Poglavlje 5 Replikacija, odr`avanje i
preslagivanje
Replikacija DNA 179
Popravak DNA 192
Rekombinacija izme|u
homolognih sljedova
DNA 204
Preslagivanje DNA 211
KLJU^NI POKUS:Preslagivanje
imunoglobulinskih gena 218
MOLEKULARNA MEDICINA:
Karcinom debeloga crijeva i
popravak DNA 203
genomske DNA
O SNOVNI BIOLO[KI PROCES RAZMNO@AVANJA zahtijeva vjerni prijenos gene-
ti~ke informacije s roditelja na potomstvo. Zbog toga je to~na replikaci-
ja genomske DNA klju~na za `ivot svih stanica i organizama. Svaki pu-
ta kad se stanica dijeli, njezin cjelokupni genom mora biti udvostru~en, pri
~emu je za kopiranje velikih molekula DNA koje izgra|uju prokariotske i euka-
riotske kromosome potrebna prisutnost cijelog niza enzima. Uz to, stanice su
razvile mehanizme za popravljanje pogrje{aka koje se ponekad doga|aju za vri-
jeme umna`anja DNA te za popravak o{te}enja koja nastaju kao rezultat djelo-
vanja ~imbenika okoli{a kao {to je zra~enje. Nepravilnosti u ovim procesima re-
zultiraju nemogu}no{}u to~ne replikacije i odr`avanja genomske DNA po-
grje{kom koja mo`e imati katastrofalne posljedice kao {to je razvoj karcinoma.
Unato~ va`nosti precizne replikacije i odr`avanja DNA, stani~ni genomi su
ipak podlo`ni promjenama. Da bi se vrste evolucijski razvijale, potrebna je pri-
sutnost mutacija i preslagivanja gena kako bi se odr`ala geneti~ka varijabilnost
izme|u jedinki. Rekombinacija homolognih kromosoma za vrijeme mejoze igra
va`nu ulogu u ovom procesu omogu}uju}i roditeljskim genima da preslagiva-
njem (rearan`manom) stvaraju nove kombinacije u budu}im generacijama.
Smatra se da preslagivanje sljedova DNA unutar genoma stvaranjem novih
kombinacija geneti~kih informacija tako|er pridonosi evolucijskom napretku.
Uz to su neki oblici preslagivanja DNA programirani za regulaciju ekspresije ge-
na tijekom diferencijacije i razvoja individualnih stanica i organizama. Karakte-
risti~an primjer toga procesa kod ljudi predstavlja preslagivanje imunoglobulin-
skih gena tijekom razvoja imunolo{kog sustava. Stoga je za razvoj pojedina~nih
organizama kao i za evoluciju vrsta potrebna suptilna ravnote`a izme|u odr`a-
vanja i varijabilnosti nasljednih informacija.
Replikacija DNA
Kao {to je navedeno u tre}em poglavlju, replikacija DNA je semikonzervativan
proces u kojem svaki roditeljski lanac slu`i kao kalup za sintezu novih, komple-
mentarnih lanaca k}eri. Glavni enzim uklju~en u ovaj proces je DNA-polimera-
za koja katalizira spajanje deoksiribonukleozid-5'-trifosfata (dNTP) rastu}eg lan-
ca DNA. Ipak, replikacija DNA znatno je kompleksnija i zahtijeva vi{e od jedne
enzimske reakcije. U cjelokupan proces uklju~eni su brojni drugi proteini, a nu-
`na je i prisutnost korigiraju}ih mehanizama kako bi se osiguralo da to~nost
 180 Poglavlje 5

replikacije bude kompatibilna s malom u~estalo{}u pogrje{aka {to je potre-

bno za normalno odvijanje stani~ne reprodukcije. Dodatni proteini, kao i
specifi~ni sljedovi DNA, potrebni su i za inicijaciju replikacije i kopiranje
krajeva eukariotskih kromosoma.

kultura stanice
E. coli
tretiranje mutagenom
kolonije nastale iz rast na polu~vrstom mediju
jedne bakterije u Petrijevoj posudi
tretirane mutagenim
~imbenikom
kulture
pojedina~nih
kolonija
pra}enje aktivnosti DNA polimeraze I kako bi
se identificirao mutant s nedostatkom enzima
Slika 5-1. Izolacija mutanata s
nedostatkom DNA-polimeraze I.
Kultura stanica E. coli tretirana je kemij-
skim mutagenom, nakon ~ega su uzgo-
jem na polu~vrstom mediju izolirane
pojedina~ne bakterijske kolonije. Neko-
liko tisu}a kolonija nasa|eno je zatim
na zasebne kulture i pretra`eno kako bi
se identificirali mutanti s nedostatkom
polimeraze I.
DNA-polimeraze
DNA-polimerazu prvi je otkrio Arhtur Kornberg, 1956. godine u lizatima
bakterije E. coli. Sposobnost ovog enzima da to~no kopira DNA-kalup pru-
`ila je biokemijsku podlogu za model replikacije molekule DNA koji su
prvotno predlo`ili Watson i Crick, tako da njezina izolacija predstavlja jed-
no od temeljnih otkri}a molekularne biologije. Ironi~no, prva identificirana
DNA-polimeraza (danas je zovemo DNA-polimeraza I) nije glavni enzim
odgovoran za replikaciju DNA E. coli. Umjesto toga danas znamo da i pro-
kariotske i eukariotske stanice sadr`avaju nekoliko DNA-polimeraza koje
imaju razli~ite uloge u replikaciji i popravku DNA.
Vi{estrukost DNA-polimeraza prvi je put otkrivena izolacijom mutant-
nog soja E. coli s nedostatkom DNA-polimeraze I (slika 5-1). Kulture E. coli
tretirane su kemijskom tvari (mutagenom) koja inducira veliku u~estalost
mutacija, nakon ~ega su izolirane i ispitane pojedina~ne bakterijske koloni-
je kako bi se identificirao mutirani soj s nedostatkom polimeraze I. Analiza
nekoliko tisu}a kolonija dovela je do izolacije `eljenog mutanta kojemu je
gotovo u potpunosti nedostajala aktivnost polimeraze I. Za~udo, mutirana
bakterija rasla je normalno iz ~ega je proizi{ao zaklju~ak da DNA-polimera-
za I nije nu`na za replikaciju DNA. S druge strane, mutirane bakterije bile
su iznimno osjetljive na ~imbenike koji o{te}uju DNA (primjerice UV-zra~e-
nje) upu}uju}i na to da je polimeraza I uklju~ena poglavito u popravak
DNA o{te}enja, a ne u replikaciju DNA per se.
Zaklju~ak da polimeraza I nije potrebna za replikaciju implicirao je da E.
coli mora sadr`avati druge DNA-polimeraze te su naknadni eksperimenti
doveli do identifikacije dvaju enzima, danas poznatih kao DNA-polimera-
za II i III. Potencijalna uloga ovih enzima ispitana je izolacijom odgovaraju-
}ih mutanata. Pokazalo se da sojevi E. coli s mutacijom polimeraze II rastu
normalno, a uloga ovoga enzima u posebnom obliku popravka DNA sklo-
nom pogrje{kama (prikazanom u odjeljku Popravak DNA) tek je nedavno
utvr|ena. Nasuprot tomu, temperaturno osjetljivi mutanti s nedostatkom
polimeraze III nisu bili u mogu}nosti replicirati svoju DNA pri visokoj tem-
peraturi, a daljnje su studije potvrdile da je polimeraza III glavni replikacij-
ski enzim E. coli.
Danas je poznato da je za replikaciju DNA E. coli uz polimerazu III po-
trebna i prisutnost polimeraze I. U prvotno opisanom mutantu za DNA-poli-
merazu I, taj enzim nije bio potpuno nedostatan, a daljnji eksperimenti po-
kazali su da prisutna aktivnost DNA-polimeraze I u tom soju igra klju~nu
ulogu u replikaciji. Replikacija DNA E. coli prema tome uklju~uje dvije razli-
~ite DNA-polimeraze ~ije su specifi~ne uloge prikazane u daljnjem tekstu.
Eukariotske stanice sadr`avaju pet tipi~nih DNA-polimeraza:a, b, g, d i
e. Polimeraza g nalazi se u mitohondrijima i odgovorna je za replikaciju mi-
tohondrijske DNA. Preostala ~etiri enzima smje{tena su u jezgri i stoga je
bilo opravdano vjerovati da su uklju~eni u replikaciju jezgrine DNA. Poli-
meraze a, b i e najaktivnije su u stanicama koje se dijele, {to sugerira njiho-
vu ulogu za vrijeme replikacije. Nasuprot tomu, polimeraza a i b podjedna-
ko su aktivne i u stanicama koje se dijele i u onima koje se ne dijele, {to je u
skladu s njihovom funkcijom u popravku o{te}enja DNA.
Dva tipa eksperimenata pru`ila su daljnje dokaze koji upu}uju na uloge
polimeraza a, b i e u procesu replikacije DNA. Prvo, replikacija DNA nekih
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 181

`ivotinjskih virusa poput SV40 mo`e se prou~avati u bezstani~nim (engl.

cell-free) ekstraktima. Prou~avanje replikacije in vitro omogu}ilo je izravnu
identifikaciju odgovornih enzima, a analiza takvih bezstani~nih sustava po-
kazala je da su polimeraze a i d nu`ne za replikaciju DNA virusa SV40. Dru-
go, polimeraze a, d i e na|ene su u kvascima kao i u stanicama sisavaca {to
je omogu}ilo izravno ispitivanje njihovih biolo{kih uloga na modelu kvasa-
ca (vidi 3. poglavlje). Studije genetike kvasaca pokazuju da su mutanti kva-
saca s nedostatkom bilo kojeg od tri navedena enzima nesposobni za proli-
feraciju impliciraju}i kriti~nu ulogu polimeraze kao i polimeraze a i d u
replikaciji DNA. Ipak, daljnje su studije pokazale da esencijalna funkcija
polimeraze e u kvascima ne zahtijeva njezino enzimsko djelovanje u svoj-
stvu DNA-polimeraze. Stoga, uloga polimeraze e u replikaciji DNA ostaje
nejasna iako je mogu}e da funkcionira sli~no kao i polimeraza d koja mo`e
katalizirati replikaciju DNA u odsutnosti polimeraze e, kako u bezstani-
~nim sustavima tako i u intaktnim kvascima.
Sve poznate DNA-polimeraze dijele dva osnovna svojstva koja su od
presudne va`nosti za replikaciju DNA (slika 5-2). Prvo, sve polimeraze sin-
tetiziraju DNA samo u 5' 3' smjeru dodaju}i dNTP na 3' hidroksilnu sku-
pinu rastu}eg lanca. Drugo, DNA-polimeraze mogu dodati nove dNTP sa-
mo na prethodno formirani lanac po~etnice koji je vodikovim vezama spo-
jen s kalupom one nisu u mogu}nosti zapo~eti sintezu DNA de novo katali-
ziraju}i polimerizaciju slobodnih dNTP. Po tome se DNA-polimeraze razli-
kuju od RNA-polimeraza koje mogu zapo~eti sintezu novog lanca RNA u
odsutnosti po~etnice. Kao {to je opisano dalje u ovom poglavlju, navedene

lanac lanac lanac lanac

po~etnice kalupa po~etnice kalupa
5' 3' 5' 3'
P OH P OH

A T A T

P P
A T
P P
T A
P P
P P
A T
P P
T A
P P

G C G C
HO P P P
P P P
G C G
C P Pi
P HO P
3'
HO T T
3'
P P
C C
smjer rasta lanca

smjer rasta lanca

P P
A A
P P
T T
P P
5' 5'
Slika 5-2. Enzimska reakcija
katalizirana DNA-polimerazom I.
Sve poznate DNA-polimeraze dodaju
deoksiribonukleotid-5'- trifosfat na 3'
hidroksilnu skupinu rastu}ega lanca
DNA (lanac po~etnice).
182 Poglavlje 5

karakteristike DNA-polimeraza ~ine se klju~nima za odr`avanje visoke vjer-

nosti replikacije DNA potrebne za umno`avanje stanica.

Replikacijske ra{lje
Molekule DNA u procesu replikacije prvi je analizirao John Cairns u ekspe-
rimentima u kojima je E. coli uzgajana u prisutnosti radioaktivnog timidina
{to omogu}uje naknadnu vizualizaciju novoreplicirane DNA s pomo}u au-
toradiografije (slika 5-3). U nekim slu~ajevima mogu}e je opaziti komplet-
ne kru`ne molekule u procesu replikacije. Ove molekule DNA sadr`avaju
dvije replikacijske ra{lje koje predstavljaju podru~ja sinteze DNA. U sva-
kim ra{ljama roditeljski lanci molekule DNA su razdvojeni i sintetiziraju se
dva nova lanca k}eri.
Proces sinteze novih lanaca DNA komplementarnih lancima roditeljske
molekule DNA predstavlja zna~ajan problem za razumijevanje biokemij-
skih procesa uklju~enih u replikaciju DNA. Budu}i da lanci dvolan~ane
DNA uzvojnice teku u suprotnim (antiparalelnim) smjerovima, kontinuira-
na sinteza dvaju novih lanaca u replikacijskim ra{ljama zahtijevala bi da je-
dan lanac bude sintetiziran u 5' 3' smjeru, dok se drugi sintetizira u su-
protnom (3' 5') smjeru. No, DNA-polimeraza katalizira polimerizaciju
dNTP samo u 5' 3' smjeru. Kako se onda vr{i sinteza drugog DNA lanca?
Ova enigma rije{ena je eksperimentima koji su pokazali da se samo je-
dan lanac molekule DNA sintetizira kontinuirano u smjeru sveukupne re-
plikacije DNA dok se drugi formira iz kratkih diskontinuiranih fragmenata
DNA (1 3 kb) koji se sintetiziraju unatrag u odnosu na smjer kretanja repli-
kacijskih ra{lji (slika 5-4). Ovi mali fragmenti novosintetizirane DNA (pre-
ma njihovom otkriva~u, nazvani Okazakijevi fragmenti) spajaju se djelova-
njem DNA-ligaze stvaraju}i cjeloviti novi lanac DNA. Kontinuirano sinteti-
zirani lanac naziva se vode}i lanac jer njegovo produljenje u smjeru kreta-
nja replikacijskih ra{lji izla`e kalup koji se koristi za sintezu Okazakijevih
fragmenata drugoga novog lanca koji nazivamo zaostaju}i ili tromi lanac.
Otkri}e diskontinuirane sinteze tromoga lanca objasnilo je mehanizam
produljenja oba lanca DNA u replikacijskim ra{ljama, no istovremeno je i

(A) (B)

lanac k}eri

replikacijske
ra{lje

Slika 5-3. Replikacija DNA E. coli. replikacijske

(A) Autoradiografija s prikazom bakteri- ra{lje
ja koje su uzgajane u [3H] timidinu kroz
dvije generacije kako bi se obilje`ila
DNA, koja je zatim izolirana i vizualizi- roditeljski lanac
rana ekspozicijom fotografskog filma.
(B) Ovaj shematski prikaz ilustrira dvije 100 mm
replikacijske ra{lje prikazane pod (A).
(Iz J. Cairns, 1963., Cold Spring Harbor
Symp.Quant. Biol. 28: 43.)
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 183

5' 3' 5' 3' 5' 3' 5' 3'

roditeljski
lanci

sinteza Okazakijeva spajanje Okazakijeva sinteza novoga

fragmenta fragmenta s tromim lancem Okazakijeva fragmenta

5'
replikacijske
ra{lje 5' 3
3'
sveukupni 5'
5
5'
smjer
replikacije 3'5'
3

3' 5' 3' 5' 3' 5' Okazakijev 3' 5' 3'
5' 3' 5' 3' 5
fragment 5' 3'
vode}i zaostaju}i
lanac lanac
Slika 5-4. Sinteza vode}ega i
tromoga lanca DNA.
Vode}i lanac sintetizira se kontinuirano
postavilo pitanje kako DNA-polimeraza koja zahtijeva po~etnicu i ne mo`e u smjeru kretanja replikacijskih ra{lji.
zapo~eti sintezu de novo, zapo~inje sintezu Okazakijevih fragmenata? Od- Zaostaju}i lanac sintetizira se u kratkim
ulomcima (Okazakijevi fragmenti), una-
govor je da kratki fragmenti RNA slu`e kao po~etnice za replikaciju DNA trag u odnosu na sveukupni smjer repli-
(slika 5-5). kacije. Okazakijevi fragmenti se nakon
Za razliku od sinteze DNA, sinteza RNA mo`e zapo~eti de novo, a enzim toga spajaju djelovanjem DNA-ligaze.
nazvan primaza sintetizira kratke fragmente RNA (primjerice duga~ke 3
10 nukleotida) komplementarne kalupu tromoga lanca u replikacijskim ra-
{ljama. Okazakijevi se fragmenti zatim sintetiziraju produljenjem ovih
RNA-po~etnica djelovanjem DNA-polimeraze. Otkri}e RNA-DNA spojeva Slika 5-5. Inicijacija Okazakijeva
u novosintetiziranim Okazakijevim fragmentima pru`ilo je klju~ni dokaz fragmenta RNA-po~etnicama.
Kratki fragmenti RNA slu`e kao po~etni-
za ulogu RNA-po~etnica u replikaciji DNA.
ce koje se mogu produljiti djelovanjem
DNA-polimeraze.

lanac DNA inicijacija sinteze sinteza RNA- ekstenzija RNA po~etnice

kalupa RNA -po~etnice DNA-polimerazom
3' 3' 3' 3'

C C P P P 5' 5 C P P P C P P P 5'
G G C C C
A A A U A U
G RNA
G G C G C
A A A U A U
T T T T A
3'
T T T T A
G G G G C DNA
A A A DNA polimeraza A T
primaza
C C C
T T T T A
G G G G
3'
A A A A
G G G G
C C C C
T T T T

5' 5' 5' 5'

184 Poglavlje 5

Slika 5-6. Uklanjanje RNA pukotina izme|u

po~etnica i spajanje Okazakijevih Okazakijevih fragmenata
fragmenata. RNA-po~etnica
Zahvaljuju}i svojoj 5'3' egzonuklea- 3' 5'
znoj aktivnosti, DNA-polimeraza I uk- 5' 3'
lanja RNA-po~etnice i popunjava puko- C G A G A T T G A C G A G U G C G A A T C A G
tine izme|u Okazakijevih fragmenata s
DNA. Nastali fragmenti DNA mogu se
G C T C T A A C T G C T C A C G C T T A G T C
zatim spojiti DNA-ligazom.
3' 5'

uklanjanje RNA 5' 3' egzonukleazom

polimeraza I
popunjavanje pukotine s DNA

3' 5'
5' 3'
C G A G A T T G A C G A G T G C G A A T C A G

G C T C T A A C T G C T C A C G C T T A G T C
3' 5'

DNA-ligaza spajanje fragmenata DNA

5' 3'
C G A G A T T G A C G A G T G C G A A T C A G

G C T C T A A C T G C T C A C G C T T A G T C
3' 5'

Da bi se formirao kontinuirani zaostaju}i (tromi) lanac DNA, RNA-po~et-

nice moraju se na kraju ukloniti iz Okazakijevih fragmenata i zamijeniti s
sljedovima DNA. Kod E. coli RNA po~etnice se uklanjaju kombiniranim dje-
lovanjem RNaze H, enzima koji degradira RNA lanac RNA-DNA hibrida, i
polimeraze I. Ovo je aspekt replikacije DNA u E. coli u kojem DNA-polime-
raza I igra klju~nu ulogu. Uz njezinu DNA-polimeraznu aktivnost, polime-
raza I djeluje kao egzonukleaza koja mo`e hidrolizirati DNA (ili RNA) ili u
3' 5' ili u 5' 3' smjeru. 5' 3' egzonukleazna aktivnost polimeraze I
uklanja ribonukleotide s 5' kraja Okazakijevih fragmenata te se oni zamje-
njuju deoksiribonukleotidima kako bi se stvorili fragmenti u potpunosti
gra|eni od sljedova DNA (slika 5-6). U eukariotskim stanicama umjesto po-
limeraze I po~etnice uklanja druga egzonukleaza, a pukotine izme|u Oka-
zakijevih fragmenata popunjavaju se djelovanjem polimeraze . Kao i kod
prokariota ovi fragmenti DNA spajaju se zatim djelovanjem DNA-ligaze.
Razli~ite DNA-polimeraze igraju zasebne uloge u replikacijskim ra{lja-
ma (slika 5-7). U prokariotskim stanicama, glavna replikacijska polimeraza
je polimeraza III koja obavlja sintezu i vode}eg lanca DNA i Okazakijevih
fragmenata produljenjem RNA-po~etnica. Polimeraza I zatim uklanja
RNA- -po~etnice i ispunjava pukotine izme|u Okazakijevih fragmenata. U
eukariotskim stanicama, polimeraza a prona|ena je u kompleksu s prima-
zom te se ~ini da zajedno s njom sudjeluje u sintezi kratkih RNA-DNA frag-
menata tijekom sinteze tromoga lanca. Polimeraza d mo`e zatim obaviti
sintezu i vode}ega i tromoga lanca produljivanjem DNA-po~etnica prvo-
tno sintetiziranih djelovanjem kompleksa polimeraza a-primaza. Uz to, po-
limeraza d mo`e nakon uklanjanja po~etnica zauzeti mjesto polimeraze I E.
coli u popunjavanju pukotina izme|u Okazakijevih fragmenata. Premda
uloga polimeraze e nije jo{ u potpunosti shva}ena, njezino je djelovanje,
~ini se, sli~no djelovanju polimeraze d.
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 185

E. coli sisavci Slika 5-7. Uloge DNA-polimeraza u

sinteza vode}ega lanca pol d/e E. coli i stanicama sisavaca.
pol III Vode}i lanac sintetizira se u E. coli
djelovanjem polimeraze III (pol III) i
djelovanjem polimeraza d i e (pol d/e)
u stanicama sisavaca. U E. coli sinteza
sinteza tromoga lanca tromoga lanca inicira se primazom, a
RNA-po~etnice produljuju se djelova-
primaza pol a/primaza
njem polimeraze III. U stanicama sisa-
vaca inicijacija sinteze tromoga lanca
odvija se s pomo}u kompleksa primaze
i polimeraze a (pol a). Kratki hibridni
pol III pol d/e fragmenti (sastoje se od RNA i DNA)
sintetizirani ovim kompleksom produ-
ljuju se zatim polimerazom d i e.

Uz polimeraze i primaze, u replikacijskim je ra{ljama aktivan ~itav niz

drugih proteina. Ti dodatni proteini identificirani su podjednako analizom
mutanata E. coli defektnih za replikaciju DNA kao i pro~i{}avanjem protei-
na iz sisavaca, potrebnih za in vitro replikaciju SV40 DNA. Jedna skupina
tih proteina potrebnih za replikaciju ve`e se za DNA-polimeraze poja~ava-
ju}i njihovu aktivnost i zadr`avaju}i ih vezanima uz DNA-kalup kako bi
nastavile sintezu novoga lanca DNA. Polimeraza III E. coli i eukariotske poli-
meraze d i e zdru`ene su s dvije vrste pomo}nih proteina (proteinima kli`u-

(A) Slika 5-8. Pomo}ni proteini

RFC polimeraze.
(A) Proteini za stavljanje stezaljke (RFC
u stanicama sisavaca) ve`u se za DNA
na mjestu spajanja po~etnice i kalupa.
Proteini kli`u}e stezaljke (PCNA u
stanicama sisavaca) ve`u se uz RFC
nakon ~ega se DNA-polimeraza ve`e
za PCNA. (B) Model PCNA vezanog
za DNA. (B, iz T. S. Krishna, X. P. Kong,
S. Gary, P. M. Burgers i J. Kuriyan, 1994.
Cell 79: 1233.)

