Wektory i terapia genowa

Fragmenty DNA pocite restryktaz mog by czone z innym odcinkiem DNA

(wektorem) trawionymi t sam restryktaz. Koce DNA badanego i wektora mog
zosta poczone za pomoc ligazy. Wektory dzielimy na:
Autonomiczne: replikuj si niezalenie od genomu gospodarza.
Integracyjne: wczaj do jego DNA s bardziej stabilne, ale wystpuj w
mniejszej liczbie kopii. Nale tu midzy innymi wektory retrowirusowe.
Ekspresyjne: maj na celu zapewni efektywn ekspresj wszczepianego
genu.
Wektory wahadowe (bifunkcjonalne): mog wystpowa w co najmniej
dwch rnych organizmach, przy czym mona je przenosi midzy komrkami
prokariotycznymi i eukariotycznymi.

Dobr odpowiedniego typu wektora zaley od rodzaju komrki, w jakiej zamierzamy

klonowa dany fragment DNA. Najwaniejszym funkcjonalnym elementem wektora s
sekwencje Ori, odpowiedzialne za inicjacj replikacji, ktre musz by odpowiednie dla
wybranego organizmu. Istotn cech wektorw jest obecno w nich sekwencji
markerowych, kodujcych np. konkretne cechy fenotypowe danego organizmu, ktre
dadz si atwo zauway lub geny odpornoci na antybiotyki.

Do najwaniejszych wektorw uywanych w medycynie nale:

Plazmidy bakteryjne: pozachromosomowe czsteczki DNA, wielkoci kilku-
kilkuset tysicy PZ, zdolne do samodzielnej replikacji u prokaryota i niektrych
eucaryota. Plazmidy s przenoszone w procesie koniugacji midzy komrkami
bakteryjnymi
Wektory fagowe: s to wirusy infekujce bakterie przez aktywne
wstrzyknicie swojego DNA do wntrza komrek. Ich namnaanie jest bardzo
szybkie. Najlepiej poznanym jest fag, ktry moe by uywany jako wektor do
infekowania E. Coli. DNA faga moe zosta zamienione miejscami z jakim
odcinkiem bakteryjnego, wczajc si tym samym do genomu lub wnika do
niego na zasadzie insercji. Z kolei fag M13 ma mniejszy plazmid (6tys pz) ale nie
powoduje lizy komrki po namnoeniu.
Kosmidy: uywane w klonowaniu duych odcinkw DNA (do 45 kpz). Skadaj
si z sekwencji plazmidu z miejscem Ori, poczonych z sekwencj cos faga ,
koniecznej do upakowania DNA w kapsydy.
Wektory drodowe:
Sztuczne chromosomy drodowe: posiadaj sekwencje centromeru,
telomeru i inicjacji replikacji, ktre czy si z plazmidami. S doskonae do
badania ekspresji genw.
Sztuczne chromosomy bakteryjne: s bardziej stabilne od drodowych i
atwiej si nimi transformuje E.Coli, a take atwiej namnaa i izoluje.
Wektory eukariotyczne ssakw: jednymi z pierwszych byy te oparte o
wirusa SV40. zawieraj one fragmenty DNA wirusa z sekwencj ori, promotory
genw kodujce wczesne biaka wirusa oraz sekwencje odpowiedzialne za
inicjacj transkrypcji.
Sztuczne chromosomy ssakw
 Noniki syntetyczne: praktyczne zastosowanie maj liposomy, czyli
czsteczki lipidw o charakterze kationowym, zawierajce egzogenny DNA
wprowadzony za pomoc plazmidu. Liposomy mog wprowadza odcinki DNA
o rozmiarach do 150 kpz. Charakteryzuj si one nisk immunogennoci i du
pojemnoci. Zmodyfikowane przez skompleksowanie z gangliozydem GM1
czyni je niewidzialnymi dla makrofagw. Innymi wektorami chemicznymi s
polipeptydy kationowe.

