1.

RESTRIKTIVNI ENZIMI
Enzimi koji se najee koriste u molekularnoj biologiji su restriktivni enzimi.
RE su osnovni alat u dg.istrazivanju, genetickom inzinjeringu itd.
Oni prepoznaju specifina mjesta odnosno DNK-a sekvence od 4-6 baznih parova u duini,
unutar koje sijeku dvolananu DNK-a na razliite i na uvijek ponovljive naine.
Sekvence prepoznavanja zovemo palindromskim(simetricnim)sekvencama,njihova
karakteristika je da se itaju isto u oba smjera.
Ovi enzimi isijecanjem DNK-a molekule stvaraju razliite krajeve i to :
1.tupe -ravne (blunt ends)
2.ljepljive-jednolanane krajeve (sticky ends);
Isto sijeku DNK-a iz razliitih izvora. Ovo je omoguilo spajanje isjeenih (restrigiranih) DNK-a
fragmenata iz razliitih izvora(organizama).
Njihovo otkrie je otvorilo put rekombinantnoj DNK-a tehnologiji.
Do sada je pronaeno vie od 500 RE koji prepoznaju preko 100 razliitih ciljnih(palindromskih)
sekvenci.

Slika 1. Ljepljivi i tupi restrikcioni fragmenti (RE- EcoRI)

Svi restikcijski enzimi se klasificiraju na osnovu sekvence koju prepoznaju i mjesta na kojem
sijeku DNK. S ozirom na to razlikujemo tri tipa RE: I, II, i III..
Najveu primjenu imaju restrikcijske endonukleaze tipa II, zbog svojih osobina jedinstvenog
prepoznavanja kratkih DNK-a sekvenci i ponovljivog isijecanaja dvolanane DNA molekule bez
obzira na njeno porijeklo.
Istovjetna ponovljivost restrikcije nije karakteristika tipa I i III.
U komercijalnoj upotrebi je vie od 200 i uglavnom se proizvode metodama genetikog
ininjeringa.
 Tabela 1.est najeih restriktivnih enzima koji se koriste

Ime Baketrija domacin Prepoznajuce Temperatura digestije

sekvence
HaeIII Haemophilis GGCC 37C
parainfluenzae
PvuII Proteus vulgaris CAGCTG 37C
EcoRI Escherichia coli GGATCC 37C
HhaI Haemophilus GCGC 37C
haemolyticus
MspI Moraxella species CCGG 37C
TaqI Thermus aquaticus TCGA 65C

Imena su dobili po inicijalima bakterije domaina iz koje su izolovani, svaki od njih ima
specifinu temperatutu digestije i pH optimum.
Zbog svoje univerzalne prirode upotrebljavaju se za digestiju DNK-a iz razliitih izvora
ukljuujui i ovjeka.
Zbog toga predstavljaju vrlo korisno sredstvo u istraivanju i dijagnostici. Bez njih bi bila
nezamisliva DNK-a manipulacija.
Bakterije su sposobne da uz pomo retrsikcijskih enzima prepoznaju stranu DNK-a i da je
digestiraju dok svoju genomsku DNK-a metiliraju (citozin i guanin su baze koje se najee
koriste za metilacije).
Sijeku oba lanca u 5- 3 pravcu.
Predpostavlja se da RE digestiraju humanu DNK-a na svakih 256 i 4096 baznih parova. Duina
sekvenci koje prepoznaju je od 4-6 baznih parova. To znai da u naem genomu od 3 milijarde
baza imamo oko 10 miliona restriktivnih mjesta od 4 baze, a oko 700 000 hiljada restrikcijskih
mjesta veliine 6 baznih parova. Naime misli se da je 50 % humanog genoma prekriveno
restrikcionim sekvencama, to omoguava ogromnu medicinsku i istraivaku primjenu
restrikcionih enzima. Njima se vrlo jednostavno i brzo moe odrediti alteracija,(point takaste
mutacije, delecije, insercije). Kod razliitih klinikih stanja omoguavaju brzi skrining mutacija
ili jednonukleotidnih polimorfizama kod veeg broja istovremeno.
Nakon reakcije restrikcije radimo fragmentalnu analizu razliitim vrstama elektrofereze kao to
je agaroza, poliakrilamidna i kapilarna.Ovom analizom elimo da utvrdimo nastanak fragmenta
razliite veliine.
Retstricion fragment lenght polymorphizam (eng.RFLP)
Za RFLP analizu prethodno moramo imati genomski ili PCR fragment nakon toga vrimo ciljanu
restrikciju a potom na gelu elektorferezom provjeravamo dali je dolo do restrikcije, na taj nain
dobijemo informacije o sekvenci na restriktivnom mjestu.
Restriktivni enzimi su neizostavni u kreiranju genomske biblioteke organizma.
Genomska biblioteka- klonirani fragmenti genoma nekog organizma u odreenim elijama
(E.coli i kvasac).
Tokom elektroferetske fragmentalne analize (analizaDNK-a fragmenta) nastalih PCR ili RFLP
metodom, mora se izvrti vizuelizacija. Kad su nukleinske kiseline u pitanju najjednostavnija
vizuelizacija je upotrebom etidijum bromida kao visoko interferirajueg agensa izmeu baznih
parova. Izlaganjem takvog fragmenta UV svjetlu na gelu vidimo bend ili traku oekivanog DNK-
a fragmenta. Zbog navedenih svojstava izbjegava se etidijum bromid jer je mutagen a time i
kancerogen pa se pribjegava fluroscentnom (skupljem) nainu obiljeavanja (detekcije,
vizuelizacije) fragmenata nukleinskih kiselina.