RFC

PCNA

(B)

RFC

polimeraza
186 Poglavlje 5
smjer kretanja
replikacijskih ra{lji
vode}i
lanac
Slika 5-9. Djelovanje helikaze i
proteina koji ve`e jednolan~anu
DNA.
Helikaze odmotavaju dva lanca rodi-
teljske DNA ispred replikacijskih ra{lji.
Odmotani lanci DNA stabiliziraju se
proteinima koji ve`u jednolan~anu
DNA kako bi mogli slu`iti kao kalupi za
sintezu nove DNA.
Slika 5-10. Djelovanje topoizome-
raza za vrijeme replikacije DNA.
(A) Dok se dva lanca roditeljske DNA
odmotavaju, DNA ispred replikacijskih
ra{lji prisiljena je na rotaciju u suprot-
nom smjeru uzrokuju}i me|usobno
uvijanje kru`nih molekula.
(B) Ovaj problem rije{en je djelovanjem
topoizomeraza koje kataliziraju rever-
zibilno kidanje i spajanje lanaca DNA.
Privremeni prekidi nastali djelovanjem
ovih enzima slu`e kao osi koje omogu-
}uju da se dva lanaca DNA slobodno
rotiraju jedan oko drugoga.
}e stezaljke, engl. sliding-clamp proteins, i proteinima za
stavljanje stezaljke, engl. clamp-loading proteins) koji posta-
vljaju polimerazu na po~etnicu i odr`avaju njezinu stabil-
nu povezanost s kalupom (slika 5-8). Proteini za stavljanje
helikaza stezaljke (u E. coli nazvani g-kompleks, a u eukariotima
replikacijski faktor C, RFC) specifi~no prepoznaju i ve`u
proteini koji se ve`u
za jednolan~anu DNA DNA na mjestu spajanja po~etnice i kalupa. Proteini kli`u-
}e stezaljke (b protein E. coli i jezgreni antigen proliferiraju-
}ih stanica, PCNA, engl. proliferating cell nuclear antigen) ve-
`u se na protein za stavljanje stezaljke i stvaraju prsten
oko DNA-kalupa. Proteini kli`u}e stezaljke smje{taju za-
tromi
lanac
tim DNA-polimerazu na DNA na mjesto spajanja po~etni-
ce i kalupa. Prsten stvoren proteinima kli`u}e stezaljke od-
r`ava zdru`enost polimeraze s njezinim kalupom tijekom
procesa replikacije i tako omogu}uje neometanu ugradnju
vi{e tisu}a nukleotida u novosintetizirani lanac DNA.
Drugi proteini razmotavaju DNA-kalup i stabiliziraju
jednolan~ana podru~ja (slika 5-9). Helikaze su enzimi koji
kataliziraju razmotavanje roditeljske DNA ispred replika-
cijskih ra{lji {to je povezano s hidrolizom ATP. Proteini ko-
ji ve`u jednolan~anu DNA (engl. single stranded DNA-binding proteins, pri-
mjerice eukariotski replikacijski faktor A, RFA) nakon toga stabiliziraju razmo-
ta ni DNA-kalup odr`avaju}i ga u ispru`enom jednolan~anom stanju kako
bi se mogao kopirati djelovanjem polimeraze.
Dok se lanci roditeljske DNA razmataju, DNA ispred replikacijskih ra{lji
prisiljena je na rotaciju. Nekontrolirana rotacija dovela bi do toga da se kru-
`ne molekule DNA (poput SV40 DNA i kromosoma E. coli) omotaju same
oko sebe {to bi na kraju blokiralo proces replikacije (slika 5-10). Ovaj pro-
blem rije{en je djelovanjem topoizomeraza, enzima koji kataliziraju reverzi-
bilno kidanje i ponovno spajanje lanaca DNA. Postoje dvije vrste ovih enzi-
ma: topoizomeraze tipa I kidaju samo jedan lanac DNA, dok topoizomera-
ze tipa II istovremeno kidaju oba lanca. Prekidi nastali djelovanjem topoizo-
meraza slu`e kao osi koje omogu}uju da se dva lanaca DNA kalupa slobod-
no rotiraju jedan oko drugoga tako da se replikacija mo`e nastaviti bez uvi-
janja DNA ispred replikacijskih ra{lji (slika 5-10). Premda su eukariotski
(A) odmotavanje
roditeljske DNA
uvijanje lanca DNA
ispred replikacijskih ra{lji
(B)
privremeni prekid slu`i
topoizomeraza
kao os kako bi se
omogu}ila slobodna
rotacija lanca DNA
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 187

kromosomi gra|eni od linearnih, a ne kru`nih molekula DNA, njihova re-

plikacija tako|er zahtijeva djelovanje topoizomeraza jer bi se u suprotnom
kompletni kromosomi morali kontinuirano rotirati za vrijeme sinteze
DNA.
Topoizomeraza tipa II potrebna je ne samo za razmotavanje DNA ve} i
za razmotavanje novorepliciranih kru`nih DNA molekula koje su postale
me|usobno isprepletene. ^ini se da je topoizomeraza tipa II u eukariot-
skim stanicama tako|er uklju~ena u kondenzaciju mitoti~kih kromosoma.
Ispitivanja mutanata kvasaca, kao i eksperimenti na vinskoj mu{ici te stani-
cama sisavaca, pokazali su da je topoizomeraza II potrebna za razdvajanje
kromatida k}eri u mitozi sugeriraju}i njezinu ulogu u razmotavanju novo-
repliciranih petlji DNA eukariotskih kromosoma.
Enzimi uklju~eni u replikaciju DNA djeluju na koordiniran na~in sinteti-
ziraju}i istovremeno vode}i i zaostaju}i lanac DNA u replikacijskim ra{lja-
ma (slika 5-11). Ovaj zadatak posti`e se stvaranjem dimera replikativnih
DNA-polimeraza (polimeraza III kod E. coli ili polimeraze d/e kod eukario-
ta) od kojih svaka sadr`ava i odgovaraju}e prate}e proteine. Jedna moleku-
la polimeraze tada sintetizira vode}i lanac dok druga djeluje u sintezi tro-
moga lanca. Smatra se da zaostaju}i lanac stvara petlju u replikacijskim ra-
{ljama tako da se podjedinica polimeraze uklju~ena u sintezu tromoga lan-
ca kre}e u istom sveukupnom smjeru kao druga podjedinica koja sintetizi-
ra vode}i lanac.

topoizomeraza

smjer kretanja
replikacijskih ra{lji

helikaza
primaza
RNA-po~etnica proteini koji se ve`u na
protein za stavljanje jednolan~anu DNA
stezaljke

RNA-po~etnica

Okazakijev
fragment

kli`u}a Slika 5-11. Model replikacijskih

vode}i stezaljka ra{lji E. coli.
dimer
lanac Helikaza, primaza i dvije molekule
polimeraze III
DNA-polimeraze III provode koordi-
polimeraza I niranu sintezu vode}eg i zaostaju}eg
zaostaju}i lanca DNA. Kalup tromoga lanca je uvi-
lanac jen tako da se polimeraza odgovor na
za sintezu tromoga lanca kre}e u istom
smjeru kao i sveukupno kretanje replika-
cijskih ra{lji. Topoizomeraza djeluje kao
os okretanja ispred replikacijskih ra{lji,
a DNA-polimeraza I i ligaza uklanjaju
RNA-po~etnice i spajaju Okazakijeve
ligaza fragmente iza replikacijskih ra{lji.
188 Poglavlje 5

5' 3' Vjernost replikacije

G A A Preciznost umna`anja DNA kriti~na je za stani~no razmno`avanje, a procje-
na mutacijskih stopa za razli~ite gene pokazuje da u~estalost pogrje{aka ti-
C T T T G A jekom replikacije odgovara samo jednoj pogrje{no ugra|enoj bazi na sva-
3' 5'
kih 109 do 1010 ugra|enih nukleotida. Ova u~estalost pogrje{aka znatno je
ugradnja G manja od one koja bi se mogla predvidjeti samo na osnovi komplementar-
umjesto A nosti sparivanja baza. Konkretno, razlika u slobodnoj energiji koja proistje-
3' ~e iz promjena u sparivanju vodikovim vezama izme|u korektno i neko-
5' rektno sparenih baza je tek tolika da favorizira stvaranje komplementarnoga
G baznog para za svega tisu}u puta. Zbog toga bi izbor baza reguliran samo
G A
sparivanjem vodikovim vezama na temelju komplementarnosti rezultirao
C T T T G A u~estalo{}u pogrje{aka koja odgovara ugradnji otprilike jedne pogrje{ne
3' 5' baze na svakih 103 nukleotida. Mnogo ve}i stupanj vjernosti replikacije koji
polimeraza izrezuje se u stvari posti`e proistje~e uglavnom iz aktivnosti DNA-polimeraze.
krivo spareni G Jedan od mehanizama kojim DNA-polimeraza pove}ava vjernost repli-
s pomo}u 3' 5' kacije jest taj da poma`e u izboru odgovaraju}e baze za ugradnju u novo-
egzonukleaze
sintetizirani lanac. Polimeraza ne katalizira ugradnju bilo kojeg nukleotida
koji je vodikovim vezama povezan s lancem kalupa. Umjesto toga, ona ak-
5' 3'
tivno diskriminira ugradnju pogrje{ne baze prilago|uju}i se konformaciji
G A A
komplementarnoga para baza. Nedavna ispitivanja strukture nekoliko
C T T T G A DNA-polimeraza upu}uju na to da vezanje korektno sparenih dNTP indu-
3' 5' cira konformacijske promjene u DNA-polimerazi koje dovode do ugradnje
sinteza se nastavlja
nukleotida u DNA. Izgleda da sposobnost DNA-polimeraze da favorizira
ugradnjom odgovaraju}e ugradnju pravilno sparenih nukleotida pove}ava preciznost replikacije za
baze (A) oko tisu}u puta smanjuju}i time o~ekivanu u~estalost pogrje{aka sa 103 na
oko 106.
5' 3' Drugi glavni mehanizam odgovoran za preciznost DNA replikacije je
G A A korektivna (engl. proofreading) aktivnost DNA-polimeraze. Kao {to je ve}
spomenuto, polimeraza I iz E. coli posjeduje 3'5' kao i 5'3' egzonuklea-
C T T T G A
3' 5'
znu aktivnost. 5'3' egzonukleaza djeluje u smjeru DNA sinteze i poma`e
u uklanjanju RNA-po~etnica iz Okazakijevih fragmenata. 3'5' egzonukle-
aza djeluje u suprotnom smjeru od smjera sinteze DNA i sudjeluje u pro-
vjeravanju to~nosti novosintetiziranoga lanca (slika 5-12). Svi novougra|e-
Slika 5-12. Korektivna aktivnost
DNA-polimeraze. ni nukleotidi podlije`u ovakvom provjeravanju jer DNA-polimeraza nije u
G je ugra|en umjesto A kao rezultat stanju zapo~eti sintezu de novo, ve} samo produljuje ve} postoje}e po~etni-
krivog sparivanja s T na lancu kalupa. ce koje su vodikovim vezama povezane s kalupom. Kada do|e do ugrad-
Zbog toga {to je krivo sparen G na 3' nje pogrje{ne baze vrlo je vjerojatno da se ona ne }e iskoristiti za nastavak
kraju novosintetiziranoga lanca nije ve- sinteze, ve} }e se ukloniti 3'5' egzonukleaznom aktivno{}u DNA-polime-
zan vodikovom vezom s lancem kalupa.
Ovo pogrje{no sparivanje na 3' kraju raze. 3'5' egzonukleazna aktivnost DNA-polimeraze I srodna je s 3'5'
rastu}eg lanca prepoznano je i izreza- egzonukleaznom aktivno{}u polimeraze III iz E. coli i eukariotskih polime-
no 3'5' egzonukleaznom aktivno{}u raza d i e koje selektivno uklanjaju nepravilno sparene baze ugra|ene na
DNA-polimeraze koja, da bi nastavila kraj rastu}eg lanca DNA i time pove}avaju vjernost replikacije za oko sto
sintezu, zahtijeva po~etnicu spojenu
do tisu}u puta.
vodikovim vezama s lancem kalupa. Na-
kon izrezivanja krivo sparenog G, sinte- Va`nost korektivnog od~itavanja novosintetiziranog lanca mogla bi obja-
za DNA mo`e se nastaviti ugradnjom sniti za{to DNA-polimeraze zahtijevaju prisutnost po~etnica i kataliziraju
odgovaraju}ega nukleotida (A). sintezu lanaca DNA samo u 5'3' smjeru. Kad se DNA sintetizira u 5'3'
smjeru energija potrebna za polimerizaciju proistje~e iz hidrolize 5' trifos-
fatne skupine slobodnog dNTP do koje dolazi kad se isti dodaje na 3' hidro-
ksilnu skupinu rastu}ega lanca (vidi sliku 5-2). Nasuprot tomu, kad bi se
DNA produljivala u 3'5' smjeru, energija polimerizacije morala bi potjeca-
ti iz hidrolize 5' trifosfatne skupine terminalnih nukleotida ve} ugra|enih u
DNA. To bi onemogu}ilo korektivno od~itavanje zbog toga {to bi pri takvoj
sintezi uklanjanje nepravilno sparenoga terminalnog nukleotida istovreme-
no uklonilo 5' trifosfatnu skupinu potrebnu kao izvor energije za daljnje
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 189

produljenje lanca. Prema tome, iako sposobnost DNA-polimeraze da pro-

duljuje po~etnice samo u 5'3' smjeru ~ini replikaciju na izgled komplici-
ranom, ona je nu`na da bi osigurala precizno umna`anje geneti~kog mate-
rijala.
Uz sposobnost da razlikuje ugradnju pogrje{no sparene baze, korekti-
vna aktivnost DNA-polimeraze dovoljna je da smanji u~estalost pogrje{aka
pri replikaciji na otprilike jednu pogrje{no sparenu bazu na svakih 109 ugra-
|enih nukleotida. Kako bi se uklonile pogre{no sparene baze ugra|ene u
novosintetiziranu DNA, djeluju dodatni mehanizmi (prikazani u odjeljku
Popravak DNA), osiguravaju}i time jo{ ve}u vjernost umna`anja geneti~ke
informacije.

Ishodi{te i inicijacija replikacije

Umna`anje prokariotskih i eukariotskih DNA zapo~inje na jedinstvenom
mjestu zvanom ishodi{te replikacije koje slu`i kao specifi~no vezno mje-
sto za proteine koji iniciraju proces replikacije. Prvo ishodi{te replikacije
opisano je u E. coli. Prvo je otkriveno da umna`anje uvijek zapo~inje na je-
dinstvenom mjestu bakterijskog kromosoma, a detaljnije su analize pokaza-
le da je ishodi{te replikacije gra|eno od 245 parova baza ~iji dijelovi slu`e
kao vezna mjesta za proteine potrebne za inicijaciju replikacije DNA (slika
5-13). Klju~ni korak predstavlja vezanje inicijacijskog proteina za specifi~ni
slijed nukleotida unutar ishodi{ta ~ime zapo~inje razmatanje dvostruke uz-
vojnice. Osim toga, inicijacijski protein regrutira i druge proteine uklju~e-
ne u sintezu DNA. Nakon toga helikaza i proteini koji ve`u jednolan~anu
DNA djeluju u daljnjem razmotavanju DNA-kalupa, a primaza zapo~inje
sintezu vode}eg lanca. Formiraju se dvije replikacijske ra{lje u kojima sinte-
za te~e u suprotnim smjerovima uzdu` kru`noga kromosoma E. coli.
Prou~avanje ishodi{ta replikacije nekoliko animalnih virusa kao {to je
SV40 poslu`ilo je kao model za istra`ivanje inicijacije DNA sinteze u euka-
riota. Ovaj virus posjeduje jedno ishodi{te replikacije (gra|eno od 64 paro-
Slika 5-13. Ishodi{te replikacije E.
va baza) koje funkcionira i u inficiranim stanicama i u bezstani~nim sustavi- coli.
ma. Replikaciju zapo~inje T antigen protein kodiran virusnim genomom Replikacija zapo~inje u jedinstvenom is-
koji se ve`e za ishodi{te replikacije i istodobno djeluje kao helikaza. Za hodi{tu na kromosomu E. coli ozna~e-
stabilizaciju razmotanoga kalupa potrebna je prisutnost proteina koji se ve- nom s ori (engl. origin). Prvi korak je ve-
zanje inicijacijskog proteina za ori slijed
`e za jednolan~anu DNA, a zatim kompleks DNA-polimeraza i primaze
u molekuli DNA {to dovodi do djelomi-
zapo~inje sintezu DNA. ~nog odmotavanja kalupne DNA. Od-
Premda su jednostruka ishodi{ta dovoljna za replikaciju bakterijskih i motavanje DNA se nastavlja djelova-
virusnih genoma, za replikaciju mnogo ve}ih genoma eukariotskih stanica njem helikaze i proteina koji ve`u jedno-
unutar prihvatljivog vremenskog perioda potrebna je prisutnost vi{estru- lan~anu DNA, a primaza sintetizira
RNA-po~etnice. Dvije replikacijske ra-
kih ishodi{ta replikacije. Tako se primjerice sveukupni genom E. coli (4 106
{lje stvorene u ishodi{tu kre}u se zatim
parova baza) replicira iz jednostrukog ishodi{ta za otprilike 30 minuta. Kad u suprotnim smjerovima uzdu` kru`ne
bi se genom sisavaca (3 109 parova baza) replicirao istom brzinom iz jed- molekule DNA.

RNA-po~etnica proteini koji se ve`u za

helikaza jednolan~anu DNA
ori ori
inicijator

sinteza RNA- ori

-po~etnice ori

vezanje odmotavanje formiranje dviju

inicijacijskog DNA djelovanja replikacijskih
proteina helikaze i proteina ra{lji
koji se ve`u za
jednolan~anu DNA
190 Poglavlje 5

Slika 5-14. Ishodi{ta replikacije u ori ori ori

eukariotskim kromosomima.
Replikacija zapo~inje u vi{estrukim isho-
di{tima (ori) od kojih svako stvara dvije inicijacija
replikacijske ra{lje. replikacije

pomicanje replikacijskih
novosintetizirana ra{lji u suprotnim
DNA ( ) smjerovima

nog ishodi{ta za replikaciju DNA bilo bi potrebno oko 3 tjedna (30.000 mi-
nuta). Tako|er je poznato da je brzina replikacije DNA u stanicama sisava-
ca u stvari oko deset puta manja nego u E. coli, vjerojatno radi pakiranja
eukariotske DNA u kromatin. Unato~ tomu, genomi stanica sisavaca uglav-
nom se repliciraju unutar nekoliko sati, {to zahtijeva kori{tenje vi{e tisu}a
ishodi{ta replikacije.
Prisutnost vi{estrukih ishodi{ta replikacije u eukariotskim stanicama
prvi je put pokazana izlaganjem kulture stanica sisavaca radioaktivnom ti-
midinu unutar razli~itih vremenskih intervala {to je pra}eno autoradiogra-
fijom kako bi se detektirala novosintetizirana DNA. Rezultati takvih ispiti-
vanja pokazali su da sinteza DNA zapo~inje na vi{e mjesta iz kojih se zatim
nastavlja u oba smjera uzdu` kromosoma (slika 5-14). Ishodi{ta replikacije
u stanicama sisavaca me|usobno su udaljena za otprilike 50 do 300 kb pre-
ma tome humani genom ima oko 30.000 ishodi{ta replikacije. Genomi jed-
nostavnijih eukariota tako|er posjeduju vi{estruka ishodi{ta; tako primjeri-
ce replikacija u kvascima zapo~inje u ishodi{tima me|usobno udaljenim
oko 40 kb.
Ishodi{ta replikacije eukariotskih kromosoma prvi put su prou~avana u
kvascu S. cerevisiae u kojem su identificirani kao sljedovi koji podupiru re-
plikaciju plazmida u transformiranim stanicama (slika 5-15). To je ujedno
bio funkcionalni test za ove sljedove i do sada je izolirano nekoliko takvih
elemenata (nazvani autonomno repliciraju}i sljedovi ili ARS). Njihova ulo-
ga kao ishodi{ta replikacije potvr|ena je izravnom biokemijskom analizom,
ne samo u plazmidima ve} i u kromosomskoj DNA kvasaca.
Funkcionalni ARS elementi obuhva}aju oko 100 parova baza, uklju~uju-
}i slijed dug 11 parova baza koji je prisutan u mnogim razli~itim ARS ele-
mentima (slika 5-16). Ovaj sredi{nji slijed nu`an je za funkciju ARS eleme-
nata te predstavlja vezno mjesto za proteinski kompleks (nazvan komple-
ks ishodi{ta replikacije ili ORC; engl. origin replication complex) koji je potre-
ban za inicijaciju replikacije DNA u ishodi{tima S. cerevisiae. ^ini se da ORC
kompleks regrutira druge proteine prema ishodi{tu (uklju~uju}i DNA-heli-
kazu), {to dovodi do inicijacije replikacije. Mehanizam zapo~injanja replika-
cije DNA u S. cerevisiae prema tome je izgleda sli~an onome u prokariot-
skim i eukariotskim virusima inicijacijski protein se specifi~no ve`e za sli-
jed nukleotida u ishodi{tu replikacije.
Daljnja ispitivanja pokazala su da je uloga ORC proteina kao inicijatora
replikacije konzervirana u svim eukariotima od kvasaca do sisavaca. Ipak,
ishodi{ta replikacije drugih eukariota znatno su manje definirana od ARS
elemenata S. cerevisiae. Ishodi{ta replikacije u genomu S. pombe nalaze se
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 191

ARS
LEU2 LEU2

plazmid I plazmid II

transformirane stanice kvasca transformirane stanice kvasca

uzgoj u mediju bez leucina uzgoj u mediju bez leucina

transformirane
kolonije kvasca

dobivene su samo rijetke

transformirane stanice kvasca
u kojima je plazmid integriran
u kromosomsku DNA

dobiveno mnogo transformiranih

stanica jer se plazmid mo`e replicirati
bez integriranja u kromosom

unutar slijeda nukleotida dugog 1 kb. Ona nemaju jasno definiranih ORC Slika 5-15. Identifikacija ishodi{ta
replikacije u kvascu.
veznih mjesta kao {to su ARS elementi S. cerevisiae, ali sadr`avaju ponavlja- Oba plazmida, plazmid I i plazmid II
ju}e sljedove bogate AT bazama koji vjerojatno slu`e kao vezno mjesto za sadr`avaju selektivni biljeg, gen (LEU2)
ORC kompleks. Otkriveno je da ishodi{te replikacije vinske mu{ice obuhva- koji omogu}uje transformiranim stani-
}a preko 2 kb dugi slijed nukleotida te da sadr`ava nekoliko ORC veznih cama rast u mediju bez leucina. Ipak,
mjesta ~iji sljedovi jo{ nisu poznati. Kod sisavaca je lokalizirano nekoliko is- samo plazmid II sadr`ava ishodi{te rep-
likacije (ARS). Transfor macija stanica
hodi{ta u podru~jima genoma koja obuhva}aju nekoliko kilobaza. U dru- kvasca s plazmidom I daje samo rijetke
gim slu~ajevima, replikacija mo`e zapo~eti u vi{estrukim ishodi{tima s veli- transformante u kojima je plazmid integ-
kom inicijacijskom zonom koja obuhva}a 10 50 kb. Stoga se ~ini da slje- riran u kromosomsku DNA. Plazmid II
dovi koji definiraju ishodi{te replikacije znatno variraju unutar eukariota je, me|utim, sposoban replicirati se bez
iako je uloga ORC proteina kao inicijatora replikacije vrlo konzervirana. integracije u kromosomom kvasca (auto-
nomna replikacija) tako da njegov unos
u stanice kvasca rezultira znatno ve}im
Telomere i telomeraze: umna`anje krajeva kromosoma brojem transformiranih stanica.
Budu}i da DNA-polimeraze produljuju po~etnice samo u 5' 3' smjeru,
one ne mogu kopirati krajnje 5' dijelove linearnih molekula DNA. Zbog to-
ga su za replikaciju krajnjih sljedova linearnih eukariotskih kromosoma
192 Poglavlje 5

ORC

DNA
B3 B2 B1 ACS

(A/T)TTTA(T/C)(A/G)TTT(A/T)

Slika 5-16. ARS element kvasca.

