37.

Mikrobiolgiai diagnosztikai mdszerek

(Ismertesse a bakteriolgiban, mycolgiban, parazitolgiban, s a virolgiban
alkalmazott tenysztses, szerolgiai, molekulris biolgiai s egyb mdszereket s
kimutatsi lehetsgeket.)

A klinikai mikrobiolgia nll disciplina, mely a klinikai orvosls szolglatban ll

gyakorlati, alkalmazott tudomny. Fontos a mikrobiolgus s a klinikus kztti folyamatos
munkakapcsolat. A minta bekldsnek ltalnos szablyai kzl ki kell emelni a
kontaminci megelzst, a biztonsgos, trsmentes bekldst, s a gyorsasgot, ill. a
vizsglat krlap (ksr lap) kitltsnek jelentsgt. A mikrobiolgia arra trekszik, hogy
jl megvlasztott, helyesen vett s kldtt mintbl, a minthoz mellkelt klinikai informci
alapjn, minl hamarabb oki genst igyekezzen tallni a beteg eredmnyes kezelsnek
elsegtse rdekben. A mikrobiolgiai vizsglat lehet ktelez, diagnosztikus, szr, ill.
felszabadt.

Diagnosztikai mdszerek:

A krokoz kimutatsa:

- mikroszkpos vizsglattal (natv s festett ksztmny)

- tenysztssel
- llatoltssal
- a krokoz antignjnek kimutatsval (coagglutinaci, latex agglutinci,
immunfluorescencia, CIE, EIA, ELISA, RIA, immunoblotting)
- a krokoz nukleinsav sszetevit (nukleinsav hibridizci, PCR)
- a krokoz enzimjeit, enzimaktivitsnak vgtermkeit (gz chromatographia)
analizl eljrsokkal.

Az infekci sorn megjelen ellenanyagok kimutatsa, adja a msik lehetsget (agglutinati,

precipitci, komplementktsi prba, haemagglutinati gtls, indirekt immunfluorescens
eljrs, ELISA, immunblotting)

agglutinci: Az agglutincis reakcikban az antignt vagy az antitestet a vrsvrsejtek

vagy egyb hordozrszecskk, pl. latex szemcsk felletre ktik.

immunfluorescencia: A fnymikroszkpos immuncitokmia legelterjedtebben alkalmazott

vltozata az immunfluoreszcencia mikroszkpia. A metszetet vagy a detergens kezelssel
permeabilizlt sejtet a vizsgland fehrje elleni antitesttel kezelik, amelyet fluoreszcens
festkkel jelltek meg. Ha a ksztmnyt ezutn fluoreszcencia-mikroszkpban vizsgljk,
csak a specifikus fehrjt tartalmaz, antitestet kt rgik fognak fluoreszklni. Klnbz
szn festkek alkalmazsval ugyanazon metszetben, sejtben klnbz fehrjk
expresszija, lokalizcija vizsglhat.

ELISA: enzimhez kttt ellenanyag-vizsglat Az enzimhez kapcsolt immunszorbens

vizsglatok (ELISA) olyan, szilrd fzison lejtszd sznreakcik, ahol a reagensek manyag
fellethez vannak ktve, s a reakcit enzimmel kapcsolt antitest segtsgvel kvetjk
nyomon.

immunblotting: Az eljrs specifikus fehrje detektlsra s mennyisgnek

meghatrozsra alkalmas jelletlen fehrjekeverkben

PCR:A polimerz-lncreakci egy molekulris

biolgiai technolgia DNS enzimatikus amplifiklsra (azaz a kpik megsokszorozsra)
l szervezet, pldul E. coli vagy leszt, ignybevtele nlkl. A technolgia lehetv teszi
a DNS egy kis darabjnak megsokszorozst analzis cljbl.

