Professional Documents
Culture Documents
Validacija Analitičkih Metoda PDF
Validacija Analitičkih Metoda PDF
Validacija Analitičkih Metoda PDF
Validacija analitikih
metoda osnovna naela
Katica Lazari A nalitike metode trebaju biti validirane kako bi se osigurala pouzdanost
i tonost analitikih podataka. Tako kae regulativa koja to i zahtijeva
zadnjih dvadesetak godina. Slau se i analitiari koji su temeljna naela vali-
dacije metoda primjenjivali i puno prije pojave regulative jer je to jednostav-
no sastavni dio struke. U meuvremenu objavljeno je puno radova, lanaka,
osvrta, provedeno bezbroj razliitih eksperimenata. U nekim su laboratoriji-
ma validacije metoda postale rutina, dok se u drugima one tek poinju pro-
voditi. U ovome e lanku biti predstavljene osnovne postavke za validaciju
analitikih metoda nune analitiarima koji poinju, ali i koristan podsjetnik
za one koji su ve uli u rutinu validacija analitikih metoda.
61
Selektivnost je nezaobilazan parametar za validaciju veine kad se oekuju uzorci sa irokim rasponom koncentracija,
metoda. U praksi se dokazuje usporedbom odziva metode na isplati se definirati maksimalno podruje metode.
referencijski materijal i analit u uzorku. Kod kromatografskih Preciznost se odreuje kao izraz slaganja izmeu niza mje-
laboratoriji
metoda, osim usporedbe kromatograma referencijskog ma- renja izvedenih iz istog homogenog uzorka pod propisa-
terijala i uzorka, potrebno je dokumentirati i parametre koji nim uvjetima. Ovisno o uvjetima u kojima se odreuje ra-
odreuju razdvojenost i simetriju pikova, a kod odreenih zlikujemo:
metoda i prikupiti dokaze o istoi pikova.
preciznost pod uvjetima ponovljivosti ili ponovljivost
Linearnost je odreena kao mogunost metode da unutar pri emu uvjeti ukljuuju jedan laboratorij, istog ana-
odreenog podruja daje ispitne rezultate proporcionalne litiara, istu aparaturu, kratko razdoblje.
koncentraciji analita u uzorku.
meupreciznost preciznost koja se ostvaruje unutar
U praksi se linearnost odreuje mjerenjem odziva metode na istog laboratorija u duljem razdoblju uz oekivane
razliite poznate koncentracije referencijskog materijala (pre- promjene nekih uvjeta (razliiti analitiari, instru-
poruuje se najmanje pet koncentracijskih razina uz tri ponav- menti, kolonereagensi iz razliitih boca i razliitih do-
ljanja). Procjenjuje se matematiki i grafiki. Matematiki se bavljaa).
preko linearne regresije izrazi jednadba pravca (y = ax + b) i
izrauna koeficijent korelacije (k). Nagib pravca (a) parametar Preciznost pod uvjetima obnovljivosti ili obnovljivost promjen-
je koji izravno ukazuje na osjetljivost metode. Odsjeak pravca ljivi uvjeti ukljuuju razliite laboratorije. Taj se parametar
(b) moe ukazivati na sustavnu pogreku. Za koeficijent kore- odreuje u svrhu normiranja metode i rijetko je sastavni dio
lacije uobiajeno se postavlja kriterij k 0,99. Za vrlo niske validacije koju provodi sm laboratorij. Eksperimentima pre-
koncentracije prihvaa se i kriterij k 0,98. Grafiki prikazi ciznosti kvantificiraju se sluajne pogreke metode, a nume-
ovisnosti signala o koncentraciji analita vani su zbog mogu- riki je pokazatelj standardna devijacija, koeficijent varijacije
nosti vizualnog nadzora. Najee se upotrebljavaju dva naina ili varijanca. Kod eksperimenata meupreciznosti iznimno je
grafikog prikaza: vano mjerenja koja se ponavljaju provoditi u uvjetima koji
su to sliniji onima pri rutinskoj uporabi metode. U sluaju
Grafiki prikaz odstupanja od regresijskog pravca pre- rezultata koji ne zadovoljavaju treba otkriti najvaniji izvor
ma koncentraciji ili logaritmu koncentracije za line- pogreke i pokuati ga ukloniti.