Element sadr`ava 11 parova baza dug ARS konsenzus slijed (ACS engl. ARS con-
sensus sequence) koji predstavlja specifi~no vezno mjesto ORC kompleksa (kompleks
ishodi{ta replikacije). Tri dodatna elementa (B1, B2 i B3) pojedina~no nisu esencijalni,
ali zajedno pridonose funkciji ARS elementa.

potrebni posebni mehanizmi. Terminalni dijelovi kromosoma (telomere)

sastoje se od uzastopnih ponavljanja jednostavnih sljedova DNA (vidi 4.
poglavlje). Telomere se odr`avaju djelovanjem posebnog enzima, nazva-
nog telomeraza, koji je sposoban replicirati krajnje sljedove DNA u odsut-
nosti DNA-kalupa.
Telomeraza je reverzna transkriptaza, tip DNA-polimeraze koji sintetizi-
ra DNA na osnovi RNA-kalupa, a prvi je put otkrivena u retrovirusima (vi-
di 3. poglavlje). Va`no je napomenuti da je telomeraza enzimski kompleks
koji sadr`ava svoj vlastiti RNA-kalup komplementaran s ponavljaju}im te-
lomernim sljedovima kromosoma. Kori{tenje RNA-kalupa omogu}uje telo-
merazi da stvori vi{estruke kopije ponavljaju}ih sljedova telomera odr`ava-
ju}i ih na taj na~in i u odsutnosti konvencionalnoga DNA-kalupa.
Mehanizam telomerazne aktivnosti objasnili su 1985. godine Carol Grei-
der i Elizabeth Blackburn prou~avaju}i protozou Tetrahymena (slika 5-17).
Telomeraza Tetrahymena nalazi se u kompleksu sa 159 nukleotida dugom
RNA koja sadr`ava slijed 3'-AACCCCAAC-5'. Ovaj je slijed komplementa-
ran s telomernim ponavljanjem Tetrahymena (5'-TTGGGG-3') i slu`i kao ka-
lup za sintezu telomerne DNA. Kori{tenje ove RNA kao kalupa omogu}uje
telomerazi da produlji 3' kraj kromosomske DNA za jednu ponavljaju}u je-
dinicu vi{e od originalne duljine. Komplementarni se lanac tada mo`e sin-
tetizirati djelovanjem kompleksa polimeraze i primaze kori{tenjem kon-
vencionalne RNA po~etnice. Uklanjanje RNA po~etnice ostavlja jednolan-
~ani 3' kraj kromosomske DNA koji mo`e stvarati petlje na kraju eukariot-
skih kromosoma (vidi sliku 4-22).
Telomeraze su otkrivene u razli~itim eukariotima, a geni koji kodiraju te-
lomerazne RNA klonirani su iz Tetrahymena, kvasaca, mi{a i ~ovjeka. Telome-
razna RNA uvijek sadr`ava sljedove komplementarne s ponavljaju}im slije-
dom telomere organizma iz kojega je izolirana (vidi tablicu 4-4). Uloga telo-
meraze u odr`avanju krajeva eukariotskih kromosoma dokazana je i uno{e-
njem mutiranih gena za telomeraznu RNA u kvasce {to je rezultiralo odgo-
varaju}im promjenama ponavljaju}ih sljedova na krajevima kromosoma.

Popravak DNA
DNA, kao i svaka druga molekula, mo`e biti izlo`ena razli~itim kemijskim
reakcijama. Budu}i da DNA slu`i kao jedinstvena, trajna kopija stani~noga
genoma, promjene njezine strukture imaju znatno ve}e posljedice nego
promjene drugih stani~nih komponenti, poput RNA, ili proteina. Mutacije
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 193

5' 3' Slika 5-17. Djelovanje telomeraze.

telomerna DNA s T T G G G G G G G T T G Telomerna DNA jednostavni je ponav-
jednolan~anim 3' krajem ljaju}i slijed s jednolan~anim 3' krajem
A A C C C C C
na novosintetiziranom vode}em lancu.
3' 5' Telomeraza, kao dio enzimskog kom-
pleksa, sadr`ava svoju vlastitu moleku-
novosintetizirani lu RNA komplementar nu telomer noj
tromi lanci
vezanje za
DNA. Jednolan~ani 3' kraj telomer ne
telomeraznu RNA DNA ve`e se za RNA telomeraze koja
zatim slu`i kao kalup za produljenje
vode}ega lanca za jednu ponavljaju}u
jedinicu. Zaostaju}i lanac telomer ne
DNA mo`e se nakon toga sintetizirati s
pomo}u konvencionalne RNA-po~etni-
5' 3' ce djelovanjem DNA-polimeraze.
T T G G G G G T T G

A A C C C C A A C C C C A A C
3' 5' 3' 5'

telomerazna RNA telomeraza

telomeraza djeluje kao

reverzna-transkriptaza

5' 3'
T T G G G G G G T T G G G G T T G

A A C C C C 3' kraj vode}ega lanca produljen

3' 5' za jednu ponavljaju}u jedinicu

produljavanje tromoga lanca

primazom i polimerazom

5' 3'
T T G G G G T T G G G G T T G G G G T T G

A A C C C C C C A A C C C C
3' 5'

uklanjanje RNA-po~etnice

5' 3'
T T G G G G G T T G G G G T T G

A A C C C C C C A A C
3' 5' telomerna DNA
produljena za jednu
ponavljaju}u jedinicu

mogu proiza}i iz ugradnje pogrje{ne baze za vrijeme umna`anja DNA. Uz

to, u molekuli DNA doga|aju se razli~ite kemijske promjene, bilo spontano
(slika 5-18) bilo kao posljedica izlo`enosti kemikalijama ili zra~enju (slika 5-
19). Takva o{te}enja DNA mogu blokirati replikaciju ili transkripciju, a mo-
194 Poglavlje 5

gu i rezultirati visokom u~estalo{}u mutacija ~ije su posljedice neprihvatlji-

ve s gledi{ta stani~ne reprodukcije. Da bi odr`ale integritet svojega genoma
stanice su morale razviti mehanizme za popravak o{te}enja DNA. Mehani-
zmi popravka DNA mogu se podijeliti u dvije op}e skupine: (1) izravni
obrat kemijske reakcije odgovorne za o{te}enje DNA i (2) uklanjanje o{te}e-
nih baza nakon ~ega slijedi njihova zamjena s novosintetiziranom DNA. U
slu~ajevima kad zataje oba mehanizma popravka DNA, evolucija je razvila
dodatne mehanizme koji stanici poma`u da se nosi s o{te}enjima.

Izravni obrat o{te}enja DNA

Ve}ina o{te}enja DNA popravlja se uklanjanjem o{te}ene baze nakon ~ega
slijedi ponovna sinteza uklonjenog podru~ja. Neka se o{te}enja ipak mogu
popraviti izravnim obratom o{te}enja {to mo`e biti znatno u~inkovitiji na-
~in borbe sa specifi~nim tipovima o{te}enja DNA koji se u~estalo doga|aju.
Samo nekoliko tipova o{te}enja DNA popravlja se na ovaj na~in pirimi-
dinski dimeri nastali kao rezultat izlaganja ultraljubi~astom (UV) svjetlu i

(A) deaminacija
NH2 O
C C
N CH HN CH

O C CH O C CH
N N

citozin uracil

NH2 O
C C
N N
N C HN C
CH CH
HC C HC C
N N
N N

adenin hipoksantin

(B) depurinacija

C
N
HN C
CH
H2N C C
N
N
Slika 5-18. Spontano o{te}enje
DNA.
Dvije su glavne vrste spontanih o{te-
P CH2 O P CH2 O OH
}enja DNA: (A) deaminacija adenina,
citozina i gvanina i (B) depurinacija
(gubitak purinskog mjesta) koja nasta- H H H H H H H H
je zbog kidanja veze izme|u purinske
baze i deoksiriboze, ostavljaju}i apurin- O H O H
sko (AP) mjesto u DNA. dGMP = deo-
ksigvanozin-monofosfat. dGMP AP mjesto
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 195

(A) izlaganje UV-svjetlu

H H
O O
P C N P C N
O 2 3 O
N1 4 C O N C O
6 5
C C C C
H CH3
H CH3

H O H ciklobutanski
O
prsten
P C N P C N
O O
N C O N C O

C C C C
H CH3 H CH3
susjedni timin u DNA timinski dimer

(B) alkiliranje
CH3
O O
C C
6 N N
HN 1 5 C 7 N C
8 CH CH
2
4
H2N C 3 C 9 H2N C C
N N
N N

gvanin O6-metilgvanin

(C) reakcija s karcinogenom

O
O
C
N
C HN C
N
HN C C
CH
CH HN C C
H2N C C N
OH N
N
N

gvanin
OH
OH

adicija ve}e kemijske skupine

Slika 5-19. Primjeri o{te}enja DNA

alkilirani gvaninski ostatci, modificirani dodatkom metilne ili etilne skupi- induciranih zra~enjem i kemijskim
ne na O6 poziciju purinskog prstena. ~imbenicima.
UV-svjetlo jedan je od zna~ajnijih izvora o{te}enja DNA, a tako|er je naj- (A) UV-svjetlo inducira nastajanje pi-
vi{e prou~eni tip o{te}enja u smislu mehanizama popravka. Na njegovu rimidinskih dimera u kojima su dva
susjedna pirimidina (primjerice timina)
va`nost upu}uje ~injenica da izlaganje Sun~evu UV-zra~enju predstavlja spojena strukturom ciklobutanskog pr-
uzrok gotovo svih karcinoma ko`e u ljudi. Glavni tip o{te}enja induciran stena. (B) Alkiliranje je adicija metilne ili
UV-svjetlom jest formiranje pirimidinskih dimera u kojem su susjedni piri- etilne skupine na razli~ite polo`aje DNA
midini na istom lancu DNA spojeni ciklobutanskim prstenom nastalim zasi- baza. U ovom primjeru alkiliranje O6 po-
}enjem dvostruke veze izme|u petoga i {estoga atoma ugljika (vidi sliku lo`aja gvanina rezultira stvaranjem O6
metilgvanina. (C) Mnogi karcinogeni
5-19A). Stvaranje ovakvih dimera naru{ava strukturu DNA i blokira trans- (primjerice benzapiren) reagiraju s baza-
kripciju ili replikaciju nizvodno od mjesta o{te}enja pa je njihov popravak ma u DNA {to rezultira adicijom velikih
usko povezan sa sposobno{}u stanica da pre`ive UV-zra~enje. Jedan od me- kemijskih skupina na molekulu DNA.
196 Poglavlje 5

timinski dimer hanizama za popravljanje UV induciranih pirimidinskih dimera jest izrav-

ni obrat dimerizacijske reakcije. Proces se naziva fotoreaktivacija jer se za
kidanje strukture ciklobutanskog prstena koristi energija vidljive svjetlosti
(slika 5-20). Fotoreaktivacijom se izvorne pirimidinske baze vra}aju u nor-
malno stanje i one ostaju u molekuli DNA. Kako je Sun~evo UV-zra~enje
glavni izvor o{te}enja molekule DNA u razli~itim tipovima stanica, logi~no
je o~ekivati da je popravak pirimidinskih dimera fotoreaktivacijom zajed-
svjetlo ni~ko razli~itim prokariotskim i eukariotskim stanicama, uklju~uju}i E. coli,
fotoreaktivacijski kvasce i neke vrste biljaka i `ivotinja. Zanimljivo je, ipak, da fotoreaktivaci-
enzim ja nije univerzalna; mnoge vrste (uklju~uju}i ~ovjeka) nemaju ovaj mehani-
zam popravka DNA.
Drugi oblik direktnog popravka odnosi se na o{te}enja proiza{la iz reakci-
je izme|u alkiliraju}ih ~imbenika i DNA. Alkiliraju}i ~imbenici su reaktivne
komponente koje mogu prenijeti metilnu ili etilnu skupinu na bazu DNA i
time je kemijski modificirati (vidi sliku 5-19B). Osobito va`an tip o{te}enja je
metilacija O6 pozicije gvanina stoga {to nastali produkt, O6-metilgvanin,
Slika 5-20. Izravni popravak
timinskih dimera. stvara komplementarne bazne parove s timinom umjesto s citozinom. Ova
UV-svjetlom inducirani timinski dimeri lezija mo`e biti popravljena djelovanjem enzima nazvanog O6-metilgvanin-
mogu se popraviti fotoreaktivacijom, metiltransferaza, koji prenosi metilnu skupinu s O6-metilgvanina na cistein-
pri ~emu energija vidljive svjetlosti ski ostatak u svom aktivnom mjestu (slika 5-21). Time je uklonjena potenci-
slu`i za kidanje veza koje tvore ciklobu- jalna mutagena kemijska modifikacija i restauriran izvorni gvanin. Enzimi
tanski prsten.
koji kataliziraju ovu direktnu reakciju popravka zastupljeni su u znatnom
broju prokariotskih i eukariotskih organizama, uklju~uju}i i ~ovjeka.

CH3

O
C
N
N C
CH
H
H2N C C
N cistein
N

P CH2 HS CH2
O

H H H H

HO H
O6-metilgvanin O6-metilgvanin-
metiltransferaza
O
C
N
HN C
CH
CH
H2N C C
N metilcistein
N

+
P CH2 H3C S CH2
O

H H H H
Slika 5-21. Popravak O6-metilgvanina.
6
O -metilgvanin-metiltransferaza prenosi metilnu HO H
skupinu s O6-metilgvanina na cisteinski ostatak u
gvanin
aktivnom mjestu enzima.
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 197

Popravak izrezivanjem (ekscizijski popravak)

Premda je izravni popravak u~inkovit na~in no{enja s odre|enim tipovima
o{te}enja DNA, popravak izrezivanjem je op}enitiji na~in popravka {iroke
skupine kemijskih promjena molekule DNA. Prema tome, razli~iti tipovi
popravka izrezivanjem predstavljaju najva`nije mehanizme popravka
DNA kako u prokariotskim tako i u eukariotskim stanicama. U popravku
izrezivanjem, o{te}ena DNA biva prepoznana i uklonjena bilo u obliku slo-
bodnih baza ili nukleotida. Nastala pukotina se zatim popunjava sintezom
novog lanca DNA kori{tenjem neo{te}enoga komplementarnog lanca kao
kalupa. Tri tipa popravka izrezivanjem izrezivanje baza, izrezivanje nu-
kleotida i popravak krivo sparenih baza (engl. mismatch repair) omogu}u-
ju stanicama da se bore sa {irokim spektrom razli~itih o{te}enja DNA.
Popravak molekule DNA koja sadr`ava uracil predstavlja dobar primjer
popravka izrezivanjem baza, u kojem jedna o{te}ena baza biva prepozna-
na i uklonjena iz molekule DNA (slika 5-22). Uracil se mo`e pojaviti u DNA
DNA sadr`ava U stvoren
na dva na~ina: (1) Uracil (kao dUTP deoksiuridin-trifosfat) povremeno se deaminacijom C
ugra|uje na mjestu timina za vrijeme sinteze DNA; i (2) uracil se mo`e po-
javiti u DNA deaminacijom citozina (vidi sliku 5-18A). Drugi mehanizam U
ima mnogo ve}i biolo{ki zna~aj budu}i da mijenja normalni obrazac kom-
plementarnog sparivanja baza i time predstavlja mutageni doga|aj. Izrezi-
G
vanje uracila katalizirano je djelovanjem DNA-glikozilaze, enzima koji ki-
da vezu izme|u baze (uracila) i deoksiriboze u okosnici DNA. Ova reakcija
stvara slobodni uracil i apirimidinsko mjesto {e}er bez pridru`ene baze. DNA-glikozilaza
DNA-glikozilaze tako|er prepoznaju i uklanjaju druge nepravilne baze
uklju~uju}i hipoksantin stvoren deaminacijom adenina, pirimidinske dime- AP mjesto
re, alkilirane purine (osim O6-alkil gvanina) i baze o{te}ene oksidacijom ili
ioniziraju}im zra~enjem.
Rezultat aktivnosti DNA-glikozilaze jest formiranje apirimidinskog ili
apurinskog mjesta (uobi~ajeno zvanim AP mjestom) u DNA. Sli~na AP G
mjesta nastaju kao rezultat spontanoga gubitka purinskih baza (vidi sliku
5-18B), {to se doga|a sa zna~ajnom u~estalo{}u u normalnim stani~nim AP-endonukleaza
uvjetima. Procjenjuje se da na taj na~in svaka stanica u ljudskom tijelu
dnevno gubi nekoliko tisu}a purinskih baza. Ta se mjesta popravljaju djelo-
vanjem AP-endonukleaze koja kida lanac DNA uz AP mjesto (vidi sliku 5-
22). Preostali se deoksiribozni ostatak zatim ukloni, a nastala pukotina od
jedne baze popunjava se djelovanjem DNA-polimeraze i ligaze. G
Dok DNA-glikozilaze prepoznaju samo specifi~ne oblike o{te}enih baza,
drugi sustavi popravka izrezivanjem prepoznaju {iroku skupinu o{te}enih
baza koje naru{avaju strukturu DNA molekule, uklju~uju}i pirimidinske deoksiriboza-fosfodiesteraza
dimere inducirane UV zra~enjem i velike skupine dodane bazama DNA
kao rezultat interakcije razli~itih kancerogena s DNA (vidi sliku 5-19C).
Ovaj {iroko rasprostranjeni oblik popravka DNA poznat je kao popravak
izrezivanjem nukleotida jer se o{te}ene baze (primjerice dimeri timina)
uklanjaju kao dio oligonukleotida u kojem je do{lo o{te}enja (slika 5-23). G

DNA-polimeraza

Slika 5-22. Popravak izrezivanjem baza. ligaza

U ovom je primjeru uracil (U) stvoren deaminacijom citozina (C) i zbog toga se nalazi
nasuprot gvaninu (G) u komplementarnom lancu DNA. Veza izme|u uracila i deok-
siriboze prekinuta je djelovanjem DNA-glikozilaze ostavljaju}i u DNA {e}er bez pri-
C
dru`ene baze (AP mjesto). Ovo mjesto prepoznaje AP-endonukleaza koja kida lanac
DNA. Preostala deoksiriboza uklanja se djelovanjem deoksiriboza-fosfodiesteraze.
Nastala pukotina popunjava se nakon toga DNA-polimerazom i ligazom {to dovodi G
do ugradnje odgovaraju}e baze (C) nasuprot G.
198 Poglavlje 5

Kod E. coli popravak izrezivanjem nukleotida kataliziran je djelovanjem

produkata triju gena (uvrA, B i C) koji su otkriveni zahvaljuju}i ~injenici da
mutacije ovih lokusa rezultiraju ekstremnom osjetljivo{}u na UV-svjetlo.
Protein UvrA prepoznaje o{te}enu DNA i regrutira UvrB i UvrC k mjestu
lezije. UvrB i UvrC zatim kidaju lanac na 3' i 5' strani o{te}enog mjesta odva-
jaju}i oligonukleotid gra|en od 12 ili 13 baza. UvrABC kompleks se ~esto
naziva ekscinukleaza, imenom koje odra`ava njegovu sposobnost da izra-
vno izrezuje (engl. excise) odre|eni oligonukleotid. Nakon toga je potrebna
aktivnost helikaze kako bi se iz dvolan~ane molekule DNA uklonio oligo-
nukleotid u kojem se nalazi o{te}enje, a nastala pukotina popunjava se dje-
lovanjem DNA-polimeraze i ligaze.
Sustav popravka izrezivanjem nukleotida tako|er je intenzivno prou~a-
van u eukariotskim organizmima, uklju~uju}i kvasce, glodavce i ~ovjeka. U
kvascima, kao i u E. coli, otkriveno je nekoliko gena uklju~enih u popravak
DNA (nazvanih RAD geni engl. radiation sensitivity) izolacijom mutanata s
pove}anom osjetljivo{}u na UV-svjetlo. U ~ovjeka su geni popravka DNA
otkriveni uglavnom prou~avanjem osoba koje pate od nasljednih bolesti

T T

prepoznavanje o{te}enja
kidanje nukleazom

T T

helikaza izrezani
oligonukleotid

T T

Slika 5-23. Popravak timinskih

DNA-polimeraza
dimera izrezivanjem nukleotida.
O{te}ena DNA prepoznana je i pokida- ligaza
na na oba kraja timinskog dimera djelo-
vanjem 3'5'-nukleaze. Odmotavanje
DNA-helikazom rezultira izrezivanjem
T T
oligonukleotida koji sadr`ava o{te}ene
baze. Nastala pukotina popunjava se
djelovanjem DNA-polimeraze i zatvara
ligazom.
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 199

uzrokovanih nemogu}no{}u popravka o{te}enja DNA. Najintenzivnije

prou~avana od ovih bolesti je Xeroderma pigmentosum (XP), rijedak geneti-
~ki poreme}aj koji poga|a otprilike jednu od 25.000 osoba. Pojedinci s
ovom bole{}u ekstremno su osjetljivi na UV-zra~enje i razvijaju multiple
karcinome ko`e na podru~jima tijela izlo`enima Sun~evu svjetlu. James
Cleaver je 1968. godine do{ao do klju~nog otkri}a da kultivirane stanice izo-
lirane iz bolesnika koji pate od Xeroderma pigmentosum ne mogu provoditi
popravka izrezivanjem nukleotida. Ovo opa`anje ne samo da je pru`ilo
prvu vezu izme|u popravka DNA i karcinoma, ve} je tako|er predlo`ilo T

kori{tenje XP stanica kao eksperimentalnih sustava za identifikaciju ljud-

skih gena uklju~enih u popravak DNA. Ljudski geni uklju~eni u popravak
DNA otkriveni su osim toga i prou~avanjem druge dvije bolesti ljudi koje
nastaju kao posljedica defekata u popravku DNA (Cockayneov sindrom i XPC
trihotiodistrofija), te prou~avanjem stani~nih linija osjetljivih na UV-zra~e- prepoznavanje
hHR23B o{te}enja
nje. Vrata eksperimentalne analize popravka izrezivanjem nukleotida u
sustavima sisavaca otvorilo je kloniranje gena zadu`enih za popravak o{te- hHR23B
}enja DNA. Tome su pridonijeli eksperimenti prijenosa gena provedeni u XPC
stanicama sisavaca s defektima u popravku DNA, a koji se zasnivaju na spo-
sobnosti alela divljeg tipa da osjetljivost mutiranih stanica na UV-zra~enje
vrate na normalnu razinu.
Molekularnim kloniranjem otkriveno je sedam razli~itih gena popravka
TFIIH
(ozna~enih XPA do XPG) koji su mutirani kod osoba oboljelih od Xeroderma (XPB and XPD)
pigmentosum, a otkriveni su i geni mutirani u osoba koje pate od Cockayneo-
XPG helikaza
va sindroma i trihotiodistrofije, te geni u stani~nim linijama osjetljivim na
UV-zra~enje. Proteini kodirani ovim genima popravka o{te}enja DNA u si-
savaca usko su srodni proteinskim produktima RAD gena kvasaca, {to uka-
zuje na visoku konzerviranost mehanizma popravka izrezivanjem nukleoti-
da u eukariotskim organizmima. Kada su klonirani geni popravka u kvasa-
ca i sisavaca bilo je mogu}e dobiti i proteine koje oni kodiraju u ~istom obli-
ku te razviti in vitro sustave za ispitivanje njihove uloge u mehanizmima
popravka (slika 5-24). Po~etni korak popravka izrezivanjem nukleotida u XPA
stanicama sisavaca uklju~uje prepoznavanje krivo sparenih baza s pomo}u XPF/ERCC 1
kompleksa gra|enog od XPC proteina i proteina pod imenom hHR23B, ho-
molognog kva{~evom Rad23 proteinu. Nakon toga slijedi usmjerivanje XPF
XPB, XPD i XPG proteina ka mjestu o{te}enja DNA. XPB i XPD proteini su ERCCI T
komponente transkripcijskog faktora TFIIH, koji se sastoji od vi{e podjedi-
nica, a potreban je za inicijaciju transkripcije eukariotskih gena (vidi 6. po-
glavlje) oni djeluju kao helikaze, odmataju}i otprilike 30 parova baza
DNA oko mjesta o{te}enja. XPA protein zatim potvr|uje o{te}enje i usmje- XPA
ruje heterodimer XPF i ERCC1 protein (protein popravka identificiran u kidanje i izrezivanje
stani~nim linijama glodavaca osjetljivim na UV-zra~enje) ka mjestu o{te}e- oligonukleotida
nja. XPF/ERCC1 i XPG su endonukleaze koje kidaju DNA u 5'3' smjeru
od o{te}enog mjesta. Tim se kidanjem izrezuje oligonukleotid duljine od
T T
otprilike 30 baza. Nastala pukotina popunjava se djelovanjem DNA-polime-
raze d ili e (uz suradnju RFC i PCNA) i ligaze.
Dok XPC/hHR23B kompleks mo`e prepoznati o{te}enja DNA bilo gdje
u genomu, alternativni oblik popravka izrezivanjem nukleotida, zvan po-

DNA-polimeraza
Slika 5-24. Popravak izrezivanjem nukleotida u stanicama sisavaca.
ligaza
XPC/hHR23B kompleks prepoznaje DNA o{te}enje (primjerice timinski dimer).
Nakon toga se transkripcijski faktor TFIIH, koji sadr`ava XPB i XPD helikaze kao
i XPG, usmjeruje k mjestu o{te}ene DNA. Nakon odmotavanja DNA djelovanjem
XPB i XPD, XPA potvr|uje prisutnost o{te}enja i mobilizira XPF/ERCC1 kompleks. T

XPF/ERCC1 i XPG-endonukleaze kidaju DNA i uklanjanju o{te}eni oligonukleotid.