precipitci: Az elnevezs onnan szrmazik, hogy ha megfelel mennyisg antign s

antitest tallkozik egymssal, akkor a reakci lthat csapadkkpzdsben nyilvnul meg. A
minta szvetnedvt sszekeverjk az antiszrummal. Az inkubls utn szabad szemmel vagy
mikroszkppal rtkelnk. Amennyiben az antign (azaz a keresett vrus) jelen volt a
szvetnedvben, akkor az antignantitest reakci kvetkeztben apr pelyhekbl ll
csapadk keletkezik.

komplementktsi prba: rzkeny szerolgiai eljrs, amely az ellenanyagok, vagy

antignek kis mennyisgnek kimutatsra is alkalmas.

haemagglutinci gtls: A hemagglutinci felhasznlhat a vrsvrsejt

felleti antignek azonostshoz (az ismert antitestekkel), vagy az antitestekre (ismert
felleti antigen vrsvrsejtekkel).

A klinikai mikrobiolgia felosztsa:

- klinikai bakteriolgia
- kl. virolgia
- kl. mycolgia
- kl. parazitolgia: protozoolgia, helmintholgia, entomolgia

Bakteriolgia:

A baktriumok alaki tulajdonsgainak tanulmnyozsra a fnymikroszkp szolgl,

ismeretesek mg a fziskontraszt, a sttltteres, a fluorescens mikroszkpok is. Finom
szerekezeti vizsglatokhoz elektronmikroszkpot (transzmisszis vagy psztz EM)
hasznlnak.

A baktriumok natv vagy festett llapotban vizsglhatk.

Natv ksztmnyben a baktrium aktv mozgst llapthatjuk meg.

Festsi eljrsokat kt csoportba sorolhatjuk (annak megfelelen, hogy egy vagy tbb fle
festkoldatot hasznlunk a bakt.-ok sznezsre):

- egyszer
- sszetett
Egyszer fests:

- vizes metilnkk vagy vizes fuchsinoldattal festjk a ksztmnyt.

- alaki, szerkezeti elrendezds, baktriumok mrete vizsglhat

sszetett festsi eljrsok:

- Gram-fests: Az eljrs lnyege az, hogy a fests s az acetonos alkohollal trtn

differencils sorn a sejtfal szerkezet klnbzsge miatt a baktriumok a kontraszt
fests sorn elsznezdnek. A Gram-pozitv baktriumok lilskkek, a Gram-negatv
baktriumok pedig pirosak lesznek. A Gram-fests nlklzhetetlen a baktriumok
identifiklsban.
- Ziehl-Neelsen-fests: a mycrobaktriumok kimutatsra s azonostsra alkalmazott
eljrs, melynek alapja a mycrobaktriumok sejtfalban tallhat lipidek s viaszok
nagy mennyisge. A savval, vagy ssavas alkohollal trtn kezelst kveten
ugyanis ezekbl a carbolos fuchsin nem oldhat ki, ezrt lnkpirosra festdnek, mg
ms mikrobk knnyen elszntelenthetk s a metilnkkes utnfests sorn kkre
festdnek.
- Neisser-fests: a baktriumban jelenlv szemcsk, volutin rgk kimutatsra
szolgl.

A csillk festssel (Peppler-fle fests) vagy ezst impegrcis eljrssal, immunfluorescens

festssel tehetk lthatv. A mozgskpessg indirekt bizonytkaknt a higagar tptalajban
U-csben vagy a tptalaj lemez felletn megfigyelhet rajzs (lepedkkpzds) szolgl.

A tok kimutatsra morfolgiai s immunolgiai mdszerek szolglnak pl.: tus-mdszer,

specilis festsek, immunfluorescens fests, Neufeld-fle tok-duzzadsi prba.

A sprk fnymikroszkppal knnyen vizsglhatk, viszont nehezebben festhet, mint a

vegetatv alak, de intenzv pcolssal sznezhet (Mller-fle spra fests).

