Prirodno-matematiki fakultet

Univerzitet u Sarajevu

BOJENJE BAKTERIJA U MIKROBIOLOGIJI

Ime i prezime : Medina Rondi

Predmet : Mikrobiologija

Prof. dr. Anesa Jerkovi-Mujki

 SADRAJ :

SADRAJ : .......................................................................................................................................................................2
1. UVOD .........................................................................................................................................................................3
2. METODE POSMATRANJA MIKROORGANIZAMA ........................................................................................................4
2.1. Nativni preparati .................................................................................................................................................4
2.2. Obojeni preparati ...............................................................................................................................................5
3. BOJENJE BAKTERIJA ...................................................................................................................................................6
3.1. Mikrobioloke boje .............................................................................................................................................6
3.1.1. Hemijski sastav boja ....................................................................................................................................7
3.2. Rastvor boje ........................................................................................................................................................7
3.3. Priprema preparata ............................................................................................................................................8
4. METODE BOJENJA ......................................................................................................................................................8
4.1. Jednostavno bojenje ...........................................................................................................................................8
4.2. Sloeno bojenje ..................................................................................................................................................9
4.2.1. Bojenje po Gramu ........................................................................................................................................9
4.2.2. Bojenje po Cil Nilzenu ................................................................................................................................11
4.2.3. Bojenje spora .............................................................................................................................................12
4.2.4. Bojenje flagela ...........................................................................................................................................12
4.2.5. Bojenje kapsula ..........................................................................................................................................13
5. ZAKLJUAK ...............................................................................................................................................................14
6. LITERATURA .............................................................................................................................................................15

2
 1. UVOD

Mikrobiologija je znanost koja se bavi proavanjem mikroba ije se dimenzije izraavaju u mikrometrima
(10-6 ) . Za njihovo posmatranje i prouavanje koristi se mikroskop. Ukoliko nas zanima oblik i veliina
bakterija sluimo se obinim svetlosnim mikrokopom,meutim, ukoliko elimo posmatrati ultrastrukture
koristiemo elektronski mikroskop .

Ako elimo da posmatramo ivu bakterijsku stanicu i na taj nain ustanovimo njenu pokretljivost,oblik i
veliinu sluiemo se nativnim preparatom koji nam nee dati uvid u detaljniju grau. Pored nativnih
preparata postoje i obojeni preparati koji se razlikuju po tome to stanice usled tretiranja bakteriolokim
bojama umiru.

Pojedine vrste bakterija boje se na razne naine istim bojama. Sem toga, i pojedini delovi bakterijske
strukture ne primaju sve boje na isti nain niti na njih isto reaguju. Zbog toga je bojenje bakterija, naroito
za praktine, rutinske svrhe, jedan od najvanijih metoda, a esto i jedini metod za identifikaciju i
diferencijaciju pojedinih vrsta.

3
 2. METODE POSMATRANJA MIKROORGANIZAMA

Sve mikrobe, s izuzetkom virusa moemo posmatrati svetlosnim mikroskopom sluei se poveanjem do
1000 puta. Metode posmatranja koje emo primenjivati zavise u prvom redu od toga radi li se o bakterijama
ili gljivama, a zatim i o tome elimo li posmatrati ive ili mrtve i obojene mikrobe. Prema tome postoje :

nativni preparati i
obojeni razmazi,odnosno preparati.

Ako se sluimo svetlosnim mikroskopom, imamo na izbor vie tehnika posmatranja :

normalna mikroskopija,
fazna mikroskopija,
mikroskopija u tamnom polju i
fluorescentna mikroskopija (Bezjak,1974).

Faznokontrastni mikroskop ima specijalan objektiv i dijafragmu,koji omoguavaju da se strori znatno

vei kontrast izmeu objekta i okoline. Ovim mikroskopom omogueno je posmatranje ivih, neobojenih
stanica (Jerkovi-Mujki i Pili,2014).

Pri mikroskopiranju u tamnom polju ne koristi se svetlost koja je prola direktno kroz preparat,ve svetlost
rasprena od posmatranog objekta, dok se sam preparat osvetljava sa strane (Jerkovi-Mujki i Pili,2014).

