Professional Documents
Culture Documents
Penentuan Jumlah Sel Mikroorganisme
Penentuan Jumlah Sel Mikroorganisme
%T
1:1
98,9
0,004803708
1:2
95,9
0,018181393
1:4
93,833333
0,027642856
1:8
95,167777
0,021515142
1:16
93,433333
0,029498257
Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS
SEL/
1
2
3
B
12
8
7
C
9
7
6
JUMLAH
22,2
3
D
6
7
5
TOTAL
KOTAK
38
36
37
7,6
7,2
7,4
22,2
E
5
5
10
Jumlah sel ragi = 7,4 sel / kotak x 25 kotak / mm2 = 185 sel / mm2
= 185 sel / mm2 x 10 mm2 / mm3 = 1850 sel / mm3
Jadi jumlah sel ragi pada pengenceran 10.000 kali :
= 1850 sel / mm3 x 1000 mm3 / ml sampel
= 1.850.000 sel / ml sampel
Tabel II.2.2 Data Pengamatan Pengenceran 100.000 kali
KOTAK
SEL/
RU
N
1
2
3
2
2
3
5
4
1
C
5
3
6
JUMLAH
4
2
6
6
1
3
TOTAL
KOTAK
22
12
17
4,4
2,4
3,4
10.2
10,2
3
= 3,4 sel / kotak
Jumlah sel ragi = 3,4 sel / kotak x 25 kotak / mm2 = 85 sel / mm2
= 85 sel / mm2 x 10 mm2 / mm3 = 850 sel / mm3
Jadi jumlah sel ragi pada pengenceran 100.000 kali :
= 850 sel / mm3 x 1000 mm3 / ml sampel
= 850.000 sel / ml sampel
Tabel II.2.3 Data Pengamatan Pengenceran 1.000.000 kali
KOTAK
SEL/
RU
N
TOTAL
A
Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS
KOTAK
2
0
1
0
2
2
1
3
0
JUMLAH
2,8
3
1
0
0
0
1
1
4
6
4
0,8
1,2
0,8
2,8
Jumlah sel ragi = 0,933333 sel / kotak x 25 kotak / mm2 = 23,33333 sel / mm2
= 23,33333 sel / mm2 x 10 mm2 / mm3 = 233,3333 sel / mm3
Jadi jumlah sel ragi pada pengenceran 1.000.000 kali :
= 233,3333 sel / mm3 x 1000 mm3 / ml sampel
= 233.333,33 sel / ml sampel
III.
Pembahasan
(Schlegel, 1994)
Metode ini menggunakan alat spektrofotometer untuk mengetahui intensitas kekeruhan suatu
suspensi sel. Spektrofotometer adalah suatu instrumen yang digunakan untuk mengukur transmitans
atau absorbans suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang.
(Underwood, 2002)
Prinsip utama metode turbidimetri adalah bahwa ketika seberkas cahaya ditransmisikan pada
suatu sampel berisi mikroorganisme maka sampel tersebut akan memancarkan cahaya tersebut. Di
mana cahaya tersebut akan diserap oleh mikroorganisme yang berada dalam sampel, hal ini disebut
dengan absorbansi. Sedangkan untuk %T (transmittan persen) adalah persen fraksi cahaya masuk
yang diteruskan oleh sampel. Semakin banyak mikroorganisme yang terkandung dalam suatu
sampel maka cahaya yang diteruskan akan semakin sedikit. Setidaknya dibutuhkan lebih dari
100.000.000 sel per mililiter agar kekeruhan suatu sampel dapat teramati dengan baik. Sekitar 10
juta 100 juta sel per mililiter sampel dibutuhkan untuk membuat suatu suspensi cukup keruh agar
dapat dibaca oleh spektrofotometer. Oleh karena itu kekurangan metode ini adalah tidak bisa
Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS
(Underwood, 2002)
Panjang gelombang yang dipasang pada 686 nm karena 686 nm adalah panjang gelombang
maksimum untuk pembacaan secara empiris. Kemudian langkah selanjutnya adalah menyiapkan 2
kuvet yang masing-masing untuk blanko dan suspensi. Untuk blanko, kuvet diisi dengan media NB
cair. Hal ini dikarenakan media yang digunakan pada suspensi bakteri adalah NB cair. Kedua
blanko ini digunakan untuk mengkalibrasi spektrofotometer. Kalibrasi bertujuan untuk memeriksa
ketepatan dari sumber cahaya. Proses ini sangat penting untuk memastikan bahwa spektrofotometer
berfungsi
dengan
baik
dan
pengukurannya
sudah
benar.
Setelah
mengkalibrasi
alat
spektrofotometer, tiap larutan pada kelima tabung diukur persen transmittannya. Setiap pergantian
larutan suspensi dengan tingkat pengenceran yang berbeda harus selalu melakukan kalibrasi.
(Underwood, 2002)
Media yang digunakan dalam percobaan ini adalah NB (Nutrien Broth) cair. NB (Nutrient
Broth) merupakan suatu ekstrak cair jaringan daging sapi yang empuk, dikonsentrasikan menjadi
pasta. Kandungan dalam NB ini adalah substansi jaringan hewan yang dapat larut dalam air,
meliputi karbohidrat, senyawa nitrogen organik, vitamin yang larut dalam air, dan garam-garaman
yang baik bagi untuk berkembangbiaknya bakteri.
