SADRAJ

SADRAJ.............................................................................................................2
UVOD...................................................................................................................3
METODE..............................................................................................................4
PCR-RFLP.............................................................................................................5
PCR.......................................................................................................................7
Metoda sekvenciranja..........................................................................................12
Literatura.............................................................................................................16
UVOD

Molekularno genetike analize su alati dananjih biologa, koji su zainteresovani ne

samo za opisivanje, ve i razumijevanje procesa elijske i razvojne biologije. Ove analize
predstavljaju spoj biohemijskih i genetikih pristupa u rjeavanju nekog problema i
ispitivanjima ivih sistema.

Biohemijski pristup je jako koristan u identifikaciji velikih makromolekulskih

komponenti elija i metabolitikih ciklusa. Ipak, ako se koristi sam, on nije adekvatan nain
analize detalja regulacija ovih metabolikih ciklusa. Biohemijske analize su, iako mone, jako
ograniene. Biohemiari identificiraju i karakteriziraju komponente od interesa (proteine)
tako to ih proiste ili prate njihovo prisustvo putem proba reakcija ili elijskih procesa koje
kataliziraju. Nadalo se da e ispitivanje karakteristika kao to su subelijske lokalizacije,
strukture i identifikacija interreagirajuih proteina pruiti naznake njihovih funkcija.
Meutim, ove studije su neinformativne, ako je komponenta zastupljena u jako malim
koliinama ili je nestabilna. Ukoliko se ne moe napraviti proba za odreenu metodu,
biohemijski pristup nee dati rezultata.

Genetiki pristup nema ova ogranienja, ali zato ima druga. Informacije o broju,
funkciji, lokaciji ili strukturi genske funkcije, nisu primarno potrebne. Bitno je samo da se
posmatra proces od interesa (divlji-tip fenotipa) i identifikuje pojedince koji pokazuju
alteracije ili aberacije u ovom procesu (mutantni fenotip). Genetski pristup podrazumijeva da
mali ili bilo koji elijski procesi nastaju spontano in vivo, a da tu postoji gen koji kodira
protein ili RNK koja je odgovorna za katalizu procesa i doputa im da se dese u stopi koja je
adekvatna kako bi se odrao rast i razvoj. Genetiari odvajaju mutirane indvidue koje
pokazuju alteraciju u tim elijskim procesima, koriste genetike analize da bi identificirali
iroku lepezu gena koji kodiraju produkte ukljuene u regulaciji procesa od interesa i istrauju
genetske interakcije izmeu samih gena. Da bi nastavio sa istraivanjem, genetiar mora da
izolira i funkcionalno karakterie genski produkt, a to zahtijeva alate biohemijskih analiza. ta
vie, velika ogranienja za genetiare proizilaze iz dostupnosti specifinih genetskih tehnika
za odreeni organizam koji se istrauje.

Strunom primjenom tehnika genetike i biohemijske analize, molekularno-genetike

analize omoguavaju istraivau da identificira sve gene koji kontroliraju proces, izoliraju
protein ili RNA koja je umijeana, odnosno, i otkrivaju njihove molekularne mehanizme.

2
Genetski pristup je izravan, ali nije lagan. Alati genetikih analiza ukljuuju selekciju/skrining
mutacije, analizu komplementarnosti, analizu finih struktura mutacija, analizu supresije i
amplifikacije i donedavne mogunosti genskog kloniranja, analiziranju sekvence i genomike.1

METODE

Postoji veliki broj tehnika koje se primjenjuju u molekularno-genetikim analizama

(Gel elektroforeza, ekstrakcija DNK i RNK, restrikcijski enzimi, Southeren i Northern
blotting, PCR i mnoge druge). U ovom emo radu opisati tri molekularno-genetike tehnike
(PCR, PCR-RFLP, Sekvenciranje) kroz analizu mitohondrijalne DNK u npr., scenariju
dokazivanja majinstva. Tehnike e biti opisane kroz PCR-RFLP metodu i metodu
sekvenciranja.

