Testovi toksinosti

Toksinost vode predstavlja nezavisan parametar za procenjivanje kvaliteta vode.

Potrebno je istai da saprobni sistem nije u stanju, sam po sebi, da izrazi efekte
toksinosti, u emu se i ogleda znaaj procenjivanja toksinosti vode.
Toksinost vode je prouzrokovana prisustvom toksinih supstanci u odreenoj
koncentraciji u samoj vodi. Najei uzronici toksinosti vode su teki metali, pesticidi,
fenoli ili druga organska i neorganska jedinjenja. Hemijske analize vode mogu nam
pokazati sastav i koncentraciju hemijski opasnih materija ali ne i efekte istih na ive
organizme. Stoga kontrola vode upotrebom testova toksinosti u poslednje vreme dobija
sve vie na znaaju u savremenom monitoringu ivotne sredine, naroito vodenih
ekosistema.
Primena biolokog materijala za procenu stepena toksinosti vode zasniva se na
injenici da biljni i ivotinjski organizmi na odreeni nain reaguju na prisustvo toksinih
organiskih i neorganskih supstanci u svojoj okolini. Kakva e reakcija biti zavisie,
izmeu ostalog, od nivoa organizacije na koju se ispoljava toksini uticaj, pri emu
reakcija svakog vieg nivoa organizacije ukljuuje reakcije prethodnih niih nivoa
(GRNBERG 1988):

Nivo organizacije Reakcija na toksini nivo

Biocenoza Promena raznovrsnosti
Populacija Promena stabilnosti populacije
Organizam Promena rasta, razmnoavanja i vitaliteta
Tkiva i organi Promena strukture i funkcije
elija Promena strukture i metabolizma
Molekul Promena permabiliteta membrane i enzimatske aktivnosti

Stepen reakcije na toksinu supstancu zavisi od osetljivosti biljne ili ivotnjske

vrste, od vrste i koncentracije toksine supstance i moe se kvantifikovati. Na osnovu
toga pojedine vrste biljaka i ivotinja mogu da poslue kao test organizmi (indikatori) za
procenu stepena toksinosti povrinskih, podzemnih i otpadnih voda, ali i za porcenu
uspenosti procesa preiavanja otpadnih voda.

Tipovi testova

Prema EIFAC (1980) testovi toksinosti su svrstani u 5 sledeih kategorija:

1. Screening testovi za proveru akutne toksinosti hemikalija ili derivata pod
standardnim uslovima
2. Testovi za uspostavljanje kriterijuma kvaliteta vode
3. Monitoring test otpadnih voda (efluenata)
4. Testove koje propisuje zakon
5. Testovi za monitoring reka
Izbor test organizma

Prvo to se uzima u obzir pri izboru organizama za testove toksinosti je (redosled

ne odgovara i stepenu vanosti):
1. njihova osetljivost na materijal ili sredinske faktore koji se razmatraju,
2. geografska rasprostranjenost, brojnost i raspoloivost tokom godine,
3. ekonominost i ekoloka vanost na lokalnom i nacionalnom nivou,
4. upotrebljivost za metode kultura ili metode odgajanja ili odravanja pod
laboratorijskim uslovima i poznavanje njihovog naina ivota i neophodnih
sredinskih uslova, i
5. njihovo opte zdravstveno stanje i otpornost na parazite i bolesti.

