Elektrohemijski senzori i biosenzori

Boban Zarkov

Elektrohemijski senzori i biosenzori

Seminarski rad na doktorskim studijama

Fiziki fakultet
Beograd, 2010

SADRAJ
0
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

strana
Uvod 2
Tipovi biosenzora 6
Karakteristike biosenzora 7
Metode imobilizacije 8
Elektrohemijski biosenzori 9
Potenciometrijski pretvarai - pH metar 9
Amperometrijski pretvarai - Klarkova elektroda 15
Konduktometrijski pretvarai 17
Biosenzori prve generacije - membrane 19
Biosenzori druge generacije - medijatori, metalizovne elektrode i polimeri 21
Biosenzori tree generacije - elektrode sa ugraenim enzimima 23
Kalorimetrijski biosenzori 24
Optiki biosenzori 26
Literatura 28

Uvod

1
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

Biosenzori se mogu definisati kao analitiki ureaji koji u sebi ukljuuju bioloki
aktivnu komponentu u bliskom kontaktu sa fiziko-hemijskim pretvaraem i procesorom
elektronskog signala [1]. Izraz biosenzor se esto upotrebljava za detekcione ureaje koji imaju
za cilj da odrede koncentraciju supstance i drugih biolokih parametara od interesa ak i onda
kada ne koriste bioloki sistem direktno. Biosenzori se koriste u irokoj oblasti reavanja
analitikih problema u medicini, zatiti ivotne sredine, proizvodnji hrane, industrijskim
procesima, sigurnosnoj zatiti i vojnoj industriji. Osobine koje ih ine toliko posebnim i
znaajnim u ivotu ljudi su brzina i efikasnost.
Naunik koji je prvi izneo ideju o konceptu biosenzora jeste Profesor Leyland D. Clark,
koji je 1956 godine objavio rad vezan za kiseoninu elektrodu. Oslanjajui se na dugogodinje
iskustvo i veliku elju da proiri oblast telesnih analita koji mogu biti mereni, napravio je
prekretnicu kada je na konferenciji u Amerikoj akademiji nauka u Nju Jorku 1962 godine
objasnio kako je mogue napraviti elektrohemijske senzore dodavanjem enzimskih pretvaraa
umetnutih izmeu dve membrane. Koncept je izveden na eksperimentu u kojem je glukozna
oksidaza bila umetnuta i fiksirana na Klarkovu kiseoninu elektrodu korienjem membrana za
dijalizu. Smanjenje merene koncentracije kiseonika bilo je prorporcionalno poveanju
koncentracije glukoze u uzorku.
Kontinualno merenje laboratorijski nepripremljenih uzorka i produkata je bitno u
kontroli biohemijskog procesa. Odnedavno mnogi biosenzori imaju razvijene i obezbeene
metode za brzo i kontinualano merenje razliitih komponenti. Biosenzor je opte gledano
enzim ili elija kojoj je onemogueno kretanje a koja u kombinaciji sa pretvaraem omoguava
praenje promena parametara mikrookoline. Sam senzor je obino potopljen u tenost i on je u
direktnom kontaktu sa procesom. Biosenzor (slika 1) se sastoji od:

1) bioloki aktivne komponente (enzim, antitelo, elija ...)

2) sistemom koji onemoguava kretanje biolokog sistema
3) pretvaraa (eng. Transducer) koji ima sposobnost da uoenu fiziku ili hemijsku promenu
prevede u signal pogodan za obradu
4) ureaja za obradu elektronskog signala

2
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

Slika 1. Shema biosenzora

U blizini odreenog molekula bioloki sistem menja okruenje koju osetljiv merni
ureaj registruje kao promenu i alje u signal. Takav signal se dalje moe konvertovati u neki
pogodan merni parametar. Biosenzori su specifini jer koriste sistem imobilizacije i
omoguavaju naprednu neprekidnu kontrolu merenja.
Bioelementi koji se koriste u biosenzorima su najee enzimi i antitela mada mogu biti
i mikroorganizmi, organele, elije, tkiva itd. Veliki molekuli proteina koji ubrzavaju hemijske
reakcije i do nekoliko miliona puta i iz nje izlaze hemijski nepromenjeni nazivaju se enzimi.
Osnovna ideja upotrebe enzima kod senzora jeste da se na enzim poveu molekuli reakcije na
koju enzim deluje. Tom prilikom se stvara kompleks sastavljen od enzima i molekula reakcije
koji nije dugoroan i iz te interakcije dobijamo sada nove produkte reakcije koje moemo
meriti dok enzim izlazi iz reakcije potpuno nepromenjen (slika 2).

Slika 2. Grafiki prikaz interakcije enzima i molekula

U metabolizmu ivih bia enzimi razgrauju hranu, sintetiu hemijske supstance

potrebne za normalano funkcionisanje organizma, vre reciklau razgraujui enzime koji vie
nisu potrebni itd. Enzimi se takoe svakodnevno koriste u proizvodima kao to su deterdenti
za sudove, ve i razne druge kune hemikalije. Do danas je poznato preko 5000 enzima.
Nomenklatura enzima nam pomae pri imenovanju ovog velikog broja enzima i po njoj
enzimima se daje ime koje se zavrava sa -za a prefiks je hemijska stupstanca koja
transformie, odnosno na koju enzim utie.
Da bi neki enzim mogao pretvoriti supstancu A u supstancu B a nikada u supstancu C
on mora biti u stanju detektovati razliku atomske strukture molekula do na jedan atom. Enzimi
se mogu koristiti u istom obliku ali mogu biti prisutni i u mikroorganizmima ili biljnom
3
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