Mitohondrijalna DNK (mtDNK) je odlian genealoki marker koji se prenosi sa jedne

generacije u sljedeu bez mjenjanja(jedino ukoliko je rije o mutaciji). Mitohondrije se inae
nalaze u citoplazmi elije i proizvode energiju. Poto sva citoplazma dolazi od jajne elije,a
muke spolne stanice samo sadravaju jezgro, mtDNK se ekskluzivno nasljeuje od majke.
Ona stoga nije podlona roditeljskoj rekombinaciji i epigenetskom efektu koji potie od
roditelja. Iako je sjajna u genealogiji ili evolutivnim istraivanjima, mtDNK zbog odsustva
rekombinacije nije korisno sredstvo u forenzici. Takoer upotrebom mtDNK ne moemo
razdvojiti blisku rodbinu, zato to odreeni mtDNK profil moe imati svako u porodici ko ima
istog enskog pretka.Iako je jedrena DNK monija, mtDNK je tokom dugih vremenskih
perioda stabilnija. Ta odlika mtDNK potie od toga to se ona nalazi u organeli sa duplim
zidovima, i to je zastupljena u velikom broju kopija. To nam pomae da dobijemo vei broj
DNK iz uzoraka, naroito onih koji su jako degradirali. Mitohondrijalna DNK ima 37 gena u
2 glavna regiona. Jedan je nekodirajui region koji kontrolilra samu mtDNK, dok drugi
kodirajui sadrava ovih 37 gena. U ovih 37 gena spadaju: 22 tRNK (translatorna RNK) gena,
2 rRNK (ribosomalna RNK) gena i 13 gena zaduenih u proizvodnji elijske energije.

1
Corinne A. Michels (2002.), Genetic Techniques for Biological Research A case study approach,
Department of Biology, Queen's College of the City University of New York, New York, USA, JOHN
VVILEY & SONS, LTD.

3
 Tabela 1.Neke razlike izmeu mitohonrijalne i jedrene DNK

Jedrena DNK Mitohondrijalna DNK

3,2 Biliona baznih parova 17,000 baznih parova
Dvije kopije po eliji 100 kopija
Linearna Cirkularna
Nasljeuje i od oca i od majke Nasljeuje se samo od majke
Diploidni genom Haploidni genom
Rekombinira se Ne rekombinira se
Unikatna Ista kod svakog unutar majinske linije
PCR-RFLP

Prije nego to su specifini geni i sa njima povezane mutacije bile potpuno

okaratkerisane, genetike analize su se provodile putem RFLP-a (Restriction fragment length
polymorphisam). RFLP predstavlja varijacije u duini restrikcijskih fragmenata izmeu alela
koje potiu od prisustva ili odsustva restriskcijskog mjesta. Postoji vei broj tipova genetikih
varijacija.Tkz. male genetike varijacije ukljuuju jednonukleotidne polimorfizme (SNPs),
mulitnukleotidne polimorfizme(MNPs) i mikroindele. MNP-ovi su mutliple, konsekventne
nukleotidne varijacije jedne zajednike duine kao to je dupli nukleotidni polimorfizam
(DNPs) i trostruki nukleotidni polimorfizam(TNPs) sa dvije odnosno tri varijable nukleotida.
Mikroindele su delecije, duplikacije i kombinacije koje uestvuju u dobitku ili gubitku jedne
do pedeset nukleotida. Ljudski genom sadri vie od tri miliona SNP-ova lociranih sa
srednjom duinom od blizu hiljadu baznih parova.

Figura 1.Male genetike varijacije. Male genetike varijacije ukljuuju: SNP-ove, DNP-ove i
TNP-ove.

PCR-RFLP je popularna tehnika za genotopiziranje. Ona eksploatie SNP-ove, MNP-

ove i mikroindele esto povezane sa nastajanjem ili ukidanjem mjesta prepoznavnja za

4
 odreeni restrikcijski enzim. Prvi korak u PCR-RFLP analizi je PCR amplifikacija fragmenta
koji sadri varijaciju, u naem e sluaju to biti mtDNK (mitohondrijalna DNK). Zatim sljedi
tretman sa odgovarajuim restrikcijskim enzimom. Kako prisustvo ili odsustvo mjesta
restrikcijske rezultira formiranjem restrikcijskog fragmenta razliitih duina, alelna
identifikacija se izvrava putem gel elektroforeze. PCR-RFLP se dakle sastoji od nekoliko
odvojenih koraka koji ukljuuju dizajniranje prajmera, identifikacija odgovarajueg
restrikcijskog enzima, amplifikacije, apliciranja restrikcijskog enzima i gel elektroforeze.2
Sama DNK (u naem sluaju mtDNK) se ekstrahira jednim od protokola za ekstrakciju DNK
iz uzoraka. Uzet emo primjer ekstrakcije mtDNK iz folikula dlake.

