Desteador ‘evel (netv0 Most FIGURA 1.12° Estructura del microscopio confocal y diagrama dol trayecto de los rayos. La fuente lminosa del isroscopio con= focal eS un generadcr laser. El haz léser (inea rola) que se crige ‘hacia la muosta de todo pr moro alraviesa un separador de haces. erole> y luego pasa por dos espejos Ue amido movies; eos ‘espejos barren el haz laser por la muestra en las coordenadas xe y. Por dito, el haz léser entra en cl microscopy atravioca cu cicto- rma oprico para uminar a muestra de todo que Se desea exarinat. La uz emitda por a muestra de tejdo uminada (linea azul relorna, por el sistema éptico del miseescopio, paca por ambot o=pojcs do. Darro, aravissa el separador de haces y se enioca en el ofiico puniforme. La luz que atraviesa este orci es captada yregistraca or el diapostive detector conectndo a un ordenador quo forma la Imagen, un pice ala vez. pal entre un microscopio convencional y uno confocal es la adi Cin de una apertura de detector (orifcio puntiforme! que est en corjuncién con el punto focal de la lente: por lo tanto es con- focal Face officio de posicién precisa slo permite que pase la luz “en fo.0" havia cl imetir del disposicivo fotomuliplcadoe (detector), mientras que la Inv “hea de foc” tiene blaqueado el paso hacia, dltctor (Fig. 1.11) Este sistema tiene la eapacidad de obtener una resolucidn (0.2 2 0.5 jim) y una claridad excepcionales de un core fino de una muestra biol plemente por eliza la he fuera ce foco. Fl sistema de iminaciin lise que uriliza es fuerte mente convergent yen consecuenca,preduce una lz exitlora de gran inensiad onl fer de un pin deharr rm ficial. Un sistema de espejos mueve el haz iser soe l ‘manera cue se ilumine un solo puntoa a vee (Fig. 1.12). Se explo- ran muchos puros individuals en el mismo plano foal yan pros ¢grama informitico reconscruye la imagen a partir de los datos regis. ttados durante a exploracién. En este aspecto, la microscopia con- focal se parece ala comografia axial computaizada (TAC). Por otra pare. al usr s6lo la profundidad escasa de la imagen en {aco es posible crear imagencs miitipks de distinas profundidades, dela musstra Literalmente se puede as disecar capa por capa todo cl espesor de la muestra, Tambien es posisle utilizar el ordenador para hacer reconstruecionestridimensionaes de una serie de excas imagenes. Dado que cada imagen individual de profundidades cespeciica dentio dela muestra es my nitida, a imagen tridimen- sional resuleaate tiene iguses earscreristicas de nitidez, Ademis, 9778 miembros ura ver que el ordenador ha armado cada una de las imégenes de Jos cores la reconstruccién tridimensional puede rorase y verse desde cualquier anguio que se dese (véase la Fig. 1.4), icrocopio de luz ultravioleta utiliza lentes de cuarzo con tuna fuente de luz ultraviole. Laimagen en el microseopio de lux ultravioleta (UV) depen- ddede la absorcién dela luz UV por ls mokeulas dela nuesis. Lt fuente UV tiene une longitud de onda aproximada de 200 nm, por lo que este microscopio puede alcanzar una resohuciba de 0.1 jum. En principio, a microscopia UV tiene un funcionamien- (0 semejante al de un espectrofotémetro, pero los resultados se regstrn en una placa forogrifea La muestra no puede inspeccio- narse directamente a través de un ocular porque la luz. UV no es visible yksiona al ojo. La microscopia de luz UV es ul para detecar cidos nucleicos; cen especial, las purinasy ls pirimiinas, que son la bases nitoge- rads de los nuclestides. Tambien es de uilidad para detecta las poteinas que contienen ciertesarrinoicidos. Mediante el wo de luna iluminacién con longitudes de onda espeifices es comiin que, ‘a través del microscopio UV, realicen procedimientos xpectofo- tométricos para determinar cuamttativamente el DNA y el RNA cen células indviduales. Como se describe en el Recuadro 1.2 de la pigina 7, a microespectroforometria de Feulgen se utlira en clinica para cvaluar ef grado de ploidia (ruitiplos de le canti dad normal de DNA) en los cortes de tumores. El microscopio de polarizacién tiene su fundamento en el hecho de que las moléculas o fos conjuntos de moléculas muy bien ordenados pueden rotarel Angulo del plano en que vibra la luz polarizada. El microscopio de polarizacién o de luz polarizada es una simple modificacin del misroscopio dptico de campo claro en la ‘cual un filto de polarizacién, lamado polarizador, secoloca entre fa fuente luminosa y Ix muestra, y un seguado filtro, lamado el analizador, se instala entre a lene objetivo y el observador. “Tamo el pelarizador eomo el anaizador pueden rota; la dife- rencia entre sus angulos de rtacion se uriliza para determinar grado en el que una estructura afecta el haz de haz poarizada. Lz epecidad de los crises o de las sustancias paracrisclinas de rotar cl plaro de la liz polarizada reibe el nombre de birrefringencia (cefiaccdn debe) EL misctloesriado ys incusiones cristaloides cn las edlulas intersicales (de Leydig) del resticulo, entre otras cestructurascomunes, exh ben birteffingencia, Microscopia electrénica Hay dos tipos de microscopios electénicos que proporcionan datos morfologicos y analiticos Ge células y tides: el microscopio cleccrénico de tansmisién (MET) y el microscopio elecnico de bartido (MEB). El adelanco principal dele microscopiaelectrnica respec de a microscopia 6ptca es quela longitu de onda del haz de eectrones es unas 2.UOO veces menor que la del har de luz, con, Je que aumerta la rsolucién por un factor de 10%, EI MET uniliza la internecién de un haz de electrones con la ‘muestra para producir una imagen. La “éptica” del MET es, en principio, similar ala del microsco- po dptico (wéace la Fig, 1.9), excepto que el microscopio elec code transmision urliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz. » Estudiantes de Medicina FMED UBA +1 Unirse al grupoHl principio del microscopio es el siguiente: ‘© Una fuente (cétodo, canén de electrones) como es un fil mento de rungxteno calentado que emiteeleetrones. 