materijalu bez prethodnog izolovanja. Aktivnost mnogih enzima ukljuuje oksido redukcione
reakcije koje mogu biti detektovane elektrohemijskim pretvaraima. Postoji pet glavnih klasa
enzima koje emo samo nabrojati. To su oksidoreduktaze, transferaze, hidrolaze, liaze i
izomeraze. Prednosti enzima sastoje se u tome to se veoma lako veu za odgovarajui supstrat,
to su visoko selektivni i to imaju katalitiku aktivnost (brzo se aktiviraju). Mane enzima
ogledaju se u gubljenu aktivnosti posle relativno kratkog vremenskog perioda i za vreme
imobilizacije na pretvarau. Jedna od mane jeste i njihova visoka cena kotanja.
Druga po upotrebi familija biomolekula jesu antitela. Antitela su proteini iz grupe
imunoglobulina koje sintetiu B-limfociti kao odgovor na prisustvo stranog tela u organizmu
kao to su virusi, bakterije, implanti i slino. Za razliku od enzima, antitela ne kataliziraju
hemijske reakcije ve im je uloga da odreen strani materijal obelee, vrsto vezujui se za njih
i na taj nain svojom selektivnou jasno pokau imunolokom sistemu koji antigen treba da
bude napadnut i uniten. U praksi ako je antigen prisutan u uzorku, on e biti obavijen
antitelom u formi velikog antigen-antitelo kompleksa. To dovodi do promene fiziko-hemijskih
parametara (mase ili optikog parametra) u okolini povrine pretvaraa to se manifestuje
detektovanjem signala. Prednosti antitela su visoka selektivnost i osetljivost kao i veoma
snano vezivanje za antigen. Jedina mana im je to nemaju katalitiki efekat.
Vrlo esto koritena metoda za poboljanje selektivnosti jeste prepoznavanje oblika
molekula merene veliine (eng. Shape-specific recognition). Takava metoda se obino koristi
kod biosenzora koji tako bivaju osetljiviji na odreene molekularne strukture. Prepoznavanje se
potpomae filterom (slika 3) koji proputa samo odreene molekularne strukture tako da
olakava aktivnom senzoru interakciju sa eljenom merenom veliinom.

4
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

Slika 3. Prepoznavanje oblika

Upotreba elementa za bioloko prepoznavanje je jedna od osnovnih razlika u

unutranjoj strukturi funkcionisanja biosenzora i ostalih hemijskih senzora. Element koji vri
prepoznavanje izuzetno dobro prepoznaje molekule koje elimo meriti i to na principu
molekularne strukture. Primarna merena veliina povezuje se sa svojim parom koji ima
komplementarnu strukturu. Nakon toga se merenje svodi ili na merenje koncentracije
novostvorenih parova (eng. Bio-affinity recognition) ili novo stvoreni parovi izazivaju neke od
hemijskih reakcija iji e nusprodukti postati predmet merenja (eng. Biometabolic recognition).
Selektivnost se unapreuje i koritenjem odgovarajuih enzima ili katalizatora. Njihova uloga
je u smanjenju tzv. aktivacione energije, energije potrebne za indukovanje hemijske reakcije. U
praksi to znai da e senzor imati mnogo krae vreme odziva to je vrlo traena karakteristika
senzora.

Prema principu detektovanja odreene veliine senzore je mogue klasifikovati na tri tipa:

Fizike senzore za merenje daljine, mase, temperature, pritiska

Hemijske senzore koji mere hemijske supstance hemijskim ili fizikim odzivom
Biosenzore koji mere hemijske supstance koristei bioloke detektujue elemente

Tipovi biosenzora

ovek poseduje najmanje pet senzora (nos, jezik, ui, oi, prsti) [2]. Oni predstavljaju
glavne tipove senzora. U laboratoriji jedan od najpoznatijih tipova senzora jeste lakmus papir,
tester za koncentraciju kiseline odnosno koncentraciju baze koji nam moe dati kvalitativnu
indikaciju o prisutnosti ili odsutnosti kiseline. Mnogo precizniji metod za prikaz stepena
kiselosti je merenje pH pomou pH metra. To je elektrohemijski ureaj koji daje elektrini
odziv koji se moe oitati analogno preko kretnog kalema ili digitalno preko displeja.
Prema nainu detektovanja koncentracije analita od interesa senzore moemo podeliti
na dva tipa. Prvi su enzim-metaboliki biosenzori koji u sebi ukljuuju upotrebu enzimskih i
elijskih elektroda. U reakciji supstrata sa enzimom dolazi do supstrat enzimskog komplaksa
koji kao rezultat vraa enzim u izvornom obliku i produkte koji su proizvod reakcija. Kod
5
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

ovakvog tipa biosenzora meri se odnos potronje substrata i osloboenih proizvoda to se dalje
prevodi u kvantifikovani signal. Drugi tip predstavljaju tzv. bioafinitetni senzori koji se baziraju
na interakcijama vezivanja imobilizovanih biomolekula i analita od interesa. Bitna
karakteristika ovakvog tipa biosenzora je visoka selektivnost interakcija (slika 4). Primeri
obuhvataju antitelo-antigen interakcije, nukleinske kiseline za komplementarne sekvence i
lektin za eer.

Slika 4. Visoka selektivnost bioafinitetnih senzora

U Tabeli 1 prikazani su najee korieni principi detekcije. U desnoj koloni tablice

dati su i tipini predstavnici za svaki princip.

