LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA MONOKLONSKIH GAMAPATIJA.

BENCE-JONES
PROTEINURIJA

Dr.sc. Danica Matii

Kliniki zavod za laboratorijsku dijagnostiku Medicinskog fakulteta Sveuilita u Zagrebu i
KBC Zagreb

LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA MONOKLONSKIH GAMAPATIJA

Monoklonske gamapatije su karakterizirane prisutnou monoklonskih, intaktnih

imunoglobulina ili njihovih fragmenata, tzv. monoklonskih komponenti, u serumu i/ili mokrai
koje stvara klon B-stanica podvrgnut genetikoj transformaciji. Takvo stanje moe biti
posljedica benigne ili maligne bolesti. Kliniki simptomi monoklonskih gamapatija su irokog
spektra, od asimptomatskog neprogresivnog stadija, otkriveni obino sluajno, do malignog
agresivnog multiplog mijeloma ili limfoma. Prezentacija monoklonskih gamapatija ovisi o
stvarnoj transformaciji stanica kao i prirodi monoklonske komponente.
Laboratorijska dijagnostika monoklonskih gamapatija obuhvaa:
Odreivanje biokemijskih pokazatelja: ukupni proteini u serumu, elektroforeza serumskih
proteina, imunoglobulini G, A i M, razred i tip eventualno prisutnog monoklonskog
imunoglobulina, 2-mikroglobulin, kreatinin i kalcij u serumu te Bence Jones protein (BJP)
kvantitativno u serumu i potvrivanje istog imunofiksacijom u mokrai.
Odreivanje hematolokih pokazatelja: sedimentacija eritrocita, hemoglobin, diferencijalna
krvna slika.
Citoloki pregled: punkcija sternalne ili bedrene kosti.

Godine 1999. Ameriko drutvo klinikih kemiara dalo je smjernice za kliniku i

laboratorijsku evaluaciju bolesnika s monoklonskim gamapatijama (1):
1. Elektroforeza proteina u serumu i mokrai je indicirana za svakog bolesnika kod kojeg
postoji sumnja na poremeaj plazma stanica.
2. Za definiranje abnormalnog razreda i tipa proteina indicirana je imunofiksacija.
Iako je nalaz elektroforeze negativan kod suspektnih bolesnika treba napraviti imunofiksaciju.
Imunofiksacija nije indicirana ako se ustvrdi poliklonska hipergamaglobulinemija.
3. Monoklonski imunoglobulin (M-protein) je potrebno pratiti denzitometrijski.
Imunofiksaciju nije potrebno ponavljati ako se nisu dogodile promjene u migraciji M-proteina
te ako se nije pojavila nova vrpca.
4. Za sve bolesnike s poremeajem plazma stanica potrebno je nefelometrijsko odreivanje
imunoglobulina da bi se ustvrdila koncentracija ostalih neukljuenih imunoglobulina.
5. Svim bolesnicima s multiplim mijelomom, Waldenstrm makroglobulinemijom,
amiloidozom i srodnim bolestima potrebno je odrediti prisutnost i dnevno izluivanje
monoklonskih slobodnih laganih lanaca - 24 satni urin ukoncentrirati 100x te napraviti
imunofiksaciju.
6. Kod bolesnika s multiplim mijelomom, Waldenstrm makroglobulinemijom te amiloidozom
potrebno je pratiti promjene u koncentraciji M-proteina svakih 1-2 mjeseca, dok se takvo
praenje kod monoklonskih gamapatija neodreenog znaaja (MGNZ) preporuuje jednom
na godinu.
7. Hiperviskozni sindrom trai zamjenu plazme s indikacijama utemeljenima na klinikim
znaajkama (viskozitet i elektroforezu seruma treba napraviti prije nego se plazma zamijeni
radi usporedbe koncentracija M-proteina).
8. Krioglobuline treba napraviti u svih bolesnika s M-proteinom koji pokazuju osjetljivost na
hladnou, posebno kod onih sa M-IgM.
9. Preporuene metode za evaluaciju M-proteina su: kapilarna zonska elektroforeza visoke
rezolucije; imunofiksacija za odreivanje razreda i tipa M-proteina ili imunoselekcija za
dokaz monoklonskih tekih lanaca. Imunosupstrakcija kao metoda za odreivanje razreda i
tipa M-proteina je metoda koja obeava.