(Pelczar, 1986)
berlabel 1:2 sehingga volumenya menjadi 8 ml dan mengocok tabung reaksi hingga
tercampur rata. Sisanya dibiarkan tetap berada di dalam tabung berlabel 1:1. Kemudian mengambil
Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS
(Torotora, 2010)
Setelah mendapat seluruh nilai %T, kemudian menghitung nilai OD (Optical Density) pada
masing-masing suspensi. Optical density (OD) adalah jumlah cahaya yang dihamburkan dan diserap
oleh sel dalam suatu larutan. Penurunan rumus OD adalah sebagai berikut:
OD = Absorbansi sampel Absorbansi blangko
= log 1/(%T) sampel - log 1/(%T) blanko
Dimana %T = T/100 , maka:
OD = log 1/(T100) log 1/(100100)
= log 100/T 0
= log 100 log T
= 2 log% T
Sehingga nilai OD didapatkan sebagai:
OD = 2 log %T
(Malhotra, 2003)
Setelah mendapatkan nilai OD, langkah selanjutnya adalah membuat grafik antara nilai OD vs
Faktor Pengenceran sehingga didapatkan grafik berikut:
Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS
Optical Density
6
4
2
0
0
10
12
Faktor Pengenceran
Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS
(Tortora, 2010)
Tetapi terjadi pengecualian pada faktor pengenceran 1:4 dimana nilai %T yang diperoleh lebih
besar daripada nilai %T pada pengenceran 1:8 yang menyebabkan nilai optical densitynya menjadi
lebih kecil. Hal iini terjadi karena kurang teliti dalam melaksanakan percobaan, yaitu tidak
mengaduk sampel secara merata sebelum dimasukkan ke dalam kuvet sehingga dapat
memungkinkan sedikitnya kandungan bakteri dalam media yang dipindahkan ke dalam kuvet
shingga cahaya yang mencapai detektor lebih besar jumlahnya.
III.2 Metode Counting Chamber
Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mempelajari cara menghitung jumlah sel
mikroorganisme dengan menggunakan metode counting chamber.
Metode Counting Chamber adalah suatu metode perhitungan jumlah sel mikroorganisme
secara langsung dengan menggunakan Petroff Hausser cell counter, atau yang disebut juga
hemasitometer. Hemasitometer ditemukan oleh Louis-Charls Malassez dan terdiri dari kaca
mikroskop yang tipis dengan lekukan persegi panjang sehingga membentuk ruang. Ruang ini
terbentuk dari barisan goresan cahaya dari arah garis tegak lurusnya. Alat ini memiliki luasan yang
dibatasi oleh garis yang diketahui dan kedalaman ruang juga diketahui. Maka dengan ini dapat
dihitung banyak sel atau partikel pada spesifik volume dari suatu cairan sampel, dan menghitung
konsentrasi sel pada cairan. Biasanya alat ini digunakan untuk menghitung konsentrasi dari sel
darah (dari asal kata hemo).
(Tortora, 2010)
Kaca penutup yang diletakkan di atas sampel, tidak mengapung di cairan tetapi ditahan pada
tinggi spesifik biasanya 0,1 mm. Pada metode ini sampel sejumlah beberapa ml diteteskan ke atas
bagian hemasitometer yang berkotak-kotak, kemudian dilihat melalui mikroskop. Kemudian jumlah
sel mikroorganisme pada beberapa kotak yang berbeda dihitung, lalu didapatkan rata-rata jumlah
sel tiap kotak. Kemudian melalui luas tiap kotak, didapatkan jumlah sel mikroorganisme tiap satuan
luas (mm2). Dan dari jumlah sel yang diteteskan, dapat diperoleh jumlah sel mikroorganisme tiap
satuan volume (ml).
Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS
(www.microbehunter.com)
Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS
Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS
10
Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS
11
Apakah hubungan antar Optical Density (OD) dengan jumlah sel pada kultur saudara?
Jawab:
Hubungan antara OD dengan jumlah sel mikroorganisme dapat ditentukan dengan membuat
kurva standar yang menyatakan hubungan antara OD dengan jumlah sel mikroorganisme
tersebut. Kurva standar atau kurva kalibrasi dapat dibuat berdasarkan perhitungan jumlah sel
dengan metode plate counts atau counting chamber. Sedangkan pada percobaan ini,
mikroorganisme yang digunakan pada metode turbidimetri tidak sama dengan mikroorganisme
yang digunakan pada metode counting chamber sehingga kurva standar tidak dapat dibuat dan
perhitungan jumlah sel pada metode turbidimetri tidak dapat dilakukan.
2.
Apakah diperlukan untuk membuat suatu hubungan antara perhitungan jumlah sel
antara
Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS
12
Appendix
1. Metode Turbidimetri
Faktor Pengenceran
1:1
1:2
1:4
1:8
1:16
Pengenceran 1:1
OD
2 log %Tterukur
2 log 98,8
0,004803708
Pengenceran 1:2
OD
2 log %Tterukur
2 log 95,9
0,018181393
Pengenceran 1:4
OD
2 log %Tterukur
2 log 93,83333
0,027642856
Pengenceran 1:8
OD
2 log %Tterukur
2 log 95,16777
0,021515142
Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS
%T
98,9
95,9
93.83333
95,16777
93,43333
13
2 log %Tterukur
2 log 93,43333
0,02948157
Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS
14
Laboratorium Mikrobiologi
Jurusan Teknik Kimia FTI-ITS