PROTOKOL: TRANSFEKCIJA

Transfekcija postupak unoenja strane DNA u animalne stanice

(HEK 293)
Da bi transfekcija HEK 293 stanine linije bila uspjena, stanice moraju biti TRIPSINIZIRANE
dan ranije, kako bi na dan provedbe transfekcije bile u LOG fazi (fazi diobe) jer jedino takve
mogu primiti stranu DNA. Transfekcija stanica moe se provoditi razliitim metodama primjenom
lipofectamina 2000, lipofectamina 3000, polietileniminom (PEI). Stanice moraju bit 50%
kofluentne.
Protokol za transfekciju Lipofectaminom 2000 (flask T25 25 cm 2):
Potrebno je pripremiti dvije epice: jedna epica s plazmidnom DNA te jednu s
transfekcijskim agensom (Lipofectamin 2000)
U svaku epicu se prvo stavi medij (bez seruma i AB) koline odrediti prema Tablici 1.
(za T25, volume medija je 0,5 mL/epici, dok konani volumen u T25 mora biti 6 mL).

S obzirom na povrinu T25, potrebno je dodati 10 g plazmidne DNA (koliinski

odrediti prema koncentracijama plazmida:
o c(2656) = 3 mg/mL
o c(BMP6) = 0,13 mg/mL
o c(pSV) = 1,5 mg/mL
iz tablice odrediti i koliinu Lipofectamina 2000
pripremljene epice ostaviti na RT kroz 5 min
pripremljene epice pomjeati ( lipofectamin 2000 dodati u epicu s plazmidnom DNA) i
ostaviti 30 min
Iz flaska T25 maknuti medij, te ga isprati s PBS-om
Dodati 5 mL medija, te dodati Pen-Strep (100x -> 1x), na 6 mL ispadne 60 L
Zatim u flask nakapati mix plazmidne DNA i Lipofectamina 2000
Inkubacija 2 dana (bojanje X-galom ->protokol)

KOTRANSFEKCIJA

Protokol: transfekcija
 Transfekcija stanica s dva razliita plazmida npr. BMP6 i pSV. pSV je u manjoj
koncentraciji u odnosu na BMP6 te je tu samo indicator da je dolo do transfekcije
kada emo stanice bojati X-galom. Ovisno o koncentraciji plazmidne DNA, potrebno je
izraunati volumen dodavanja odreene pl.DNA. U konanici, epica mora sadravati 10
g plazmidne DNA ( u ovom sluaju 9 g BMP6 i 1 g pSV).