PEPTIDELE ACTIVE Endotelinele reprezinta o familie de peptide noi cu o activitate biologic’ deosebiti. In 1988, M. Yanagisawa gi alti savanti au cipitat din cultura endoteliului vascular un peptid cu un efect biologic foarte pronuntat, numit endotelind. Timp de zece ani s-a efectuat un studiu amplu referitor la peptida respectiva, receptori ei, enzima -endotelin convertaza si inhibitorii ei, Endotelinele sunt cei mai efectivi factori vasoactivi. Sunt implicate in patogenia unor forme de maladii hipertonice, ischemii renale, hemoragii subarahnoidale. Este determinat rolul lor in infaretul miocardic, aritmiile cardiace. Derind cu endotelina-1 (ET-1),un peptid biciclic din 21 aminoacizi,s-au depistat si alte 2izoforme - ET-2 si ET-3, codificate probabil de gene diferite. Aceste peptide sunt marea speranti a savantilor pe viitor! Toate trei endoteline in mod diferit sunt expresate in tesuturile vasculare, Primele doud au o activitate majora de vasoconstrictor, ‘Sunt clonate si secvenate 2 tipuri de receptori (ET-A si ET-B), care s-au depistat atit in endoteliul vaselor, cit si inrinichi, plimini, suprarenale, tesutul nervos. Constrictia vaselor e mediati de ET-A receptori, structuri fixatoare de G-proteing; pe cind inductia receptorilor ET-B conduce atit la constrictia, cit si la dilatarea vaselor. Funetia acestor receptori e cuplati cu activarea fosfolipazei C si A,, cu majorarea nivelulni de Ca? intracelular, formarea intensiva a prostaciclinei si/sau tromboxanului A,. ET-1 siET-3 in tesutul nervos intensifica sinteza fosfoinozitfostfatului. 7 ET-I apare ca rezultatal proteolizei limitate a endotelinei majore -(B=ET) in trei tape: a) hidroliza proteolitic& a preproendotelinei-1 ta Arg(92) in endotelina-I-Lys- Arg (40) sub actiunea convertazei (E,); b) hidroliza capatului C-terminal B = ET-I-Lys-Arg(40) la B= carboxipeptidaza (E,); c) scindarea premergitorului B-ET-1 la legatura Trp(21) = Val (22) cu formarea endotelinei ET-1, etapa determinata de convertaza respectiva (B,). ‘Schematic: Pre-Pro-ET-1 EL» B=ET-1-Lys-Arg(40) "T-1(38) de o Ex. Endotelina-1 E, (enzima endotelin convertaza - ECE-1) este o metalproteinazai din grupa celot fixate in membrana, care participa in procesingul postsecretorial al hormanilor peptidici sineuropeptidelor. Are unele proprietiti asemingtoare cu familia Zn**-metaloproteazelot. In centrul activ este restul Tyr si regiunea fixatoare de Zn’*. E depistald enzima ECE (endothelin-converting enzyme) in majoritatea tesuturilor Activitatea ei e determinat’ atit prin metode imunochimice, cit si prin testare biologics Eaprezinta un dimer cu subunitatile de 120-130 kDa fixate prin pungidisulfidice. Spaisingul altemativ a demonstrat variante ale ECE c& grupaN terminali\e diferitd, cu ospecificitate selectivi la substratuti. ECE-1 ate o specifictate mare la B-ET-1 simult mai putinefectiva laBT-25i ET-3. Aceste date presupun prezenta enzimei in mai multe izoforme ale BCE- Iasi 1p) -40-ECE-2, 0 alti endotelin convertaza, in 59% e omoloaga cu ECE-1 - 0 expresie ‘majord e depistatd in fesuturile creierului. Ambele enzime au structuri de baz comune: sunt proteine integrale membranare de tip Il, ce contin o secvent cu Zn* caracteristic au 10 site-uriglicozil, cu olocalizare nu chiar identicd, sunt inhilbate de aceiasiinhibitori cudiferita sensibilitate. ECE-2 hidrolizeazi B-ET-1 mai efectiv decit B-ET-2 $i B-ET-3. Dar cea mai esentiald deosebire ¢ pH optim