Nastala pukotina popunjava se djelovanjem DNA-polimeraze i zatvara ligazom.
200 Poglavlje 5

RNA-polimeraza zaustavljena Slika 5-25. Popravak povezan s transkripcijom u stanicama sisavaca.

na mjestu o{te}enja RNA-polimeraza zaustavljena je na mjestu lezije u DNA lancu koji se prepisuje.
Zaustavljenu RNA-polimerazu prepoznaju proteini povezani s transkripcijskim
popravkom, CSA i CSB, koji usmjeruju TF II i XPG k mjestu o{te}enja DNA. Popra-
T
vak se dalje odvija uobi~ajenim mehanizmom popravka izrezivanjem nukleotida
(vidi sliku 5-24).

CSB
pravak udru`en s transkripcijom, specifi~an je za popravak o{te}enja unu-
tar gena koji se prepisuju. Veza izme|u transkripcije i popravka gena prvi
C
CSB puta je dokazana eksperimentima koji su pokazali da se lanac DNA koji se
T
prepisuje popravlja znatno br`e od lanca koji se ne prepisuje, kako u E. coli
tako i u stanicama sisavaca. Budu}i da o{te}enje DNA blokira transkripciju,
stanica favorizira popravak za vrijeme transkripcije jer joj omogu}uje da
CSA poglavito popravi o{te}enja onih gena koji su eksprimirani. Kod E. coli
TFIIH
(XPB i XPD)
mehanizam povezanosti transkripcije i popravka uklju~uje prepoznavanje
RNA-polimeraze zako~ene pri o{te}enju lanca DNA koji se prepisuje. Zako-
XPG
~enu RNA- polimerazu prepoznaje protein, nazvan faktor povezan s trans-
kripcijskim popravkom, koji uklanja RNA-polimerazu i usmjeruje UvrABC
ekscinukleazu prema mjestu o{te}enja.
T U stanicama sisavaca, popravak udru`en s transkripcijom uklju~uje pre-
poznavanje zako~ene RNA-polimeraze djelovanjem CSA i CSB proteina
koji su kodirani genima odgovornim za Cockayneov sindrom (slika 5-25).
Za razliku od bolesnika koji pate od Xeroderma pigmentosum, bolesnici s Coc-
XPA kayneovim sindromom pokazuju specifi~an defekt popravka povezanog s
XPF/ERCCI transkripcijom {to je u skladu s ulogom CSA i CSB proteina kao faktora po-
vezanih s transkripcijskim popravkom. CSA i CSB djeluju analogno XPC/
XPF
ERCC1 kompleksu usmjeruju}i XPB, XPD i XPG k mjestu o{te}enja. Nakon
T T toga slijedi mobiliziranje XPA proteina i XPF/ERCC1 kompleksa te izreziva-
nje o{te}enog oligonukleotida. Popravak udru`en s transkripcijom se, pre-
ma tome, nastavlja sli~no uobi~ajenom popravku izrezivanjem nukleotida
s izuzetkom po~etnog prepoznavanja zako~ene RNA polimeraze djelova-
XPA
njem CSA i CSB proteina, a ne izravnim prepoznavanjem o{te}enja DNA s
izrezivanje
oligonukleotida pomo}u XPC/hHR23B kompleksa.
sinteza DNA Tre}i mehanizam popravka izrezivanjem prepoznaje krivo sparene baze
ligacija ugra|ene za vrijeme replikacije DNA. Mnoge od tih krivo sparenih baza
uklanjaju se korektivnom aktivno{}u DNA-polimeraze. Preostale krivo spa-
T T
rene baze objekt su kasnijeg korektivnog mehanizma zvanog popravak kri-
vo sparenih baza (engl. mismatch repair system) koji provjerava novoreplicira-
nu DNA. Mehanizmi ovog popravka sposobni su otkriti i specifi~no izrezati
krivo sparenu bazu iz novosintetiziranoga lanca DNA omogu}iv{i time po-
pravak pogrje{ke i ponovno uspostavljanje izvornoga slijeda nukleotida.
Kod E. coli, sposobnost sustava popravka krivo sparenih baza da razliku-
je roditeljski od novosintetiziranoga lanca DNA zasniva se na ~injenici da
je DNA ove bakterije modificirana metilacijom adeninskih ostataka unutar
slijeda GATC ~ime se adenin pretvara u 6-metiladenozin (slika 5-26). Kako
se metilacija odvija nakon replikacije, novosintetizirani lanci DNA nisu me-
tilirani i mogu se specifi~no prepoznati enzimima popravka pogrje{no spa-
renih baza. Popravak pogrje{no sparenih baza zapo~inje djelovanjem pro-
teina MutS koji prepoznaje krivo sparene baze te tvori kompleks s dva dru-
ga proteina zvana MutL i MutH. MutH-endonukleaza zatim kida nemetili-
rani lanac DNA unutar GATC slijeda. MutL i MutS djeluju nakon toga za-
jedno s egzonukleazom i helikazom isijecaju}i DNA izme|u prekida lanca i
krivo sparenih baza, a nastala pukotina popunjava se djelovanjem DNA-
polimeraze i ligaze.
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 201

Slika 5-26. Popravak pogrje{no sparenih baza u E. coli. CH3 CH3 stari lanac
Sustav popravka pogrje{no sparenih baza otkriva i uklanja pogrje{no sparene baze
u novorepliciranoj DNA koja se razlikuje od roditeljskog lanca jer jo{ nije metilira-
na. MutS se ve`e za pogrje{no sparenu bazu nakon ~ega se ve`e i MutL. Vezanje novi lanac
MutL aktivira MutH koji kida nemodificirani lanac nasuprot mjestu metilacije. MutS pogrje{no sparena
i MutL zajedno s helikazom i egzonukleazom nakon toga izrezuju dio nemodifici- baza MutS, MutL, MutH
ranog lanca koji sadr`ava pogrje{no sparenu bazu. Pukotina se popunjava djelova-
njem DNA-polimeraze i zatvara ligazom.
CH3 H L S CH3

MutS, MutL, helikaza,

Eukarioti imaju sli~an sustav popravka krivo sparenih baza premda se egzonukleaza
mehanizam kojim eukariotske stanice prepoznaju novorepliciranu DNA
razlikuje od onog kori{tenog u E. coli. ^ini se da u stanicama sisavaca speci- CH3 L S CH3
fi~nost pogrje{no sparene baze u novosintetiziranom lancu nije odre|ena
metilacijom DNA. Umjesto toga, prisutnost jednolan~anog loma (u ovom
slu~aju u novosintetiziranom lancu DNA) ili pak povezivanje eukariotskih DNA-polimeraza
homologa proteina MutS i MutL s replikacijskim sustavom mogli bi odredi- ligaza
ti koji je lanac potrebno popraviti. Homolozi MutS i MutL proteina ve`u se CH3 CH3
zatim za krivo sparenu bazu i upravljaju isijecanjem DNA izme|u loma lan-
ca i krivo sparenih baza, kao i u slu~aju E coli. Va`nost ovog mehanizma
popravka dramati~no je ilustrirana ~injenicom da su mutacije ljudskih ho-
mologa mutS i mutL gena odgovorne za uobi~ajeni tip nasljednog karcino-
ma debeloga crijeva (nasljedni nepolipozni kolorektalni karcinom ili
HNPCC). HNPCC predstavlja jedno od najuobi~ajenijih nasljednih obolje-
nja s u~estalo{}u od jedne na 200 osoba, a odgovoran je za 15% svih kolo-
rektalnih karcinoma u SAD-u. Povezanost izme|u HNPCC i poreme}aja u
popravku krivo sparenih baza otkrivena je 1993. godine kad su dvije skupi-
ne znanstvenika klonirale ljudski homolog mutS gena i prona{le da je muta-
cija u ovom genu odgovorna za otprilike polovinu HNPCC slu~ajeva. Na-
knadna ispitivanja pokazala su da je ve}ina preostalih slu~ajeva HNPCC
rezultat mutacije jednog od tri ljudska homologa mutL gena. ^ini se da de-
fekti ovih gena rezultiraju visokom u~estalo{}u mutacija drugih stani~nih
gena s odgovaraju}om visokom vjerojatno{}u da }e neke od njih na kraju
dovesti do razvoja karcinoma.

Popravak sklon pogrje{kama

Mehanizmi izravnog obrata o{te}enja DNA i popravka izrezivanjem po-
pravljaju o{te}enje DNA prije replikacije tako da se DNA mo`e sintetizirati
kori{tenjem neo{te}enog lanca DNA kao kalupa. U slu~aju da ovi mehani-
zmi zaka`u, stanica ipak ima alternativne mehanizme za popravak o{te}e-
nja DNA u replikacijskim ra{ljama. Pirimidinski dimeri i mnogi drugi tipo-
vi lezija ne mogu se kopirati normalnom aktivno{}u DNA-polimeraza pa je
replikacija na mjestima tih o{te}enja blokirana. No, stanice tako|er posje-
duju nekoliko specijaliziranih DNA-polimeraza koje su u stanju izvr{iti re-
plikaciju i preko mjesta s o{te}enjem DNA. Replikacija o{te}ene DNA djelo-
vanjem takvih specijaliziranih polimeraza mo`e dovesti do u~estalog
ugra|ivanja neodgovaraju}ih baza pa se ovaj oblik borbe s o{te}enjima
DNA naziva popravak sklon pogrje{kama (engl. error prone repair).
Prva DNA-polimeraza sklona pogrje{kama otkrivena je 1999. godine u
E. coli. Ovaj enzim, nazvan polimeraza V, induciran je u odgovoru na eks-
tenzivno UV-zra~enje. Polimeraza V mo`e sintetizirati novi lanac molekule
DNA preko mjesta s timinskim dimerima (slika 5-27). Druge dvije DNA-po-
limeraze u E. coli, polimeraza II i IV, na sli~an su na~in inducirane o{te}e-
njem DNA i djeluju u mehanizmu popravka sklonom pogrje{kama. Euka-
202 Poglavlje 5
normalna replikacija
T T
DNA-polimeraza
sklona pogrje{kama
usmjerena
ka mjestu lezije
T T
sinteza DNA preko
mjesta o{te}enja
djelovanjem DNA
polimeraze sklone
pogrje{kama
T T
nastavljanje normalne
replikacije
T T
popravak lezije
izrezivanjem
T zapo~eta sintezom Okazakijeva fragmenta i mo`e se nastaviti uzdu` o{te}e-
Slika 5-27. Popravak sklon
pogre{kama
Normalna replikacija blokirana je timin-
skim dimerom, ali DNA-polimeraza
sklona pogre{kama, kao {to je primje-
rice polimeraza V (pol V), prepoznaje
i nastavlja sintezu DNA i preko o{te}e-
nog mjesta. Replikacija se tada mo`e
nastaviti regular nom replikacijskom
DNA-polimerazom, a timinski dimer se
na kraju uklanja popravkom ekscizijom
nukleotida. Sinteza DNA pomo}u poli-
meraze sklone pogre{kama dovodi do
u~estale ugradnje pogre{nih baza.
riotske stanice tako|er sadr`avaju vi{e DNA-polimeraza sklonih pogrje{ka-
ma. Do sada je otkriveno devet takvih enzima u stanicama ~ovjeka.
Sve DNA-polimeraze sklone pogrje{kama iskazuju malu vjernost izvor-
nom kalupu kad kopiraju neo{te}enu DNA, sa stopama pogrje{aka od 100
do 10.000 puta ve}im no {to su stope pogrje{aka normalnih replikacijskih
DNA-polimeraza (primjerice polimeraze III u E. coli ili polimeraze d i u
eukariota). Uz to, polimeraze sklone pogrje{kama nemaju 3'5' korektivnu
aktivnost svojstvenu normalnim replikacijskim DNA-polimerazama (vidi
sliku 5-12).
Va`no je ipak da su polimeraze sklone pogrje{kama specijalizirane za
ugradnju odgovaraju}ih baza smje{tenih nasuprot specifi~nim lezijama u
o{te}enoj DNA i stoga su u mogu}nosti to~no sintetizirati novi lanac koriste-
}i neke oblike o{te}enoga lanca kao kalupa. Tako primjerice polimeraza V u
E. coli specifi~no prepoznaje timinske dimere i korektno ugra|uje AA na na-
suprotnom mjestu novosintetiziranoga lanaca. Dakle, ovi enzimi sposobni
su specifi~no ugraditi odgovaraju}u bazu smje{tenu nasuprot nekim oblici-
ma o{te}enja DNA, premda su sklone pogrje{kama u ugra|ivanju baza
smje{tenih nasuprot drugih oblika o{te}ene DNA ili u sintezi DNA kori{te-
njem normalnoga neo{te}enog kalupa.
Rekombinacijski popravak
Jo{ jedan na~in popravka DNA, rekombinacijski popravak, zasniva se na
zamjeni o{te}ene DNA rekombinacijom s neo{te}enom molekulom. Ovaj
mehanizam se u~estalo koristi za popravak o{te}enja na koja se nailazi za
vrijeme replikacije DNA kada prisutnost timinskih dimera ili drugih lezija,
koje ne mogu biti kopirane djelovanjem normalne replikacijske DNA-poli-
meraze, blokira napredovanje replikacijskih ra{lji. Rekombinacijski popra-
vak ovisi o ~injenici da je jedan lanac roditeljske DNA ostao neo{te}en, i da
je replikacijom dao normalnu sestrinsku molekulu, koja sada mo`e biti isko-
ri{tena za popravak o{te}enoga lanca.
Premda molekularni mehanizmi rekombinacijskoga popravka nisu u
potpunosti poznati i mogu varirati me|u razli~itim tipovima stanica op}i
ilustrativni model prikazan je na slici 5-28. U ovom primjeru normalna re-
plikacija blokirana je prisutno{}u timinskog dimera u jednom lancu mole-
kule DNA. Ipak, nizvodno od mjesta o{te}enja replikacija mo`e opet biti
nog lanca kalupa. Rezultat toga je sestrinski lanac koji sadr`ava pukotinu
nasuprot mjestu o{te}enja roditeljskoga lanca. Neo{te}eni roditeljski lanac,
koji je replikacijom dao normalni sestrinski lanac, mo`e zatim biti upotrije-
bljen za popunjavanje pukotine nasuprot mjestu o{te}enja s pomo}u re-
kombinacije homolognih sljedova DNA (vidi daljnji tekst). Budu}i da je ta-
ko nastala pukotina u prethodno intaktnom roditeljskom lancu smje{tena
nasuprot neo{te}enom lancu ona mo`e biti popunjena djelovanjem DNA-
polimeraze. Iako druga roditeljska molekula i dalje sadr`ava izvorno o{te}e-
nje (timinski dimer), ono sada le`i nasuprot normalnom lancu i mo`e se
kasnije popraviti popravkom izrezivanjem.
Rekombinacijski popravak tako|er pru`a glavni mehanizam za popra-
vljanje dvolan~anih lomova koji se mogu pojaviti u molekuli DNA kao po-
sljedica ioniziraju}eg zra~enja (primjerice X zrake) ili djelovanja nekih ke-
mijskih ~imbenika (slika 5-29). Kako ovaj tip o{te}enja poga|a oba lanca
DNA osobito je nezgodan za popravak. Rekombinacija s homolognim slije-
dom DNA u neo{te}enom kromosomu osigurava mehanizam za popravlja-
nje ovakvih o{te}enja i restauriranje normalnog slijeda DNA. Alternativno,
dvolan~ani lomovi mogu se popraviti jednostavno spajanjem prekinutih
krajeva zahva}ene molekule DNA, no to bi rezultiralo visokom u~estalosti
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 203

M O L E KU L A R N A M E D I C I N A

Karcinom debelog crijeva i popravak DNA

Bolest
Karcinomi kolona i rektuma (kolono-
rektalni karcinomi) neki su od naj~e-
{}ih karcinoma u zapadnom svijetu.
Na njih otpada oko 140.000 sveukup-
nih karcinoma koji su godi{nje zabilje-
`eni u SAD-u (otprilike oko 10% inci-
dencije karcinoma). Ve}ina karcinoma
kolona (kao i drugih vrsta karcinoma)
nisu nasljedne bolesti {to zna~i da
se ne prenose izravno s roditelja na
potomstvo. No ipak, opisana su dva
nasljedna oblika karcinoma. U oba
slu~aja naslje|ivanje gena za predispo-
ziciju pojave karcinoma rezultira vrlo
velikom vjerojatno{}u razvoja bolesti.
Jedan od oblika nasljednog karcinoma
debeloga crijeva (familijarna adenoma-
tozna polipoza) iznimno je rijedak i
~ini manje od 1% slu~ajeva karcinoma
debeloga crijeva. Drugi nasljedni oblik
karcinoma debeloga crijeva (nasljedni
nepolipozni kolorektalni karcinom ili
HNPCC, engl. hereditary nonpolyposis
colorectal cancer) znatno je u~estaliji i
~ini do 15% svih slu~ajeva karcinoma
debeloga crijeva. HNPCC je jedna
od naju~estalijih nasljednih bolesti i
poga|a pribli`no jednu od svakih 200
osoba. Premda su karcinomi debeloga
crijeva naj~e{}a manifestacija ovog obo-
ljenja, pogo|ene osobe tako|er pate od
pove}ane incidencije drugih tipova kar-
cinoma, uklju~uju}i karcinom jajnika i
endometrija.
Molekular na i stani~na osnova
Poput drugih karcinoma, kolorektalni
se karcinom razvija zbog mutacije gena
koji reguliraju stani~nu proliferaciju
{to dovodi do nekontroliranoga rasta
stanica karcinoma. U ve}ini slu~ajeva
te mutacije nastaju sporadi~no u somat-
skim stanicama. Za razliku od toga,
kod nasljednih karcinoma mutacije u
stanicama germinativne linije (spolnim
stanicama) predisponiraju osobu za raz-
voj bolesti.
Zna~ajan napredak u istra`ivanju
ove vrste karcinoma dogodio se 1993.
godine kada je otkriveno da gen odgo-
voran za oko 50% HNPCC slu~ajeva
kodira enzim uklju~en u popravak
krivo sparenih baza ovaj gen u
~ovjeka homolog je MutS gena u E. coli.
Naknadna istra`ivanja pokazala su da
su jo{ tri gena, odgovor na za ve}inu
preostalih slu~ajeva HNPCC, homolozi
MutL gena te su tako|er uklju~eni u
popravak krivo sparenih baza. Muta-
cije u ovim genima rezultiraju visokom
u~estalo{}u mutacija drugih stani~nih
gena. Velika je vjerojatnost da }e neke
od tih mutacija na kraju dovesti do
razvoja karcinoma u slu~aju da pogode
gene koji reguliraju proliferaciju sta-
nica.
Prevencija i lije~enje
Kao i kod drugih nasljednih bolesti,
otkri}e gena odgovor nih za HNPCC
omogu}uje da se geneti~kim testira-
njem identificiraju osobe izlo`ene
riziku za razvoj ovog oblika nasljednog
karcinoma. Nadalje, prenatalna gene-
ti~ka dijagnoza mo`e biti veoma va`na
nosiocima HNPCC mutacija u planira-
nju obitelji. Potencijalne pogodnosti
otkrivanja ovih mutacija nisu ograni-
~ene samo na prevenciju preno{enja
mutiranoga gena na sljede}u genera-
ciju njihovo otkri}e mo`e tako|er
pridonijeti prevenciji razvoja bolesti
kod nosioca mutacija.
Klju~na zna~ajka karcinoma debe-
loga crijeva jest njegov postupni razvoj
u razdoblju od nekoliko godina. Rano
dijagnosticiranje oboljenja znatno po-
ve}ava {anse pre`ivljenja bolesnika.
Po~etni stadij karcinoma debeloga
crijeva predstavlja rast malih benignih
polipa koji s vremenom postaju maligni
i napadaju okolno vezivno tkivo.
Prije maligne transfor macije polipe je
mogu}e lako ukloniti kirur{kim putem
{to je vrlo efikasno u prevenciji razvoja
tumora. Polipi i rani stadiji karcinoma
debeloga crijeva mogu se otkriti ispitiva-
njem debeloga crijeva s tankom osvijet-
ljenom sondom (kolonoskopom), tako
da u~estale kolonoskopije bolesnika s
HNPCC mogu omogu}iti uklanjanje
polipa prije razvoja karcinoma. Osim
toga, otkriveno je nekoliko lijekova
potencijalnih inhibitora razvoja kar-
cinoma debeloga crijeva koji mogu
donijeti znatnu korist bolesnicima s
HNPCC. Pravodobna primjena pre-
ventivnih mjera, u smislu otkrivanja
mutacija odgovornih za HNPCC, mo`e
znatno pridonijeti smanjenju broja obo-
ljelih od ove zlo}udne bolesti.
Polip debeloga crijeva vizualiziran kolono-
skopijom. (David M. Martin, M.D./SPL/Photo
Researches, Inc..)

pogrje{aka koje nastaju zbog delecije baza oko mjesta o{te}enja. Treba na-
pomenuti da geni odgovorni za nasljedni karcinom dojke (BRCA1 i BRCA2)
kodiraju proteine koji su uklju~eni u popravak dvolan~anih lomova posre-
dovanjem homologne rekombinacije, {to sugerira da defekti ovog tipa pop-
ravka DNA mogu imati za posljedicu nastanak jednog od naju~estalijih
karcinoma u `ena.
204 Poglavlje 5

Slika 5-28. Rekombinacijski

popravak.
Prisutnost timinskih dimera blokira re- TT
plikaciju, ali DNA-polimeraza mo`e zao-
bi}i leziju i ponovo zapo~eti replikaciju blokiranje replikacije
na novom mjestu nizvodno od dimera. timinskim djelovanjem
Kao rezultat toga nasuprot dimera
u novosintetiziranom lancu nastaje
pukotina. Ona se popunjava rekom- polimeraza nastavlja
binacijom s neo{te}enim roditeljskim sintezu nizvodno od
lancem. Premda to ostavlja pukotinu u o{te}enja
prethodno intaktnom roditeljskom lan-
cu, ta pukotina mo`e se popuniti aktiv- TT
no{}u polimeraze i ligaze, kori{tenjem
intaktnog lanca k}eri kao kalupa. Pre- pukotina u lancu k}eri
ma tome stvaraju se dvije cjelovite mo- nasuprot dimeru
lekule DNA, a preostali timinski dimer u roditeljskom lancu
mo`e se na kraju ukloniti ekscizijskim
popravkom.
neo{te}eni roditeljski
lanac rekombinira se
u pukotinu

TT
rekombinacija ostavlja
pukotinu u prethodno
intaktnom roditeljskom
lancu

pukotina se popunjava
djelovanjem polimeraze
i ligaze

TT

Rekombinacija izme|u homolognih

sljedova DNA
Precizna replikacija DNA i popravak o{te}enja DNA nu`ni su za odr`anje
geneti~ke informacije i osiguranje njezina to~nog prijenosa s roditelja na
potomstvo. Kao {to je prikazano u prethodnom tekstu, rekombinacija je va-
`an mehanizam za popravak o{te}enja DNA. Uz to, rekombinacija je klju-
~na za stvaranje geneti~ke raznolikosti, osobito va`ne s evolucijskog gledi-
{ta. Geneti~ka razli~itost me|u jedinkama pru`a osnovni startni materijal
prirodne selekcije koji omogu}uje vrstama da evoluiraju i prilagode se
promjenjivim uvjetima okoli{a. Rekombinacija ima sredi{nju ulogu u tom
procesu jer omogu}uje genima da se preslo`e u razli~ite kombinacije. Tako
primjerice rekombinacija rezultira izmjenom gena u sparenim homolog-
nim kromosomima za vrijeme mejoze. Uz to, rekombinacija je uklju~ena u
preslagivanje specifi~nih sljedova DNA koji mijenjaju ekspresiju i funkciju
nekih gena tijekom razvoja i diferencijacije. Stoga, rekombinacija igra va-
`nu ulogu u `ivotu pojedina~nih stanica i organizama, a istovremeno prido-
nosi geneti~koj raznolikosti vrsta.
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 205

ioniziraju}e zra}enje Slika 5-29. Popravak dvolan~anih

lomova.
Ioniziraju}e zra~enje i neke kemikalije
5' 3' induciraju dvolan~ane lomove u DNA.
3' 5' Ovi lomovi se mogu popraviti homo-
lognom rekombinacijom s nor malnim
homologna kromosomom dovode}i do restauracije
rekombinacija spajanje krajeva izvor noga slijeda DNA. Alter nativno,
krajevi dvolan~anih lomova mogu se iz-
5' 3 ravno spojiti, no to je ~esto povezano s
3' 5 gubitkom baza uz mjesto o{te}enja.
normalna + 5'
3'
3'
5'
homologna DNA
5' 3'
3' 5'