arna podruja odstupanja jednoliko rasporeena izme-
u pozitivnih i negativnih vrijednosti (slika 1a). Vano je naglasiti da se eksperimenti preciznosti rade na ho-
mogenom autentinom uzorku, odnosno umjetno pripre-
Grafiki prikaz relativnih signala (omjer signala i odgo- mljenom uzorku, a postupak se ponavlja prema propisu u
varajue koncentracije) na osi y i odgovarajuih kon- metodi upravo onako kako e se ubudue raditi u praksi. Broj
centracija na osi x log skale. Dobivena linija treba biti ponavljanja treba zadovoljiti zahtjeve statistike. Najee se
vodoravna u cijelome linearnom podruju, a podruje radi po tri ponavljanja na nekoliko koncentracijskih razina
linearnosti prestaje pri koncentracijama gdje linija re- koji se, naravno, poklapaju s podrujem linearnosti. Kriteri-
lativnog odziva sijee paralelne linije koje odgovaraju ji prihvatljivosti ovise o vrsti analize, matrici uzorka i koncen-
95 postotnoj ili 105 postotnoj koncentraciji (slika 1b). traciji analita koji se odreuje.
Podruje je raspon izmeu gornje i donje koncentracijske Istinitost metode definira se kao stupanj podudaranja iz-
granice analita (granice su ukljuene) u uzorku koje se meu stvarne, tj. prihvaene referencijske vrijednosti, i
mogu kvantificirati uz odgovarajuu preciznost, istinitost srednje vrijednosti dobivene primijenjenim postupkom
i linearnost. Za odreivanje tog parametra nije potrebno odreeni broj puta. Numeriki pokazatelj istinitosti ekspe-
provoditi zasebne eksperimente, nego se zakljuci izvode iz rimentalno je utvreno sustavno odstupanje (eng. bias) me-
studije linearnosti. tode, dobiven je kao razlika aritmetike sredine rezultata i
U puno sluajeva podruje je odreeno svrhom metode i ne- referencijske vrijednosti ili kao njihov odnos, to se posebno
ma potrebe za ispitivanjem krajnjih mogunosti metode. Na- primjenjuje kod odreivanja iskoritenja. Eksperimenti se
protiv, suavanjem podruja na koncentracijski raspon uzo- provode nakon odreivanja selektivnosti, linearnosti i preci-
raka postiu se bolja tonost i preciznost metode. Meutim, znosti, najmanje tri puta za najmanje tri koncentracijske ra-
detektora / koncentracija
Odziv detektora
Odziv
Koncentracija Logaritam
62
zine rasporeene unutar radnog podruja metode. Raspon Ako se zahtijeva da metoda ima zadanu preciznost na grani-
koncentracija treba odgovarati stvarnom uzorku, ali treba ci kvantifikacije, pripremi se vie uzoraka poznate koncentra-
ukljuiti i koncentraciju na granici kvantifikacije (GK) kada cije u podruju oko mogue granice kvantifikacije, svaki se
laboratoriji
je ona bitna. izmjeri 56 puta i izraunaju se relativne standardne devija-
Istinitost metode mogue je procijeniti na nekoliko naina: cije za svaku koncentraciju. Zatim se grafiki prikae odnos
RSD-a prema koncentraciji i iz grafa odredi koncentracija na
usporedbom rezultata ispitivane metode s rezultatima granici kvantifikacije s tono odreenom preciznou kako
dobivenim uhodanom referencijskom metodom se vidi na 3. slici. U praksi se obino pripremi uzorak tako
analizom uzorka poznate koncentracije, npr. certifici- odreene koncentracije i potvrdi preciznost viekratnim mje-
ranoga referencijskog materijala i usporedbom izmje- renjem.
renih rezultata i certificiranih vrijednosti Parametar granice kvantifikacije iznimno je vaan kod meto-
cijepljenjem matrice ili uzorka poznatom koncentra- da kojima se odreuju analiti u tragovima koji i u vrlo niskim
cijom referencijskog materijala. koncentracijama mogu tetno djelovati na zdravlje ljudi i
Rezultati se mogu prikazati grafiki kao odnos teorijske (oe- okoli.
kivane) vrijednosti prema izmjerenoj koncentraciji, ali obve-
zatno kao srednje iskoritenje. Relativna standardna devija-
cija i ovdje moe posluiti kao pokazatelj preciznosti.
Nekoliko praktinih napomena povezanih s istinitou:
matrica ili uzorak cijepe se dodavanjem (uvagivanjem)
referencijskog materijala na samom poetku postupka
tako da cijepljeni uzorak bude podvrgnut cjeloku-
pnom postupku od pripreme uzorka do mjerenja
iskoritenje ovisi o matrici uzorka, postupku uzorko-
vanja i koncentraciji analita
kod kromatografskog odreivanja vie komponenta
treba odrediti imbenike odziva za svaku kompo-
nentu ako se sve odreuju preko istoga referencijskog Slika 3. Odreivanje granice kvantifikacije sa zadanom preciznou
materijala
Granica detekcije/kvantifikacije najmanja je koliina ana-
lita u uzorku koja se moe detektirati/kvantificirati uz od- Robusnost se odreuje kao mjera otpornosti analitikog
govarajuu preciznost i tonost. Odreuje se razrjeivanjem postupka na male, namjerne promjene radnih uvjeta me-
osnovne otopine. tode.