1. U Eppendorfovu tubicu staviti Chelex i enzim proteinaza K. Proteinaza K e osloboditi elije

folikula kose iz dlake, dok e Chelex vezati metalne jone koji bi mogli interferirati sa PCR
reakcijom kasnije.
2. Izupati jednu ili dvije dlake sa obrva ili trepavica.
3. Koristei set i mikroskop za disekciju odrezati dlaku odmah iznad njenog bulbusa.
4. Koristei forceps ubaciti disecirani uzorak u Eppendorfovu tubicu. Ovlaeni forceps
proteinazom K bolje uzima uzorak.Uzorak treba da je uronjen u tubicu, a ne sljepljen za
zidove.
5. Staviti tubicu u Eppendorfov stalak za tubice u vodenom kupatilu 10 minuta na temperaturi
od 37 stepeni celzijusovih. U ovom periodu proteinaza K e digestirati membarnu koja uva
elije dlake.
6. Nakon 10 minuta, staviti tubicu na vorteks 15 sekundi. Ovo e raspriti elije dlake.vrsto
drati hvat na tubici dok je na vorteksu i drati poklopac tubice zatvorenim.
7. Staviti tubu u 100 stepeni celzijusovih termbloku 8 minutra. Ovo e prokljuati soluciju,
lizirati eliju i osloboditi DNK. Poklopac ima obiaj da se otvori tokom kljuanja. Nakon to
se prvi put otvori, potrebno ga je zatvoriti i staviti neki uteg na njega. Tubicu uzeti forcepsom
i staviti da se hladi 2 minute.
8. Stavit opet na vorteks 15 sekundi.
9. Centrifugirati tubicu na 14,000 rpm 30 sekundi, potom 20/200 mikrolitarskom pipetom
ukloniti 150 mikrolitara supernatanta i staviti u istu 1,5 mL tubu za centrifugiranje. Potrebno
je i kvantificirati mtDNK putem Blot tehnike ili jednaina pomou kojih se na osnovu jedrene
DNK izraunava mogua koliina mtDNK.3

2
Henrik Berg Rasmussen, Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of PCR-Amplified
Fragments(PCR-RFLP) and Gel Electrophoresis Valuable Tool for Genotypingand Genetic Fingerprinting
Institute of Biological Psychiatry, Mental Health Centre Sct. Hans,Copenhagen University Hospitals, Roskilde,
Denmark. 315-316
3
Robert J. Kosinski, Donna R. Weinbrenner, and Melodie G. Cross Extraction, Sequencing, and Analysis
of Mitochondrial DNA, Department of Biological Sciences, 132 Long Hall, Clemson University, Clemson.9-10

5
PCR

Nakon ekstrakcije i kvantifikacije dakle sljedi PCR uzorka.Polimeraza lanana

reakcija ili PCR je trenutno okosnica medicinske molekularne biologije. Jedan od razloga
velike rairenosti ove metode je njena elegantna jednostavnost naina u kojem se reakcije sa
lakoom odvijaju. Zaista, kombinacijom relevantnih bioinformatikih resursa za praktini
dizajn i za odreivanje potrebnih eksperimentalnih uslova, ova metoda prua brzu
identifikaciju i analizu DNK. Takoer otvara studije istraivanja elijskih i molekularnih
procesa onim istraivaima koji nisu biolozi, a naroito je dala veliki doprinos u mapiranju
ljudskog genoma. PCR je in vitro amplifikacijska metoda kojom se generiraju relativno velike
koliine (oko 1015 kopija ili priblino 0,25-0,5 mikrograma) specifine DNK sekvence iz male
koliine heterogene DNK koja esto ini ukupni elijski genom. Osjetljivost ove metode je
tolika da je mogua uspjena amplifikacija iz samo jedne elije ili iz neke populacije DNK
koja je pristuna u viku pozadinske DNK(npr. virusi koji su zarazili samo nekoliko elija, ili
kod curenja transkripcione RNK iz neekspresivnog tkiva).Proces se sastoji iz inkubacije
smjese koja sadri DNK i potrebne reaktante, uzastopno izmeu 3 razliite temperature
inkubacije: denaturacije, anilinga (hibridizacije) i ekstenzije.Ova nagla promjena temperature
je mogua upotrebom termoblokova koji mogu mjenjati temperaturu za 3 stepena celzijusovih
u intervalu od 3 sekunde. PCR postie skoro eksponencijonalnu amplifikaciju DNK sekvence,
duine definirane parom oligonukleotidnih prajmera komplementarnih 20-25 bp sekvenci na
njenim 5' i 3' krajevima ciljne molekule. Tipini uzorci ukljuuju krv, briseve usta, stanice iz
horionskih upica itd. Ekstrakt DNK ne mora biti ist, niti cjelovit kao to je sluaj kod
parafinskih arhiviranih uzoraka. U sluaju uzorka krvi obino vrenje uzrokovat e
oslobaanje dovoljno DNK za uspjenu amplifikaciju. PCR mix je obino 5-50 l
volumena i odvija se u 0,2 ml ili 0,5ml tubicama.Mix se sastoji od 2l DNK uzorka, 1,5l
pufera(MgCl), 2l dezoksinukleotidnih trifosfata(dNTP-ova), 2l oligonukleotidnih prajmera,
18,3l EDTA(ph 7), 0,2l termostabilne DNK polimeraze(Taq DNK polimeraza), koja
sintetie DNK inkorporirajui dNTP-ove i produujui hibiridizirane prajmere sve dok se
uzorak ne amplifcira.