Postoje brojne opisane metode za odreivanje toksinih efekata vode za koje se

mogu koristiti razliiti test organizmi. Meu biotestovima koji su u upotrebi, veina
(54,5%) su testovi koji koriste prostije ili sloenije ivotinjske organizame. ee
korienje ivotinja kao test organizama je razumljivo jer su oni filogenetski blii oveku.
esto su testovi na ivim organizmima relativno komplikovani i podrazumevaju
odravanje laboratorijske kulture test organizma. Odreeni izuzetak su testovi na viim
biljkama, koji su relativno jednostavni i jeftini, jer se najee koristi gotov semenski
materijal, pa kultivisanje i odravanje nije potrebno. Sem toga vie biljke poseduju i mali
broj hromozoma, lako vidljivih mikroskopom, tako da su pogodne kako za detekciju
toksinih efekata, tako i za detekciju mutagenih efekata (genotoksinost). Na osnovu
karakteristika test organizama u slubenoj upotrebi se nalaze sledei testovi:
Paramecium test: Test organizam je jednoelijska Protoza, papuica
(Paramecium caudatum EHR.). Meri se stopa smrtnosti. Duina trajanja testa 2 dana. Test
je pogodan za ispitivanje akutne toksinosti povrinskih, podzemnih i otpadnih voda koje
sadre masne kiseline, organska jedinjenja i teke metale (BREITING AND TMPLING ,
1982).
Tubifeks test: Kao test organizam se koristi oligoheta Tubifex tubifex O. F.
MLL.. Prati se stopa smrtnosti. Duina trajanja testa 3 dana. Test je pogodan za za
ispitivanje akutne toksinosti povrinskih, podzemnih i otpadnih voda koje sadre
insekticide (BREITING AND TMPLING , 1982).
Dafnia test: Test organizam je velika vodena buva, nii rakovi (Daphnia magna
ST.), starosti do 24 asa. Prati se stopa smrtnosti. Duina trajanja testa 2 dana ili1 dan.
Test je pogodan za ispitivanje akutne toksinosti otpadnih voda koje sadre insekticide ili
teke metale (BREITING AND TMPLING , 1982).
Azelus test: Test organizam je zglavkar, isopoda, vodena babura (Asellus
aquaticus RAKOVITZA). Meri se stopa smrtnosti. Duina trajanja testa 2 dana. Test je
pogodan za ispitivanje akutne toksinosti povrinskih, podzemnih i otpadnih voda koje
sadre insekticide na bazi hlorovanih ugljovodonika (BREITING AND TMPLING , 1982).
Gupi test: Test organizam je akvarijumska riba gupi (Poecilia reticulata PETERS).
Meri se stopa smrtnosti. Duina trajanja testa 3 dana. Test je pogodan za ispitivanje
akutne toksinosti povrinskih, podzemnih i otpadnih voda koje sadre pesticide, fenole,
cianide, tenzide i teke metale (BREITING AND TMPLING , 1982).
Pastramka test: Test organizam je pastrmka (Salmo gairdneri RICH.). Kriterijum
testa je stopa smrtnosti. Duina trajanja testa 3 dana. Test je pogodan za ispitivanje
akutne toksinosti povrinskih, podzemnih i otpadnih voda koje sadre pesticide, fenole,
cianide, tenzide i teke metale (BREITING AND TMPLING , 1982).
Ankistrodezmus test: Test organizam je planktonska zelena alga Ankistrodesmus
falcatus CORDA. Meri se inhibicija razmnoavanja. Duina trajanja testa 10 dana. Test je
pogodan za merenje toksinosti povrinskih, podzemnih i otpadnih voda koje sadre
tenzide i teke metale (BREITING AND TMPLING , 1982).
Formidium test: Test organizam je modrozelena alga Phormidium autumnale
GOMONT. Kriterijum testa je inhibicija fototaksine reakcije. Trajanje testa 24 sata. Test
je pogodan za merenje toksinosti povrinskih, podzemnih i otpadnih voda koje sadre
herbicide i teke metale (BREITING AND TMPLING , 1982).
Test klijavosti: Test organizam je slaica, Sinapis alba L. Meri se inhibicija rasta
korenia i hipokotila. Test traje od 3 do 5 dana. Test je pogodan za ispitivanje akutne
toksinosti vode za navodnjavanje (BREITING AND TMPLING , 1982).
Lepidium test: Test objekat je vrtna krecava salata, Lepidium sativum L. Meri
se inhibicija rasta korenia. Duina trajanja testa 2 dana. Test je pogodan za ispitivanje
akutne toksinosti vode koja sadri teke metale i fenole.
Alium test: Test organizam je lukovica semenskog crnog luka, arpadik
(Allium cepa L.). Meri se inhibicija rasta korneia. Duina trajanja 2 dana. Test je
pogodan za ispitivanje akutne toksinosti vode za pie, vode koja je kontaminirana
tekim metalima, organskim i neorganskim jedinjenjima, kao i vode koja sadri efluente
hemijske industrije (FISKESJO 1981, 1985).

Za detekciju kako toksinosti tako i genotoksinosti posebno su pogodni Alium i

Lepidium-test. Mikroskopske promene u vidu usporenja ili potpune inhibicije rasta
korenia test organizama, do kojih dolazi zbog uticaja zagaujuih supstanci
predstavljaju fenotipsku ekspresiju promena u genetikom materijalu u elijama
korenia. Promene koje nastaju vidljive su kao hromozomske aberacije i nepravilnosti
elija koje su u mitozi.