Princip Merenje (fizika veliina) Tipian senzor (detektor)

Konduktometrin Otpor Tanko oksidni gasni senzor
i
Potenciometrijski Napon Jon selektivni FET za pH
Kapacitivni Kapacitet Polimerni senzor vlage
Amperometrijski Struja Elektrohemijska elija
Kalorimetrijski Toplota / Temperatura Pelistorni gasni senzor
Gravimetrijski Masa Piezo elektrini ili SAW
senzor
Optiki Duina putanje / Infra crveni detektor za

6
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

apsorpcija metan
Rezonantni Uestanost Povrinski plazmon
Fluorescentni Intenzitet Fiber

Tabela 1. Najee koriteni principi detekcije kod biohemijskih senzora

Karakteristike biosenzora

Osobine biosenzora se mogu opisati raznim parametara. Adekvatnim odabirom

parametara moemo izabrati eljeni biosenzor koji u potpunosti ispunjava potrebne zahteve.
Glavne karakteristike biosenzora najee se mogu opisati navedenim parametrima:

Osetljivost - predstavlja odgovor senzora na jedininu promenu koncentracije analita.

Selektivnost - je sposobnost senzora da da odgovor na ciljani analit. Visok stepen selektivnosti
je najpoeljniji parametar biosenzora.
Merni opseg to je onaj opseg merenih koncentracija za koji je osetljivost biosenzora dobra.
Ponekad se ovaj parametar naziva dinamiki opseg ili linearnost.
Vreme odziva je vremenski interval koji je potreban biosenzoru da registuje 63% maksimalne
vrednosti merenog signala za step promenu koncentracije analita.
Reproducibilnost - je preciznost sa kojom se moe dobiti izlazni signal sa senzora pri detekciji
identine promene koncentracije analita.
Granica detekcije predstavlja najmanju vrednost koncentracije analitaza za koju sistem moe
detektovati merenje.
Vreme ivota predstavlja vremenski period eksploatacije senzora za koji ne dolazi do
znaajnog pada performansi (radnih parametara) senzora.
Stabilnost je parametar koji nam pokazuje kako se menja osetljivost u toku vremena za
konstantnu vrednost koncentracije analita.

Metode imobilizacije

7
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

Povezivanje selektivnih elemenata i njihova imobilizacija sa odgovarajuom elektrodom od

velikog su znaaja za ispravan rad biosenzora. Postoji nekoliko naina vezivanja bioelemenata
sa elektrodom i to su:
adsorpcijom selektivnog elementa na povrinu
kovalentnim vezivanjem
mikrokapsulacijom
cross-linking-om gde se koristi bifunkcionalni agens da hemijski povee pretvara i
selektivnu komponentu
zarobljavanjem gde se selektivni element nalazi uhvaen unutar gela, paste, ili
polimera

Elektrohemijski biosenzori

Elektrohemijski senzori su najrazvijenija grupa hemijskih senzora [3]. Prema elektrinoj

veliini koju mere mogu se podeliti na: naponske (eng. Potentiometric sensors), strujne (eng.
Amperometric sensor) i senzore koji mere otpor (eng. Conductometric sensor). Zajednika
karakteristika im je da koriste posebne elektrode na kojima se odvijaju hemijske reakcije ili
dolazi do modulacije prenosa naelektrisanja. Budui da je osnovna pretpostavka delovanja
takvih senzora zatvoreno strujno kolo u praksi se koriste dve elektrode od kojih jednu zovemo
povratna a drugu radna elektroda. U praksi esto se elektrohemijski senzori nazivaju i
elektrohemijske elije.

Potenciometrijski pretvarai - pH metar

8
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

Princip rada ovakve vrste senzora zasniva se na merenju napona elektrohemijske elije
[3]. Elektrohemijska elija se sastoji od dve poluelije. Svaku polueliju predstavlja elektroda
uronjena u rastvor soli. Na kontaktu elektroda-elektrolit dolazi do spontane hemijske reakcije
tzv. redoks reakcije. Redoks reakcije su reakcije razmene elektrona gde dolazi do promene
oksidacionog broja supstanci koje uestvuju u procesu oksidacije i redukcije. Oksidacija je
proces otputanja elektrona ili poveanja oksidacionog broja supstance. Redukcija je proces
primanja elektrona ili smanjenja oksidacionog broja. Redukciona supstanca Red se oksiduje
otputajui elektrone a oksidaciona supstanca Ox se redukuje primajui elektrone.

Red1 Ox1 + ne Anoda (1)

Ox2 + ne Red2 Katoda (2)
Red1 + Ox2 Ox1 + Red2 (3)

Razlikuju se hemijske i elektrohemijske redoks reakcije. Hemijske redoks reakcije se

odigravaju u reakcionom medijumu bez posredstva elektroda dok se elektrohemijske redoks
reakcije odigravaju iskljuivo posredstvom metalnih elektroda. Koncentracije supstanci koje
uestvuju u redoks reakcijama mogu se odrediti merenjem potencijala elektroda uronjenih u
rastvore elektrolita. Za neku elektrohemijsku reakciju redukcije: Ox + ne Red veza izmeu
elektrohemijskog potencijala Eox/red i koncentracije nekog redoks para u rastvoru daje Nernstova
(W. Nernst) jednaina (4).