Fluorescentni mikroskop se koristi za vizuelizaciju objekata koji imaju mogunost da odaju svetlost
odreene boje tj. da fluoresciraju, kada se osvetle ultravioletnom svetlou (Jerkovi-Mujki i Pili,2014).

Mikrobe moemo posmatrati sluei se elektronskim mikroskopom koji koristi snop elektrona pri
stvaranju slike,a soiva su mu elektromagneti. Ovom tehnikom mogue je videti vie detalja u grai elije.
Razlikuju se dva osnovna tipa elektronskog mikroskopa,a to su :

transmisioni (TEM) i
pretrani (scanning EM ili SEM) (Jerkovi-Mujki i Pili,2014).

2.1. Nativni preparati

To su pripravci materijala bez ikakve obrade samo to se po potrebi doda voda ili fizioloka otopina NaCl,
a nalaze se na predmetnom staklu pokriveni pokrovnim stakalcem. U mikrobiologiji se rade iznimno (tj.

4
preteno za utvrivanje pokretljivosti bakterija, odnosno kod posmatranja spiroheta u tamnom polju).
Nativni preparati se posmatraju s malim ili srednjim poveanjem mikroskopa,a samo iznimno upotrebom
objektiva za imerziju. Najee ih promatramo normalnom ili faznom mikroskopijom. Stanovita je prednost
nativnih preparata pred obojenim u brzini i jednostavnosti pripreme, a mikrobe vidimo u njihovoj prirodnoj,
neizmenjenoj morfologiji (Bai i Belagi,1998).

Za pripremanje obinog nativnog preparata potrebna je suspenzija bakterija, kolonija sa vrste podloge ili
bolesniki materijal (Bai i Belagi,1998).

Drugi tip nativnog preparata je visea kap koji se priprema u specijalnim predmetnim staklima sa
udubljenjem u sredini ili na krajevima. Jedna kap ispitivanog materijala stavi se sterilnom ezom na sredinu
ljuspice, okrene i postavi tako da kap doe iznad udubljenja ploice. Okolinu udubljenja ili ivice ljuspice
treba prethodno namazati tankim slojem vazelina da bi se spreilo isuivanje preparata. Ovaj oblik nativnog
preparata omoguava due posmatranje, a time i bolje uoavanje pokretljivosti (Bai i Belagi,1998).

2.2. Obojeni preparati

Da bismo mikroorganizme mogli obojiti, moramo najpre prirediti odgovarajui preparat, a to je razmaz
materijala u kome se mikrobi nalaze. Ako elimo posmatrati mikrobe prisutne u tkivu, moemo nainiti i
histoloke rezove, a tek onda obojiti (Bezjak,1974).

U bojenju mikroba postoji niz razliitih metoda, jednostavnih ili sloenih. Najee se koriste razliite
anilinske boje, odnosno kombinacije dve boje ili meavine vie boja (npr. Giemsa). Metode bojanje nazivaju
se prema autoru koji ih je uveo u praksu (Bezjak,1974).

Slika 1: Obojeni preparat

5
 3. BOJENJE BAKTERIJA

Bojenje bakterija se koristi u mikrobiolokim laboratorijama sa ciljem da se utvrdi oblik

mikroorganizama, njihova veliina, karakteristian raspored u odnosu na vrstu, njihova unutranja i
spoljanja hemijska struktura i odnos pojedinih delova bakterijske elije prema primenjenoj boji. Pojedini
delovi bakterijske elije boje se razliito. Mikroskopiranje obojenih bakterija predstavlja jednu od metoda
identifikacije. Za bojenje raznih vrsta mikroorganizama kosriste se posebne boje koje se nazivaju bioloke
odnosno mikrobioloke boje (Bai i Belagi,1998).

3.1. Mikrobioloke boje

Boje su tvari koje imaju sposobnost apsorpcije svjetlosti u vidljivom delu spektra, odnosno u rasponu od
380 do 760 nm. Ona se fizikim silama ili hemijskim vezama veu na materijale te ih na taj nain oboje.
Zajedniko hemijsko svojstvo boja je veliki broj nezasienih veza u molekulskoj strukturi. Obojenost tvari
zavisi od razmetanja dvostrukih veza i o njihovom broju, te o hemijskoj strukturi molekula odreene tvari
(Novoseli,2016).