Procjena moe biti vizualna, s pomou omjera signal/um ili Ispitivanje robusnosti provodi se kako bi se odredilo kako
statistika. Vizualna se procjena moe primijeniti i kod nein- male promjene radnih uvjeta i provedbe metode utjeu na
strumentnih i instrumentnih metoda, uglavnom samo za gra- rezultat analize. Vaan su dio razvoja metode jer pomau ot-
nicu detekcije, a procjenjuje se najmanji signal koji se ned- kriti optimalne uvjete izvedbe metode te upuuju na to to
vojbeno moe prepoznati. Omjer signal/um moe se treba nadzirati. Tijekom eksperimenta mijenjaju se radni
primijeniti samo na analitike postupke s baznom linijom, a uvjeti unutar stvarnih granica i prati kvantitativna promjena
prihvatljivi su omjeri 3 : 1 za granicu detekcije i 10 : 1 za gra- rezultata. Na primjer kod tekuinske kromatografije ispituju
nicu kvantifikacije. Statistiki se granice detekcije i kvantifi- se utjecaji sastava i pH mobilne faze, temperature, protoka te
kacije mogu odrediti na bazi standardne devijacije signala i razliite are ili dobavljai kolona. Stabilnost otopine tako-
nagiba prema jednadbama: GD = 3.3 /a, odnosno Kg = 10 er je tipian parametar ispitivanja robusnosti metode. Ako
s/a pri emu je a nagib, a s standardna devijacija regresijskog promjena nekog radnog uvjeta ne utjee bitno na rezultat,
pravca. kae se da je on u podruju robusnosti metode. Uvjete za ko-
je je utvreno da utjeu na rezultat treba drati pod nadzo-
rom i to jasno naznaiti u opisu metode. Primjeri utjecaja
promjene parametara temperature kolone i pH mobilne faze
prikazani su na 4. slici.
Prema podacima o robusnosti postavljaju se parametri za is-
pitivanje prikladnosti sustava.
Pri provedbi validacije nije potrebno za svaku metodu odre-
diti sve parametre. Njihov odabir ovisi o namjeni metode,
kako to je to prikazano u 1. tablici.
NEPRECIZNO I PRECIZNO ALI PRECIZNO I
NETONO NETONO TONO Razumijevanje znaenja pojedinih parametara i naina na
koji se izvode u laboratoriju, poznavanje znaajka metode i
Slika 2. Prikaz preciznosti i istinitosti regulatornih zahtjeva osnova su za postavljanje kriterija pri-
63
Tablica 1. Validacijski parametri potrebni za validaciju analitikih me-
toda razliitih namjena
Analiza tragova
laboratoriji
Identifikacijski
Sadraj
testovi kvantitativna Limit Test
istinitost ne da ne da
preciznost
ponovljivost ne da ne da
meupreciznost ne da ne da
selektivnost da da da da
GD ne ne da ne
GK ne da ne ne
linearnost ne da ne da
podruje ne da ne da
Prema: ICH Harmonised Tripartite Guideline Validation Of Anal-
4. slika Postojanost metode utjecaj ytical Procedures: Text And Methodology Q2(R1)
temperature kolone i pH mobilne faze
Literatura
[1] The European Community Guidelines: CPMP Committee for Proprietary Medicinal Products (http://
www.eudra.org)
[2] USA Guidelines: US Food and Drug Administration (http://www.fda.gov)
[3] USP (http://www.usp.org)
[4] cGMP (http://www.cgmp.com)
[5] International Committee for Harmonisation (http://www.ich.org) ICH Guidance for Industry Q2(R1)
Validation of Analytical Procedures Methodology
[6] Eurachem (http://www.vtt.fr/ket/eurachem) The Fitness for Purpose of Analytical Methods
[7] AOAC How to Meet ISO 17025 Requirements for Method Verification Prepared by AOAC INTERNATI-
ONAL 481 N. Frederick Ave, Suite 5002007
[8] IUPAC Technical Report: Harmonized Guidelines for Single Laboratory Validation of Methods of Analysis,
Pure Appl. Chem., Vol. 74, No. 5, pp. 835855, 2002
[9] NATA: Technical Note #17 Guidelines for the Validation and Verification of Chemical Test Methods, April
2009
64