+ izgubljene baze

popravak bez pogrje{aka gubitak baza na krajevima

U ovom dijelu poglavlja prikazani su mehanizmi rekombinacije izme|u

molekula DNA ~iji su sljedovi izrazito homologni. Primjeri uklju~uju homo-
lognu rekombinaciju za vrijeme popravka DNA kao i rekombinaciju izme-
|u sparenih eukariotskih kromosoma tijekom mejoze te rekombinaciju iz-
me|u bakterijskih kromosoma za vrijeme seksualnog razmno`avanja. Bu-
du}i da ovaj tip rekombinacije podrazumijeva izmjenu geneti~ke informaci-
je izme|u dviju homolognih molekula DNA, on ne dovodi do promjene u
sveukupnom ustroju gena na kromosomu. Drugi tipovi rekombinacije ne
Slika 5-30. Modeli rekombinacije.
zahtijevaju izrazitu homologiju sljedova DNA i stoga se mogu odvijati i iz- U modelu izbora kopije, rekombinacija
me|u nesrodnih dijelova DNA molekule. Rekombinacijski doga|aji toga ti- se odvija za vrijeme sinteze molekula
pa dovode do preslagivanja gena o ~emu }e biti govora dalje u ovom po- DNA k}eri. Replikacija DNA zapo~inje
glavlju. s jednim roditeljskim DNA-kalupom a
zatim se prebacuje na drugu roditeljsku
molekulu {to rezultira sintezom rekom-
Molekule DNA rekombiniraju se lomljenjem i ponovnim binantnih DNA k}eri koje sadr`avaju sli-
spajanjem jedove homologne obama roditeljima.
Geneti~ka rekombinacija prvi je put definirana kad je primije}eno da se ge- U modelu loma i ponovnog spajanja
ni na razli~itim kopijama homolognih kromosoma vinske mu{ice mogu rekombinacija nastaje kao rezultat loma
preslo`iti tijekom mejoze. Nedugo zatim, otkri}e DNA kao materijala od i ukri`enoga prespajanja roditeljskih
molekula DNA.

model izbora kopije

prebacivanje na kopiranje drugoga
sinteza novih DNA k}eri roditeljskog kalupa rekombinantne DNA k}eri

model loma i ponovnoga spajanja

roditeljske DNA lom i unakrsno prespajanje rekombinantne DNA molekule
 206 Poglavlje 5

Slika 5-31. Eksperimentalni prikaz

rekombinacije mehanizmom loma A a
i ponovnoga spajanja. roditeljski virusi B b
Geneti~ki razli~iti roditeljski virusi uz-
gajani su u mediju s ili lakim ili te{kim
izotopima ugljika (12C ili 14C) i du{ika
(14N ili 15N) kako bi se obilje`ile njihove uzgoj u 12C, 14N uzgoj u 13C, 15N
DNA molekule s obzirom na gusto}u. mediju mediju
E. coli je inficirana pod uvjetima koji
inhibiraju replikaciju, a nastale virus-
ne ~estice prikupljene su i analizirane
ravnote`nim centrifugiranjem u gradi- infekcija E. coli
jentu CsCl kako bi se odredila gusto}a
genskih rekombinanata. Na|eno je da
rekombinantni virusi imaju intermedi-
jar nu gusto}u {to indicira da su stekli rekombinacija izme|u
DNA obaju roditelja mehanizmom nekih virusnih
loma i ponovnoga spajanja. molekula DNA

odre|ivanje distribucije te{kih i lakih

molekula DNA separacijom virusa u
gradijentu gusto}e CsCl

A A
B B
laki roditeljski virusi

A a
rekombinantni virusi b B
intermedijarne gusto}e

roditeljske molekule DNA a a

te{ki roditeljski virusi b b
A B C
5' 3'
3' 5'

a b c
5' 3'
3' 5'
roditeljske molekule DNA kojega su gra|eni geni dalo je dva alternativna modela za obja{njenje re-
s lomom u mjestu s kombinacije na molekularnoj razini (slika 5-30). Model izbora kopije (engl.
preklapaju}im (ljepljivim) copy choice model) pretpostavlja da rekombinantna molekula DNA nastaje
jednolan~anim krajevima
za vrijeme sinteze DNA na taj na~in da DNA-polimeraza prvo zapo~ne ko-
5' 3' piranje jednoga roditeljskog lanca, a zatim se prebaci na kopiranje drugoga
3' 5'
roditeljskog lanca. Alternativni je model predlagao da do rekombinacije do-
lazi lomom i ponovnim spajanjem dviju roditeljskih molekula DNA, a ne
5' 3'
3' 5' sintezom nove molekule DNA.
kri`no prespajanje
Ova dva modela prvi su put predlo`ena 1961. godine, na temelju zapa`a-
komplementarnim nja prilikom analize rekombinacije izme|u genoma bakterijskih virusa (sli-
sparivanjem baza ka 5-31). Poznato je da infekcija E. coli virusima koji nose razli~ite geneti~ke
biljege dovodi do nastanka rekombinantnih potomaka. Da bi se odgovorilo
rekombinanti
A b c na pitanje uklju~uje li ova rekombinacija lom i ponovno spajanje roditelj-
5' 3'
3' 5'
A B c
Slika 5-32. Homologna rekombinacija komplementarnim sparivanjem
a B C baza.
5' 3' Roditeljske molekule DNA pokidane su u mjestima s preklapaju}im jednolan~anim
3' 5'
a b C krajevima (ljepljivim krajevima) koji su izmijenjeni putem sparivanja baza s homolog-
nim slijedovima. Rezultat toga je heterodupleksno podru~je u kojem dva DNA lanca
podru~je heterodupleksa potje~u iz razli~itih roditeljskih molekula.
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 207

Slika 5-33. Hollidayev model homologne rekombinacije. 3' 5'

Jednolan~ani zarezi uvedeni su u na istim pozicijama obiju roditeljskih molekula. Na- 5' 3'
kon toga dolazi do izmjene zarezanih lanaca komplementarnim sparivanjem baza, a
5' 3'
ligacija stvara ukri`eni me|uprodukt zvan Hollidayeva veza. 3' 5'
zarezivanje roditeljskih
DNA-molekula
skih molekula DNA, jedan od roditeljskih virusa uzgajan je u mediju koji
sadr`ava te{ki izotop ugljika (13C) i du{ika (15N) dok je drugi uzgajan u me- 3' 5'
diju koji sadr`ava normalne lake izotope (12C i 14N). Time su dobiveni rodi- 5' 3'
teljski virusi razli~ite gusto}e koji se mogu razdvojiti centrifugiranjem u gra-
5' 3'
dijentu gusto}e CsCl. Nakon toga je E. coli inficirana razli~ito obilje`enim 3' 5'
roditeljskim virusima u uvjetima koji inhibiraju replikaciju, a novostvorene
virusne ~estice analizirane su prema njihovoj gusto}i i geneti~kim karakte- izmjena lanaca
ristikama. Dobiveni su geneti~ki rekombinirani virusi intermedijarne gusto-
}e {to upu}uje na to da nose molekule DNA obaju roditelja kao {to je predvi- 3' 5'
5' 3'
|eno modelom loma i ponovnog spajanja, a ne modelom izbora kopije.
5' 3'
Modeli homologne rekombinacije 3' 5'

Otkri}e da se rekombinacija odvija lomom i ponovnim spajanjem postavilo ligacija

je novo klju~no pitanje: kako dvije roditeljske molekule DNA mogu biti pre- Hollidayeva veza
kinute to~no na istom mjestu tako da se mogu ponovo spojiti, a da pri tome 3' 5'
5' 3'
ne nastanu mutacije zbog delecija odnosno adicija nukleotida u mjestu lo-
ma? Za vrijeme rekombinacije izme|u homolognih molekula DNA (op}i 5' 3'
3' 5'
tip homologne rekombinacije) takvo poravnavanje omogu}eno je spariva-
njem baza komplementarnih lanaca DNA (slika 5-32). Preklapaju}i jedno- podru~je heterodupleksa
lan~ani krajevi izmjenjuju se izme|u homolognih molekula DNA dovode}i
do stvaranja heterodupleksa u kojem dva lanca rekombinantne dvolan~a-
ne uzvojnice potje~u od razli~itih roditelja. Kad se molekule DNA hetero-
dupleksa geneti~ki razlikuju, molekula DNA koja nastaje sadr`ava dva ra-
zli~ita geneti~ka biljega. U nekim slu~ajevima krivo sparene baze u
heterodupleksu mogu biti prepoznane i ispravljene mehanizmom popra-
vka krivo sparenih baza na na~in koji je opisan ranije u ovom poglavlju.
Molekularni model rekombinacije predlo`en je 1964. godine na temelju is-
pitivanja rekombinacije u gljivicama i bakterijama kad su dobiveni prvi ge-
neti~ki dokazi za stvaranje i popravak heterodupleksa. Ovaj model, poznat
kao Hollidayev model (nazvan prema istra`iva~u Robinu Hollidayu),
premda modificiran stjecanjem novih podataka i danas pru`a osnovu poi-
manja rekombinacijskih mehanizama.
Izvorna verzija Hollidayeva modela predla`e da rekombinacija zapo~i-
nje uvo|enjem ureza (engl. nick) u istom mjestu obiju roditeljskih moleku-
la (slika 5-33). Lanci DNA s urezom djelomi~no se razmotaju i svaki izvr{i
nukleofilni napad na drugu molekulu na taj na~in da se spari s komplemen-
tarnim neprekinutim lancem. Ligacija prekinutih lanaca stvara zatim ukri-
`enje poznato kao Hollidayeva veza koja predstavlja glavni me|uprodukt
u rekombinaciji. Izravni prikaz Hollidayeve veze dobiven uz pomo} elek-
tronskog mikroskopa dao je jasnu potporu za ovaj model rekombinacije
(slika 5-34).

Slika 5-34. Identifikacija Hollidayeve veze pomo}u elektronske

mikroskopije.
Elektronskomikroskopska fotografija Hollidayeve veze otkrivene za vrijeme rekom-
binacije plazmidnih molekula DNA u E. coli. U donjem dijelu slike prikazan je inter-
pretacijski crte` strukture. Prikazana molekula ilustrira Hollidayevu vezu otvorene
konfiguracije koja rezultira iz rotacije me|uprodukta s ukri`enim lancima (vidi sliku
5- 33) (Ljubazno{}u Huntington Potter, University of South Florida i David Dressler,
University of Oxford)
208 Poglavlje 5

po~etna Hollidayeva veza izomer Hollidayeve veze

A B A B A a
rotacija donjega dijela rotacija desnoga dijela
strukture za 180 strukture za 180

b a b B
a b

zarezivanje i zarezivanje i
prespajanje prespajanje
ukri`enih lanaca ukri`enih lanaca

A B A a

b B
a b

A B A b

a + b a + B

nerekombinantni heterodupleks rekombinantni heterodupleks

Slika 5-35. Izomerizacija i razrje{avanje Hollidayeve veze.

Hollidayeva veza razrje{uje se kidanjem i prespajanjem ukri`enih lanaca. Ako se Hol-
lidayeva veza stvorena inicijalnom izmjenom lanaca razrje{i nastaju heterodupleksni
potomci koji nisu rekombinantni za genske biljege izvan heterodupleksnog podru~-
ja. Ipak, dvije rotacije molekule s ukri`enim lancima stvaraju izomer u kojem su ukri-
`eni neprekinuti roditeljski lanci, a ne inicijalno zarezani lanci. Kidanje i prespajanje
ukri`enih lanaca tih izomera daje potomke koji su rekombinantni heterodupleksi.

Jednom stvorena Hollidayeva veza mo`e biti razrije{ena kidanjem i po-

novnim spajanjem ukri`enih lanaca {to dovodi do stvaranja rekombinant-
ne molekule (slika 5-35). To se mo`e dogoditi na dva razli~ita na~ina ovisno
o orijentaciji Hollidayeve veze koja zapravo odre|uje dva razli~ita izome-
ra. U izomeru koji nastaje iz po~etne izmjene lanaca ukri`eni su oni lanci
koji su zarezani na po~etku rekombinacijskog procesa. No, jednostavna ro-
tacija ove strukture daje druga~iji izomer u kojem su ukri`eni neprekinuti
roditeljski lanci. Razrje{enje razli~itih izomera ima razli~ite geneti~ke poslje-
dice. U prvom slu~aju nastale molekule imaju heterodupleksna podru~ja,
ali DNA koja ome|uje ta podru~ja nije rekombinirana. Ako do|e do izome-
rizacije, kidanje i spajanje ukri`enih lanaca rezultirat }e molekulama ~ija su
podru~ja koja ome|uju heterodupleks rekombinirana. Stvaranje rekombi-
niranih i nerekombiniranih heterodupleksa odre|eno je upravo Hollidaye-
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 209

vom vezom {to je u skladu s geneti~kim podatcima na kojima je zasnovan

Hollidayev model.
Kao {to je u po~etku re~eno, Hollidayev model nije u stanju objasniti ka-
ko dolazi do inicijacije rekombinacije istovremenim zarezivanjem obiju ro-
diteljskih molekula na istovjetnom polo`aju. ^ini se da rekombinacija op}e-
nito po~inje dvolan~anim lomom kako za vrijeme popravka DNA tako i za
vrijeme rekombinacije izme|u homolognih kromosoma tijekom mejoze (sli-
ka 5-36). Oba lanca DNA na mjestu dvolan~anog loma prvo se razgrade
djelovanjem nukleaze koja razgra|uje DNA u 5'3' smjeru stvaraju}i je-
dnolan~ane krajeve. Ti jednolan~ani krajevi izvr{e nukleofilni napad na
drugu roditeljsku molekulu pri ~emu se spare komplementarne baze. Puko-
tine se zatim popunjavaju sintezom kao pri popravku DNA, a lanci spajaju
ligacijom stvaraju}i molekulu s dvostrukom Hollidayevom vezom koja mo-
`e biti razrije{ena daju}i ili rekombinantne ili nerekombinantne heterodu-
pleksne molekule kao {to je to ranije opisano.

Enzimi uklju~eni u homolognu rekombinaciju

Ve}ina enzima za koje se danas zna da su uklju~eni u rekombinaciju prvot-
no je identificirana analizom rekombinacijski defektnih mutanata E. coli.
Takve geneti~ke analize utvrdile su da rekombinacija zahtijeva specifi~ne
enzime, zajedno s proteinima (kao {to su DNA-polimeraza, ligaza i proteini
koji ve`u jednolan~anu DNA) koji imaju vi{estruke uloge u metabolizmu
DNA. Otkri}e gena potrebnih za u~inkovitu rekombinaciju u E. coli omogu-
}ilo je izolaciju njima kodiranih proteina ~ije su karakteristike ispitane bio-

5' 3'
3' 5'

dvolan~ani lom

5' 3'
3' 5'

razgradnja nukleazom

5' 3'
3' 5'

3' 5'
5' 3'
neo{te}ena roditeljska DNA
invazija lanaca

5' 3'
3' 5'

3' 5'
5' 3'
Slika 5-36. Inicijacija rekombinaci-
sinteza DNA je dvolan~anim lomom.
ligacija Oba lanca DNA na mjestu dvolan~anog
loma razgra|ena su nukleazom u 5'
3' smjeru. Jednolan~ani krajevi zatim
5' 3'
3' 5' zalaze u drugu roditeljsku molekulu s
pomo}u homolognoga sparivanja baza.
3' 5' Pukotine se nakon toga popunjavaju sin-
5' 3' tezom DNA i zatvaraju ligacijom stvara-
dvostruka Hollidayeva veza ju}i dvostruku Hollidayevu vezu.
210 Poglavlje 5

Slika 5-37. Funkcija RecA proteina. jednolan~ana DNA

RecA se inicijalno ve`e za jednolan~a-
nu DNA stvaraju}i nit koja se sastoji
od proteina i DNA. RecA protein koji
obavija jednolan~anu DNA se zatim
ve`e za drugu, dvolan~anu molekulu
DNA stvaraju}i kompleks u kojem ne
dolazi do sparivanja baza. Nakon toga vezanje RecA
slijedi komplementarno sparivanje baza DNA obavijena s RecA
i izmjena lanaca pri ~emu nastaju hete-
rodupleksna podru~ja.

vezanje za dvolan~anu DNA

kompleks bez sparenih baza

sparivanje homolognih podru~ja

izmjena lanaca

kemijskom analizom u bezstani~nim sustavima. Ta ispitivanja razjasnila su

djelovanje nekoliko enzima koji kataliziraju stvaranje i razrje{enje Holli-
dayevih struktura.
Sredi{nji protein uklju~en u homolognu rekombinaciju je RecA koji pro-
movira izmjenu lanaca izme|u homolognih DNA molekula {to rezultira
stvaranjem heterodupleksa (slika 5-37). Aktivnost RecA proteina mo`e se
opisati u tri koraka. RecA protein se prvo ve`e za jednolan~anu DNA stva-
raju}i pri tome nit sa~injenu od proteina i DNA. Budu}i da sadr`ava dva
vezna mjesta za DNA, RecA protein vezan za jednolan~anu DNA mo`e ve-
zati i drugu, dvolan~anu molekulu DNA, stvaraju}i tako kompleks izme|u
dvije molekule DNA. Ovo nespecifi~no povezivanje, posredovano RecA
proteinom, popra}eno je specifi~nim sparivanjem baza izme|u jednolan~a-
ne DNA i njoj komplementarnog podru~ja dvolan~ane DNA. Zatim jedno-
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 211

lan~ani kraj molekule DNA, obavijen RecA proteinom, zamijeni homologni Hollidayeva veza
lanac dvolan~ane molekule DNA formiraju}i pri tome heterodupleks. Ovaj
proces kataliziran je samim RecA proteinom te je stoga RecA protein sposo-
ban da sam katalizira reakcije izmjene lanaca koje imaju sredi{nju ulogu u
stvaranju Hollidayevih veza. Za geneti~ku rekombinaciju kao i za popra-
RuvA
vak dvolan~anih lomova kod kvasaca potreban je RecA proteinu srodan migracija mjesta RuvB
protein nazvan RAD51. Osim {to je strukturno sli~an RecA proteinu RAD51 ukri`enja
je tako|er sposoban katalizirati izmjenu lanaca in vitro. Proteini srodni pro-
teinu RAD51 otkriveni su i u slo`enijim eukariotskim organizmima, uklju-
~uju}i ~ovjeka, {to je pokazalo da proteini srodni RecA proteinu imaju
klju~ne uloge u homolognoj rekombinaciji kako u prokariotskim tako i u
eukariotskim stanicama.
Kad se Hollidayeva veza formira, u rekombinaciju se uklju~uje komple- RuvC
cijepanje ukri`enih
ks sastavljen od sljede}a tri proteina bakterije E. coli, a to su RuvA, RuvB i lanaca
RuvC (slika 5-38). RuvA prepoznaje Hollidayevu vezu i regrutira RuvB.
Ruv B djeluje kao motor koji upravlja migracijom mjesta u kojem su ukri`e-
ni DNA lanci mijenjaju}i na taj na~in veli~inu heterodupleksa i polo`aj na
kojem }e ukri`eni lanci biti pokidani i ponovno spojeni. RuvC razrje{uje
Hollidayevu vezu kidaju}i ukri`ene lance DNA. Proces zavr{ava ponovnim ligacija
spajanjem prekinutih lanaca ligacijom na taj na~in da se stvore dvije rekom- rekombinantne
molekule
binantne molekule. Eukariotske stanice ne posjeduju homologe proteina
RuvA, RuvB i Ruv C koje nalazimo u E. coli. Umjesto toga, razrje{avanje
Hollidayeve veze u eukariotskim stanicama posredovano je nekim drugim +
proteinima koji jo{ nisu u potpunosti poznati.

Preslagivanje DNA Slika 5-38. Migracija ukri`enja i

Homologna rekombinacija rezultira preraspodjelom gena izme|u homolo- razrje{enje Hollidayeve veze.
RuvA prepoznaje Hollidayevu vezu i
gnih kromosoma pri ~emu se ne mijenja sadr`aj genoma. Nasuprot tomu, mobilizira RuvB koji katalizira pomica-
druge vrste rekombinacijskih doga|aja dovode do preslagivanja genomske nje mjesta u kojem su lanci ukri`eni
DNA. Neki od tih preslagivanja DNA va`ni su u kontroli ekspresije gena u (migracija ukri`enja). RuvC razrje{ava
specifi~nim tipovima stanica, dok drugi pridonose geneti~koj raznolikosti Hollidayevu vezu kidaju}i ukri`ene
pri ~emu mogu biti va`ni za evoluciju. lance koji se zatim spajaju djelovanjem
ligaze.
Otkri}e da se geni mogu premje{tati na razli~ita mjesta u kromosomima
potje~e iz istra`ivanja kukuruza koje je ~etrdesetih godina pro{loga stolje}a
provela Barbara McClintock. Ona je samo na osnovi geneti~ke analize opi-
sala nove geneti~ke elemente koji se mogu pomicati na razli~ita podru~ja u
genomu kukuruza te mijenjati ekspresiju susjednih gena. No, pro{lo je sko-
ro tri desetlje}a prije no {to je fizi~ka osnova njezina zapa`anja rasvijetljena
otkri}em pokretnih elemenata u bakterijama ~ime je ideja o pokretnim ge-
neti~kim elementima postala {iroko prihva}ena od strane znanstvene jav-
nosti. Danas je poznato nekoliko tipova preslagivanja DNA koji se zbivaju
u eukariotskim i prokariotskim genomima, uklju~uju}i i premje{tanje ele-
menata koje je prva opisala Barbara McClintock. Nadalje, danas znamo da
pokretni geneti~ki elementi ~ine veliki dio genoma biljaka i `ivotinja, uklju-
~uju}i i ljudski genom gdje je njihov udio gotovo 50%.

