Tema 3: Bacteriologia: tcniques de cultiu,

allament i recompte
Composici dels medis de cultiu
CHO
N
P
S
Sals minerals
Factors de creixement
Classificaci dels medis de cultiu
Segons lestat fsic: Mdis slids / semislids / lquids

Segons la composici:

Medis qumicament definits -> es coneix la composici exacta

Medis complexos o indefinits -> no es coneix la composici exacta

Segons ls:

Medis comuns
Medis enriquits
Medis selectius
Medis diferencials
Medis de transport i manteniment (Ringer )
Medis de cultiu slids. Bacteris aerobis
Agar nutritiu Agar Hektoen o entric
Agar TSA Agar Salmonella-Shigella (SS)
Agar sang: Columbia + 5% sang de Agar de Levine o EMB
corder -> hemlisi Agar TSI
Agar CNA: Columbia + CNA + 5% sang Agar Kligler
de corder Agar Lowenstein-Jensen
Agar xocolata: Agar xocolata + factors Agar BCYE (i Agar BCYE-GVPC)
de creixement i agar Thayer-Martin Agar Campylosel
Agar CLED Agar Gardnerella
Agar Mueller-Hinton Altres: agar Bordetella, agar Brucella,...
Agar Chapman o manitol salat (MSA)
Agar DNasa
Agar Bilis-Esculina
Agar MacConkey
Medis de cultiu slids per bacteris anaerobis
Agar Schaedler
Agar bilis-esculina
Agar Clostridium difficile
Medis de cultiu lquids
Brou tioglicolat (TG)
Brou infusi cervell-cor (BHI)
Brou peptona
Brou selenit (Salmonella)
Brou Todd Hewitt
Brou 7H9 de Middlebrook
(micobacteris)
Preparaci dels medis de cultiu
https://www.youtube.com/watch?v=miga09gVMyY (guants!)

A partir de medis deshidratats comercialitzats. -> info de composici, preparaci i

conservaci

1. Dissoluci del producte en pols

a. Control de [ingredients] i procediments establerts
b. Ajustar el pH del medi (neutrfils, acidfils, basfils)
2. Esterilitzaci del medi
a. Si el medi no s estril, no hi ha garantia que all que creixi s lo que hem sembrat!!
b. Correcta esterilitzaci (calor, T, t) en autoclau: mida envasos, no hermtics
c. Indicadors desterilitat: F, Q (cinta adhesiva) i B (espores de B. stearothermophilus)
3. Distribuci del medi en plaques o tubs
Preparaci de medis slids
Agent gelificant (agar) en 12-15 g/L

s lquid quan sescalfa i solidifica quan es refreda.

Medis slids en placa (plaques de Petri)

Medis slids en tub
https://www.youtube.com/watch?v=YGoPu0cn9ms (guants!)

https://www.youtube.com/watch?v=xl264TosO5s (guants!)
Preparaci de medis slids en placa
A partir de medis deshidratats.

1. Dissoluci del producte en pols.

a. Seguir instruccions etiqueta per ajustar [ ] i pH
b. Amb H2O destillada. Agitar i escalfar en matrs Erlenmeyer -> homogenetzar
2. Esterilitzaci
a. autoclavat; termolbils: filtraci esterilitzant o tindalitzaci
b. Autoclau: tapar amb cot gras (no hidrfil)
3. Complementaci
a. Alguns ingredients termosensibles (antibitics, sang, vit) sincorporen desprs desterilitzar, de
forma asptica
4. Distribuci en plaques
a. Deixar refredar (45-50C) el matrs en una zona estril i distribuir en plaques de Petri estrils
b. En plaques Petri de 90mm es dispensen 15-20mL de medi (gruix: 2-3mm)
c. Deixar refredar. Segellar-les amb cinta adhesiva perqu no sobrin.
Preparaci de medis slids en tub
La dosificaci es fa immediatament desprs de la dissoluci
Sesterilitza els tubs amb el medi

Si els tubs tenen tap de rosca hermtic -> no han destar totalment enroscats
durant lesterilitzaci en lautoclau

La solidificaci (refredament) del medi

Tubs en posici inclinada (bec de flauta) -> + superfcie de cultiu
Tubs en posici vertical -> estudi mobilitat bacteris
Emmagatzematge dels tubs amb medi: nevera 2-8C.
Preparaci de medis lquids
= medis slids en tub. Refredament vertical

Esterilitzaci al matrs o al tub.

Preparaci de medis semislids
Agent gelificant: 2-4 g/L

Preparaci en tubs
Esterilitzar abans o desprs de la dosificaci o distribuci (instruccions
fabricant)
s:
Estudi del creixement bacteri al llarg del tub. Poca difusi doxigen pel medi, condiciona el
creixement de bacteris aerobis, anaerobis
Estudi de mobilitat bacteriana i detectar la presncia de flagels
Control de qualitat dels medis de cultiu
Medis de cultiu comercials:

Certificat del control de qualitat (condicions conservaci, control esterilitat)

Cal comprovar
Caracterstiques fsiques
Esterilitat (medis exempts / no exempts)
Funcionament adequat amb soques de referncia (medis exempts / no exempts)

Medis de cultiu preparats al laboratori:

Cal controlar
Ingredients i additius
Procediments
Comprovacions: com en medi comercial no exempt
Sembra i incubaci dels medis de cultiu
Preparaci de la mostra
Sembra del medi de cultiu
Equips i instruments per a la sembra
Tcniques de sembra
Diferents tcniques: https://www.youtube.com/watch?v=-TnHCd4sY24
Sembra per esgotament de nansa en ziga-zaga:
https://www.youtube.com/watch?v=6NckVGCobwY
Sembra massiva en superfcie:
https://www.youtube.com/watch?v=7g7IjQagYFs
Sembra en medi lquid: https://www.youtube.com/watch?v=8BPTDHslZnA
Sembra en medi lquid: https://www.youtube.com/watch?v=Pq193eZI3fk
(indumentria de treball incorrecta)
Tcniques de sembra
Procediment de sembra
Estufes de cultiu
Parmetres dincubaci
Temperatura: 35-37C
Atmosfera (oxigen)
Bacteris aerobis -> necessiten O2 per crixer
B. anaerobis -> noms creixen sense O2 -> gerres danaerobiosi (atm. amb H2 i CO2)
B. microaerfils -> necessiten baixes [O2] -> gerres danaerobiosi condicions microaerfiles
Humitat: 70-80%. recipient amb aigua dins lestufa
Llum: creixen millor en foscor
Temps: 18-24h
alguns micobacteris de creixement lent: 4-6 setmanes
Finalitat dels cultius bacterians
Allament: separaci dun det. microorg. de la resta de microorg.

Permet identificar, fer resembres i estudiar la seva sensibilitat a antibitics

Per a allar, farem una sembra per esgotament de nansa:
Allar un bacteri concret duna mostra polimicrobiana
Allar els diversos bacteris presents en una mostra

Identificaci: de lespcie bacteriana (utilitzant claus dicotmiques)

Anlisi macroscpic del medi i de les colnies:

Morfologia de les colnies (i color)
Canvi de color del medi de cultiu (viratge dels indicadors, producci de substncies)
Precipitaci dalgun component
Producci de gas (medis slids en tub)
Resultats per addici de reactius qumics
Ex: reactiu de Kovac per producci dindol
Ex: HCl 1N per agar DNasa
Proves BQ
Recompte
Antigament -> recompte en cmara de recompte. Inconvenient: recompte total
(vives i mortes). Ens interessa comptar bacteris viables!

Recompte de viables: es basa en comptar el nm. de colnies que creixen en un

medi slid en placa.

N colnies no s n bacteris! -> Sexpressa com UFC/mL

Requisits:

Densitat de colnies adequada: les colnies no han destar sobreposades ni

amuntegades
La quantitat de mostra sembrada ha de ser coneguda
Mtodes de recompte
Mtode directe de recompte -> til per mostres de crrega bacteriana baixa

Sembra massiva en superfcie dun volum conegut

Recompte manual de colnies i clcul de UFC/mL

Mtode de les dilucions decimals seriades

-> aconseguir plaques amb densitat de colnies adequada

Preparar dillucions a partir duna mostra (M), 1/10, 1/100, , 1/10(6)

Sembra massiva + recompte manual
Clcul de UFC/mL
Alternativa: Sembra en estries
Mtode del filtre de membrana

Es fa passar un volum conegut de mostra a travs duna membrana de nylon

o nitrocellulosa (porus 0,22 um)
Es posa el filtre sobre un medi de cultiu slid a incubar
Es fa el recompte de colnies
Mtodes de recompte estimatiu (densitat bacteriana)
Estndards de terbolesa de McFarland -> terbolesa (n total = viables + no v.)

11 patrons basats en una suspensi de sulfat de bari

Cada patr t una terbolesa comparable a la duna suspensi bacteriana amb
una densitat bacteriana det. -> comparar terbolesa (fons de ratlles negres)

Espectofotometria -> terbolesa (n total)

Es mesura labsorbncia de la suspensi bacteriana a 600 o 625nm

Ms objectiu i ms exacte que estndards de McFarland
Automatitzaci del recompte
Anlisi dimatge

Requereix un cultiu previ -> imatge digitalitzada de la placa

Un software analitza la imatge i la tradueix a UFC/mL

Recompte cellular automatitzat -> cribatge rutinari dorines

2 mtodes:

Diferncia de conductivitat entre bacteris i el fluid que els cont (comptador

cellular)
Citometria de flux: utilitza un fluorocrom especfic per cids nucleics.
Recompte dorines
Serveix per detectar una infecci. Caract. de mostres dorina:

Rang de recompte amplssim: 0 UFC/mL a 10(7)

UFC/mL
No cal saber n exacte de UFC/mL -> s suficient amb
valors estimatius (mltiples de 10) per a decisions
clniques -> mtode estimatiu de viables + allament

Mtode de sembra:

Sembra massiva per esgotament de nansa (agar CLED)

Nanses calibrades de 5 uL

Alternativa: Laminocultius
Clcul de bancs de dilucions i Recompte de viables
Prctica 3:
https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice/tecnicas-de-aislamiento/banco-de-diluciones-1

Exemple: preparem 10mL, fent una diluci 1/10. Safegeix 1mL de mostra a 9mL
de diluent (1mL de mostra / 10 mL diluci)
Per a una diluci 1/100: (es pot fer a partir de la 1/10 (seriada) o a partir de la
Mostra))
Podem fer dilucions a partir de mostres slides:

I podem concentrar una mostra:

Recompte de viables (directe sobre la placa Petri) i clcul de UFC/mL: establim
la densitat microbiana de la mostra