Isti autori takoer su opisali preporueni postupak evaluiranja M-proteina (2):

1. Za elektroforetsko razdvajanje proteina u serumu preporuuje se koristiti visoko rezolutne
elektroforetske tehnike na agarozi ili kapilarna zonska elektroforeza.
2. Nefelometrijsko kvantitativno odreivanje imunoglobulina.
3. Odreivanje razreda i tipa M-proteina imunofiksacijom odnosno imunoselekcijom. Metoda
imunosupstrakcije je mogua samo uz kapilarnu zonsku elektroforezu.
4. Kvantifikaciju M-proteina izvoditi denzitometrijski.
5. Kontrola kvalitete evaluacije M-proteina: kljuna komponenta interne kontrole je izravan
kontakt s kliniarem o sluaju koji je neuobiajene prirode ili ako postoji bilo kakav nesklad u
nalazu.

Prvi korak u otkrivanju monoklonskih imunoglobulina je zonska elektroforeza serumskih

proteina, najee na acetat-celulozi ili agarozi.
Nisko rezolutne tehnike, kao to je elektroforeza na acetat-celulozi, razdvajaju proteine na
pet frakcija. Kod ove elektroforeze nije mogue postii dobro razdvajanje 1- (transferin) i 2-
globulinske frakcije (C3). Sama tehnika je lako primjenjiva, ali uz slabu ili nikakvu kontrolu
temperature.
Visoko rezolutne tehnike omoguuju bolje razdvajanje transferina i C3 u beta podruju kao i
bolje uoavanje malih koncentracija M-proteina koji mogu putovati od 2 do gama podruja.
Visoki stupanj rezolucije je posljedica vie faktora, od kontrole temperature, upotrebe
kalcijeva laktata u puferu, kontrole debljine sloja gela i same aplikacije uzorka.
Neki sustavi omoguuju razdvajanje proteina na 10 do 12 frakcija, ukljuujui vizualizaciju
transtiretina (prealbumin), albumina, alfa-lipoproteina, 1-kiselog glikoproteina (orozomukoid),
1-antitripsina, 2- makroglobulina, haptoglobina, transferina, beta lipoproteina, C3,
fibrinogena, C-reaktivnog proteina (kad je znaajno povien) i gama globulina koje uglavnom
predstavlja IgG. Mnogi od ovih proteina su prisutni u tako malim koncentracijama da ih je
bolje kvantitativno odreivati nekim drugim metodama, kao to je nefelometrija. Bez obzira
na razdvajanje proteina na 10 do 12 frakcija veina laboratorija oitava elferograme
denzitometrijski samo na 5 do 6 frakcija (Slika 1).
Slika 1. Elferogram dobiven visoko rezolutnom elektroforezom

Dananja dijagnostika preporuuje koritenje visoko rezolutnih elektroforeza.

Metodom izbora za razdvajanje serumskih proteina smatra se kapilarna zonska
elektroforeza. Kapilarna elektroforeza predstavlja skupinu srodnih tehnika koje koriste
kapilare, promjera od 20-200 m, za razdvajanje razliitih molekula i spojeva (Slika 2).

Slika 2. Kapilarna zonska elektoforeza

Uinkovito razdvajanje omogueno je koritenjem visokih napona (do 30 000 V), koji
uzrokuju elektroendoosmozni i elektroforetski tok puferske otopine i iona unutar kapilare.
Izmeu negativnih naboja kapilare i pozitivnog naboja puferske otopine nastaje toliko snani
elektroosmozni tok koji je jai od elektroforetskog toka posljedica ega je putovanje proteina
prema katodi.
Kvantitativno odreivanje imunoglobulina moe biti nefelometrijski ili radijalnom
imunodifuzijom. Metoda izbora je nefelometrija, zbog same brzine mjerenja kao i osjetljivosti
metode te ponovljivosti rezultata. Radijalna imunodifuzija zahtijeva vizualno mjerenje nastalih
prstenova precipitata to moe utjecati na kvalitetu rezultata. Koja god metoda da se koristi,
kvantifikacija M-proteina je problematina zbog njegovih promijenjenih imunolokih i fiziko-
kemijskih svojstava. Zato se preporuuje odreivanje M-proteina denzitometrijski.
Metoda izbora za odreivanje razreda i tipa M-proteina je imunofiksacija koja se moe
napraviti unutar 4 sata. Uzorak seruma nanosi se razrijeen na katodni kraj prema
preporuenim razrjeenjima za svaki imunoglobulin. U sluaju izrazito poveane
koncentracije imunoglobulina unato razrjeenju moe doi do uinka suvika antigena.
Optimalna precipitacija s komercijalnim antiserumima dogaa se kod koncentracije
imunoglobulina oko 10 g/L. Zato se preporua napraviti kontrolnu elektroforezu prije
izvoenja same imunofiksacije kako bi uoilo kolika je vrpca samog M-proteina.
Odreivanje razreda i tipa M-proteina mogue je takoer odrediti kapilarnom elektroforezom,
tj. metodom imunosubtrakcije.
Imunosupstrakcija je alternativna metoda za imunofiksaciju koju su prvi put opisali Aguzzi i
Poggi 1977. godine. Razred i tip M-proteina odreuje se tako da se uzorci seruma inkubiraju
s odreenim antitijelima, vezanima na sefarozi, na teki ili laki lanac, bilo vezani ili slobodni.
Poslije inkubacije uzorka, tretirani uzorak i netretirani kontrolni serum razdvoje se kapilarnom
zonskom elektroforezom. Elferogram uzorka nakon imunosupstrakcije, koji se nalazio u
kapilari s odgovarajuim antitijelom na teki i lagani lanac, nee vie imati vrpcu M-proteina
(Slika 3).