Mikrobioloke boje po svom poreklu mogu biti:

priorodne i
sintetike.

Prirodne boje dobijaju se ekstrakcijom iz raznih biljaka ili ivotinja. Proces njihovog dobijanja je dosta
teak i komplikovan, pa su zbog toga veoma skupe. U godinama intenzivnog razvoja mikrobiologije
prirodne boje se uglavnom zamenjuju vetakim. Danas se jo uvek od prirodnih boja (koje nisu
sintetizovane) koristi : indigo koji se dobija iz roda biljaka Indigofera koje sadre glukozid indikan a koji
varenjem daje boju indigo karmin. Brazilin je takoe prirodna boja koja se dobija kao ekstrakt kore
brazilskog drveta. Bezbojan je kada se svee pripremi. Oksidacijom dobija crvenu boju koja se naziva
brazilin (Bai i Belagi,1998).

Vetake boje koje se upotrebljavaju u mikrobiolokim laboratorijama su uglavnom anilinske boje. Nisu
sve derivati anilina, ak nemaju ni srodnost sa tom vrstom jedinjenja. Dobijaju se procesima destilacije
katrana, kamenog uglja, pa su neki autori predlagali za njihov naziv ugljenokatranske boje. Smatraju se
derivatima benzena ili benzola. Ove boje su mnogo jeftinije od prirodnih,a njihova prednost je u
standardizaciji (Bai i Belagi,1998).

6
 3.1.1. Hemijski sastav boja

Svaka boja sadri heterohromnu i auksohromnu grupu.

Hromoforne skupine, od kojih se sastoji molekula bojila, nosioci su obojenosti jer su odgovorne za
selektivnu apsorpciju svjetlosti (Novoseli,2016).

Pored hromoforne grupe boje sadre i auksohormnu grupu koja je vezanu za benzolov prsten koja
omoguava hemijsku reakciju izmeu hromofora i hemijskih spojeva u stsanici (Jerkovi-Mujki,2008).

Od auksokromnih skupina najvanije su hidroksilna (-OH), amino (-NH2), sulfonska (- SO3H) i

karboksilna (-COOH) skupina. Topivost boja u vodi poveae prisustvo sulfonskih (-SO3H) i karboksilnih
(-COOH) skupina (Novoseli,2016).

Na osnovu tipa auksohromne grupe razlikuju se :

kisele,
bazne i
neutralne boje.

Kisele boje imaju veliki afinitet za pozitivno nabijene molekule a bazne boje za negativno nabijene
molekule. Zbog postojanja negativnog naboja na povrini bakterijske stanice bazne boje su delotvornije i
ee se koriste u bojenju. Poznatije bazne boje su metilensko plavo, kristal violet, bazini fuksin i dr
(Jerkovi-Mujki,2008).

3.2. Rastvor boje

Boje se nalaze u cvrstom stanju u prahu ili u vidu kristala,a upotrebljavaju se njihovi zasieni vodeni ili
alkoholnirastvori (najee odgovaraju 1-2% rastvoru boje), mada se neke vrlo lepo rastvaraju u
karanfilievom ulju (na primjer oran, svetlo zeleno i druge).

Rastvor se moe pripremiti prema tzv.direktnom nainu, kada se boja rastvara direktno u destilovanoj
vodi, ili indirektnom nainu, kada se prvo pripremi zasieni alkoholni rastvor boje. To je matini rastvor od
kog se posle pravi razblaen rastvor boje u destilovanoj vodi. Vodeni rastvori su manje postojani pa je
preporuljivo pripremiti matini rastvor koji moe due stajati, a od njega se lako priprema pravi rastvor za
bojenje. Matini rastvor se pravi u 96% alkoholu tako to se u odreenu koliinu alkohola postepeno dodaje

7
boja dok se ne pojavi talog koji se dalje ne rastvara. Rastvor se ostavi 2-3 dana u termostatu na 30C a zatim
se prema potrebi pravi rastvor za bojenje (Rad u biolokoj laboratoriji).