Incijalni korak kod PCR-a je denatruacija na 94 stepena koja traje 5 minuta, kako bi se
genomska DNK denaturirala u jednolananu DNK. Glavnina procesa se sastoji od uzastpone
inkubacije uzorka na tri razliite temperature, koje zajedno ine jedan PCR ciklus. Prvi korak
ciklusa je inkubacija na 94-96 stepeni 10 sekundi do 1 minute, kako bi se denaturisala novo

6
sintetisana ablonska DNK. Sljedea inkubacija se odvija na temperaturi koja je odreena
topivou prajmera, (idealna je oko 56 stepeni) koja dozvoljava aniling/hibridizaciju samo
odreene ciljne sekvence. Trea inkubacija je obino na 72 stepena i traje 20 sekundi do 2
minute, tokom koje Taq DNK polimeraza produava prajmere posredujui sintezi DNK
koristei ciljnu sekvencu kao ablon. Za jedarnu DNK normalno je da PCR reakcija ima 30-
35 ciklusa i traje 3 sata,s tim da je u naem sluaju broj ciklusa ukoliko radimo sa mtDNK,
potrebno poveati na 34-40. Takoer preporuljivo je dodati vie Taq polimeraze i koristiti
veu koliinu PCR produkta u eventualnim post PCR manipulacijama ukoliko se radi sa
mtDNK.

Figura 2. Uproena ema PCR-a koja ukljuuje 3 etape:denaturacija, aniling i ekstenzija

U prvom ciklusu PCR reakcije prajmeri mogu da se hibridiziraju jedino na originalnu ciljnu
DNK.U ovom sluaju, prajmer definie samo 5' kraj svakog novo sintetisanog lanca dok 3'
ostaje nedefinisan i varijabilan. Meutim, u sljedeim ciklusima,kako novositentisana DNK iz
prvog ciklusa postaje matrica za sljedei ciklus, ona biva definisana na oba kraja pomou oba
pramjera. Zbog sinteze kasnijih uzoraka koji se uveavaju eksponencionalno, dok se DNK
koja je sintetisana od originalne sekvence uvea linearno, predominanti PCR produkt nazvan
amplikon bit e odreen lokacijama prednjeg(forward) i zadnjeg(reverse) prajmera.

7
 Figura 3. Reprezentacija kasnih ciklusa kod PCR

Amplifikacija se odvija eksopnencijalno u ranim ciklusima, sve dok u kasnijim ciklusima ne

dosegne plafon zbog iznurenosti reakcijskih komponenti. Zbog ovog razloga poeljno je
ostaviti zavrenu reakciju u termobloku na sobnoj temperaturi nekoliko sati ili preko noi. To
se moe i uraditi tako to se programira holdtemperatura od oko 4-12 stepeni nakon
finalnog PCR ciklusa. Specifinost PCR lei i u dizajnu dva oligonukleotidna prajmera. Oni
ne samo da moraju biti komplementarni ciljnoj sekvenci, ve i ne smiju biti
samokomplementarni izmeu sebe da se ne bi uvezali u dimer i tako sprijeili DNK
amplifikaciju. Takoer moraju da budu isti u koliini GC sekvenci, i da imaju slinu
temperaturu anilinga.4

4
John M. Walker and Ralph Rapley(edt), Molecular Biomethods Handbook, 2nd edition, (2008), Life Sciences
University of Hertfordshire Hatfield, Hertfordshire, School of Life Sciences University of Hertfordshire Hatfield,
Hertfordshire, UK 29-33.