Slika 3. Elferogram kapilarne elektroforeze bolesnika s monoklonskom gamapatijom: A:

kontrolni elferogram ; B: elferogram poslije inkubacije uzorka s antitijelom na teki lanac
gama (IgG); C: elferogram nakon inkubacije uzorka s antitijelom na laki lanac kapa.

Kako se M-proteini nalaze, osim u multiplom mijelomu i drugim imunoproliferativnim

bolestima, i u nizu razliitih drugih bolesti (primjerice u autoimunim bolestima, bolestima
jetre, karcinomima i dr.) kao i u 1-2% zdravog puanstva starosti 25-60 godina. Najvei
problem u diferencijalnoj dijagnozi je odluka izmeu multiplog mijeloma i gamapatije
neodreenog znaaja. Glavni biokemijski kriteriji za razlikovanje ova dva stanja su
koncentracija M-proteina, koncentracija ostalih neukljuenih imunoglobulina i nalaz
monoklonskih slobodnih laganih lanaca tipa kapa ili lambda u mokrai.
Benigna monoklonska gamapatija: koncentracija M-proteina manja od 10 g/L, koncentracija
ostalih imunoglobulina normalna, negativan nalaz monoklonskih slobodnih laganih lanaca
kapa ili lambda tipa u mokrai i odsutnost porasta koncentracije M-proteina nakon nekoliko
narednih godina.
Maligna monoklonska gamapatija (multipli mijelom): koncentracija M-proteina vea od 10
g/L, odsutnost sinteze ostalih imunoglobulina, u oko 50-80% bolesnika s multiplim
mijelomom nalaz monoklonskih slobodnih laganih lanaca kapa ili lambda tipa u mokrai.
Najvaniji kriterij je svakako kliniko napredovanje bolesti i M-proteina, jer kod veine
bolesnika s multiplim mijelomom postoji eksponencijalni porast koncentracije M-proteina u
serumu. Stoga je od iznimne vanosti praenje koncentracije M-proteina u serumu kao i
redovito preispitivanje prisutnosti monoklonskih slobodnih laganih lanaca tipa kapa ili lambda
u mokrai.
Poseban problem su monoklonski tekih lanci gama, alfa i mi (bolest tekih lanaca), koji se
ne mogu uoiti elektroforezom seruma. Njihova imunoloka identifikacija provodi se s
pomou posebne imunokemijske metode, imunoselekcije.
Treba uzeti u obzir i tekoe pri otkrivanju M-IgD i M-IgE koji se u serumu nalaze u vrlo
malim koncentracijama. Osim toga M-IgD se razgrauje in vivo i in vitro pa na elferogramu
nalazimo samo difuznu vrpcu proteina. M-IgM stvara komplekse ili polimere koji su netopljivi i
ostaju na startu. Lanu monoklonsku vrpcu moemo imati i od monoklonski sintetiziranih
krioglobulina ako je uzorak uzet nepravilno.

BENCE-JONES PROTEINURIJA

Monoklonski slobodni lagani lanci imunoglobulina, Bence-Jones proteini, (BJP), su

homogena populacija kapa () ili lambda () lakih lanaca imunoglobulina koje stvara maligni
klon B-stanica. Oni su vaan tumorski biljeg za identifikaciju i praenje bolesnika s multiplim
mijelomom lakih lanaca i amiloidoze lakih lanaca. Kod raznih nemalignih bolesti, kao to su
reumatoidni artritis, sistemski eritematozni lupus i kronino bubreno zatajenje, mogu se nai
pozitivni BJP u mokrai. Visoke doze penicilina ili aspirina prije skupljanja mokrae mogu dati
lano pozitivan rezultat.
Nalaz BJP tipa kapa ili lambda u mokrai je gotovo uvijek znak malignosti procesa jer se ti
lanci gotovo nikada ne nalaze u benignim monoklonskim gamapatijama. Stoga je vano
besprijekorno dokazivanje BJP u mokrai. Slino kao i u serumu, prvi korak je zonska
elektroforeza najmanje 100x uguene mokrae na acetat-celulozi. BJP se mogu nai na
elferogramu od alfa do gama podruja, to je rezultat njihove razliite molekularne mase
(monomeri, dimeri, tetrameri) (slika 4). Ponekad se mogu nai i dvije monoklonske vrpce, to
je posljedica ili polimerizacije BJP, posebice tipa lambda, ili postojanja dvaju klonova.
Poseban problem u laboratorijskoj dijagnostici predstavlja otkrivanje BJP u serumu
(mikroglobulinski mijelom), a ponekad i u mokrai.
Slika 4. Intaktni imunoglobulini i slobodni laki lanci

