TEHNIKA IZRADE DNA-IPA

S obzirom na nain proizvodnje, primjenu, nain oitanja i prezentiranja rezultata, razlikujemo

vie razliitih podjela DNA-ipa. S obzirom na vrstu probe razlikujemo oligonukleotidni i cDNA-
ip (cDNA-chip/array).
Na oligonukleotidnom ipu se nalaze probe kratkih nukleotidnih sekvenci. U principu se naziv
ipa odnosi na specifinu tehniku proizvodnje koja objedinjuje kemijsku sintezu s tehnologijom
fotolitografije. Oligonukleotidne sekvence su sintetizirane direktno na ip (in situ). Sekvence
mogu biti due (60 baznih proba) ili krae (25 baznih proba), ovisno o namjeni ipa. Prednost
manjih proba je vea specifinost, uz vrlo malu mogunost kontaminacije s drugim sekvencama
(kao to je sluaj kod cDNA-ipa) jer se probe sintetiziraju in situ. Glavni nedostatak je visoka
cijena. Proizvodnja fotolitografskih maski iziskuje veliku financijsku investiciju. Nadalje,
fotolitografske maske se bez dodatnih trokova ne mogu izmijeniti da bi se proizveli drugaiji
oligonukleotidi. cDNA-ip se odnosi na mikroip, a naziva se i tokasti ip (spotted array).
Proizvodnja cDNA-ipa zahtijeva odreen meukorak koji nije potreban kod proizvodnje
oligonukleotidnog ipa, a to je koritenje enzima obrnute transkriptaze za proizvodnju cDNA i
PCR-a (polymerase chain reaction) za umnaanje cDNA komplementarnih odgovarajuoj mRNA.
Prema tome, probe cDNA ipa su oligonukleotidi, cDNA ili mali fragmenti PCR produkata koji
se podudaraju (komplementarni su) s mRNA. Probe se prvo sintetiziraju, a tek nakon toga
deponiraju na povrinu ipa koja je najee staklena (a moe biti plastina ili najlonska
membrana), jer veina laboratorija koristi staklena mikroskopska stakalca. Za deponiranje proba
na supstrat koristi se robot koji na vrhu svoje robotske ruke ima ugraene igle koje uranjaju u
posude s DNA probama i odlau ih na predviene lokacije na povrini ipa. Dobiveni uzorak na
ipu predstavlja profile nukleinskih kiselina pripremljenih proba koje su spremne hibridizirati s
komplementarnim cDNA metama pripremljenima obrnutom transkripcijom s mRNA iz
eksperimentalnih uzoraka.
Identifikacija mutacija i DNA varijacija na cjelokupnom genomu te sekvenciranje i analiza
genoma moe se izvesti oligonukleotidnim DNA-ipom, dok se cDNA-ip najee koristi u
prouavanju ekspresije gena, detekciji odreenih proteinskih komponenti u hrani, detekciji
mutiranih gena, te pri odreivanju sigurnosti konzumiranja GMO biljaka.

S bzirom na tip eksperimenta razlikujemo jednostruki i dvostruki marker eksperiment.