RT a red
E ox / red E ox / red

ln (4)
nF a ox

gde je:

Eox/red standardni potencijal elektrohemijske reakcije

RT/F Konstanta ( R = 8,315 J/mol K; T = 298,1 K ; F = 9,65104 C/mol;
prilikom prelaska sa prirodnog na dekadni logaritam konstanta ima
vrednost od 0,059 V )
n broj elektrona koji uestvuju u reakciji
ared i aox aktivnost supstance u redukovanom i oksidovanom obliku

9
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

U sluaju kada je koncentracija supstanci manja od 0,1 moldm3 aktivnost se moe

zameniti koncentracijom:

0 ,059 c
E ox / red E ox / red log red
n c ox
(5)

Nernstova jednaina omoguava izraunavanje i procenu sledeih veliina bitnih za hemijske i

elektrohemijske redoks procese:

izraunavanje elektrohemijskih potencijala

izraunavanje koncentracije jona na osnovu elektrodnog potencijala
izraunavanje elektromotornih sila
procenu tipa elektrohemijske elije
odreivanje smera redoks reakcija u elijama
odreivanje konstanti ravnotee na osnovu izmerenih EMS elija

Elektrode mogu da budu indikatorske kada potencijal elektrode direktno zavisi od

koncentracije jona u rastvoru i referentne koje imaju konstantan potencijal. Indikatorske
elektrode su: vodonina (H+-jon), staklena (H+-jon), srebrna (Ag+-jon) i druge.
Referentne elektrode su: zasiena kalomelova elektroda, standardna vodonina
elektroda, srebro-srebrohloridna elektroda (Ag/AgCl) i druge. Elektromotorna sila E
predstavlja razliku elektrodnih potencijala elektroda unutar elektrohemijske elije.
Elektromotorna sila elije se moe izraunati kao:

E = Ekatoda Eanoda (6)

Elektrohemijska elija ili spreg jeste ureaj koji se sastoji od dve metalne elektrode
uronjene u rastvore odgovarajueg elektrolita koje su meusobno odvojene polupropustljivim
pregradama. Metalne elektrode zajedno sa svojim rastvorima (poluelije) su tako odabrane da

10
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

je potencijal u jednoj polueliji vii od potencijala u drugoj polueliji. Poluelije su povezane

preko rastvora solnim mostom (eng. salt bridge) to je prikazano na slici 5.

Slika 5. Skica elektrohemijske elije

Elektrodu na kojoj je potencijal vii zovemo anodom a elektrodu kojoj je potencijal nii
nazivamo katodom . Otputeni elektroni anode dolaze na katodu i tamo ponovno redukuju jone
katode. Smanjenje jona na elektrodi katode neutralie se jonima suprotnog predznaka iz solnog
mosta. Analogno u polueliji katode otputeni joni metalne elektrode u rastvoru predstavljaju
viak naelektrisanja koji se neutralie jonima suprotnog naelektrisanja iz solnog mosta. Na taj
nain strujno kolo se zatvara.

11
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

Slika 6. Merna i referentna pH elektroda

Kod potenciometrijskih senzora izmereni potencijal na selektivnoj memembrani ili

elektrodnoj povrini koja je u kontaktu sa rastvorom povezan je sa koncentracijom jona u
analitu. Potencijal (relativni) se meri pri nultoj struji i prema referentnoj elektrodi. U sluaju
merenja pH vrednosti tenosti (negativni logaritam koncentracije vodonikovih jona) merna
elektroda se najee realizuje kao staklena elektroda ija membrana proputa samo
vodonikove jone (slika 6). Merna elektroda je tzv. jonski osetljiva elektroda koja daje odziv
proporcionalan koncentraciji jona koji merimo. Elektrolit unutar staklene kugle merne
elektrode je rastvor hloridne kiseline u kojoj je stavljena elektroda od srebra sa prevlakom od
srebro hlorida (AgCl). Ono to se eli postii sa takvom mernom elektrodom je da napon koji
se javlja izmeu rastvora hlorovodonine kiseline (HCl) i srebrne elektrode bude mali i
nepromenjiv. Na taj nain merna elektroda zavisi samo od napona na polupropusnoj membrani
koji je odgovor pH vrednosti rastvora, tj. razliite koncentracije vodonikovih jona unutar
staklene kugle. Prilikom merenja koncentracija drugih jona moe se razlikovati tip membrane
na mernoj elektrodi kao i rastvor u kojoj je potopljena merna elektroda ali krajnji cilj ostaje isti:
uiniti napon jonski selektivne merne elektrode zavisan samo od koncentracije merenih jona u
rastvoru kvantitativno izraenom Nernstonovom jednainom.

12
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

Referentna elektroda se sastoji od vlastitog kuita i elektrolita u koji je uronjena

elektroda. U sluaju pH metra to je obino elektroda sa ivom i ivinim hloridom (HgCl 2)
prikazana na slici7.

Slika 7. Setup mernog sistema potenciometarskog senzora

Uslov za konstantnim naponom postavljen je unutar referentne elektrode kao i na mestu

dodira referentne elektrode sa tenou iju koncentraciju jona merimo. Za merenje
koncentracija jona drugih hemijskih elemenata princip je isti dok se sama realizacija referentne
elektrode izmenjena. Merenje pH vrednosti je u sutini utvrivanje stepena kiselosti nekog
vodenog rastvora. Kiselost je odreena koncentracijom vodonikovih H + (OH-) jona. Neutralan
rastvor ima podjednaku koncentraciju H+ i OH- iona. Konstanta disocijacije K je definisana na
preko jednaine (7):

(7)

Kako je koncentracija nedisosovane vode mnogo vea od koncentracije disosovane

vode (koncentracije slobodnih H+ i OH- iona) mogue je deljenik izraza u jednaini (7) smatrati
konstantnim pa ga takoe staviti pod konstantu Kw koja pri 25C iznosi 10-14 mol2dm-6
prikazano u jednaini (8):
13
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

[ H+ ][ OH- ] = KW = 10-14 mol2 dm-6

[ H-] = [ OH+ ] = 10-7 mol dm-3 neutralan rastvor (8)