1 Los electrones son atraidos hacia un &nodo, '¢ Una diferencia elécria ene cl cicodo y lsnodo impart alos clectrones un voltae ce aceleracién de entre 20.000 y 200.000 voltios, con lo que se genera un haz de electrones. (¢ Ese har de ectroresatravisa lusgo una sere de lentes elec- ‘tromagnéticas que cumplen la misma funcida cue las lenses de «risal de un mictoscopio dptico. La lente condensador da forma al har de electrones que alcanaa el plano de la muestra y eambia su diimsuo. Entonces, haz que ha atravesado ly muestra es enfocado y aumen-ado por una Fente objetivo para después volver ase auinentado por una Lente proyector 0 mis. La imagen final e mira en una pantalla Fosfor rescente o se captura en una placa fotogrifica. Las pares de ka muestra que han sido atravesida por los electrones apareren elae 1s; las partes que han absorbido y dspersado los electrones a causa Ge su densdad inherente 6 de a adicion de metals pesados duran- thy prepuation apereven escuras. Con fiecuencia por arta Cebajo de a pantllsvsorasecoloca un detector de eleeanes con ten receptor sensible a la luz, como puede ser un dispositive aco- plado a cargas (CCD), pars ver la imagen en tiempo teal en un ‘monitor. Eto permite archiva sin compsicaciones ls imagenes 0 dos videos en formato digi en ordenador, La preparacién de las muestras para la microscopia electr6- nica de transmisién es similar a la de la microscopia éptica, excepto por la newssidad de médos mas refinados. incipics uliados ex ls preparacién de los cores para su examen con el MET sor, en esenca, los mismos que los que son vilidos para la microscopia dptica, peo com la este in aio e que, en cada paso, se debe trabajar con mucstras 3 a 4 veces rmenores © mas delgadas que las habitual para la microscopia para subiro bajar la muestra de modo que el hxz lier te cer treend diodo, Conforme la pia se hunce en una depresién edis- positive piczoeléeico ceva la muestra para compensa, y cuando Ja pti eleva sobre una eminencia el dspositivo compensa bajan- do ls muesira. La eorrience hicia el dispostivo piesoelécrico se cempreta como el eje & que junto con Tos ejes xe y presenta la topografa de la maestra con una resolucién molecular y «veces, andrrica (Fig 1.14) Una vertaja principal del MFA para ol examen de las ues tras biologicas es que, a diferencia ée los instruments épricos de aka resolucién (p. ej MET 9 MEB), la mucstra no necesita estaren el vacio; incluso, puede estar en agua. Por consiguiente, «es posible obtener imagenes de celulas viva y de su medio ci cundante. 41 Unirse al grupo » Estudiantes de Medicina FMED UBAFIGURA 1.13 * Diagrama del microscoplo de fuerza atémica (MFA). Una pia muy fina en un voladize © soporie mévil se desplaza ‘sobre ura superficie de una muesta bioligica. El mecarismo de retrocontral provisto por los expioradores piezoelécricos permite que la [lia 8@ mantenga con una fuerza cons'ante sobre la superficie da la munstra. La pia sa axtiande hacia abajo dase a extramo de un ‘soporte rellector ce laser. Sotre el soports esta enfocado un haz léser. A medida que la pia explora la superficie de la muestra, sutien- {00 y bajando por el contorna de la supertcie, el haz laser so desvia dasde el soporte hacia un fotodindD El fotociodo mice los cambics fen Ins intensilades dei ha? ldser y luego conv arta esta informacion en una cortienta eléctrica. Un ordenador o computariera procesa la Infomacién recuperada desde el fotodiodo para lormar una imagen de la superice y también para ragular el explcrador piezoeléctico. En el modo de contacto (detale de la izquie'da) as fuerzas electrostaicas o de tension supericial arastran la pua exoloradora sobre la “suparfcie de la muestra. En ol mado de percusicn {detalle de la cerecha) la pia del soperte oscia. Este Utimo modo permite ol estudio de muestras bandas y fragies al mismo tempo que consigue una alta resclucien FICURA 1.14 © imagen to mieroscoplo de fuerza atémica de una motéeula de DNA ingivicual. Esta imagen se obtwo en el modo de contacto, en el cual la pia exploradora sube y baja des- plazada por las anfactuosidedes del "erro enorme 9 mueve hacia adelante y hacia atras sobte la superice dela mussia La muestra esta colocada sotre una supercie de mica ulvatsa. Una meléclaincviul de ONA produce ura eminence sufcente para Ser deteciaca con ‘acidad. Los engrosamentos alo Lago do la meléeula de ONA sor causados por las protenas unidas a ofa y estos exgrosamientos produces Un movimiento ain mayor do la pia exoleradora El campo de exploracion mide 540 1m por 540 nm, La longtud do la moléesla co DNA orca entre O'y 40 fun, 185.00 >. (Gentes Ue a declora Gabrsla Bayordo, JPK Instruments AG, Satin, Alemaria) a Estudiantes de Medicina FMED UBA 9778 miembros