Alium test

Alium test toksinosti je test klijanja koji koristi kao test organizam lukovice
semenskog crnog luka - arpadik, Allium cepa L.. Test je prvi uveo LEVAN jo 1938.
godine, a u neto modifikovanom obliku primenjuje se poslednjih godina pri ispitivanju
akutne toksinosti vode za pie, kao i vode koja sadri organska i neorgnska jedinjenja ili
efluente hemijske industrije (FISKESIJ, 1985). Korenii arpadika rastu u vodi, a test se
zasniva na principu da je duina korenia obrnuto proporcionalna subletalnim
koncentracijama zagaujuih supstanci u vodi, dok letalne koncentracije u potpunosti
zaustavljaju rast korenia. Nakon izlaganja lukovica delovanju vode u roku od 48
asova, meri se inhibicija rasta korenia luka. Poreenjem duine korenia luka
ispitivane koncentracije uzorka, sa duinom korenia iz kontrole mogue je odrediti
stepen toksinosti vode. PRAT,1946; FJERDINGSTAND, 1964; SLDEEK, 1964; REIMANN,
1966; predlau sledei sistem toksinosti:
 stupanj toksinosti inhibicija ili mortalitet (%)
atoksinost 0
oligotoksinost 0-30
-mezotoksinost 30-50
-mezotoksinost 50-70
politoksinost 70-90
eutoksinost 90-100

Postupak

1. 24h pre postavljanja ekseperimenta esmenska voda se ostavi da odstoji u irokoj

posudi. Na ovaj nain emo omoguiti isparavanje hlora iz vode koji inae moe
negativno da utie na rast korenia. Kao kontrolna voda koristi se demineralizovana
destilovana voda u sluaju kada se ispituje voda za pie.
2. Temperatura vode koja se eli ispitati na toksinost, mora biti priblino jednaka
sobnoj temperaturi pre postavljanja eksperimenta, to se postie dranjem vode na
sobnoj temperaturi najmanje 2h pre upotrebe.
3. Za svaku probu vode koja se ispituje potrebno je odabrati najmanje 5 lukovica koje se
smetaju u pojedinane epruvete ili aice zapremine 20 50 ml.
4. Obelee se aice ili epruvete markerom (K (kontrola), D (nerazblaena voda koja se
ispituje), 1:1 (razblaena ispitivana voda sa vodom iz kontrole u zapreminskom
odnosu 1:1), 1:5 (razblaena ispitivana voda sa vodom iz kontrole u odnosu 1:5). Sipa
se kontrolna voda i nerazblaena voda koja se ispituje u epruvete.
5. Naprave se eljena razblaenja koja se takoe sipaju u epruvete.
6. Odaberu se zdrave, svee lukovice arpadika (semenski crni luk, Allium cepa),
podjednake veliine.
7. Skalpelom se skine povrinski sloj u predelu korenia pri emu treba voditi rauna
da se ne otete vrni delovi korenia.
8. Lukovice se postave u epruvete, koje se odloe na mrano mesto ujednaene sobne
temperature.
9. Posle 24h se vri zamena vode.
10. Posle 48h se mere duine svih korenia milimetarskim papirom, lenjirom ili
nonijusom.
11. Izmerene vrednosti se belee u tabelu iz koje se kasnije vre statistiki prorauni.

Uzorak Datum K D 1:1 1:5

N
U1 x
%
N
U2 x
%

N- ukupan broj premerenih korenia

x srednja vrednost duine korenia u cm
% - procentualna vrednost rasta korenia u odnosu na kontrolu (100%)
K kontrola
D nerazblaena voda
1:1, 1:5 zapreminski odnos vode koja se ispituje i vode za razblaenje

12. Na osnovu dobijenih % vrednosti rasta korenia izraunava se % inhibicije i

konstatuje nivo toksinosti istraivane vode.
% inhibicije = 100% - % rasta korenia u odnosu na kontrolu
13. Dobijene vrednosti % inhibicije se mogu prikazati grafiki.