Ovako zapisano, kiselost rastvora se moe odrediti koncentracijom vodonikovih katjona H+ gde
je u kiselim rastvorima koncentracija velika ( vea od 10-7) a u baznim mala (manja od 10-7). Iz
praktinih razloga se pH vrednost rastvora oznaava eksponentom prema jednaini (9):

pH = - log [H+]
kiselo
pH < 7
bazno (9)
pH > 7 neutralno
pH = 7

Iako se oekuje da jon-selektivna elektroda reaguje samo na primarne jone ne postoji ni

jedna koja nee reagovati na prisustvo drugih jona. Iz ovoga proizilazi da e u prisustvu
interferujuih jona potencijal elektrode zavisiti i od koncentacije primarnih i koncentracije
interferujuih jona. Kod merenja glukoze koristimo jodid selektivnu elektrodu. Reakcije koje se
deavaju uz prisutvu enzma oksidaze su

glukoza + O2 glukozna kiselina + H2O2 (10)

- +
H2O2 + 2 I + 2 H I2 + 2 H2O (11)
Jodid-selektivna elektroda prati smanjenje koncentracije jodida to je prouzrokovano
dejstvom vodonik-peroksida.

Amperometrijski pretvarai Klarkova elektroda

Kod amperometrijskih pretvaraa elektrodni potencijal se dri na konstantnoj vrednosti

dovoljnoj za oksidaciju ili redukciju vrste od znaaja [3]. Ovaj tip senzora meri jainu struje
kroz elektrohemijsku eliju uslovljenu koncentracijom merene veliine. Princip merenja sastoji
se u proputanju kiseonika iz okoline kroz polupropusnu membranu do same elektrode. Porast
vrednosti struje uslovljen koncentracijom proputenog kiseonika kroz membranu rezultat je
redoks reakcije u dva koraka:
O2+2H2O+2e- H2O2+2OH- (12)

14
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

H2O2+2e- 2OH- (13)

Kod ovih reakcija prati se potronja kiseonika ili proizvodnja vodonik peroksida. Prvi
razvijeni biosenzor bazirao se na korienju kiseonine elektrode. Clark je prouavao redukciju
kiseonika na metalnim platinskim elektrodama. U toku rada je doao na ideju da uz povrinu
platine postavi enzime koji reaguju sa kiseonikom. Oekivao je da e aktivnost enzima moi
pratiti promenom koncentracije kiseonika oko elektrode. Konkretno odabrani enzim je tzv.
glukoza oksidaza senzor (GOD). Slika 8 prikazuje pojednostavljeni prikaz delovanja GOD-a.

Slika 8. Princip delovanja GOD-a

Glukoza reaguje sa GOD-om i pretvara se u glukoznu kiselinu ali pri tome ostavlja dva
elektrona i dva protona redukujui tako GOD. Zatim kiseonik iz rastvora reaguje sa GOD-
om prihvaajui dva protona i dva elektrona i gradi H 2O2 (vodonik peroksid) pa se tako
regenerie (oksidirajui) GOD koji je sada ponovno spreman za reakciju s glukozom. Clark je
pokazao u svojim eksperimentima da potronja kiseonika zavisi od koliine glukoze. to je bilo
prisutno vie glukoze to se troilo vie kiseonika na elektrodama (alternativa je detektovati
H2O2 umesto potronje kiseonika budui da je sistem manje osetljiv na promene kiseonika u
uzorku). Na taj nain se uspostvila veza izmeu koncentracije glukoze i potencijala Clarkovih
elektroda.

15
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

Slika 9. Primer Klarkove elektrode [3] page 509.

Na gornjoj slici prikazan je principijalni izgled Clarkove elektrode. Merna elektroda

predstavljena u obliku epa plemenitog metala platine (Pt) i referentna elektroda srebro-
srebrohlorida (Ag-AgCl) u obliku ice uronjene su u rastvor kalijum hlorida (KCl). Jaina
struje koja protie izmeu elektroda proporcijonalna je koncentraciji analita to je analitiki
prikazano jednaom (14):

(14)

gde je F-Faradayeva konstanta, A-povrina elektrode, -konstanta membrane, D-difuziona

konstanta membrane, p-parcijalni pritisak kiseonika i x - debljina membrane.
Produkt reakcije vodonik peroksid (H2O2) se oksiduje na + 650 mV u odnosu na
referentnu electrodu. Zbog toga se primenjuje potencijal od + 650 mV i meri oksidacija
vodonik peroksida. Ispostavlja se da je jaina struje direktno proporcionalna koncentraciji
glukoze (slika 10).

16
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

Slika 10. Zavisnost jaine struje od koncentracije glukoze

Mana kiseoninih senzora je to su veoma skloni smetnjama od strane spoljanjeg

kiseonika. Zbog toga je poeljnije pratiti koncentraciju proizvedenog vodonik peroksida a ne
koncentraciju kiseonika koji se troi u reakciji.

Konduktometrijski pretvarai

Kod ove vrste pretvaraa cilj je izmeriti provodljivosti elektrolita u elektrohemijskoj

eliji [3]. U homogenom elektrolitskom rastvoru provodljivost elektrolita G je inverzno
proporcionalana duini segmenta elektrolita L du elektrinog polja a direktno proporcionalna
povrini poprenog preseka A upravnog na smer polja, jednaina (15):

(15)

gde je -specifina provodljivost [-1cm-1] elektrolita povezana sa koncentracijom merenih

jona u rastvoru. Prema Kohlarausch-u postoji direktna veza izmeu provodljivosti i
koncentracije data jednainom (16)

G = G0 c 0,5 (16)

17
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

gde je -karakteristika elektrolita, G0-provodljivost elektrolita uz upotrebu idealnog rastvora

(eng. infinite dilution). Praktino merenja provodljivosti elektrolita vri se upotrebom
Wheatston-ovog mosta gde je otpor u jednoj grani mosta zamenjen elektrolitskim rastvorom.