Mjesno-specifi~na rekombinacija
(engl. site-specific recombination)
Za razliku od uobi~ajene homologne rekombinacije, koja se doga|a na sva-
kom ve}em podru~ju homologije nukleotidnih sljedova, mjesno-specifi-
~na rekombinacija odvija se izme|u specifi~nih sljedova u podru~jima
DNA manje homolognosti. Glavna interakcija u ovom procesu nije posre-
dovana komplementarnim sparivanjem baza ve} aktivno{}u proteina koji
prepoznaju specifi~ni ciljni slijed nukleotida.
212 Poglavlje 5

Prototip rekombinacije u specifi~nom mjestu dobiven je istra`ivanjem

bakteriofaga l. Kad bakteriofag l inficira E. coli, on se mo`e ili replicirati uz-
rokuju}i lizu stanica ili integrirati u bakterijski kromosom formiraju}i pro-
fag koji se tada odr`ava kao dio genoma E. coli (lizogeni ciklus) (slika 5-39).
U povoljnim okolnostima integracija DNA mo`e biti reverzna, {to kao re-
zultat ima izrezivanje DNA bakterofaga l i inicijaciju liti~ke virusne replika-
cije. I integracija i ekscizija DNA bakteriofaga l uklju~uje mjesno-specifi-
~nu rekombinaciju izme|u sljedova DNA virusa i stanice doma}ina.

bakteriofag l

l DNA ubrizguje se u
E. coli DNA stanicu doma}ina i
formira kru`nu molekulu

replikacija l DNA rekombinacija

i sinteza virusnih l DNA s
proteina kromosomom E. coli

pakiranje DNA u
nove virusne ~estice

profag

liza stanice stanica sa profagom

osloba|anje virusnih normalno se dijeli
~estica
Slika 5-39. Liti~ki i lizogeni ciklus
bakteriofaga l.
Infekcija E. coli zapo~inje injektiranjem
l DNA koja zatim zadobija kru`ni ob-
lik unutar stanice doma}ina. U liti~koj
infekciji l DNA replicira se i upravlja
sintezom virusnih proteina. Virusna
DNA se zatim pakira u virusne ~estice
koje se osloba|aju lizom stanice. U
lizogenoj infekciji l DNA se rekombi-
nira s genomom doma}ina formiraju}i
profag koji je integriran u kromosom E.
coli. Integrirana l DNA ne upravlja sin-
tezom virusnih ~estica ve} se umjesto
toga replicira zajedno s ostatkom bakte-
rijskoga genoma. liti~ki ciklus lizogeni ciklus
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 213

DNA E. coli i DNA bakteriofaga l rekombiniraju se u specifi~nom mjestu

zvanom mjesto pri~vr{}ivanja (engl. attachment site, att). Stoga, integracija
DNA bakteriofaga l uklju~uje rekombinaciju izme|u att mjesta faga (attP) l DNA
dugog otprilike 240 nukleotida i att mjesta bakterije (attB) dugog otprilike
25 nukleotida (slika 5-40). Proces je posredovan proteinom bakteriofaga l
zvanim integraza (Int) koji se specifi~no ve`e i za attP i za attB slijed. Int se attP
po~etno ve`e za attP stvaraju}i kompleks u kojem je DNA att mjesta faga
omotana oko vi{estrukih kopija Int proteina. Int-attP kompleks se zatim ve- attB
`e za attB poravnavaju}i att mjesta bakteriofaga l i bakterije. Nakon toga

E. coli DNA

Int

5' 3'
G C T T T T T T A T A C T A A
attP integraza
C G A A A A A T G A T T
3' 5'

Int Int

5' 3' 1
G C T T T T T A C T A A
1
attB
C G A A A A A T G A T T
3' 5' l profag u
kromosomu E. coli
Int
integraza stvara lomove s jednolan~anim
(ljepljivim) krajevima u specifi~nim mjestima
unutar jezgrenoga podru~ja homologne regije

Slika 5-40. Integracija l DNA

putem mjesno-specifi~ne
G T T T T A C T A rekombinacije.
Integracija nastaje kao rezultat rekom-
C G A A A A A A T A T G A T T binacije izme|u specifi~nih slijedova u
bakteriofagu l i genomu E. coli, nazva-
nih attP i attB. Proces je kataliziran pro-
teinom (integraza) kodiranim virusnim
G T T T T A C T A genomom, koji prepoznaje i attP i attB
slijed.
C A A A T G T

izmjena lanaca i ligacija

G C T T T T T A C T A A

C G A A A A A A T A T G A T T
Slika 5-41. Mehanizam mjesno-specifi~ne
attP attB rekombinacije bakteriofaga l.
Mjesno specifi~na rekombinacija odvija se unutar 15 nukle-
otida dugoga homolognoga jezgrenoga slijeda zajedni~kog
G C T T T T T T A T A C T A A
i attP i attB slijedu. Integraza (Int) kida u specifi~nom mjestu
unutar tog slijeda stvaraju}i (ljepljive) jednolan~ane DNA
C G A A A A A A T A T G A T T repove. Ona zatim katalizira izmjenu lanaca i ligaciju, {to
rezultira rekombinacijom izme|u attP i attB slijeda i integra-
attB attP cijom l DNA.
214 Poglavlje 5

fag i bakterija izmjenjuju lance DNA ova se izmjena doga|a izme|u 15

nukleotida zajedni~kih za attP i attB mjesto (slika 5-41). Int protein re`e
unutar ovog slijeda od 15 nukleotida u attB i attP mjestu na taj na~in da
ostavlja nazubljene (ljepljive) krajeve, zatim katalizira izmjenu lanaca i po-
vezuje prekinute lance ~ime se DNA bakteriofaga integrira u kromosom
E. coli. Protein Int tako|er sudjeluje u izrezivanju profaga l, {to je u osnovi
obrnuto od procesa integracije.
Mjesno-specifi~na rekombinacija va`na je ne samo u interakciji virusa,
poput bakteriofaga l, sa stanicama doma}ina, ve} i u programiranim presla-
givanjima gena unutar stani~nih genoma. Kod kralje{njaka je mjesno-speci-
fi~na rekombinacija kriti~na za razvoj imunosustava koji prepoznaje strane
tvari koje u|u u tijelo (antigene) i {titi od infekcija. Dvije su glavne skupine
imunoodgovora posredovane B odnosno T limfocitima. B limfociti izlu~uju
protutijela (imunoglobulini) koja reagiraju s topljivim antigenima dok T
limfociti izlu~uju proteine stani~ne povr{ine (receptori T stanica) koji reagi-
raju s antigenima prisutnim na povr{ini drugih stanica. Klju~na osobina
imunoglobulina i receptora T stanica jest njihova iznimno velika raznoli-
kost koja omogu}uje prepoznavanje {irokoga spektra stranih antigena. Ta-
ko je primjerice svaka osoba sposobna stvoriti vi{e od 1011 razli~itih protuti-
jela, {to je znatno vi{e od ukupnog broja gena u humanom genomu (30.000
40.000). Ta razli~ita imunoglobulinska protutijela (kao i receptori T stani-
ca) nisu kodirana jezgrinim genima germinativnih stanica, ve} jedinstve-
nim limfocitnim genima koji se formiraju tijekom razvoja imunolo{kog su-
stava kao rezultat mjesno-specifi~ne rekombinacije izme|u razli~itih seg-
menata imunoglobulina i gena za receptore T stanica.
Ulogu mjesno-specifi~ne rekombinacije u stvaranju imunoglobulinskih
gena prvi je put, 1976. godine, prikazao Susumu Tonegawa. Imunoglobuli-
ni su gra|eni od dvaju identi~nih parova te{kog i lakog polipeptidnog lan-
ca (slika 5-42). Oba lanca sadr`avaju konstantno podru~je na C kraju te vari-
jabilno podru~je na N kraju. Varijabilno podru~je, koje ima razli~it slijed
aminokiselina u razli~itim imunoglobulinskim molekulama, odgovorno je
za vezanje antigena i upravo ta raznolikost aminokiselinskoga slijeda varija-
bilnog podru~ja omogu}uje razli~itim protutijelima da prepoznaju specifi-
~ne antigene. Premda je svaka osoba u stanju stvoriti {irok spektar razli~itih
protutijela, svaki B limfocit stvara samo jedan tip protutijela. S. Tonegawa
varijabilno podru~je
N N
otkrio je da je svako protutijelo kodirano jedinstvenim genom stvorenim
konstantno
mjesno-specifi~nom rekombinacijom tijekom razvoja B limfocita. Preslagi-
N N
podru~je vanje gena stvara razli~ite imunoglobulinske gene u razli~itim B limfociti-
ma tako da je populacija od otprilike 1012 B limfocita ~ovje~jega tijela spo-
sobna stvoriti protutijela protiv {irokog spektra stranih antigena.
S
S
S Geni koji kodiraju lake lance imunoglobulina gra|eni su od tri podru~ja:
S
SS
SS
V podru~ja koje kodira 9596 N-terminalnih aminokiselina varijabilnog
podru~ja polipeptida, J podru~je (engl. joining region) koje kodira 1214 C
laki lanac terminalnih aminokiselina varijabilnog podru~ja proteina, i C podru~je ko-
je kodira konstantnu regiju polipeptida (slika 5-43). Glavna skupina gena
te{ki lanac lakoga lanca u mi{eva formira se kombinacijom otprilike 250 V podru~ja i 4
C C J podru~ja s jednim C podru~jem. Tijekom razvoja limfocita mjesno-specifi-
~na rekombinacija dovodi do preslagivanja gena jedno V podru~je rekom-
binira s jednim J podru~jem stvaraju}i funkcionalni gen lakoga lanca. Razli-
Slika 5-42. Struktura ~ita V i J podru~ja rekombiniraju u razli~itim B limfocitima tako da mogu}e
imunoglobulina. kombiniranje 250 V podru~ja s 4 J podru~ja mo`e stvoriti otprilike 1.000
Imunoglobulini su gra|eni od dvaju
te{kih i dvaju lakih lanaca spojena disul- (4 250) jedinstvenih lakih lanaca.
fidnim vezama. I te{ki i laki lanci imaju Geni te{koga lanca sadr`avaju ~etvrto podru~je poznato kao D podru~je
varijabilna i konstantna podru~ja. (engl. diversity) koje kodira aminokiseline smje{tene izme|u V i J podru~ja
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 215

DNA germinativne
linije
V1 V2 V3 V250 20 kb J1 J2 J3 J4 C

mjesno-specifi~na rekombinacija

preslagivanje gena

preslo`ena DNA u B limfocitima

V1 V2 V3 J3 J4 C
transkripcija

primarni transkript
V3 J3 J4 C

prekrajanje
Slika 5-43. Preslagivanje imuno-
globulinskih gena za lake lance.
imunoglobulinska mRNA Svaki gen za laki lanac (prikazan je mi{ji
V3 J3 C
laki lanac) sastoji se od konstantnoga
podru~ja (C), spajaju}ega podru~ja (J) i
varijabilnoga podru~ja (V). Postoji otpri-
(slika 5-44). Stvaranje funkcionalnoga gena te{koga lanca zahtijeva dva re- like 250 razli~itih varijabilnih podru~ja
koja su u ger minativnim stanicama
kombinacijska doga|aja. D podru~je se prvo rekombinira s J podru~jem, a odvojena od J i C sa otprilike 20 kb.
zatim se V podru~je rekombinira s preslo`enim DJ podru~jem. Kod mi{eva Tijekom razvoja B limfocita mjesno spe-
postoji oko 500 V podru~ja te{kih lanaca, 12 D podru~ja i 4 J podru~ja, tako cifi~na rekombinacija spaja jedno od V
da ukupni broj te{kih lanaca koji mo`e biti stvoren rekombinacijskim doga- podru~ja s jednim od ~etiri J podru~ja.
|ajima iznosi 24.000 (500 12 4). Ovo preslagivanje aktivira transkripci-
ju {to rezultira stvaranjem primar nog
Kombiniranje otprilike 1.000 razli~itih lakih lanaca i 24.000 te{kih lanaca transkripta koji sadr`ava preslo`eno VJ
stvorenih mjesno-specifi~nom rekombinacijom mo`e proizvesti oko 2 107 podru~je zajedno s preostalim J podru~-
razli~itih imunoglobulinskih molekula. Raznolikost je nadalje pove}ana sto- jima i C podru~jem. Preostala neupora-
ga {to spajanje segmenata imunoglobulinskih gena ~esto uklju~uje gubitak bljena J podru~ja i introni izme|u J i C
se nakon toga uklanjaju prekrajanjem
stvaraju}i funkcionalnu mRNA.

DNA germinativne linije D10 D12

V1 V500 D1 D2 D3 D4 D5 D6 D7 D8 D9 D11 J1 J2 J3 J4 C

spajanje D i J podru~ja

V1 V500 D1 D2 D3 D4 D5 J2 J3 J4 C

spajanje V i DJ segmenta

preslo`ena DNA u B limfocitima

V1 V25 D5 J2 J3 J4 C Slika 5-44. Preslagivanje
transkripcija gena za te{ke lance
imunoglobulina.
Geni te{kih lanaca uz V, J i
primarni transkript C sadr`avaju i D podru~ja.
V25 D5 J2 J3 J4 C Prvo se spajaju D i J podru~je.
prekrajanje Zatim se V podru~je spaja s
preslo`enim DJ segmentom.
Introni izme|u J i C uklanja-
mRNA ju se prekrajanjem i nastaje
V25 D5 J2 C mRNA te{koga lanca.
216 Poglavlje 5

Slika 5-45. Struktura receptora T stanica.

a-lanac b-lanac Receptori T stanica gra|eni su od dvaju polipeptidnih lanaca (a i b) koji se prote`u
kroz citoplazmatsku membranu, a me|usobno su spojeni disulfidnom vezom. I a i b
lanci gra|eni su od varijabilnih i konstantnih podru~ja.
varijabilno
podru~je

ili dodatak od jednoga do nekoliko nukleotida. Mutacije proiza{le zbog tih

delecija i insercija pove}avaju raznolikost varijabilnih podru~ja imunoglo-
konstantno bulina za oko 100 puta, {to odgovara formiranju otprilike 105 razli~itih lakih
podru~je
lanaca i 2 106 te{kih lanaca koji se zatim mogu kombinirati stvaraju}i vi{e
od 1011 razli~itih protutijela. Nakon formiranja preslo`enih imunoglobulin-
skih gena mo`e se posti}i jo{ ve}a raznolikost protutijela procesom soma-
tske hipermutacije {to rezultira u~estalim mutacijama u varijabilnim podru-
~jima gena za laki i te{ki lanac.
citosol Sli~no tome, receptori T limfocita gra|eni su od dvaju lanaca (nazvanih
a i b), a svaki od njih sadr`ava varijabilna i konstantna podru~ja (slika 5-
45). Geni koji kodiraju ove polipeptide stvaraju se rekombinacijom izme|u
citoplazmatska membrana V i J podru~ja (a-lanac) ili izme|u V, D i J podru~ja (b-lanac), analogno stva-
ranju imunoglobulinskih gena. Mjesno-specifi~na rekombinacija izme|u
tih razli~itih podru~ja DNA, a tako|er i mutacije koje su se dogodile tije-
kom rekombinacije, stvaraju stupanj raznolikosti receptora T stanica sli~an
onome imunoglobulina. No, receptori T stanica razlikuju se od imunoglo-
bulina u tome {to nisu podvrgnuti uno{enju daljnje raznolikosti soma-
tskom hipermutacijom.
VDJ rekombinacija posredovana je kompleksom koji ~ine dva proteina,
RAG1 i RAG2, specifi~no eksprimirana u limfocitima. RAG proteini prepo-
znaju takozvane sljedove rekombinacijskog signala (RS) smje{tene uz kodi-
raju}e sljedove svakoga genskog podru~ja i poti~u preslagivanje DNA uvo-
|enjem dvolan~anog loma izme|u RS slijeda i kodiraju}eg slijeda (slika 5-
46). Kodiraju}i krajevi genskih podru~ja zatim se spajaju stvaraju}i preslo-
`ene imunoglobuline ili gene za receptore T stanica, pri ~emu se vrlo ~esto
doga|aju delecije ili adicije nukleotida. Zanimljivo je da je RAG1 usko sro-
dan enzimima koji kataliziraju transpoziciju DNA i integraciju retrovirusa
{to }e biti obja{njeno dalje u ovom poglavlju.

Transpozicija posredovana DNA intermedijarima

Mjesno-specifi~na rekombinacija odvija se izme|u dva specifi~na slijeda
koji posjeduju barem malo homologije. Za razliku od toga, transpozicija
uklju~uje premje{tanje sljedova unutar genoma i ne zahtijeva homologiju
nukleotidnih sljedova. Elementi koji se premje{taju transpozicijom, poput
onih koje je prva opisala McClintock, zovu se pokretni elementi (engl.
transposable elements) ili transpozoni. Oni se dijele u dvije op}e skupine ovi-
sno o tome premje{taju li se putem DNA ili RNA intermedijara.
Prvi detaljno opisani transpozoni koji se premje{taju putem DNA inter-
medijara na|eni su u bakterijama (slika 5-47). Najjednostavniji od tih ele-
menata su insercijski sljedovi ~ija se veli~ina kre}e u rasponu od oko 800 do
2.000 nukleotida. Insercijski sljedovi sadr`avaju samo gen za enzim uklju-
~en u transpoziciju (transpozaza) ome|en kratkim obrnutim ponavljanji-
ma koja predstavljaju mjesta aktivnosti same transpozaze. Kompleksni
transpozoni gra|eni su od dvaju insercijskih sljedova koji ome|uju druge
gene i premje{taju se kao jedna cjelina.
Insercijski sljedovi premje{taju se s jednog na drugo mjesto na kromoso-
mu a da se pri tome ne repliciraju (slika 5-48). Transpozaza kida ciljnu DNA
tako da napravi nazubljene krajeve, te kida na krajevima obrnutih pona-
vljaju}ih sljedova transpozona. Dok je aktivnost transpozaze specifi~na na
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 217

V RS RS D Slika 5-46. VDJ rekombinacija.

Kodiraju}i dijelovi imunoglobulinskih
gena i gena za receptore T stanica
vezanje (primjerice V i D podru~je) ome|eni su
RAG1/RAG2 kratkim sljedovima rekombinacijskih
signala (RS) koji se nalaze u suprotnim
orijentacijama na 5' i 3' krajevima kodira-
ju}ih sljedova. RS sljedove prepoznaje
kompleks rekombinacijskih proteina
specifi~nih za limfocite, RAG1 i RAG2,
koji kidaju DNA izme|u kodiraju}ih i
RS sljedova. Prekinuti kodni lanci se za-
tim spajaju i tvore preslo`eni segment
gena.
RAG2
RS RS
RA

V D

kidanje

spajanje prekinutih
kodnih lanaca

V D

insercijski slijed (IS)

abcd dcba

IR transpozaza IR
Slika 5-47. Bakterijski transpozoni.
kompleksni transpozon Insercijski sljedovi (IS) dugi su od 800
do 2.000 nukleotida i sadr`avaju gene
IS IS za transpozazu ome|enu obrnutim po-
navljanjima (IR) dugim oko 20 nukleo-
tida. Kompleksni transpozoni gra|eni
IR IR bakterijski gen IR IR su od dvaju insercijskih sljedova koji
transpozaza transpozaza
ome|uju druge gene i obi~no su dugi
5 do 20 kb.
218 Poglavlje 5

K L J U ^ N I P O KU S

Preslagivanje imunoglobulinskih gena

Evidence for Somatic Rearrangement of Immunoglobulin Genes
Coding for Variable and Constant Regions
Nobumichi Hozumi and Susumu Tonegawa stanica plazmocitoma. Uporabljene su
Basel Institute for Immunology, Basel, Switzerland dvije sonde koje odgovaraju komplet-
Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Volume 73, 1976, pages noj imunoglobulinskoj mRNA molekuli
36283632 ili 3' kraju mRNA gra|enom samo od
slijeda za konstantno podru~je.
Zna~ajan rezultat bilo je otkri}e u
Kontekst temelju uzorka kidanja DNA s restrikcij- potpunosti razli~itih obrazaca za slje-
Sposobnost imunolo{kog sustava kra- skim endonukleazama. dove varijabilnog i konstantnog pod-
lje`njaka da prepoznaju beskona~no DNA embrija i plazmocitoma raz- ru~ja izme|u embrionalne DNA i DNA
mno{tvo stranih molekula (antigena) gra|ena je restrikcijskom endonuklea- izolirane iz plazmocitoma (vidi sliku). U
upu}uje na to da limfociti mogu stvoriti zom BamHI, a ulomci DNA razli~itih embrionalnoj DNA kompletna sonda
odgovaraju}i {iroki spektar protutijela. veli~ina razdvojeni su elektroforezom hibridizira s dva BamHI ulomka od 8,6
Kako je raznolikost protutijela osnova u agaroznom gelu. Zatim su iz gela i 5,6 kb. Samo 8,6 kb ulomak hibridizira
imunolo{kog prepoznavanja, razumije- izrezana podru~ja s odgovaraju}im frag- s 3' sondom, {to sugerira da taj ulomak
vanje mehanizma s pomo}u kojega je mentima, a iz njih izolirana DNA hibri- sadr`ava slijed konstantnog podru~ja,
na izgled neograni~en broj imunoglo- dizirana je s radioaktivno obilje`enim a da ulomak od 5,6 kb sadr`ava slijed
bulina kodiran genomskom DNA pred- sondama koje su dobivene iz imunoglo- varijabilnog podru~ja. U potpunosti
stavlja sredi{nju temu imunologije. bulinskih mRNA molekula izoliranih iz suprotno tomu, obje sonde hibridizirale
Prije eksperimenata koje su pro-
veli Hozumi i Tonegawa, odre|ivanje
aminokiselinskog slijeda velikog broja DNA RNA 3,4 kb
imunoglobulinskih molekula pokazalo embrij cijela
je da su laki i te{ki laki lanac gra|eni 250
embrij 3'-polovica
odbrojavanje po minuti (CPM-engl. counts per minute)

od zasebnih varijabilnih i konstantnih plazmocitom cijela

podru~ja. Geneti~ka su ispitivanja plazmocitom 3'-polovica
nadalje pokazala da mi{evi naslje|uju
samo jednu kopiju gena za konstantno 200 8,6 kb
podru~je. Ovo je opa`anje sugeriralo
da su imunoglobulini kodirani vi{estru-
kim genima za varijabilno podru~je 150
koji se mogu zdru`iti s jednim genom 5,6 kb
konstantnog podru~ja. Hozumijevo i
Tonegawino otkri}e preslagivanja imu-
noglobulinskih gena pru`ilo je pr vu 100
izravnu eksperimentalnu potporu ove
hipoteze i polo`ilo temelje za razumije-
vanje molekular ne osnove razli~itosti
protutijela. 50

Eksperimenti
Hozumi i Tonegawa eksperimentalno
su ispitali mogu}nost da se geni koji 0
kodiraju varijabilno i konstantno pod- 5 10 15
ru~je imunoglobulina spajaju na razini migracija (cm)
DNA tijekom razvoja limfocita. Uspore- gornji dio smjer elektroforoze donji dio
dili su organizaciju sljedova varijabilnih
i konstantnih podru~ja u DNA izolira- Gel-elektroforeza DNA izolirane iz embrija i plazmocitoma te razgra|ene s BamHI i hibridi-
noj iz mi{jih embrija i stanica mi{jeg zirane sa sondama koje odgovaraju ili cijeloj ili 3' podru~ju plazmocitomske mRNA. Podat-
plazmocitoma (tumor B limfocita koji ci su prikazani kao radioaktivnost detektirana u hibridnim molekulama s DNA izoliranom
stvara jednu vrstu imunoglobulina) na iz izrezanih podru~ja gela s odgovaraju}im fragmentima.
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 219

su sa samo jednim 3,4 kb dugim frag- binacijom zasebnih sljedova DNA B

mentom plazmocitomske DNA.
Interpretacija ovih rezultata bila je
da su se sljedovi varijabilnog i konstan-
tnog podru~ja koji su u embrionalnoj
DNA odvojeni preslo`ili tijekom raz-
limfocita. Sli~no preslagivanje DNA u
T limfocitima odgovorno je za stvaranje
gena koji kodiraju receptore T stanica.
Stoga su mjesno-specifi~na rekombina-
cija i programirano preslagivanje gena

voja limfocita daju}i jedan imunoglobu-
linski gen.
Utjecaj
Rezultati koje su dobili Hozumi i
Tonegawa, zasnovani na relativno indi-
rektnom pristupu mapiranja restrikcij-
skim endonukleazama potvr|eni su i
pro{ireni molekular nim kloniranjem
i sekvenciranjem imunoglobulinskih
gena. Takva istra`ivanja su danas
nedvosmisleno utvrdila da se ovi geni
stvaraju mjesno-specifi~nom rekom-
Donna Coveney/MIT
osnova za razvoj imunolo{kog sustava.
Daljnja istra`ivanja pokazala su da
varijabilna podru~ja imunoglobulina i
receptora T stanica nastaju preslagiva-
njem dvaju od tri razli~ita segmenta
DNA. Sposobnost rekombinacije ovih
segmenata, zajedno s visokom u~esta- Susumu Tonegawa
lo{}u mutacija na mjestu rekombina- osnovu za razumijevanje na koji na~in
cije, ve}im su dijelom odgovor ni za imunolo{ki sustav mo`e prepoznati i
razli~itost imunoglobulina i receptora odgovoriti na doslovno neograni~en
T stanica. raspon stranih supstanci.
Otkri}e preslagivanja imunoglo-
bulinskih gena zbog toga predstavlja

obrnutim ponavljanjima transpozona, njezina specifi~nost za sljedove unu-

tar genoma (ciljne sljedove) puno je manja tako da katalizira premje{tanje
transpozona nasumce unutar cjelokupnoga genoma. Nakon kidanja trans-
pozona i ciljne DNA, transpozaza spaja ljepljive krajeve ciljane DNA s po-
kretnim elementom. Pukotina koja nastaje u ciljanoj DNA popravlja se sin-

transpozon integriran u donorsko mjesto

IR IR

ciljno mjesto A CG T A
T GCA T

transpozaza kida na krajevima invertnih

ponavljanja transpozona uvode}i u ciljnu DNA
rezove s jednolan~anim (ljepljivim) krajevima