Najjednostavniji tip ip-eksperimenta je jednostruki marker eksperiment. U tu se svrhu ip mora
duplicirati kako bi se dobila dva identina ipa na kojima se namjerava prouiti ekspresija gena u
dva razliita uvjeta tj. tretmana. Duplicirani ipovi zatim hibridiziraju s metama koje su oznaene
samo jednim markerom. Budui da se koristi samo jedan marker, ovaj eksperiment e dati uvid u
apsolutnu razinu genske ekspresije. Dobiveni podaci iz razliitih uvjeta (tretmana) mogu se
usporediti s genima iz tzv. kontrolnog ipa. Prednost ovog sistema je da se mogu usporeivati
podaci iz razliitih eksperimenata na vie ipova. Aposlutna vrijednost genske ekspresije moe se
usporeivati izmeu istraivanja koja su izvedena s vremenskim razmakom od vie mjeseci ili
godina. Nedostatak sistema u usporedbi s dvostrukim marker sistemom je potreba za dvostruko
veom koliinom ipova za usporedbu razliitih uzoraka u eksperimentu. Dvostruki marker
eksperiment ima drugaiji pristup usporedbi ekspresije izmeu dva razliita stanja (uvjeta
okoline). Na primjeru iz rada Patrick Brown laboratorija u Stanford-u vidi se da su cDNA mete
dobivene iz stanica kvasca koje su rasle u uvjetima prisutnosti galaktoze ili glukoze. Za
razlikovanje signala izmeu dviju meta tijekom obrnute transkripcije dodani su razliito
fluorescentno obojeni nukleotidi, Cy3 ili Cy5 koji emitiraju svjetlo pri razliitim valnim duljinama.
Ovaj eksperiment se ponovi tako da se zamijeni marker. Skenirajui ip dva puta, jednom za Cy3
i jednom za Cy5, dobije se slika u kojoj se vidi omjer i jedne i druge boje te se moe izmjeriti
omjer transkripata iz oba uvjeta rasta (Gross i sur. 2000; Duggan i sur. 1995). Obzirom na podjelu
prema proizvoaima razlikujemo fotolitografiju i inkjet tehnologiju. Fitolitografijom se vee
stotine genskih sekvenci na povrinu ipa koristei fotolitografske procese kao to su
fotosenzitivne maske, kemijski predloci i ostale tehnike koritene u kompjuterskoj proizvodnj
ipova (Anonymous, 2008.).
Inkjet tehnologija ukljuuje postavljanje genskih proba na supstrat ipa koritenjem rasprivaa
sitnih kapljica koji su ugraeni u inkjet printer. Raspriva prska kemijsku otopinu koja sadri
genske probe u obliku odreenog uzorka na supstrat ipa. Razlikujemo elektronsko i kemijsko
vezanje genskih proba na supstrat. Elektronsko vezanje je smjetanje nabijenih molekula na
specifina test polja. Kako DNA ima snaan negativan naboj moe biti elektroniki pomaknuta
prema podruju pozitivnog naboja. Test polje ili cijeli red test polja na ipu su elektroniki
aktivirani pozitivnim nabojem. Otopina DNA proba je izloena na ip. Negativno nabijene probe
se ubrzano kreu prema pozitivno nabijenim poljima gdje se zatim koncentriraju i kemijski veu
za to polje. ip se zatim ispire i dodaje se nova, drugaija otopina DNA proba. Polje po polje, red
po red, DNA probe se specifinim vezama veu na ip. Kemijsko vezanje koristi kemijske procese
za vezanje DNA proba na staklenu povrinu. Prvo se individualne cDNA molekule izoliraju i
amplificiraju. Zatim se mikrouzorci (zapremine oko milijuntog dijela volumena jedne kapljice
vode) svake cDNA nanose na staklenu povrinu ipa tako da se svaki gen nalazi na jedinstvenoj
lokaciji. Mikrouzorci se zatim veu za staklo. Ovaj proces aktivira individualne elemente na ipu,
pripremajui ih na reagiranje i vezanje s komplementarnim DNA dijelovima (Theriault i sur.
1999).
DNA ip omoguuje ono to klasini sustavi molekularnih markera nisu u mogunosti, a to je
istraivanje ekspresije pojedinih gena, kao i istraivanje interakcija izmeu pojedinih gena. Zbog
toga DNA ip dobiva sve znaajniju ulogu, ne samo u genetici ve i u fiziologiji, dijagnostici,
veterini, humanoj medicini i prehrambenoj tehnologiji, kao i u veini inspekcijskih poslova u
podruju sanitarne zatite i hrane. ira upotreba ipa oekuje se u narednom razdoblju, a ujedno i
pad cijene primjene metode.
Razvoj DNA ipa e u konanici biti osnova za iru upotrebu novih metoda dijagnostike u zatiti
bilja, fitosanitarnoj inspekciji, veterinarskoj zatiti i inspekciji ivotinja, kao i u analizi hrane,
ljudske i animalne.
Standardni genski mikropostrojski eksperiment u osnovi se sastoji od sljedeih koraka:
1.) izoliranje RNK iz uzorka koji se treba usporediti,
2.) reverzna transkripcija RNK uzorka u obiljeene cDNK (komplementarna DNK),
3.) hibridizacija obiljeenih cDNK s identinim membranskim array-ima ili s array-ima na
staklenim slajdovima,
4.) ispiranje nevezane cDNK,
5.) detekcija i kvantifikacija hibridiziranih cDNK,
6.) usporeivanje kvantitativnih podataka iz razliitih uzoraka.
Primjena DNA mikropostroja tehnologije pomae znanstvenicima u identifikaciji novih gena,
razumijevanju njihovog funkcioniranja i razina ekspresija pod razliitim uvjetima. Takoer,
osigurava bolji uvid u razliite bolesti poput bolesti srca, mentalnih oboljenja, zaraznih bolesti te
uvelike doprinosi istraivanju karcinoma.
DNA mikropostrojna tehnologija moe omoguiti daljnju klasifikaciju tipova karcinoma prema
obrascima genske aktivnosti u tumorskim stanicama te tako pomoi u razvoju uinkovitijih
tretmanskih rjeenja koja e biti usmjerena izravno na specifine vrste karcinoma. .
Iako je proizvodnja DNK ipa vrlo skup i sofisticiran proces, posebice stoga to je u sluaju
humanog genoma potrebno na array-ju pojedinano rasporediti i vie od 30 000 gena, uporabom
automatiziranih ureaja i robota trokovi ovoga procesa smanjuju. Analiza velikog broja
informacija koje proizlaze iz mikropostroja eksperimenta obavlja se raunalnim putem, pri emu
dobivene informacije bivaju uvrtene u baze podataka koje se automatski obrauju.