Pri merenjima se po pravilu elektrode polarizuju niskonaponskim i niskofrekvetnim

strujama. Primena jednosmerne struje za polarizaciju elektroda moe da dovede do
elektrohemijskih promena (elektrolize) koja menja prirodu elektroda (modifikuje povrinu) ili
dovodi do redoks reakcija koje menjaju sastav i koncentraciju elektrolita. Zbog toga se otpor
elektrolita odnosno specifina provodljivost menjaju odmah po ukljuivanju kola jednosmerne
struje. Ove promene su vee i bre ukoliko su napon i jaina jednosmerne struje vei a vreme
merenja due. Pored toga pri merenju provodljivosti naizmeninom strujom treba obratiti
panju na zagrevanje elektrolita ukoliko se upotrebe jae struje. Potrebno je upotrebiti slabije
struje polarizacije a eliju ukljuivati samo u toku merenja. Provodljivost elektrolita zavisi pre
svega od njegove koncentracije a koncentracija zavisi od stepena disocijacije molekulskog
oblika supstance. Prema Ohm-ov zakonu jednaina (17), struja kroz otpornik iznosi:

U (17)
I
R
Elektrini otpor homogenog provodnika dat je jednainom (18), gde je k - specifini otpor, l
-duina, S - povrina

l (18)
Rk
S

Specifina provodljivost elektrolita data je jednainom (19), gde je C-otporni kapacitet posude,
R-otpor.

C (19)

R

Specifina provodljivost elektrolita meri se na udaljenosti od 1cm izmeu elektroda od

platina ija je povrina 1x1cm. Otporni kapacitet posude C se uvek odreuje eksperimentalno
merenjem otpora elektrolita iju specifinu provodljivost znamo iz rastvora kalijum-hlorida.

18
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

Hronoloki gledano moemo napraviti podelu po generacijama na osnovu mehanizma

dejstva biosenzora [1]. Tako je:

prva generacija senzori bazirani na kiseoninim elektrodama

druga generacija senzori bazirani na medijatorima
trea generacija elektrode sa ugraenim enzimima

Fiziko - hemijskim modifikacijama preduzeti su razliiti pristupi za poveanje

selektivnosti detektujue elektrode korienjem membrana, medijatora, metalizovanjem
elektroda i upotrebom polimera.

Prva generacija biosenzora

Kao to je pomenuto, prva generacija glukoznih biosenzora je bila bazirana na merenju

koncentracije vodonik peroksida na elektrodi [4]. Elektroda koje su obino od metala ili
ugljenika ima ulogu pretvaraa gde tok elektrona moe proizvesti merljivu struju. Ovakvo
reenje ima i svojih nedostataka. Kao prvo praenje koncentracije vodonik peroksida zahteva
visok radni potencijal. Drugo, nepoeljne bioloki elektroaktivne supstance koje mogu biti
zastupljene u okruenju kao to su urin ili druge kiseline mogu reagovati sa elektrodom,
prouzrukujui interferenciju u merenju. Kiseonik ima ogranienu rastvorljivost u mnogim
biolokim fluidima koji ograniavaju enzimsku reakciju a samim tim i odgovor biosenzora.
Unapreene verzije prve generacije biosenzora su razvijene sa zadatkom da odstrane
ove efekte. Jedna od primera jeste upotreba ugljenine elektrode presvuene grafitnom pastom
u kojoj su dispergovane metalne estice. Za metale kao to su ruthenium, rhodium, platinum i
iridium se pokazalo da proizvode poboljanje rezultata u odnosu na standardne uljenine paste i
da legure kao to je ruthenijum platina dodatno unapreuju osetljivost biosenzora. Elektrode
konstruisane na ovaj nain smanjuju radni potencijal potreban za redukciju vodonik peroksida
na elektrodama to eliminie neeljene reakcije drugih elektroaktivnih supstanci koje se nalaze
u okolini.

19
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

Gore pomenute grafitne paste nanose se na elektrode u obliku meavine grafitnog

pudera i meavine organskih tenosti. Kiseonik ima rastvorljivost mnogo puta veu u
odreenim organskim rastvaraima nego u vodi i koristei pojedine fluorohemikalije kao
meavinu tenosti za grafitne paste dobijamo poboljanje odziva biosenzora prve generacije do
take gde su mogu porediti sa biosenzorima druge generacije po karakteristikama. Organske
tenosti takoe poveavaju stabilnost biosenzora tokom dugog vremenskog perioda a posebno
termostabilnost. Razlog za to jeste to su enzimi zarobljeni unutar organske tenosti mnogo
stabilniji nego kada su potopljeni u vodi. Dehidrirani enzimi imaju veoma krutu konfiguraciju i
u kontaktu sa slobodnim molekulima vode dolazi do deaktivacije enzima. Ovakvo poboljanje
biosenzora dovelo je do njihove masovne proizvodnje i primeni u razliitim aplikacijama.

Membrana je tanak polupropusni film koji omoguava izdvajanje odreenih

komponenti iz tene faze rastvora jer deluje kao selektivna barijera za transfer suspendovanih i
rastvorenih materija. Koja e materija biti proputena a koja nee zavisi od fiziko-hemijskih
karakteristika te materije i od dimenzija pora i elektro-hemijskih svojstava membrane. Vano je
uoiti da membrana nije pasivna ve funkcionalna barijera transferu rastvorenih supstanci ija
propusnost zavisi od fiziko-hemijskih interakcija izmeu membrane i rastvorenih materija.
Razvijene su razliite permiselektivne membrane koje kontroliu vrste koje stiu do elektrode
na bazi naelektrisanja i veliine. Tako na primer upotrebom membrane od celuloze acetata
moemo kontrolisati i naelektrisanje i veliina proputene materije, nafionom samo
naelektrisanje dok membranom od polikarbonata samo veliinu. Nedostatak membrana
prilikom upotrebe je njihov veliki uticaj na difuziju.