8
 Ranije su se prajmeri i identifikacija restrikcionih enzima koji e se koristiti za PCR-
RFLP odvijala na 2 odvojena naina. Prvi je bio da se prajmeri dizajniraju koritenjem
programa kao to je Primer 3, emu bi sljedilo in-silico analiza segmenata koji su odreeni, od
strane dizajniranog prajmera kako bi se identificirali odgovarajui restikcioni enzimi.
Odreivanje enzima se takoer moe provesti koristei program NEBcutter V2, koji se
takoer zasniva na diskriminaciji alela putem in-silico analize.

Figura 4.ematski prikaz uticaja gubitka restrikcijskog mjesta na duine fragmenata kod
mtDNK

Danas zahvaljujui bioinformatici postoje mnogi programi koji nam pomau u odabiru
prajmera ali i restrikcijskih enzima za PCR-RFLP metodu. Dizajniranje PCR-RFLP prajmera
koristei ove programe moe nam utediti mnogo vremena. Takoer ovi programi su jako
efikasni u identifikaciji odgovarajueg restrikcijskog enzima a mnogi doputaju dizajniranje
prajmera kako za obini PCR-RFLP tako i za neke druge tehnike koje su izveden iz ove
metode(npr. mismatch PCR-RFLP, primer introduced restriction analysis PIRA, forced
restriction fragment length polymorphisam F-PCR-RFLP).

9
 Tabela 2.URL-ovi programa za PCR-RFLP

Figura 5. In Silico korisniki interfejs

Zadnji korak ove metode je vizualizacija fragmenata putem elektroforeze. Ovo se postie
koritenjem ploaste gel elektroforeze sa poliakrilamidom ili agarozom kao molekularnim
matriksom. Kod PCR-RFLP-a jedarne DNK, duine kod 50% fragmenata obraenog uzorka
moraju biti identine sa duinama fragmenata jednog roditelja dok drugi dio fragmenata mora
biti identian sa duinama fragmenata drugog roditelja. 5 Poto se mtDNK nasljeuje samo od
5
Henrik Berg Rasmussen, Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of PCR-Amplified
Fragments(PCR-RFLP) and Gel Electrophoresis Valuable Tool for Genotypingand Genetic Fingerprinting
Institute of Biological Psychiatry, Mental Health Centre Sct. Hans, Copenhagen University Hospitals, Roskilde,

10
majke duine nastalih fragmenata kod osobe koja se ispituje moraju biti identine sa
duinama fragmenata njegove majke, ukoliko se dokazuje majinstvo.

Metoda sekvenciranja

DNK sekvenciranje je proces utvrivanja redosljeda baza unutar lanca DNK i

predstavlja jednu od osnovnih metoda na kojima poiva genetiko ininjerstvo. Poznavanje
DNK sekvence preduvjet je bilo kakvoj manipulaciji ciljanim segmentom nasljednog
materijala. Postoji vie tehnika sekvenciranja koje se meusobno razlikuju po svojim
osnovnim principima. To su:Maxam-Gilbertova metoda, Sangerova metoda i automatsko
sekvenciranje.

Maxam-Gilberotva metoda se bazira na upotrebi razliitih hemijskih reagensa koji

diferencijalno boje nitrogenske baze molekule DNK. Ovaj tip bojenja se karakterie i kao
baznospecifian jer se svaka baza razliito boji. Danas je ova metoda uglavnom prevaziena
ipak ovaj postupak i danas nalazi primjenu pri ilustraciji poliakrilamidne gel-elektroforeze
kao primjenjene metode DNK sekvenciranja. Da bi DNK lanac bio sekvenciran ovom
metodom on prvo mora biti obiljeen radioaktivnim 32P izotopom. Bazno specifino bojenje
se zasniva na sljedeoj proceduri. Tretman hemijskim reagensom potencira razliitost DNK
baza i tako omoguava alternirajue bojenje. Reagens stupa u baznospecifine reakcije, npr.
formiranje dimetilsulfatmetilata guanina, koji nastaju na N7 poziciji ove baze. Alternirajue
baze se dislociraju sa fosfo-eernog skeleta DNK molekule. Lanac se boji piperidinom na
eernoj komponenti kostura, gdje nedostaje odgovoarajua baza. Rezultat se oitava na
poliakrilamidnom gel-elektroforezom tako to se postave etiri kolone na gelu, za svaku
baznospecifino obojenje po jednu.