Terapia genowa

Polega na wprowadzeniu prawidowego genu do komrki w ktrej wystpuje on w

formie uszkodzonej lub nie wystpuje w ogle. Terapia musi by poprzedzona testami
In vivo oraz In vitro. Konieczne jest uycie odpowiednich wektorw. Wskanikiem
sukcesu terapii jest pojawienie si ekspresji danego genu. Pacjenci poddani terapii
genowej musze pozostawa pod cis kontrol w celu oceny efektw leczenia i
wykrycia ewentualnych skutkw ubocznych. Obecnie jedyn dopuszczaln metod jest
wprowadzanie wektorw do komrek somatycznych. Modyfikacja komrek linii
pciowych jest ze wzgldw etycznych zabroniona.

Strategie terapii genowej:

Ex vivo: polega na pobraniu od chorego komrek do celowych i
wprowadzeniu genu In vitro. Kolejnym etapem jest ponowne wprowadzenie
komrek do organizmu.
In vivo: polega na wprowadzeniu terapeutycznego genu bezporednio do
tkanek.

Rodzaje terapii genowej

Dodawanie genw: gen uszkodzony pozstaje w swoim locus, a gen
terapeutyczny jest wprowadzony w inne miejsce chromosomu.
Zamiana genw: polega na wymianie genu zmutowanego na gen
prawidowy w procesie somatycznej rekombinacji homologicznej.
doskonalenie genomu: dodanie genu, ktry nie zastpuje adnego
innego, ale koduje substancje, ktre fizjologicznie nie s produkowane przez
komrk. Mog to by geny kodujce rybozymy, biaka wirusowe i
interleukin 2. produkty genu wprowadzonego wpywaj na ekspresj innych.

Prby terapii genowej u ludzi

Do roku 2010 odbyy si 1644 prby kliniczne terapii genowe u ludzi, z czego ponad
900 przeprowadzono po roku 2000. najwicej z nich dotyczyo chorb
nowotworowych, na drugim miejscu znalazy si choroby sercowo-naczyniowe.

Terapia genowa w niektrych chorobach

Mukowiscydoza: prby dotycz gwnie skorygowania defektu
genetycznego komrek oskrzeli, gdy objawy pucne s w chorobie
najgroniejsze. Najczstszymi wektorami s w tym przypadku adenowirusy,
ostatnio te lentiwirusy. Transgen (CFTR) w odpowiednim wektorze
wprowadza si drog wziewn. Gwnym problemem jest wprowadzenie
wektora do komrek, gdy spotyka si on z odpowiedzi odpornociow. Z
 powodu wymiany komrek nabonka terapia musi by regularnie powtarzana.
Do przywrcenia prawidowego stanu organizmu wystarczy 10% ekspresja
CFTR.
Choroby ukadu naczyniowego: prby koncentruj si na chorobie
niedokrwiennej serca i koczyn. Z duym sukcesem prowadzi si prby
wprowadzania genw kodujcych substancj wzmagajce angiogenez, np.
VEGF czy jeszcze skuteczniejszy FGF-4. prace dotycz te ograniczenia
restenozy (ponownego zwenia) po angioplastyce. Stosuje si tu geny
kodujce rybozymy ograniczajce proliferacj mini gadkich, ktra w
nadmiarze powoduje zwenie naczy. Wyniki bada w kierunku walki z
miadyc s mniej obiecujce, co wynika z trudnoci w otrzymaniu
odpowiedniej ekspresji czynnika angiogennego i jego utrzymania a do zajcia
procesu. Innym podejciem jest wszczepianie naczy ylnych modyfikowanych
ex vivo chorym na chorob zarostowo-zakrzepow.
Hipocholesterolemia rodzinna: terapia przebiega ex vivo na pobranym
fragmencie wtroby przy namnoeniu hepatocytw In vitro i wprowadzeniu
do nich za pomoc retrowirusw genu kodujcego receptor dla LDL, a
nastpnie ponownym wszczepieniu tych komrek do wtroby chorego poprzez
y krezkow. Zabieg taki powtarza si trzykrotnie, ale skuteczno nie jest
wysoka.
Choroba Parkinsona: we wszystkich prbach wykorzystuje si wektory
AAV. Pierwsze prby polegay na wprowadzeniu do jdra podwzgrza genu
dekarboksylazy kwasu glutaminowego, ktrego produkt poredniczy w
syntezie GABA. Inn metod jest wprowadzenie genu dla neuturyny, ktry
ktra pobudza rnicowanie neuronw dopaminergicznych. Trzeci opcj jest
terapia ciaa prkowanego genem dekarboksylazy L-aminokwasw
aromatycznych.
AIDS: prac postpuj w trzech kierunkach. Jednym z nich jest
wprowadzenie do komrek hematopoetycznych transgenu powodujcego
niewraliwo na infekcj wirusow HIV. Inn metod jest dostarczanie
transgenu do limfocytw t CD 4i 8. trzeci metod ma by immunizacja
antygenami wirusa HIV, ktra wywoa odporno na wirusa.
Choroba Huntingtona: prace polegaj na uzyskaniu nadekspresji
rzskowego czynnika neurotroficznego CNTF, redukujcego obumieranie
prkowia. Do komory bocznej mzgu wstrzykuje si pprzepuszczaln
kapsuk ze zmodyfikowanymi komrkami nerki chomika. Kapsuk wymienia
si co 6 miesicy. W pierwszych badaniach klinicznych tej metody otrzymano
zadowalajce efekty. W badaniach prowadzonych u naczelnych osignito
cakowit korekcj fenotypu.
Choroba Alzheimera: pierwsza prba, przeprowadzona w 2001 roku
polegaa na wprowadzeniu do przodomzgowia komrek wykazujcych
ekspresj czynnika wzrostu nerww NGF stymulujcego neurony
cholinergiczne. Komrki implantowane to autologiczne fibroblasty.

