva tri mjeseca ivota, Western blotting je bio koristan u
sluajevima gdje klasine seroloke tehnike nisu bile dovoljne. Primjena Western blotting
metode u kombinaciji sa imunohistohemijskim metodama proirila se i na dokazivanje
prisustva virusa u postmortem uzoraka (Neri et al., 2012), zatim za detekciju ekspresije CYP
enzima (Chiu et al., 2012), kao i na validaciju antitijela koja je naroito bitna u razvoju
biomarkera (Signore i Reeder, 2012).
15

4. LITERATURA

Ahmed FE (2002) Detection of genetically modified organisms in foods. Abstract. Trends

Biotechnol 20 (5): 215-23
Alvarez ML, Nourbakhsh M (2011) RNA mapping protocols: Northern blot and amplification
of cDNA ends. Abstract. Methods Mol Biol 700: 199-220. Dostupno na:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21204036

[Pristup vren: Juni 2013]

Bertoni TA, Perenha-Viana MC, Patussi EV, Cardoso RF, Svidzinski TI (2012) Western
blotting is an efficient tool for differential diagnosis of paracoccidioidomycosis and
pulmonary tuberculosis. Abstract. Clin Vaccine Immunol 19 (11): 1887-8
Brown TA (2001) Southern Blotting and Related DNA Detextion Techniques.
ENCYCLOPEDIA OF LIFE SCIENCES / & 2001 Nature Publishing Group/
www.els.net. [Online]

http://www.alliot.fr/BIO/PDF/SouthernBlot-.pdf

[Pristup

vren: Maj 2013]

Chiu KW, Nakano T, Tseng HP, Cheng YF, Jawan B, Eng HL, Goto S, Chen CL (2012)
Western blotting analysis for quantitative detection of CYP2C19 expression in liver
tissues in the setting of living donor liver transplantation. Abstract.
Hepatogastroenterology 59 (115): 805-8
Gao LY, Li GD, Tong TJ (2013) Comparison of Southern blotting and Real-time PCR in
measuring telomere shortening. Abstract. Journal Of Peking University. Health Sciences
[Beijing Da Xue Xue Bao] 18; 45 (2): 297-302

16

Haghpanah B, Mosavat B, Ghayour Z, Oreizi F (2010) Diagnostic value of hydatid cyst

antigens using western blotting method. Jundishapur Journal of Microbiology 3 (4):
175-185
Huang WH, Huang XY, Sun FZ (2010) Modified agarose gel for high-performance Southern
blotting of short DNA fragments. Abtsract. Biotechniques 49 (2): 580-1
Keren I, Abudraham S, Shahya F, Ostersetzer-Biran O (2011) An optimized method for the
analysis of plant mitochondria RNAs by Northern-blotting. Endocytobiosis & Cell
Research. 21: 34-42
Khraiwesh B (2012) Use of Northern blotting for specific detection of small RNA molecules
in transgenic plants. Abstract. Methods Mol Biol 847: 25-32
Magi B, Migliorini L (2011) Western blotting for the diagnosis of congenital toxoplasmosis.
Abstract. New Microbiol 34 (1): 93-5
Mellars G, Gomez K (2011) Mutation detection by Southern blotting. Abstract. Methods Mol
Biol 688: 281-91
Moore C (2009) Introduction to Western Blotting. [Online]
http://www.funakoshi.co.jp/download/catalog/ABD4309.pdf

[Pristup vren: Maj

2013]
Morgan IM, Taylor ER (2005) Detection and quantitation of HPV DNA replication by
Southern blotting and real-time PCR. Abstract. Methods Mol Med 119: 349-62
Neri M, Othman SM, Cantatore S, De Carlo D, Pomara C, Riezzo I, Turillazzi E, Fineschi V
(2012) Sudden infant death in an 8-month-old baby with dengue virus infection:
searching for virus in postmortem tissues by immunohistochemistry and Western
blotting. Abstract. Pediatr Infect Dis J 31 (8): 878-80
17

Schlickeiser S, Pleyer U (2007) Western, Northern and Southern Blotting.

Basic Science Techniques in Clinical Practice, Springer London, pp 48-57
Signore M, Reeder KA (2012) Antibody validation by Western blotting. Abstract. Methods
Mol Biol 823: 139-55
Trayhurn P (1996) Northern blotting. Proceedings of the Nutrition Society. 55 (1B): 583-589
Varallyay E, Burgyan J, Havelda Z (2008) MicroRNA detection by northern blotting using
locked nucleic acid probes. Abstract. Nat Protoc 3 (2): 190-6
Zibaei M, Firoozeh F, Bahrami P, Sadjjadi SM (2013) Investigation of anti-Toxocara
antibodies in epileptic patients and comparison of two methods: ELISA and Western
blotting. Abstract. Epilepsy Res Treat (2013): 156815 (dostupno online na:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3654325/ ) [Pristup vren: Juni
2013]
An Overview of Northern and Southern Blotting. [Online]
https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/overview-northern-andsouthern-blotting

[Pristup vren: Maj 2013]

Thermo Scientific. Overview of Western Blotting. [Online]

http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=8259A7B6-7DA6-41CF-9D55AA6C14F31193
UNC

School

of

[Pristup vren: Maj 2013]

Medicine.

UNIT

10:

NORTHERN

BLOTTING.

[Online]

http://www.med.unc.edu/wrkunits/3ctrpgm/pmbb/mbt/NEWNORTH.htm

[Pristup

vren: Maj 2013]

18