Mi emo za na sluaj detaljnije opisati sangerovu dideoxi metoda sekvenciranja ije

su automatizirane inaice trenutno najefikasniji metod sekvenciranja. Zasnovana je na
dobijanju serije fragmenata DNK koritenjem etiri specifina dideoksinukleotida, kojim
nedostaje OH grupa na poziciji 3-dezoksiriboze,(ddNTP) za terminalno markiranje
enzimatskih sintetiziranih kopija startne matrice.6 U naem sluaju sekvenciramo

Denmark. 319

6
Bajrovi. K i sar., (2005), Uvod u genetiko ininjerstvo i biotehnologiju, Urednici Bajrovi K., Jevri-
auevi A., Hadiselimovi R., Institut za genetiko ininjerstvo i biotehnologiju, Sarajevo. 127-130.

11
hipervarijabilne regione mtDNK koje emo kasnije uporeivati. Oni se nalaze u tkz. D-loop-u
ili kontrolnoj regiji koji sadri dva regiona HV1 i HV2 koji se mogu jako razlikovati izmeu
jedinki. Ovi se regioni amplificiraju PCR-om a potom sekvenciraju. HV1 region ima 342 bp a
HV2 region 268 bp. Rezultati se uporeuju putem CRS-a odnosno Cambridge reference
sequence for human mitohondrial DNA. Da bi se dokazalo majinstvo regioni osobe ije se
majinstvo potvruje moraju se podudarati sa regionima djeteta/osobe.

Figura 6.Mitohondrialni genom ovjeka

Da bi ova metoda uspjela ciljani se dakle segment amplificira uz prisustvo sva etiri
ddNTP-a. PCR se ovdje odvija standardno za mtDNK gdje se faza ekstenzije javlja kao
kljuna. Proces izduivanja amplificiranog segmenta prestaje inkorporacijom jednog od
ddNTP-a. Nedostatak OH grupe na spomenutoj lokaciji onemoguava daljnu aktivnost DNK
polimeraze. Samo markiranje ovih fragmenata se moe odvijati tokom ove faze ili koriteni
prajmeri mogu biti ranije oznaeni radioaktivnim ili fluorescentnim markerom. Upotreba
savremenih DNK sekvencera preferira fluorescentno markiranje.Reakcija se za kraj razdvaja
u etiri tuibce, gdje se u svaku dodaju male koliine razliitog ddNTP-a. Npr., u C-reakciju
dodaje se dATP, dCTP, dGTP, dTTP i mala koliina ddCTP. Krajnja analiza odvija se na gelu.

Automatko sekvenciranje je jednostavno, brzo i ima iroki spektar aplikabilnosti.

Manuelno sekvenciranje DNK fragmenata podrazumjevalo je etiri odvojene reakcije,
separirane u etiri odvojene linije na agaroznom ili poliakrilamidnom gelu. Polazni preduvjet
za uspjeno automatsko sekvenciranje je simultanost detekcije markiranih fragmenata i
procesa elektroforeze. Prednost imaju fluorescentni markeri. Bez obzira o kojoj generaciji

12
automatskog sekvenciranja se radilo, principi svake poivaju na Sangerovoj metodi. U prvoj
generaciji fluorescentni markeri bili su vezani za prajmere.Vezivanjem etiri fluorescente boje
za prajmer, koje se razlikuju u spektrima fluorescencije, mogue je analizirati produkte
elektroforeze sve etiri chain terminator reakcije u samo jednoj stazi. DNK fragmetni su se
detektovali na osnovu njihove fluorescencije tokom prolaska kroz polje djelovanja detektora.
Druga generacija fluorescente tehnike bazira se na upotrebi fluorescentnih markera vezanih za
chain terminator nukleotid. Svaka od ova etiri nukleotida fluorescira u razliitom spektru.
Marker je inkorporiran u DNK molekulu pomou Taq polimeraze i ima dvije funkcije u
jednom koraku: zaustavlja daljnu sintezu DNK lanca i vee fluor na kraju molekule. Osnova
prednost ove metoda je to se reakcija ne mora separirati u etiri tubice. I kod ove metode
krajnja detekcija se odvija tokom elektroforeze, prilikom prolaska markiranog fragmenta kroz
polje djelovanja detektora.