Na 100 ml desilovane vode dodaje se matinog rastvora:

fuksin 10 ml,
genciana violet 15-20 ml i
metilensko plavo 20-30 ml

3.3. Priprema preparata

Kada se materijal koji se ispituje stavi na sterilno predmetno staklo, potrebno ga je ezom razvui unutar
oznaenog kruga kako bi se dobio razmaz preparata jednake debljine. Ukoliko se radi o guem bolesnikom
materijalu potrebno ga je staviti u jednu kap vode i opet razvui ezom. Preparat se ostavi na vazduhu da se
osui, nakon ega se vri fiksiranje preparata prevlaenjem donje strane predmetnog stakla kroz gornji deo
plamenika (Bai i Belagi,1998).

Za osetljive bakterije kao to je Neisseria meningitidis fiksiranje se vri u etilnom ili metilnom alkoholu.
fiksiranje se vri radi toga da bi se bakterije zadrale na predmetnom staklu i da bi se zaustavili enzimski
procesi u eliji. U zavisnosti od vrste bojenja preparat se prelije sa jednom ili vie boja, koje se sipaju
kapaljkom tako da se prelije itav razmaz u oznaenom krugu. Posle kraeg vremena boja se odlije sa
preparata, ispere destilovanom vodom i ostavi da se osui. U hitnim sluajevima za mikroskopiranje preparat
se moe osuiti i filter papirom koji lagano upija tenost. Kada je preparat osuen moemo pristupiti
mikroskopiranju (Bai i Belagi,1998).

4. METODE BOJENJA

Metode bojenja bakterija mogu biti:

jednostavna ili prosta bojenja i

sloena bojenja.

4.1. Jednostavno bojenje

Jednostavna ili prosta bojenja su takva bojanje pri kojima se koristi samo jedna boja, najee metil plavo
ili karbol fuksin, a slui za orijentaciono ispitivanje bakterija. Ovako bojenje moe biti monohromatsko i
8
metahromatsko. Kod monohromatskog bojenja cela bakterijska elija se oboji ravnomerno i jednako jednom
bojom ( metilensko plavo, karbol fuksin, gencijana violet). Metahromatsko bojenje je takvo bojenje kod
kog se razliiti delovi bakterijske elije oboje razliito, na primer: toluidom se oboji protoplazma plavo,a
nukleoid crveno (Bai i Belagi,1998).

Slika 2 : Preparat tretiran metilensko plavim Slika 3 : Preparat tretiran karbol fuksinom

4.2. Sloeno bojenje

Sloena bojenja su bojenja kod kojih se koristi vie od jedne boje. Dele se na:

diferencijalna i
specijalna bojenja.

Diferencijalna bojenja nam omoguavaju razlikovanje odreenih grupa bakterija u zavisnosti od njihovog
hemijskog sastava. Njee upotrebljavamo diferencijalno bojenje po Gramu koje je uveo Kristijan Gram
(Christian Gram) 1884. godine (Bai i Belagi,1998).

Specijalna bojenja su bojenja koja se koriste za isticanje struktura pojedinih delova bakterijske elije kao
to su kapsula, spore, flagele, metahromatska zrnca i sl (Bai i Belagi,1998).

4.2.1. Bojenje po Gramu1

Dosad su preporuene mnogobrojne modifikacije originalnog bojenja po Gramu. U produetku je prikazana

ona modifikacija koja se najee koristi i koja se moe smatrati klasinim metodom bojenja po Gramu.

1
Hans Christian Joachim Gram (13. septembra 1853. - 14. snovembra 1938.) bio je danski bakteriolog i lekar, najpoznatiji je po
uvoenju metode bojenja koja po njemu nosi naziv.
9
 Za bojenje po Gramu potrebne su sledee integracije:

rastvor gencijana-ljubiastog,
Lugolov rastvor,
etanol,
destilirana voda i
rastvor karbolnoga fuksina.

Rastvor karbolnog gencijana-ljubiastog. Slui za bojenje bakterija. Tu boju zadravaju Gram-

pozitivne, a otputaju Gram-negativne bakterije, kada se odbojavaju alkoholom. Bolje je da se umesto te
boje koristi kristal-ljubiasto ili metil-ljubiasto.

Lugolov rastvor. Slui za bolje fiksiranje gencijana-ljubiastog (ili kristal- ili metil-ljubiastog) za
bakterije i za njihovo jasnije diferenciranje. On se sastoji od 1 g joda i 2 g kalijumovog jodida rastvorenih
u 300 ml destilovane vode.