Druga generacija biosenzora

Druga generacija biosenzora pokuala je izbei nedostatke i ogranienja ureaja prve

generacije zamenom kiseonika sa spoljanjim posrednikom elektron akceptorskim molekulom
koji je u stanju da prenese elektron od enzima do pretvaraa [4]. Problem sa malom
rastvorljivou enzima i fluktuacijom nivoa kiseonika izbegnut je primenom ove generacije
biosenzora. Ostali nedostaci su ostali prisutni, biosenzori su jo uvek osetljivi na prisustvo

20
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

kiseonika iz supstanci u okruenju koji interferira sa merenim nivoom kiseonika u analitu.

Drugi nedostatak je to je veina mediatora veoma toksina pa ograniava primenu merenja in
vivo.
Mnogi oksidaza enzimi mogu da koriste vetake elektron akceptorske molekule koji se
nazivaju medijatori. Medijator je niskomolekulski redoks par koji moe da prenese elektrone
sa aktivnog mesta enzima na povrinu elektrode i na taj nain da uspostavlja elektrini kontakt
izmau njih. Ovi medijatori imaju irok opseg struktura a samim tim i osobina, ukljuujui i
opsege redoks potencijala. Kao medijatori se koriste katjoni prelaznih metala i njihovi
kompleksi. Jedan od boljih medijatora je ferocen (Fc) sendvi kompleks gvoa i dva
ciklopentadienil (Cp) anjona. Princip dejstva medijatora na bazi ferocena sa odgovarajuim
hemijskim reakcijama jednaine (20), (21) i (22) dat je na slici 11.

Slika 11. Princip dejstva medijatora na bazi ferocena

glukoza + GODOx glukonolakton + GODR + 2H+ (20)

GODR + 2Fc+ GODOx + 2Fc (21)

2Fc 2e- 2Fc+ (22)

Dobri medijatori kao to je Ferocen bi trebalo da:

brzo reaguju sa enzimima

21
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

reverzibilno izvode transfer elektrona

imaju mali nadpotencijal pri regeneraciji
da su nezavisni od pH vrednosti
stabilni i u oksidovanom i u redukovanom obliku
ne reaguju s kiseonikom
nisu otrovni

Svrha korienja metalizovanih elektroda je u tome da se steknu uslovi pri kojima se

oksidacija enzimski generisanog H2O2 moe postii na niem primenjenom potencijalu
stvarajui jako osetljivu katalitiku povrinu. Pored toga smanjujui efekat smetnji zbog nieg
primenjenog potencijala odnos signal-um raste zbog poveanja elektrohemijski aktivne
povrine. Metalizacija se postie taloenjem odgovarajueg plemenitog metala na stakleno
ugljeninu elektrodu korienjem cikline voltametrije. Uspeni rezultati postignuti su sa
nekoliko plemenitih metala kao to su platina, paladijum, rodijum i rubidijum od kojih se
najvie moe oekivati.

Slika 12. Zavisnost odgovora detektora od Slika 13. Zavisnost odgovora detektora od
potencijala Glass Carbon elektrode (ne potencijala Metalizovane Glass Carbon
katalizuje oksidaciju H2O2 ) elektrode

Identino kao i membrane, polimeri imaju ulogu da spree ometajue vrste da stignu do
povrine elektrode i izvedu diferencijaciju na osnovu veliine i naelektrisanja. Polimeri koji se
najee koriste u praksi su: polipirol, politiofen, polianilin, diaminobenzen i polifenol.

22
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

Trea generacija biosenzora - Elektrode sa ugraenim enzimima

Trea generacija biosenzora realizovana je u direktnoj vezi izmeu enzimske reakcije i

pretvaraa bez potrebe za difuzijom stim to je enzimima onemogueno kretanje na samoj
elektrodi [4]. Na ovaj nain moe se na lak nain neprekidno meriti nivo glukoze u krvi bez
potrebe za unoenjem bilo koje supstance u analit od interesa. Direktna veza izmeu enzima do
elektrode moe biti postignuta tzv. elektrinim vodom (eng. Wiring) preko nosioca
elektronskog prenosa kao to je dugolanani polimer. Prilikom hemijskih reakcija ne dolazi do
redukcije ili oksidacije enzima direktno na elektrodi ime se spreava gubitak enzimske
aktivnosti. Kod ove visoko tehnoloke generacije biosenzora neophodno je ugraditi medijator
zajedno sa enzimom u elektrodu. U tom sluaju ne dolazi do redukcije ili oksidacije enzima
direktno na elektrodi ime se spreava gubitak enzimske aktivnosti.