Terapia genowa nowotworw

Immunoterapia: polega na uczynieniu Komorek nowotworowych
widocznymi dla ukadu immunologicznego, przez zmodyfikowanie ich
genami kodujcymi cytokin takie jak TNF. Prowadzi to do zwikszenia
 prezentacji antygenw przez komrki nowotworowe i w efekcie rekrutacji
specyficznych limfocytw T i B.
Wirusy onkolityczne: wektory tego typu wybirczo niszcz komrki
nowotworowe, pozostajc nieszkodliwe dla prawidowych. Wirusy namnaaj
si w komrkach nowotworowych i po jej rozpadzie atakuj kolejne. W
pierwszej prbie wykorzystano zmodyfikowane wirusy, namnaajce si w
komrkach pozbawionych biaka p53. innym wykorzystywanym wirusem jest
zmodyfikowany Hermes simplex stosowany w raku piersi i trzustki.
Kompensacja mutacji: polega na inhibicji funkcji onkogenu i
przywrceniu funkcji genu supresorowego dziki:
o Zatrzymaniu transkrypcji onkogenu przy pomocy antysensownych
oligonukleotydw tworzcych struktur podwjnej helisy
o Zatrzymania translacji mRNA okrelonego onkogenu przez
zastosowanie jak wyej antysensownych sekwencji
o Zablokowanie funkcji onkoprotein
o Zastpienie zmutowanych form genw p53, czy RB1 niezmutowanymi.
Terapia stosujca geny samobjcze: jest to przykad molekularnej
chemioterapii. Prby kliniczne obejmuj:
o Transfer genu kinazy tymidyniowej zwikszajcej podatno na aciklovir
o Transfer genu deaminazy cytozynowej, powodujcy podatno na 5-
fluorocytozyn
o Transfer genu cytochromu P450 2B wzmacniajcy podatno na
cyklofosfamid.
Ogem geny samobjcze koduj produkty, ktre przeksztacaj podany do
organizmu substancj (prolek) w trujce metabolity indukujce apoptoz.
Produkty toksyczne mog te by niebezpieczne dla zdrowych komrek
ssiednich. Dziki tej metodzie dokonano przeomu w walce z glejakiem mzgu.