BJP se identificiraju u mokrai primjenom elektroforeze proteina i imunofiksacije odnosno

imunoelektroforeze. Meutim, ove metode su dugotrajne, relativno nedovoljno osjetljive i
nedovoljno pouzdane. Osim toga, sadraj BJP u mokrai ovisi o tubularnoj funkciji tako da je
koncentracija u mokrai nepouzdan indikator stanja bolesti. Monomeri (25 kDa), zbog
njihove male molekularne mase, filtriraju se triput bre nego dimeri (50 kDa) tako da serum
sadri vie nego monomera bez obzira na veu produkciju lanaca.
Izluivanje BJP mokraom pokazuje samo minimalni porast, za razliku od serumske
koncentracije BJP koja proporcionalno prati rast tumorske mase. Stoga koncentracija BJP u
serumu, u odsutnosti bubrene bolesti, bolje pokazuje stanje bolesti nego koncentracija u
mokrai.
Normalno plazma stanice sintetiziraju jedan od pet tipova tekih lanaca zajedno s ili
lancima. U toj sintezi stvara se oko 40% vika lakog lanca u odnosu na koliinu tekog lanca
da bi se omoguilo uredno stvaranje intaktnih molekula imunoglobulina. U zdravih osoba,
viak serumskih lakih lanaca filtrira se i katabolizira u bubregu. Laki lanci se veu na etkasti
obrub membrane putem niskog afiniteta na receptore visokog kapaciteta, prolaze proces
endocitoze te se metaboliziraju u lizosomima. Kod zdravih osoba samo mali dio slobodnih
lakih lanaca proe u mokrau, 5-10 mg/dan (slika 5).
Slika 5. Metabolizam lakih lanaca

Kada sinteza slobodnih lakih lanaca premai 10-30 g/dan dolazi do pojave proteinurije zbog
suvika i u mokrai se nalazi velika koliina slobodnih lakih lanaca.
U multiplom mijelomu lakih lanaca zbog oteenja bubrega ulaze slobodni laki lanci unutar
uzlaznog dijela Henleove petlje i stvaraju cilindre, esto udruene s Tamm-Horsfallovim
proteinom ili prolaze u mokrau. Posljedino oteenje nefrona slobodnim lakim lancima vodi
u progresivno bubreno oteenje.
Veliina glomerularnih pora je varijabilna s mogunou filtracije molekula od 30 kDa do 60
kDa. To je presudno za razliiti klirens molekula i koje se normalno nalaze u monomernim
i dimernim oblicima. Brzina glomerularne filtracije monomernih oblika BJP tipa je 40%
unutar 2-4 sata, za dimerne oblike BJP tipa 20% unutar 3-6 sati, dok se vei polimeri
filtriraju mnogo sporije. Uklanjanje BJP moe biti produeno do 1 do 2 dana u bolesnika s
multiplim mijelomom s oteenim bubregom.
Preporuena alternativa obradi mokrae je mjerenje koncentracije BJP u serumu. Razne
studije, koje su koristile visoko osjetljivi imunotest za mjerenje slobodnih lakih lanaca u
serumu, pokazale su da je ova metoda pouzdanija od tradicionalne elektroforeze mokrae
kod dijagnoze bolesnika s nesekrecijskim mijelomom, amiloidoze i multiplog mijeloma lakih
lanaca.
U nastojanju da se nae to djelotvornija terapija provedena su mnoga istraivanja na
strukturi kristala BJP. Razumijevanje strukture kristala BJP moglo bi biti kljuno za razvoj
selektivne terapije lijekovima. Slike 6 i 7 prikazuju kristale Bence-Jones proteina.

Slika 6. Kristali Bence-Jones proteina

Slika 7. Kristali Bence-Jones proteina naeni u bolesnika s karcinomom

Literatura:
1. Keren DF, Alexanian R, Goeken J, Gorevic P, Kyle RA, Tomar RH. Guidelines for clinical
and laboratory evaluation of patients with monoclonal gammopathies. Arch Pathol Lab
Med 1999;123:106-7.
2. Keren DF. Procedures for the evaluation of monoclonal immunoglobulins. Arch Pathol
Lab Med 1999;123:126-132.
3. Bradwell AR. Serum free light chain assays. Birmingham: The Binding Site Limited,
2003;1-22.