Antibiotikum rzkenysgi vizsglatok: Ehhez a mintbl tenysztett mikroba szintenyszett

kell felhasznlni. Az n. diffzis korong mdszerhez Bauer-Kirby mdszert kell hasznlni, a
Mueller-Hinton agar, vagy Isosensitest agar tptalajok alkalmazsval. A vizsgland trzs
tenyszetbl folykony tptalajon 2-4 rs eltenyszetet kell kszteni a megfelel srsg
inokulum cljra. A tptalajokat ezen eltenyszetekbl egyenletes szlestssel kell beoltani.
Az antibiotikum tartalm korongokat az elinkublt s szrtott, beoltott tptalajokra gy kell
felhelyezni, hogy azok egymshoz egyforma tvolsgra legyenek s a kialakul gtlsi znk
(rzkenysg esetn) leolvashatak legyenek. A gtlsi znk tmrje alapjn, 18-20 rs
37C-on vgzett inkubls utn hrom kategrit klnbztetnk meg: rzkeny, mrskelten
rzkeny, rezisztens. Pontosabb eredmnyek rdekben minimlis gtl koncentrcit (MIC)
vagy minimlis baktericid koncentrcit (MBC) hatroznak meg a hgtsos mdszerrel. Ezt
helyettesti az E-teszt: klnleges alapanyag cskok koncentrci gradiens formjban
tartalmazzk az antibiotikumot. Ezeket a cskokat kell a beoltott Mueller-Hinton agar
tptalajokra elhelyezni, inkubls utn ellipszis alak gtlsi zna keletkezik, a MIC rtk a
metszspont alapjn leolvashat.
Virolgia:

A vrusok alaki sajtossgai elektronmikroszkppal tanulmnyozhatak.

Termszetes s mestersges tptalajon nem tenyszthetk, csak l sejtben, szvetben

szaporthatk. (A gazdasejt, melybe a vrus bejutott,tprogramozdik a vrus nukleinsav
hatsra, gy elindul a replikci, a sejtbl kijut rszecske, a virion, amely fertz, s
genetikai informcit hordoz.)

A krokoz kimutatsa fogkony ksrleti llatban (egr, nyl, hrcsg, tengerimalac stb.),
csirkeembriban, vagy fogkony sejttenyszeten val szaportssal, tenysztssel vagy vrus
antignek kimutatsval, enzymimmunoassay (EIA, ELISA), immunoblottinggal, nukleinsav
hybridizcival, polymerzlnc reakcival lehetsges. A vrus DNS vagy RNS kimutatsra
lehetsg van.

A vrus fertzs hatsra bekvetkez immunvlasz, az ellenanyagok kimutatsra

komplementktsi reakci, vrusneutralizci, haemagglutinatigtls, indirekt
immunfluorescens teszt, immundiffuzi, enzymimmunoassay (ELISA) segtsgvel trtnhet.

Mycolgia:

(dermatomycosisok, subcutis mycosisok, systems mycosisok, generalizlt mycosisok)

Dermatomycosisok: mikroszkpos vizsglatok (Nativ s KOH-l kezelt ksztmnyek

mikroszkpos vizsglata a gomba alakok kimutatsra.) Subcutis, systemas mycosisok: festett
ksztmnyek vizsglata (tusfests), szvettani ksztmnyek, metszetek vizsglata

Gombk tenysztse: a dextrose-t tartalmaz Sabouraud tptalajon trtnik. Dimorf gombk

tenysztsre vresagar tptalajt is mindig hasznlni kell. A sarjadz gombkat cukorbontsi
tesztekkel identifikljk.

A kitenysztett gombk antimikotikus szerekkel szembeni rzkenysgt E-tesztettel

vizsgljk.

A gombs betegsgek szerolgiai diagnzisa: komplementktsi prba, immundiffzi, latex

agglutinci, ELISA, immunfluorescencia, ritkn agglutinci hasznlhat, ezeket elssorban
systms belsszervi vagy generalizlt mycosisok esetben alkalmazzk.

Az allergis cutn prbk is jl hasznlhatk mycosisok esetn.