A CG T A
T GCA T
Slika 5-48. Transpozicija insercij-
skih sljedova.
jednolan~ani krajevi ciljne DNA Jednostavna transpozicija ne uklju~uje
pridru`eni transpozonu replikaciju transpozonske DNA. Trans-
pozaza kida na oba kraja transpozona
ACG TA i uvodi rezove s jednolan~anim (ljeplji-
T GCA T vim) krajevima u ciljnu DNA. Jednolan-
~ani krajevi ciljne DNA se zatim spajaju
popravljanje pukotina sintezom DNA s transpozonom, a pukotine u ciljnoj
DNA nastale djelovanjem transpozaze
A C G TA A C G TA se popravljaju. Rezultat toga je stvara-
T GCA T T GCA T nje kratkih izravnih ponavljanja ciljnog
mjesta zahva}ene DNA (dugih 5 do 10
direktna ponavljanja nukleotida) koja ome|uju integrirani
slijeda ciljne DNA transpozon.
220 Poglavlje 5
Slika 5-49. Organizacija DNA retro-
virusa.
Integrirana DNA provirusa ome|ena
je dugim ter minalnim ponavljanjima
(LTR) koja predstavljaju direktna ponav-
ljanja gra|ena od nekoliko stotina nu-
kleotida. Virusni geni, uklju~uju}i gene
za reverznu transkriptazu, integrazu
i struktur ne proteine virusnih ~estica,
DNA
smje{teni su izme|u LTR. Integrirani
doma}ina
provirus ome|en je kratkim direktnim
ponavljanjima DNA doma}ina.
tezom DNA nakon ~ega slijedi ligacija s drugim lancem transpozona. Rezul-
tat ovog procesa je kratko izravno ponavljanje ciljnoga slijeda s obiju strana
integriranoga pokretnog elementa {to je karakteristi~no za integraciju trans-
pozona.
Ovaj mehanizam dovodi do premje{tanja transpozona s jednog na dru-
go mjesto kromosoma. Drugi tipovi transpozona premje{taju se znatno slo-
`enijim mehanizmima kojima se istodobno s premje{tanjem na novo mje-
sto unutar genoma i repliciraju. Kao rezultat takvoga premje{tanja jedna
kopija transpozona bit }e integrirana na novo mjesto u genomu, dok }e dru-
ga kopija ostati na svom izvornom polo`aju.
Transpozoni koji se premje{taju putem DNA intermedijara prisutni su u
eukariotskim genomima kao i u bakterijskim. Tako primjerice ljudski ge-
nom sadr`ava otprilike 300.000 DNA transpozona koji ~ine oko 3% ukupne
ljudske DNA. Pokretni elementi koje je McClintock opisala u kukuruzu
premje{taju se nereplikativnim mehanizmom kao {to to ~ini ve}ina pokret-
nih elemenata i u drugim biljkama i `ivotinjama. Poput bakterijskih trans-
pozona, ovi se elementi premje{taju na razli~ita ciljna mjesta uzdu` geno-
ma. Takvo premje{tanje na nespecifi~na mjesta u genomu najvjerojatnije
nije korisno za stanice u kojima se odvija, ali zbog preslagivanja DNA sigur-
no igra veliku ulogu u evoluciji.
Nasuprot tomu, u genomima kvasaca i protozoa transpozicija s pomo}u
replikativnog mehanizma odgovorna je za programirana preslagivanja
DNA koja reguliraju ekspresiju gena. U tom slu~aju transpozicija zapo~inje
djelovanjem nukleaze koja kida specifi~no ciljano mjesto u koje se zatim
ubacuje kopija pokretnog elementa. Prema tome, pokretni se elementi ne
premje{taju samo na nespecifi~na mjesta uzdu` genoma, ve} mogu sudjelo-
vati i u specifi~nim preslagivanjima gena koja rezultiraju programiranom
promjenom ekspresije.
Transpozicija posredovana RNA intermedijarima
Ve}ina pokretnih elemenata u eukariotskim stanicama su retrotranspozoni
koji se premje{taju reverznom transkripcijom RNA intermedijara. U ~ovje-
ka postoji oko 3 milijuna kopija retrotranspozona koji ~ine oko 40% ukup-
noga genoma (vidi tablicu 4.l). Mehanizam transpozicije ovih elemenata sli-
~an je replikaciji retrovirusa. Stoga je mehanizam replikacije retrovirusa
uzet kao prototip za prou~avanje ove skupine pokretnih DNA sljedova.
Retrovirusi sadr`avaju RNA-genome u svojim virusnim ~esticama, ali
se repliciraju sintezom DNA-provirusa koji se integrira u kromosomsku
DNA inficirane stanice (vidi sliku 3-13). DNA kopija virusne RNA sintetizi-
ra se virusnim enzimom zvanim reverzna transkriptaza. Reverznom trans-
kripcijom nastaje molekula DNA koja ima izravna ponavljanja od nekoliko
stotina nukleotida na oba svoja kraja (slika 5-49). Ovi ponavljaju}i sljedovi,
nazvani duga terminalna ponavljanja (engl. long terminal repeats) ili LTR
nastaju duplikacijom onih mjesta virusne RNA za koja se ve`u po~etnice
kako bi inicirale sintezu DNA. LTR sljedovi imaju prema tome sredi{nju ulo-
gu u reverznoj transkripciji, a uz to su uklju~eni u integraciju i naknadnu
transkripciju provirusne DNA.
LTR LTR
virusni geni DNA
9 kb doma}ina
provirus
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 221

tRNA po~etnica Slika 5-50. Stvaranje LTRa za

vrijeme reverzne transkripcije.
virusna RNA LTR se sastoje od tri elementa: kratkog
5' 3' ponavljaju}eg slijeda (R engl. repeat)
R U5 PBS U3 R od oko 20 nukleotida koji je prisutan na
oba kraja virusne RNA; slijeda jedinstve-
reverzna transkriptaza vr{i
nog za 5' kraj virusne RNA (U5); i slije-
produljenje po~etnice ka 5'
kraju RNA-kalupa
da jedinstvenog za 3' kraj virusne RNA
(U3). Ponavljanja ovih sljedova nastaju
za vrijeme sinteze DNA jer reverzna
R U5 PBS U3 R transkriptaza ska~e dva puta izme|u
RNaza H razgra|uje RNA lanac krajeva svog kalupa. Sinteza se inicira
RNA-DNA dupleksa kori{tenjem tRNA po~etnice vezane za
mjesto vezanja po~etnice (PBS engl.
R U5 primer binding site) smje{teno uz U5 na
PBS
5' kraju virusne DNA. Polimeraza kopi-
reverzna transkriptaza ska~e putem hibridizacije U3 R
ra R, a RNA lanac RNA-DNA hibrida
DNA s R slijedom na 3' kraju RNA tada se razgradi RNazom H. Polimeraza
zatim ska~e na 3' kraj virusne RNA
kako bi sintetizirala kompletni lanac
R U5 DNA komplementaran RNA kalupu.
Polimeraza ska~e opet tijekom sinteze
drugoga lanca DNA koji se tako|er ini-
PBS U3 R cira po~etnicom vezanom uz 5' kraj nje-
reverzna transkriptaza produljuje po~etnicu govog kalupa. Rezultat tih skokova je
RNA-DNA dupleks razgra|en stvaranje LTR koji sadr`avaju U3-R-U5
RNazom H
U3 R U5 sljedove.

PBS
RNA ulomak slu`i kao po~etnica
za sintezu drugoga lanca DNA
U3 R U5

PBS U3 R U5
lanci DNA produljeni
RNA molekule su razgra|ene

PBS U3 R U5
RNaza H
razgra|uje tRNA U3 R U5 PBS

PBS U3 R U5

U3 R U5 PBS
drugi skok hibridizacijom PBS slijeda

PBS U3 R U5
zavr{etak sinteze DNA
U3 R U5 PBS

U3 R U5 PBS U3 R U5

LTR LTR

Kao sve DNA-polimeraze, reverzna transkriptaza zahtijeva prisutnost

po~etnica, a to su u slu~aju retrovirusa molekule tRNA vezane za specifi~na
mjesta (mjesta vezanja po~etnica) blizu 5' kraja virusne RNA (slika 5-50).
Budu}i da se sinteza DNA odvija u 5'3' smjeru, samo se mali dio DNA sin-
222 Poglavlje 5

tetizira prije nego {to reverzna transkriptaza do|e do kraja svog kalupa.
Nastavak sinteze DNA nakon toga ovisi o sposobnosti reverzne transkripta-
ze da se premjesti na 3' kraj RNA-kalupa. To se posti`e putem RNaza H ak-
tivnosti reverzne transkriptaze koja razgra|uje RNA-lanac DNA-RNA hibri-
da. Kao rezultat toga novosintetizirana DNA prevodi se u jednolan~anu
molekulu koja mo`e hibridizirati s kratkim ponavljaju}im slijedom prisu-
tnim i na 5' i na 3' kraju virusne RNA. Sinteza DNA se nakon toga mo`e
nastaviti, a kao produkt dobit }e se jednolan~ana DNA komplementarna
virusnoj RNA. Sinteza suprotnog lanca DNA zapo~ne fragmentom virusne
RNA koji djeluje kao po~etnica na mjestu uz 3' kraj DNA-kalupa. To opet
rezultira kratkim fragmentom DNA koji uklju~uje mjesto vezanja po~etni-
ce kopirano s tRNA koja je kori{tena kao inicijalna po~etnica za reverznu
transkripciju. Nukleotidni slijed tRNA koji ve`e po~etnicu zatim se degradi-
ra djelovanjem RNaze H ostavljaju}i ljepljivi lanac DNA koji se opet pre-
mje{ta i spari s komplementarnim slijedom na drugom kraju kalupa. Na-
kon toga sinteza DNA mo`e se nastaviti pri ~emu na kraju nastaje linearna
DNA koja sadr`ava LTR sljedove na oba kraja.
Linearna virusna DNA integrira se u kromosom stanice doma}ina meha-
nizmom koji podsje}a na integraciju pokretnih elemenata DNA. Integracija
je katalizirana virusnom integrazom i odvija se u mnogo razli~itih ciljnih
sljedova unutar stani~ne DNA. Integraza kida dvije baze na krajevima vi-
rusne DNA i stvara nazubljene krajeve u ciljnom mjestu stani~ne DNA.
Ljepljivi krajevi stani~ne DNA zatim se spajaju s krajevima virusne DNA, a
nastala pukotina popunjava se sintezom DNA. Integrirani provirus je pre-
ma tome ome|en izravnim ponavljanjima sljedova stani~ne DNA, sli~no
ponavljanjima koja ome|uju integrirane DNA-transpozone.
@ivotni ciklus virusa nastavlja se transkripcijom integriranog provirusa
~ime se stvara virusna genomska RNA te molekule mRNA koje upravljaju
sintezom virusnih proteina (uklju~uju}i reverznu transkriptazu i integra-
zu). Genomska RNA zatim se pakira u virusne ~estice koje se osloba|aju iz
stanice doma}ina. Tako nastale virusne ~estice mogu inficirati nove stanice
zapo~inju}i novi krug sinteze DNA i integracije. Sveukupni efekt mo`e se
promatrati kao premje{tanje provirusa s jednoga na drugo mjesto u kromo-
somu putem sinteze i reverzne transkripcije RNA intermedijara.
Drugi retrotranspozoni razlikuju se od retrovirusa po tome {to se ne pa-
kiraju u infektivne ~estice i zato se ne mogu {iriti s jedne stanice na drugu.
Ipak, ti se retrotranspozoni mogu premje{tati na nova mjesta u kromosomi-
ma unutar jedne stanice mehanizmom u osnovi sli~nim onom kojim se rep
liciraju retrovirusi.
Neki retrotranspozoni (zvani retrovirusima-sli~ni elementi ili LTR retro-
transpozoni) strukturno su sli~ni retrovirusima (slika 5-51). Retrotranspozo-
ni ovog tipa ~ine oko 8% ljudskoga genoma. Oni sadr`avaju LTR sljedove

Ty1 kvasac
330 bp 330 bp

sljedovi za kodiranje proteina

d d
5,9 kb

Slika 5-51. Struktura LTR retrotranspozona.

Pokretni element Ty1 kvasca ima istu organizaciju kao i retrovirusi. Sljedovi za kodi-
ranje proteina, uklju~uju}i gene za reverznu transkriptazu i integrazu, ome|eni su
LTR slijedovima (nazvanim d elementi) dugim oko 330 parova baza. Integrirani tran-
spozon ome|en je kratkim izravnim ponavljanjima ciljane DNA.
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 223

na oba kraja; kodiraju reverznu transkriptazu i integrazu i premje{taju se

(poput retrovirusa) transkripcijom u molekulu RNA, sintezom nove DNA
kopije s RNA-kalupa djelovanjem reverzne transkriptaze i integracijom u
stani~nu DNA.
Retrotranspozoni bez LTR sljedova razlikuju se od retrovirusa po tome
{to ne sadr`avaju LTR sljedove, premda kodiraju svoju vlastitu reverznu
transkriptazu. Glavnu skupinu ovih retrotranspozona u sisavaca ~ine viso-
koponavljaju}i dugi raspr{eni elementi (engl. highly repetitive long intersper-
sed elements LINE) koji se ponavljaju oko 850.000 puta i ~ine oko 21% ge-
nomske DNA (vidi 4. poglavlje). Cijeli LINE element dug je 6 do 7 kb, iako
je ve}ina ~lanova ove obitelji skra}ena na 5' kraju (slika 5-52). Na svom 3'
kraju LINE imaju slijed bogat adeninom za koji se smatra da je nastao rever-
znom transkripcijom poli A repova koji su dodani mRNA molekulama na-
kon transkripcije (vidi 6. poglavlje). Kao i drugi pokretni elementi, LINE su
ome|eni kratkim direktnim ponavljanjima ciljnih DNA mjesta, {to pokazu-
je da integracija uklju~uje stvaranje nazubljenih krajeva i popravak sinte-
zom.
Kako LINE ne sadr`avaju LTR sljedove, mehanizam njihove reverzne
transkripcije i naknadne integracije u kromosomsku DNA razlikuje se od
onog koji koriste retrovirusi i retrotranspozoni koji sadr`avaju LTR sljedo-
ve. Konkretno, reverzna transkripcija kao po~etnicu koristi prekinute kraje-
ve kromosomske DNA koju je pokidala nukleaza (kodirana retrotranspozo-
nom) na ciljnim mjestima za integraciju retrotranspozona (slika 5-53). Re-
verzna transkripcija tada zapo~inje unutar poli A slijeda na 3' kraju transpo-
zonske RNA i nastavlja se du` molekule. Suprotni lanac DNA sintetizira se
kori{tenjem drugoga prekinutog kraja ciljne DNA kao po~etnice, {to rezulti-
ra istovremenom sintezom i integracijom retrotranspozonske DNA.
Drugi sljedovi koji ne kodiraju svoju vlastitu reverznu transkriptazu ta-
ko|er se premje{taju putem RNA-intermedijara. Ovi elementi uklju~uju vi-
sokoponavljaju}e kratke raspr{ene elemente (engl. short interspersed elemen-
ts SINE) koji dolaze u otprilike 1,5 milijuna kopija u genomu sisavaca (vi-
di 4. poglavlje). Glavna porodica ovih elemenata kod ljudi sastavljena je od
Alu sljedova dugih otprilike 300 baza. Ovi su sljedovi na svom 3' kraju boga-
ti adeninom i ome|eni su kratkim duplikacijama nukleotidnog slijeda cilj-
ne DNA, pa su po tome strukturno sli~ni retrotranspozonima bez LTR slje-
dova (primjerice LINE). SINE nastaju reverznom transkripcijom malih mo-
lekula RNA uklju~uju}i molekule tRNA i male citoplazmatske molekule
RNA uklju~ene u transport proteina. Kako SINE elementi vi{e ne kodiraju
funkcionalne RNA produkte oni predstavljaju pseudogene koji nastaju
RNA-posredovanom transpozicijom. Pseudogeni mnogih gena koji kodira-
ju proteine (nazvani dora|eni pseudogeni) tako|er nastaju na sli~an na~in
reverznom transkripcijom glasni~kih molekula RNA (slika 5-54). Takvi dora-

LINE

reverzna transkriptaza
An
6 kb

Slika 5-52. Struktura ljudskih LINE elemenata.

LINE elementi nemaju LTR sljedove ali tako|er kodiraju reverznu transkriptazu.
Oni sadr`avaju sljedove bogate s A (ozna~eni s An) na svom 3' kraju, za koje se sma-
tra da nastaju reverznom transkripcijom poli-A repova dodanih na 3' kraj mRNA
molekula. Poput drugih pokretnih elemenata, LINE elementi su ome|eni kratkim
direktnim ponavljanjima ciljne DNA.
224 Poglavlje 5

Slika 5-53. Model reverzne trans- 5' 3'

kripcije i integracije LINE eleme- 3' 5'
nata.
Ciljna DNA pokidana je nukleazom ko- kidanje ciljane DNA
diranom retrotranspozonom. Reverzna
ciljna DNA sa zarezima s
transkripcija, kori{tenjem prekinutih jednolan~anim (ljepljivim) krajevima
krajeva ciljne DNA kao po~etnica, zapo- 5' 3'
~inje sa poli-A repom na 3' kraju RNA 3' 5'
retrotranspozona. Sinteza suprotnog
retrotranspozon 5' AAAAA 3'
lanca DNA retrotranspozona tako|er
RNA
kao po~etnicu koristi drugi lanac DNA ciljna DNA koristi se kao po~etnica
ciljnog mjesta. za reverznu transkiptazu

5' 3'
3' TTTT 5'
AAAA A

sinteza lanca komplementarnoga RNA

retrotranspozona
razgradnja RNA RNazom H

3' 5'
5' TTTT 3'

sinteza suprotnog lanca DNA

3' AAAA 5'

5' TTTT 3'

|eni pseudogeni lako se prepoznaju ne samo zbog toga {to zavr{avaju slije-
dom nukleotida bogatim adeninom, ve} i stoga {to su introni prisutni u nji-
hovim funkcionalno odgovaraju}im genima ovdje uklonjeni tijekom proce-
siranja glasni~kih molekula RNA. Smatra se da se transpozicija SINE eleme-
nata i drugih dora|enih pseudogena odvija sli~no transpoziciji LINE ele-
menata. No, kako ovi elementi ne posjeduju gene za reverznu transkripta-
zu ili nukleazu, njihovo premje{tanje vjerojatno uklju~uje djelovanje rever-
zne transkriptaze i nukleaze kodiranih genima koji se nalaze negdje drug-
dje u genomu najvjerojatnije u drugim retrotranspozonima kao {to su
LINE elementi.
Premda visokoponavljaju}i SINE i LINE elementi ~ine zna~ajan udio ge-
nomske DNA, njihova transpozicija na nasumi~na mjesta u genomu po
svemu sude}i nije od koristi za stanicu u kojoj su smje{teni. Kad se integri-
raju na nova ciljna mjesta ovi transpozoni induciraju mutacije koje su i po-
put onih izazvanih drugim ~imbenicima najvjerojatnije {tetne za stanicu. I
zaista, mutacije nastale transpozicijom LINE i SINE elemenata dovedene
su u vezu s nekim slu~ajevima hemofilije, mi{i}ne distrofije, karcinoma doj-
ke i karcinoma debeloga crijeva. S druge strane, neke mutacije nastale
premje{tanjem pokretnih elemenata mogu biti korisne na taj na~in {to pri-
donose evolucijskom razvoju vrste. Tako se primjerice prona{lo da neki re-
trotranspozoni u genomu sisavaca sadr`avaju regulatorne sljedove koji
kontroliraju ekspresiju susjednih gena.
Osim {to imaju mutageni u~inak, retrotranspozoni su odigrali veliku ulo-
gu u oblikovanju genoma stimuliranjem preslagivanja DNA. Tako primjeri-
ce preslagivanje kromosomske DNA mo`e nastati zbog rekombinacija
LINE elemenata integriranih na razli~ita mjesta u genomu. Nadalje, sljedo-
vi stani~ne DNA susjednih LINE elemenata u~estalo se prenose tijekom
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 225

egzon 1 intron 1 egzon 2 intron 2 egzon 3 Slika 5-54. Stvaranje dora|enoga

gen
5' 3'
3 pseudogena.
3' 5' Prikazani gen sadr`ava tri egzona raz-
dvojena s dvama intronima. Introni su
transkripcija
prekrajanjem uklonjeni iz primar nog
transkripta i dodan je poli-A rep na 3'
primarni kraj mRNA. Reverzna transkripcija i in-
transkript tegracija nakon toga stvaraju dora|eni
prekrajanje pseudogen koji ne sadr`ava introne i
dodatak poli-A repa ima slijed bogat adeninom na svom 3'
kraju. Dora|eni pseudogen ome|en je
AAAA kratkim direktnim ponavljanjima ciljne
DNA stvorenim tijekom integracije.
reverzna transkripcija
integracija na novo kromosomsko mjesto

dora|eni pseudogen AAAA

TTTT

transpozicije {to ima za posljedicu njihovo premje{tanje na nova mjesta u

genomu. Kako se LINE elementi mogu integrirati u aktivne gene, s njima
povezana transpozicija stani~nih sljedova DNA mo`e dovesti do stvaranja
novih regulatornih i/ili kodiraju}ih sljedova {to direktno pridonosi evolucij-
skom razvoju novih gena.
Velika ve}ina pokretnih elemenata u ljudskom genomu nije aktivna i
svega je oko 100 kopija LINE elemenata koji jo{ uvijek sadr`avaju sljedove
koji kodiraju proteine potrebne za njihovu transpoziciju. Prema tome, svi
ljudski DNA transpozoni i ve}ina retrotranspozona predstavlja evolucijske
relikte, a ne trenutno funkcionalne elemente. Ipak, to nije slu~aj kod dru-
gih vrsta uklju~uju}i Arabidopsis, C. elegans, vinsku mu{icu i mi{a koji imaju
mnogo ve}u razinu postoje}e transpozonske aktivnosti. Tako su u genomu
mi{a svi LTR retrotranspozoni, LINE i SINE elementi aktivni. Procjenjuje se
da oko 10% svih mutacija u genomu mi{a nastaje aktivno{}u transpozona
dok je svega 1 od 600 mutacija u genomu ~ovjeka uzrokovano transpozici-
jom. Ovakva dramati~na razlika u aktivnosti transpozona u genomu mi{a
odnosno ~ovjeka intrigira i tek }e se razjasniti novim istra`ivanjima.