Alkohol.- Slui za odbojavanje Gram-negativnih bakterija. Koristi se 96%-tni etilni alkohol (etanol).
Odbojavanje se vri tako da se alkohol kaplje kap po kap na preparat obojen karbol-gencijana-ljubiastim.
Preparat se dri koso tako da se alkohol sliva sa njega. Odbojavanje treba oprezno vriti sve dok sa preparata
kaplje obojeni alkohol.

Voda.- Slui za prekidanje procesa odbojavanja. im se primeti da sa preparata kaplje neobojeni alkohol,
preparat treba preliti destilisanom vodom.

Rastvor karbol-fuksina.- Taj rastvor ili rastvor neutralno crvenog slui za naknadno ili kontrastno bojenje
odbojenih Gram-negativnih bakterija.

Najobiniji nain bojenja po Gramu se vri tako da se sa fiksiranim preparatom postupa na sledei nain
i sledeim redom:

1. bojiti karbol-gencijana-ljubiastim 3 min.

2. odliti boju;
3. preliti Lugolovim rastvorom i drati 2 min ;
4. odbojavati alkoholom;
5. ispirati vodom ;
6. diferencijalno bojiti karbol-fuksinom 15-30 sek.;

10
 7. isprati vodom,osuiti i gledati pod mikroskopom.

Rezultat: Gram-pozitivne bakterije su obojene tamnoljubiasto, Gram-negativne crveno,a sve ostalo ostaje
svetlije ljubiasto (slika 4) (Karakaevi,1980).

Slika 4 : Prikaz preparata obojenog po Gramu

4.2.2. Bojenje po Cil Nilzenu

Diferencijalno bojenje po Cil Nilzenu (Zeihl Neelsenu) je bojenje na osnovu kojeg se difernciraju
acidoalkoholorezistentne bakterije od nerezistentnih. Ovaj nain bojenja najee se primenjuje kod bojenja
mikobakterija. Neke bakterije se teko boje obinim metodama bojenja jer su okruene raznim ovojnicama
sastavljenim od masnih i votanih materijala pa se zbog toga takvi mikroorganizmi ne boje lako, i to su
acidoalkoholorezistentne bakterije (otporne na delovanje kiselih alkohola). Bojenje ovih bakterija se vri uz
zagrevanje do pojave pare ali bez kljuanja u trajanju 5-8 minuta uz doljevanje boje, ukoliko je potrebno.
Prva boja kojom se preliva razmaz je karbol fuksin . Kada se preparat ohladi, ispere se vodom, a zatim
odbojava kiselim alkoholom ija je uloga da odboji bakterije koje tu boju otputaju. Posle odbojavanja
alkoholom preparat se ponovo sapere vodom i boji kontrasnom bojom (2-3 puta razblaenim rastvorom
metilenskog plavila). Rezultat bojenja je da se acidoalkoholorezistentne bakterije oboje crveno,a sve ostale
bakterije razliitim nijansama plave boje (Bai i Belagi,1998) .

11
 Slika 4 : Prikaz Zeihl Neelsenove tehnike bojenja,strelice

pokazuju acidoalkoholorezistentne bakterije

4.2.3. Bojenje spora

Neke bakterije (npr. iz roda Bacillus i Clostridium) unutar svoje stanice stvaraju specijalne strukture
endospore. Takve bakterije nazivaju se sporogene i najee se nalaze u tlu (Jerkovi-Mujki,2008)

Postoje dva postupka bojenja endospora:

indirektno bojenje i
direktno bojenje endospora.

4.2.4. Bojenje flagela

Bievi su suvie tanki (0,013 u promeru) da bi se mogli raspoznati pod obinim mikroskopom. Meutim,
njihova prisutnost i raspored mogu se prikazati ako se preparat obradi nestabilnom koloidnom suspenzijom
tanata : jaki precipitati obloe stanini zid i bieve. Na taj nain bievi podebljaju pa se obojeni naknadno
baznim fuksinom dobro vide i pod obinim mikroskopom. Kod nekih bakterija se bievi u pokretu spliu u
snopie, koji mogu biti dovoljno debeli da se vide na ivim preparatima u tamnom polju ili pod
mikroskopom s faznim kontrastom (Jewetz,Melnick i Adelberg,1969).