% inhibicije

70 % inhibicije

60

50

40

30

20

10

0
1 2 3 4
uzorak

Lepidium test

Lepidium test toksinosti je test klinanja koji koristi kao test organizme semena
krecava salate (Lepidium sativaum L.). Test je prvi opisaso MOEWUS 1949. Pomou ovog
testa mogue je izvriti procenu stepena toksinosti vodotoka ili otpadne vode. Korenii
salate rastu u ispitivanoj vodi, a test se zasniva na principu da je duina korenia obrnuto
proporcionalna subletalnim koncentracijama zagaivaa iz vode, dok letalne
koncentracije u potpunosti zaustavljaju rast korenia. Nakon izlaganja semena tetnom
efektu vode u roku od 48 asova, meri se inhibicija rasta korenia krecave salate.
Poreenjem duine korenia krecave salate ispitivane koncentracije uzorka, sa duinom
korenia iz kontrole mogue je odrediti stepen toksinosti vode.

Postupak

1. 24h pre postavljanja ekseperimenta esmenska voda se ostavi da odstoji u irokoj

posudi. Na ovaj nain emo omoguiti isparavanje hlora iz vode koji inae moe
negativno da utie na rast korenia. Kao kontrolna voda moe se koristiti
demineralizovana destilovana voda.
2. Temperatura vode koja se eli ispitati na toksinost, mora biti priblino jednaka
sobnoj temperaturi pre postavljanja eksperimenta, to se postie dranjem vode na
sobnoj temperaturi najmanje 2h pre upotrebe.
3. Za svaku probu vode koja se ispituje potrebno je odabrati 20 d0 25 zdravih
semena vrtne salate, koja se smetaju pincetom u Petri olju na filter papir. Petri
olje su zatvorene tokom eksperimenta.
4. Svaka Petri olja se obelei markerom (K (kontrola), D (nerazblaena voda koja
se ispituje), 1:1 (razblaena ispitivana voda sa vodom iz kontrole u zapreminskom
odnosu 1:1), 1:5 (razblaena ispitivana voda sa vodom iz kontrole u odnosu 1:5).
5. Filter papir svake Petri olje se natopi sa 3 ml odgovarajueg test rastvora (K-
kontrola; D-nerazblaena voda; 1:1- razblaena ispitivana voda sa vodom iz
kontrole u zapreminskom odnosu 1:1 idt.
6. Petri olje se odlau na mrano mesto (bez direktne suneve svetlosti) ujednaene
sobne temperature. Takoe se moe izvoditi i u mraku.
7. Posle 24 asa, seme se prenosi u drugu Petri olju sa sveim test rastvorom.
8. Posle daljih 24 asa se meri duina korenia milimetarskim papirom, lenjirom ili
nonijusom.
9. Izmerene vrednosti se belee u tabelu iz koje se kasnije vre statistiki prorauni.
10. Na osnovu dobijenih % vrednosti rasta korenia izraunava se % inhibicije i
konstatuje nivo toksinosti istraivane vode.
% inhibicije = 100% - % rasta korenia u odnosu na kontrolu
11. Dobijene vrednosti % inhibicije se mogu prikazati grafiki kao i u Alium-testu.

Literatura

ARAMBAI, M. (1997). Primena biolokog materijala kao indikatora zagaivanja

ivotne sredine: Indikatori zagaivanja vodene sredine: Praktina primena botanikog
materijala (Allium- i Lepidium- test). Druga jugoslovenska konfenecija o upravljanju
ZS. 264-272.
BREITIG, G. und von TMPLING, W. (herausg.) (1982): Ausgewathlte Methoden
der Wasseruntersuchung. Band II. Biologische, Mikrobiologische und toxikologische
mMethoden. 2-te berarbeite und erweiterte Auflage, s. 377-439. VEB Gustav Fischer
Verlag, Jena.
EIFASC (1980): Report on fish toxicity procedures. In: Alabaster, J. S. & Lloyd,
R., ed. Water quality criteria for freshwater fish. Sevenoaks. Butterworth.
 FISKESJO, G. (1981): Benzo (a) pyren and N-methyl-N-soguoaanidine in Allium
test. hereditos 95: 155-162.
FISKESJO, G. (1985): Allium test on river water from Braan and Saxar before and
after closure of chemical factory. Ambio, 14 (2): 99-103.
GRNBERG, W. (1988): Zur Physiologie und Pathologie von Fischen und anderen
Wassertieren. Vortrag beim Expertegeschprach Waschen und Gewasserschutz der Arge
Hygiene und Umwelt. Wien.
MOEWUS, F. (1949): Der Kressewurzeltest, ein neuer quantitativer Wuchsstofftest.
Biol. Zentral Blatt., 68: 118-140