Amplifikacija gena
Preslagivanja DNA o kojima se do sada govorilo mijenjaju polo`aj sljedova
DNA unutar genoma. Amplifikacija gena ili vi{estruko umna`anje gena
mo`e se promatrati kao druga~iji tip izmjena strukture genoma ona, nai-
me, pove}ava broj genskih kopija unutar stanice. Amplifikacija podrazumi-
jeva opetovanu replikaciju DNA ~ime se proizvode vi{estruke kopije odre-
|enih podru~ja (slika 5-55). Vi{estruko umno`eni DNA slijed mo`e se na}i
ili kao slobodna ekstrakromosomska molekula ili kao niz uzastopno pona-
vljaju}ih sljedova unutar kromosoma. U oba slu~aja dolazi do pove}ane
ekspresije amplificiranoga gena zahvaljuju}i jednostavnoj ~injenici da je
prisutno vi{e kopija dostupnih za transkripciju.
U nekim slu~ajevima amplifikacija gena odgovorna je za razvojno pro-
gramirana pove}anja ekspresije gena. Tipi~an je primjer amplifikacija ribo-
somnih RNA (rRNA) gena u oocitama vodozemaca. Oocite su iznimno veli-
ke stanice koje zahtijevaju pove}anu sintezu proteina. S obzirom na volu-
men, oocite vodozemaca su oko milijun puta ve}e od tipi~nih somatskih
stanica pa moraju imati velike koli~ine proteina tijekom ranog razvoja. To
zahtijeva pove}anu sintezu molekula rRNA {to se jednim dijelom posti`e
226 Poglavlje 5

Slika 5-55. Amplifikacija DNA. DNA

Ponavljaju}i koraci replikacije DNA stva-
raju vi{estruke kopije odre|ene regije
kromosoma.

amplifikacijom rRNA-gena. Kao {to je spomenuto u 4. poglavlju, u somat-

skim stanicama rRNA-geni dolaze u nekoliko stotina kopija {to je potrebno
za sintezu dovoljne koli~ine molekula rRNA nu`nih da se zadovolje meta-
boli~ke potrebe stanica. U oocitama vodozemaca ovi su geni amplificirani
dodatnih 2.000 puta na otprilike 1 milijun kopija po oociti. Drugi primjer
programirane genske amplifikacije odvija se u genomu vinske mu{ice. Nai-
me, geni u stanicama jajnika `enki vinske mu{ice, koji kodiraju proteine
jajne ovojnice (korionski geni), amplificirani su zato da bi se zadovoljila po-
treba za velikom koli~inom ovih proteina. Poput drugih programiranih
preslagivanja gena i amplifikacija gena relativno je rijedak doga|aj koji se
odvija u visoko specijaliziranim tipovima stanica i ne mo`e se smatrati uobi-
~ajenim mehanizmom regulacije gena.
Amplifikacija gena odvija se i kao nenormalni proces u zlo}udnim tumor-
skim stanicama gdje dovodi do povi{ene ekspresije gena koji pridonose ne-
kontroliranom rastu stanica. Ovaj tip amplifikacije gena prvi je put uo~en u
stanicama karcinoma koje su postale otporne na metotreksat, lijek koji se
uobi~ajeno koristi u kemoterapiji karcinoma. Metotreksat inhibira enzim di-
hidrofolat-reduktazu koji je uklju~en u sintezu dTTP i stoga je potreban za
sintezu DNA. Otpornost na metotreksat razvija se amplifikacijom gena za
dihidrofolat-reduktazu na taj na~in {to metotreksat ne mo`e vi{e inhibirati
djelovanje pove}ane koli~ine enzima dihidrofolat-reduktaze. Osim toga,
amplifikacija gena u stanicama karcinoma u~estalo rezultira pove}anom
ekspresijom gena koji upravljaju proliferacijom stanica (onkogeni) te tako
direktno pridonose razvoju tumora (vidi 15. poglavlje). Tako se primjerice
amplifikacija onkogena erbB-2 u~estalo odvija u karcinomu dojke. Prema to-
me, kao i kod drugih tipova preslagivanja DNA, posljedice amplifikacije ge-
na mogu biti korisne, ali i katastrofalne za stanicu ili organizam.
 Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA 227

S A @ E TA K KLJU^NI POJMOVI

REPLIKACIJA DNA
DNA-polimeraze: Razli~ite DNA-polimeraze igraju specifi~ne uloge u DNA-polimeraza, mutagen
replikaciji i popravku DNA kako u prokariotskim tako i u eukariotskim
stanicama. Sve poznate DNA-polimeraze sintetiziraju DNA samo u 5'
3' smjeru dodaju}i dNTP na prethodno sintetizirane po~etnice.
Replikacijske ra{lje: Roditeljski lanci molekule DNA se razdvoje i slu`e replikacijske ra{lje, Okazakijevi
kao kalupi za sintezu dvaju novih lanaca u replikacijskim ra{ljama. Je- fragmenti, DNA-ligaza, vode}i
dan novosintetizirani lanac (vode}i lanac) sintetizira se kontinuirano lanac, zaostaju}i lanac, primaza,
RNaza H, egzonukleaza, helikaza,
dok se drugi lanac (zaostaju}i lanac) formira spajanjem kratkih ulomaka proteini koji ve`u jednolan~anu
DNA koji se sintetiziraju u obrnutom smjeru u odnosu na sveukupni DNA, topoizomeraza
smjer replikacije. DNA-polimeraze i razli~iti drugi proteini djeluju koor-
dinirano sintetiziraju}i i vode}i i zaostaju}i lanac DNA.
Vjer nost replikacije: DNA-polimeraze pove}avaju to~nost replikacije oda- korektivna sposobnost DNA-
birom odgovaraju}e baze za unos u novosintetizirani lanac i korigira- polimeraze
njem novosintetizirane DNA na taj na~in da eliminiraju krivo sparene
baze.
Ishodi{te i inicijacija replikacije: replikacija DNA zapo~inje u specifi- ishodi{te replikacije, autonomno
~nom ishodi{tu replikacije koje sadr`ava vezna mjesta za proteine zaslu- repliciraju}i sljedovi (ARS),
kompleks ishodi{ta replikacije
`ne za po~etak procesa replikacije. (ORC)
Telomere i telomeraze replikacija krajeva kromosoma: Ponavljaju}i slje- telomere, telomeraza, reverzna
dovi nukleotida na krajevima kromosoma (telomere) repliciraju se djelo- transkriptaza
vanjem reverzne transkriptaze (telomeraze) koja sadr`ava svoj vlastiti
RNA kalup.

POPRAVAK DNA
Izravni obrat o{te}enja DNA: Nekoliko tipova ~estih o{te}enja DNA, po- pirimidinski dimeri,
fotoreaktivacija
put pirimidinskih dimera i alkiliranih gvaninskih ostataka, popravljaju
se izravnim obratom o{te}enja.
Popravak izrezivanjem: Ve}ina o{te}enja DNA popravlja se izrezivanjem popravak izrezivanjem
o{te}ene DNA. Nastale pukotine popunjavaju se novosintetiziranom baza, DNA-glikozilaza, AP-
DNA kori{tenjem neo{te}enoga komplementarnog lanca kao kalupa. U endonukleaza, popravak
izrezivanjem nukleotida,
popravku izrezivanjem baza specifi~ni tipovi pojedina~nih o{te}enih ba- ekscinukleaza, popravak udru`en
za uklanjaju se iz molekule DNA. Nasuprot tomu, popravak izreziva- s transkripcijom, popravak krivo
njem nukleotida prepoznaje {irok spektar lezija koje naru{avaju struktu- sparenih baza
ru DNA i uklanja o{te}ene baze kao dio izrezanog oligonukleotida. Tre}i
mehanizam popravka izrezivanjem specifi~no uklanja krivo sparene ba-
ze iz novosintetiziranih lanaca DNA.
Popravak sklon pogrje{kama (engl. error-prone repair): Specijalizirane popravak sklon pogrje{kama
DNA-polimeraze sposobne su replicirati DNA uzdu` mjesta o{te}enja,
premda aktivnost ovih polimeraza rezultira visokom u~estalo{}u ugrad-
nje pogrje{nih baza.
Rekombinacijski popravak: O{te}ena DNA mo`e se zamijeniti rekombi-
nacijom s neo{te}enom molekulom. Ovaj mehanizam igra va`nu ulogu
u popravku o{te}enja na koja se nailazi tijekom replikacije DNA kao i u
popravku dvolan~anih lomova.
228 Poglavlje 5

REKOMBINACIJA IZME\U HOMOLOGNIH DNA SLJEDOVA

Molekule DNA rekombiniraju se lomom i ponovnim spajanjem: Moleku-
larni mehanizam rekombinacije uklju~uje lom i ponovno spajanje rodi-
teljskih molekula DNA.
op}a homologna rekombinacija, Modeli homologne rekombinacije: Sparivanje homolognih molekula
Hollidayev model, Hollidayeva DNA omogu}eno je komplementarnim sparivanjem baza. Zarezani lan-
struktura ci roditeljske DNA ~ine nukleofilni napad na drugu roditeljsku moleku-
lu daju}i me|uprodukt s ukri`enim lancima poznat kao Hollidayeva
veza. Rekombinantne molekule se nakon toga formiraju kidanjem i po-
novnim spajanjem ukri`enih lanaca.
RecA Enzimi uklju~eni u homolognu rekombinaciju: Sredi{nji enzim homolo-
gne rekombinacije je RecA koji katalizira izmjenu lanaca homolognih
molekula DNA. Drugi enzimi zarezuju i razmotavaju roditeljske moleku-
le DNA te razrje{avaju Hollidayevu strukturu.

PRESLAGIVANJE DNA
rekombinacija u specifi~nom
mjestu, lizogeni ciklus, antigen,
imunoglobulin, receptor T
stanica
transpozicija, pokretni elementi,
transpozon
retrotranspozon, retrovirus,
reverzna transkriptaza, duga
terminalna ponavljanja (LTR),
LINE, SINE, dora|eni pseudogeni
amplifikacija gena
Rekombinacija u specifi~nom mjestu odvija se izme|u specifi~nih sljedo-
va DNA koje prepoznaju proteini uklju~eni u ovaj proces. Kod kralje`-
njaka rekombinacija u specifi~nom mjestu igra vrlo va`nu ulogu u stva-
ranju imunoglobulinskih gena i gena receptora T stanica tijekom razvoja
imunosustava.
Transpozicija posredovana DNA inter medijarima: Ve}ina DNA transpozo-
na premje{ta se uzdu` genoma bez potrebe za specifi~nim slijedom
DNA na mjestu insercije. Ipak, u protozoa i kvasaca transpozicija nekih
sljedova DNA u specifi~na ciljna mjesta rezultira programiranim presla-
givanjima DNA koja reguliraju ekspresiju gena.
Transpozicija posredovana RNA inter medijarima: Ve}ina transpozona u
eukariotskim stanicama premje{ta se reverznom transkripcijom RNA in-
termedijara sli~no replikaciji retrovirusa. Ovi retrotranspozoni uklju~uju
visokoponavljaju}e LINE i SINE sljedove genoma sisavaca.
Amplifikacija gena: Amplifikacija gena rezultat je uzastopnih replikacija
odre|enoga kromosomskog podru~ja. U nekim slu~ajevima amplifikaci-
ja gena zapravo je mehanizam za pove}anje ekspresije toga gena tije-
kom razvoja organizma. Amplifikacija gena tako|er se u~estalo doga|a
u stanicama karcinoma gdje mo`e rezultirati pove}anom ekspresijom
gena koji pridonose nekontroliranoj proliferaciji stanica.

Pitanja
1. Opi{ite uloge razli~itih DNA-polimera-
za u E. coli.
2. [to su Okazakijevi fragmenti? Kako
oni zapo~inju sintezu zaostaju}eg lanca?
Kako oni postanu kontinuirani lanac?
3. Usporedi djelovanje topoizomeraze
I i II.
4. Na koji biste na~in testirali slijed DNA
u stanicama kvasaca da biste saznali sadr-
`ava li on ishodi{te replikacije ili pak au-
tonomne replikacijske sljedove (ARS)?
5. Za{to ljudski genom sadr`ava na tisu-
}e ishodi{ta replikacije dok genom E. coli
sadr`ava samo jedno?
6. Kako zapo~inje sinteza DNA u ishodi-
{tu replikacije?
7. Na koji na~in telomeraza produljuje
krajeve kromosoma kompenziraju}i
nemogu}nost DNA-polimeraze da kom-
pletira replikaciju DNA kromosomskih
krajeva?

8. Objasnite proces popravka izreziva-
njem nukleotida.
9. Kako stanica mo`e popraviti dvolan~a-
ni lom svoje DNA?
10. Na koji je na~in karcinom dojke pove-
zan s mehanizmima popravka DNA?
11. Pacijenti koji pate od bolesti Xeroder-
ma pigmentosum imaju iznimno visoku
Literatura
Replikacija DNA
Baker, T. A. and S. P. Bell. 1998. Polymerases
and the replisome: Machines within ma-
chines. Cell 92: 296305. P
Bell, S. P. 2002. The origin replication complex:
from simple origins to complex functions.
Genes Dev. 16: 659672. P
Bell, S. P. and A. Dutta. 2002. DNA replication
in eukaryotic cells. Ann. Rev. Biochem. 71:
333374. P
Benkovic, S. J., A. M. Valentine and F. Salinas.
2001. Replisome-mediated DNA replica-
tion. Ann. Rev. Biochem. 70: 181208. P
Blackburn, E. H. 1992. Telomerases. Ann. Rev.
Biochem. 61: 113129. P
Cairns, J. 1963. The chromosome of Escherichia
coli. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.
28: 4346. I
Champoux, J. J. 2001. DNA topoisomerases:
structure, function, and mechanism. Ann.
Rev. Biochem. 70: 369413. P
Ellison, V. and B. Stillman. 2001. Opening
of the clamp: an intimate view of an
ATP-driven biological machine. Cell 106:
655660. P
Frick, D. N. and C. C. Richardson. 2001. DNA
primases. Ann. Rev. Biochem. 70: 3980. P
Gilbert, D. M. 2001. Making sense of eukary-
otic DNA replication origins. Science 294:
96100. P
Goodman, M. F. 1997. Hydrogen bonding
revisited: geometric selection as a principal
determinant of DNA replication fidelity.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1049310495.
P Popravak DNA
Huberman, J. A. and A. D. Riggs. 1968. On
the mechanism of DNA replication in
mammalian chromosomes. J. Mol. Biol. 32:
327341. I
Hubscher, U., G. Maga and S. Spadari. 2002.
Eukaryotic DNA polymerases. Ann. Rev.
Biochem. 71: 133163. P
Kornberg, A., I. R. Lehman, M. J. Bessman and
E. S. Simms. 1956. Enzymic synthesis of
deoxyribonucleic acid. Biochim. Biophys.
Acta 21: 197198. I
Replikacija, odr`avanje i preslagivanje genomske DNA
incidenciju karcinoma ko`e, ali nije na-
|eno da imaju odgovaraju}e visoku in-
cidenciju karcinoma unutra{njih organa
(primjerice karcinom debeloga crijeva).
[to nam ova ~injenica mo`e sugerirati o
vrstama o{te}enja DNA odgovor nih za
ve}inu unutarnjih karcinoma?
12. Koji fenotip biste predvidjeli za mu-
tiranoga mi{a s nedostatkom gena po-
Kunkel, T. A. and K. Bebenek. 2000. DNA
replication fidelity. Ann. Rev. Biochem. 69:
497529. P
Lohman, T. M. and K. P. Bjornson. 1996. Mech-
anisms of helicase-catalyzed DNA unwind-
ing. Ann. Rev. Biochem. 65: 169214. P
McEachern, M. J., A Krauskopf and E. H.
Blackburn. 2000. Telomeres and their con-
trol. Ann. Rev. Genet. 34: 331358. P
Ogawa, T. and T. Okazaki. 1980. Discontinu-
ous DNA replication. Ann. Rev. Biochem. 49:
421457. P
Stinthcomb, D. T., K. Struhl and R. W. Davis.
1979. Isolation and characterization of a
yeast chromosomal replicator. Nature 282:
3943. I
Waga, S. and B. Stillman. 1994. Anatomy of
a DNA replication fork revealed by recon-
stitution of SV40 DNA replication in vitro.
Nature 369: 207212. I
Waga, S. and B. Stillman. 1998. The DNA rep-
lication fork in eukaryotic cells. Ann. Rev.
Biochem. 67: 721751. P
West, S. C. 1996. DNA helicases: New breeds
of translocating motors and molecular
pumps. Cell 86: 177180. P
Wold, M. S. 1997. Replication protein A: A het-
erotrimeric, single-stranded DNA-binding
protein required for eukaryotic DNA me-
tabolism. Ann. Rev. Biochem. 66: 6192. P
Zakian, V. A. 1995. Telomeres: Beginning to
understand the end. Science 270: 16011607.
P
Batty, D. P. and R. D. Wood. 2000. Damage
recognition in nucleotide excision repair of
DNA. Gene 241: 193204. P
Cleaver, J. E. 1968. Defective repair replica-
tion of DNA in xeroderma pigmentosum.
Nature 218: 652656. I
Cox, M. M. 2001. Recombinational DNA repair
of damaged replication forks in Escherichia
coli: questions. Ann. Rev. Genet. 35: 5382.
P
229
trebnih za rekombinaciju u specifi~nom
mjestu koja se doga|a u limfocitima?
13. Mnogi od lijekova u klini~koj upora-
bi, kao i oni podvrgnuti istra`ivanjima, u
lije~enju od AIDS inhibitori su reverzne
e HIV. Koja reverzna transkriptaza u
ljudskim stanicama mo`e tako|er biti in-
hibirana ovim lijekovima? [to mo`e biti
posljedica inhibicije tih enzima?
De Laat, W. L., N. G. J. Jaspers and J. H. J.
Hoeijmakers. 1999. Molecular mechanism
of nucleotide excision repair. Genes Dev. 13:
768785. P
Fishel, R., M. K. Lescoe, M. R. S. Rao, N. G.
Copeland, N. A. Jenkins, J. Garber, M. Kane
and R. Kolodner. 1993. The human mutator
gene homolog MSH2 and its association
with hereditary nonpolyposis colon cancer.
Cell 75: 10271038. I
Friedberg, E. C., R. Wagner and M. Radman.
2002. Specialized DNA polymerases, cellu-
lar survival, and the genesis of mutations.
Science 296: 16271630. P
Friedberg, E. C., G. C. Walker and W. Siede.
1995. DNA Repair and Mutagenesis. Wash-
ington, D.C.: ASM Press.
Goodman, M. F. 2002. Error-prone repair DNA
polymerases in prokaryotes and eukary-
otes. Ann. Rev. Biochem. 71: 1750. P
Harfe, B. D. and S. Jinks-Robertson. 2000.
DNA mismatch repair and genetic instabil-
ity. Ann. Rev. Genet. 34: 359399. P
Hoeijmakers, J. H. J. 2001. Genome mainte-
nance mechanisms for preventing cancer.
Nature 411: 366374. P
Khanna, K. K. and S. P. Jackson. 2001. DNA
double strand breaks: signaling, repair and
the cancer connection. Nature Genetics 27:
247254. P
Leach, F. S. and 34 others. 1993. Mutations of a
mutS homolog in hereditary nonpolyposis
colorectal cancer. Cell 75: 12151225. I
Livneh, Z. 2001. DNA damage control by
novel DNA polymerases: translesion repli-
cation and mutagenesis. J. Biol. Chem. 276:
2563925642. P
Modrich, P. 1997. Strand-specific mismatch re-
pair in mammalian cells. J. Biol. Chem. 272:
2472724730. P
Sancar, A. 1996. DNA excision repair. Ann. Rev.
Biochem. 65: 4381. P
Seeberg, E., L. Eide and M. Bjoras. 1995. The
base excision repair pathway. Trends Bio-
chem. Sci. 20: 391397. P
230 Poglavlje 5
Svejstrup, J. Q. 2002. Mechanisms of
transcription-coupled DNA repair. Nature
Rev. Mol. Cell. Biol. 3: 2129. P
Wood, R. D. 1997. Nucleotide excision repair
in mammalian cells. J. Biol. Chem. 272:
2346523468. P
Rekombinacija izme|u
homolognih sljedova DNA
Baumann, P. and S. C. West. 1998. Role of the
human RAD51 protein in homologous re-
combination and double-stranded-break
repair. Trends Biochem. Sci. 23: 247251. P
DasGupta, C., A. M. Wu, R. Kahn, R. P. Cun-
ningham and C. M. Radding. 1981. Con-
certed strand exchange and formation of
Holliday structures by E. coli RecA protein.
Cell 25: 507516. I
Haber, J. E. and W.-D. Heyer. 2001. The fuss
about Mus81. Cell 107: 551554. P
Holliday, R. 1964. A mechanism for gene con-
version in fungi. Genet. Res. 5: 282304. I
Kowalczykowski, S. C. and A. K. Eggleston.
1994. Homologous pairing and DNA
strand-exchange proteins. Ann. Rev. Bio-
chem. 63: 9911043. P
Meselson, M. and J. J. Weigle. 1961. Chromo-
some breakage accompanying genetic
recombination in bacteriophage. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 47: 857868. I
Potter, H. and D. Dressler. 1976. On the mech-
anism of genetic recombination: Electron
microscopic observation of recombination
intermediates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:
30003004. I
Radding, C. M. 1991. Helical interactions in
homologous pairing and strand exchange
driven by RecA protein. J. Biol. Chem. 266:
53555358. P
Shinohara, A. and T. Ogawa. 1995. Ho-
mologous recombination and the roles of
double strand breaks. Trends Biochem. Sci.
20: 387391. P
Smith, G. R. 2001. Homologous recombination
near and far from DNA breaks: alternative
roles and contrasting views. Ann. Rev.
Genet. 35: 243274. P
Stahl, F. 1996. Meiotic recombination in yeast:
Coronation of the double-strand-break
repair model. Cell 87: 965968. P
Szostak, J. W., T. L. Orr-Weaver, R. J. Rothstein
and F. W. Stahl. 1983. The double-strand-
break repair model for recombination. Cell
33: 2535. I
Taylor, A. F. 1992. Movement and resolution of
Holliday junctions by enzymes from E. coli.
Cell 69: 10631065. P
West, S. C. 1992. Enzymes and molecular
mechanisms of genetic recombination.
Ann. Rev. Biochem. 61: 603640. P
West, S. C. 1997. Processing of recombination
intermediates by the RuvABC proteins.
Ann. Rev. Genet. 31: 213244. P
Preslagivanje DNA
Bassing, C. H., W. Swat and F. W. Alt. 2002. The
mechanism and regulation of chromosomal
V(D)J recombination. Cell 109: S45S55. P
Boeke, J. D., D. J. Garfinkel, C. A. Styles and
G. R. Fink. 1985. Ty elements transpose
through an RNA intermediate. Cell 40:
491500. I
Craig, N. L. 1995. Unity in transposition reac-
tions. Science 270: 253254. P
Craig, N. L. 1997. Target site selection in trans-
position. Ann. Rev. Biochem. 66: 437474.
P Ostertag, E. M. and H. H. Kazazian Jr. 2001. Bi-
Davis, M. M. 1990. T cell receptor gene diver-
sity and selection. Ann. Rev. Biochem. 59:
475496. P
Fedoroff, N. V. 2000. Transposons and genome
evolution in plants. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 97: 70027007. P
Fedoroff, N. and D. Botstein. 1992. The Dy-
namic Genome: Barbara McClintocks Ideas in
the Century of Genetics. Plainview, N.Y.: Cold
Spring Harbor Laboratory Press.
Finnegan, D. J. 1989. Eukaryotic transposable
elements and genome evolution. Trends
Genet. 5: 103107. P
Gilboa, E., S. W. Mitra, S. Goff and D. Balti-
more. 1979. A detailed model of reverse
transcription and tests of crucial aspects.
Cell 18: 93100. I
Haren, L., B. Ton-Hoang and M. Chandler.
1999. Integrating DNA: transposases and
retroviral integrases. Ann. Rev. Microbiol.
53: 245281. P
Hozumi, N. and S. Tonegawa. 1976. Evidence
for somatic rearrangement of immuno-
globulin genes coding for variable and
constant regions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
73: 36283632. I
International Human Genome Sequencing
Consortium. 2001. Initial sequencing and
analysis of the human genome. Nature 409:
860921. I
Kidwell, M. G. and D. Lisch. 1997. Transpos-
able elements as sources of variation in
animals and plants. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 94: 77047711. P
Landy, A. 1989. Dynamic, structural, and regu-
latory aspects of l site-specific recombina-
tion. Ann. Rev. Biochem. 58: 913949. P
Lewis, S. and M. Gellert. 1989. The mechanism
of antigen receptor gene assembly. Cell 59:
585588. P
McClintock, B. 1956. Controlling elements and
the gene. Cold Spring Harbor Symp. Quant.
Biol. 21: 197216. I
Moran, J. V., R. J. DeBerardinis and H. H.
Kazazian Jr. 1999. Exon shuffling by L1
retrotransposition. Science 283: 1530
1534. I
ology of mammalian L1 retrotransposons.
Ann. Rev. Genet. 35: 501538. P
Stark, G. R., M. Debatisse, E. Giulotto and G.
M. Wahl. 1989. Recent progress in under-
standing mechanisms of mammalian DNA
amplification. Cell 57: 901908. P
Stark, G. R. and G. M. Wahl. 1984. Gene ampli-
fication. Ann. Rev. Biochem. 53: 447491. P
Tonegawa, S. 1983. Somatic generation of anti-
body diversity. Nature 302: 575581. P
Venter, J. C. and 273 others. 2001. The se-
quence of the human genome. Science 291:
13041351. I
Weiner, A. M., P. L. Deininger and A.
Efstratiadis. 1986. Nonviral retroposons:
Genes, pseudogenes, and transposable
elements generated by the reverse flow of
genetic information. Ann. Rev. Biochem. 55:
631661. P