Za due fragmente moe se koristiti tkz. shotgun sequencing method-a. Osnovni

princip je sluajna fragmentacija ciljanog DNK fragmenta i inkorporoacija nastalih segmenata
u univerzalne vektore. U toj reakciji veu se poznate DNK sekvence koje se preklapaju i koje
bi trebale posluiti kao ljepilo prilikom kompletiranja analiziranih fragmenata. Tokom
kompletiranja sekvenci u kontigent identificiraju se gapovi (rupe na kojima sekvenca nije
dostupna) i jednolanani regioni (postoji sekvenca samo za jedan lanac). Prilikom formiranja
biblioteke DNK fragmenata, ovi gapovi mogu biti popunjeni direktnim sekvenciranjem
upotrebom prajmera sintetisanih na onovu poznate sekvence. Sve se sekvence itaju i
kompariraju i uoava se podudarnost sekvenci na onovu kojih se slae mozaik.

Bitno je jo naglasiti razliku izmeu sekvenciranja mtDNK i STR lokusa odnosno

kratkih ponovaka. Kod STR-a sekvenciranje datog segmenta nije cilj. Ovdje je cilj ustanoviti
broj STR-ova odnosno broj ovih ponavljajuih sekvenci tako da se cijeli lokus oboji. Alelna
varijanta datog lokusa fluorescira pobuena laserom, pa se na onovu standarda, matriksa i
odreenog markera analizira. Standard sadri sve poznate alelne varijante na datom lokusu i
omoguava detekciju i analizu konkretne varijante. U veini sluajeva radi se sa vie STR
lokusa, od kojih se neki poklapaju po veliini i po zauzetoj poziciji na gelu. Da bi se to
izbjeglo u novije vrijeme se koriste etiri boje kojima se markiraju dati lokusi. Istom bojom se
markiraju dovoljno udaljeni lokusi, kod kojih je iskljueno preklapanje, a razliitom bojom se
analiziraju lokusi iste veliine tako da je pored istog poloaja na gelu, mogua njihova

13
distinkcija, zahvaljujui raznobojnim fluorosciranju alelnih varijatni porijeklom iz razliitih
lokusa.7

Literatura

7
Bajrovi. K i sar., (2005), Uvod u genetiko ininjerstvo i biotehnologiju, Urednici Bajrovi K., Jevri-
auevi A., Hadiselimovi R., Institut za genetiko ininjerstvo i biotehnologiju, Sarajevo. 132.

14
Bajrovi. K i sar., (2005), Uvod u genetiko ininjerstvo i biotehnologiju, Urednici: Bajrovi
K., Jevri-auevi A., Hadiselimovi R., Institut za genetiko ininjerstvo i biotehnologiju,
Sarajevo.

Corinne A. Michels (2002), Genetic Techniques for Biological Research A case study
approach, Department of Biology, Queen's College of the City University of New York, New
York, USA, JOHN VVILEY & SONS, LTD.

Henrik Berg Rasmussen, Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of PCR-

Amplified Fragments(PCR-RFLP) and Gel Electrophoresis Valuable Tool for
Genotypingand Genetic Fingerprinting, Institute of Biological Psychiatry, Mental Health
Centre Sct. Hans,Copenhagen University Hospitals, Roskilde, Denmark. Avaliable from:
URL: http://www.intechopen.com/download/get/type/pdfs/id/35104

John M. Walker and Ralph Rapley(edt), Molecular Biomethods Handbook, 2nd edition,
(2008), Life Sciences University of Hertfordshire Hatfield, Hertfordshire, School of Life
Sciences University of Hertfordshire Hatfield, Hertfordshire, UK

Robert J. Kosinski, Donna R. Weinbrenner, and Melodie G. Cross Extraction, Sequencing,

and Analysis of Mitochondrial DNA,Department of Biological Sciences,132 Long Hall,
Clemson University, Clemson.Avaliable from: URL: htpp://www.ableweg.org/

15