12
4.2.5. Bojenje kapsula

Kapsule se obino dokazuju negativnim bojenjem ili njegovom modifikacijom.

Negativnim bojenjem preparat se tretira kiselom bojom pa, prema tome, bakterije ostaju bezbojne u
obojenom kantrastu. Najee se upotrebljava crna boja nigrozin. Ta se metoda koristi kad se radi o
stanicama ili strukturama koje se teko boje.

Jedno od modifikacija negativnog bojenja kapsula ( Welchova metoda) trai obradu materijala vruom
otopinom kristal-violeta, nakon ega se preparat ispere otopinom bakarnog sulfata. Ovaj se upotrebljava da
bi se uklonio viak boje, budui da bi obino ispiranje preparata vodom otopilo kapsule. Osim toga bakarni
sulfat daje boju pozadini preparata pa pozadina i stanice ispadaju tamnomodro, dok su kapsule obojene
mnogo svetlije (Jewetz,Melnick i Adelberg,1969).

4.2.6. Bojenje staninog zida i citoplazmatske membrane

Za bojenje ovih struktura koristi se Victoria-modrilo koje je specifino za njih. To je modrilo smjesa
baznih boja topivih u vodi koje pripadaju nizu fenol-metana. Razlog njihovog afiniteta prema staninom
zidu i membrani nije poznat (Jewetz,Melnick i Adelberg,1969).

13
 5. ZAKLJUAK

Bojenje bakterija predstavlja jednu od najznaajnijih metoda posmatranja bakterija. Nekada predstavlja i
jedini metod za identifikaciju i determinaciju bakterijske vrste. Nedostatak ovog metoda je to to ne
dozvoljava posmatranje ivih stanica jer bakterije prilikom pripreme preparata uginu.

Boje su tvari koje imaju sposobnost apsorpcije svetlosti u vidljivom delu spektra. Svaka boja sadri
hromofornu i auksohromnu grupu. Hromoforna grupa je nosilac obojenosti,a auksohromna omoguava
hemijsku reakciju izmeu hromofora i hemijskih spojeva u bakterijskoj stanici.

Boje se prema poreklu dele na prirodne i sintetike. Boje se obino nalaze u vrstom stanju u vidu praha
ili kristala i da bismo ih koristili u laboratoriji potrebno je da pripremimo ratsvor boje.

Razlikujemo jednostavno i sloeno bojenje. U jednostavnom bojenju sluimo se samo jednom bojom,a u
sloenom koristimo vie boja. Sloeno bojenje moe biti diferencijalno i specijalno. Diferencijalno bojenje
koristimo kako bi izvrili odvajanje i identifikaciju razliitih bakterija. Najznaanija diferencijalna bojenja
su bojenje po Gramu i Cil Nilzenu. Specijalno bojenje koristi se za bojenje pojedinanih bakterijskih
struktura kao to su spore, flagele, kapsula, stanini zid i plazma membrana.

14
 6. LITERATURA

Karakaevi, B. (1980). Mikrobiologija i parazitologija, Medicinska knjiga Beograd-Zagreb.

Jawetz, E., Melnick, J. L., Adelberg, E. A. (1969). Pregled medicinske mikrobiologije, kolska knjiga
Zagreb.

Bai, F., Belagi, E.(1998). Mikrobiologija,morfoloki aspekti sa dijagnostikom, Medicinski fakultet

Sarajevo.

Bezjak, V. (1974). Opa mikrobiologija, kolska knjiga-Zagreb.

Jerkovi-Mujki, A. (2008). Praktikum iz ope mikrobiologije, Prirodno-matematiki fakultet Univerziteta

u Sarajevu.

Jerkovi-Mujki, A. , Pili S. (2014). Prirunik za vjebe iz citologije, Prirodno-matematiki fakultet

Univerziteta u Sarajevu.

Novoseli, K. (2016). Obezbojenje kongo crvenila i malahitnog zelenila pomou Trametes versicor na
vrstim supstancama. Diplomski rad. Osijek : Prehrambeno-tehnoloki fakultet.

Rad u biolokoj laboratoriji. Dostupno na : https://ar.scribd.com/doc/26811443/Rad-u-Bioloskoj-

Laboratoriji

15