Kalorimetrijski biosenzori

Mnogo katalitikih enzimskih reakcija je egzotermno. Osloboena energija u vidu

toplote moe biti iskorienja kao osnov za merenje brzine reakcije i koncentracije analita. Ovo
predstavlja najoptiji tip primenjenih biosenzora koji se zovu kalorimetrijski biosenzori.
Promena temperature obino je odreena vrednostima otpora na termistorima koji se nalaze na
ulazu i izlazu male cilindrine kapsule u kojoj se nalazi imobilizovani enzim. Kapsula je
temperaturno izolovana od okruenja. Pod tako strogo kontrolisanim uslovima moe se
registrovati ak 80% proizvedene toplote prilikom protoka jedininog uzorka kroz zapreminu
kapsule. Promena temperature moe se kvantitativno izraunati promenom entalpije izolovanog
sistema. Ako 1 molM reaktanta kompletno bude prevedeno u produkt reakcije proizvodei pri
tome 100 KJ/mol onda svaki mmolM proizvodi 0,1 J toplote. Sa 80% efikasnosti to e
prouzrokovati promenu temperature u konanom iznosu od aproksimativno 0,02 C. Da bi
kalorimetrijski biosenzor bio upotrebljiv, mora ispuniti uslov da rezolucija promene
temperature bude reda 0,0001 C.
23
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

Reaktant Enzim Koliina toplote

kJ/mole
Cholesterol Cholesterol oxidase 53
Esters Chzmotrypsin 4-16
Glucose Glucose oxidase 80
Hydrogen peroxid catalase 100
Penicillin G Penicillinase 67
Peptides Trypsin 10-30
Starch Amylase 8
Sucrose Invertase 20
Urea Urease 61
Uric acid uricase 49

Tabela 2. Detektovana promena toplote za razliite reaktante i odgovarajue enzime

Slika 14 Shematski dijagram kalorimetrijskog biosenzora

Na slici 14 vidimo kako uzorak (a) protie kroz spoljnji temperaturni izolator (b) do
izmenjivaa toplote (c) unutar aluminijumskog bloka (d). Odatle, reaktant prolazi kroz
referentni termistor (e) i enzimsku kapsulu ( zapremine 1 ml ) koja sadri biokatalizator u kojoj
se odvija reakcija. Promena temperature odreuje se preko termistora (g) a preko izlaznog

24
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

otvora (h) reaktant naputa merni ureaj. Spoljanja elektronika (i) odreuje promenu opora,
odnosno promenu temperature meu termistorima. Termistori se koriste za detekciju promene
temperature tako to im elektrina provodnost, odnosno otpornost zavisi od temperature po
sledeoj zavisnosti:
(23)
=B

Gde su R1 i R2 otpornosti termistora na apsolutnim temperaturama T1 i T2 dok je B

karakteristina temperaturna konstanta termistora. Kada je promena temperature veoma mala

kao u navedenom sluaju B << 1 i datu relaciju moemo uprostiti. Uzimajui

aproksimaciju kada je x<<1 da je ex >> 1+x ; x je ovde B

(24)
R1=R2

Relativno smanjenje eletrine otpornosti termistora proporcionalno je poveanju temperature

(T). Tipina konstanta propocionalnosti - je - . Promena otpornosti prevodi se pomou

balansiranog Wheatstone-ovog mosta u propocionalnu promenu napona.

Optiki biosenzori

Optiki biosenzori se baziraju na detekciji promene optikih karakteristika (apsorpcija,

emisija, polarizacija, indeks prelamanja) odreenog dela spektra zraenja. Princip rada sastoji
se u prostiranju svetlosti odreene talasne duine kroz merni uzorak usled ega dolazi do
promena optikih karakteristika svetlosti. Imamo dve metode detekcije: direktnu i indirektnu
(eng. competetive binding). Kod direktne metode merena veliina i senzorski materijal se
vezuju u parove ili nusprodukte koji su dalje odgovorni za promenu neke od optikih
karakteristika. Indirektna metoda opisuje postojanje tzv. analognih molekula koji pre izlaganju

25
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

svetlosti grade parove sa senzorskim materijalom. Kada se takav par sada izloi dejstvu
svetlosti odreene talasne duine dolazi do raskidanja veza izmeu parova analognih molekule
i senzirajueg materijala i na mesto analognih molekula dolazi merna veliina. To znai da
porast slobodnih analognih molekula, menja optike karakteristike upadne svetlosti (slika 15).
U veliini tih promena se nalazi informacija o koncentraciji merene veliine jer je ona direktno
odgovorna za stvaranje slobodnih analognih molekula.

Slika 15. Optiki senzor - indirektna metoda

Na slici 16, prikazan je principijalna shema optike detekcije CO2 pomou foto
otpornika. Fotootpornici koji su deo Wheatsonovog mosta izloeni su dejstvu infracrvenog
zraenja. Kada se izmeu izvora zraenja i fotootpornika nae molekul CO 2 dolazi do
apsorpcije zraenja to se manifestuje kao neravnoteno stanje mosta. Razliit intenzitet
svetlosti koji se detektuje na fotootporniku, proporcionalan je koliini apsorbovane svetlosti
odnosno koncentraciji CO2.

26
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

Slika 16. Optika detekcija CO2

Optiki senzori nude odreene prednosti u odnosu na elektrohemijske senzore. Nije

potrebna referentna elektroda (koristi se referentni nivo svetlosti). Optiki kablovi su imuni na
elektronski um ali su jako osetljivi na svetlost okoline. Mogue je izvesti viestruko merenje
vie veliina na razliitim talasnim duinama. Mana im je relativno usko podruje linearnosti
(dva reda veliine koncentracije) u odnosu na elektrohemijske senzore kao i cena.

Literatura:
1. Advances in Biosensors, Volume 5, Elsevier Science B.V. Chapter 1, pages 1-36,
Designing a simple biosensor, P.Shantilatha, Shailly Varma and Chanchal K.
Mitra
2. B.Eggins, Chemical sensors and biosensors,Wilay, 2006

27
 Elektrohemijski senzori i biosenzori

3. Handbook of modern physics, Jacob Fraden, Chapter 17, Chemical sensors,

page 499-530
4. ELEC3042 Introduction to Nanobiotechnology, Assignment: The Glucose
Biosensor, Michael Ball

28