pentru forma 2, care este egal cu 5,5, si enzima e neactiva la valori neutre, optime pentru ECE- 1. Prezenta, de asemenea, a ECE-2 in {esuturile neendoteliale demonstreazii cl acest ferment functioneazit ca enzimé extra- si intracelulard, esponsabili de hidroliza intraveziculara a precursoruhui ET-1, sintetizatin aparatul Golgi. Cele prezentate presupun 2 tipuri de sintez& a endotelinelor: extra si intracelulara. Sunt depistate si enzime ce degradeazi fiziologic endotelinele «maturen- metaloendopeptidaza cu pH optim de 5,5; «endotelinaza (serin proteinaza). Endotelina si, corespunzitor, ECE regleazi tonusul vaselor si, in general, cardiohemodinamica. Peptidul participa la patogenia hipertensiei esentiale - inhibitorii ECE previn dezvoltarea hipertensiei pulmonare in experiment. Efectele sunt dependente de funetionaren sistemmilni renini-angiotenins. S-au depistat unele efecte neurologice ale ET-I si ET-3, modificdri in reactiile de comportare, efect central cardiorespirator. in prezent se presupune ca endotelinele, de rind cu alti reglatori ca histamina, bradikinina, angiotensina II, participa la relisingul diferentiat al adrenalinei si/sau noradrenalinei din suprarenale in stres (situatii extremale). Esential e rolul lor in reglarea starii funcfionale a endoteliului- stratului intim arterial si venos din diferitele vase ale organismului. Dereglatile metabolismului normal al endotelinelor, expresiaintensivla pprecursorilor si receptorilorrespectivi, activitatea major a ECE devin factori de dezvoltare a proceselor patologice din organism, motiv care impune investigarea unor metode de control si de reglare a activitati lor in organism - inhibitorii metaloproteazelor. Inhibitor clasic se considera fosfoamidonul, Mult mai activ este analogul tiorfamuui. in baza compusilor acidului fosfonies-au sintetizat inhibitor’ ai ECE, foarte puterici si selectivi. Sunt utiliza sianalogiai ET-1, care blochea7A activitatea ECE atitin vitro, citsiin vivo. Inultimii ani se confirma ci unele peptide cw o structurd foarte simplé, predominant din glicina si prolind (PG, GP, PGP, GPGG), posedé o activitate biologici deosebita referitor la congularea singelui, actiunea protectoare a mucoasei, nociceptie. La aceste peptide se aldtura si PGe (ciclic) depistat in ereier. O particularitate deosebiti a acestor fragmente, ce confin prolina terminal, este stabilitatea major’ in luidele organismului fai de altele (de mii de ori), Aceste peptide au ca sursi si alimentele, cici e stabilit cA tripeptidele ce contin prolina sunt absorbite de celulele endoteliale intestinale nescindate. Un precursor al lor poate fi si enterostatina (APGPR), precum gi colagenul si clastina. Compartimentalizarea stricta a proceselor permite realizarea unor functiidiametral opuse, de exemplu,acidul glutamic, licina, care indeplinesc atitrol plastic, citsi energetic siservese drept neurotransmifatori, Asemenea compartimentalizare e real si pentru Aisprecursorii peptidelor reglatoare (PR). Determinant poate fi fesutul, organul, precum si repartitia locali a proteazelor. S-a stabilit ci aceste peptide blocheaza agregatia trombocitelor, formarea trombinei gia fibrinei; sunt inhibitori ai fibrinazei (XIII,). Posibil c& aceste peptide simple ce contin prolina (fragmente ale colagenului i elastinei) sunt factori endogeni cu actiune de antitromboza si trombolitic’ Prolincomponentele peptidice, PGP si GPGG, amplificd rezistenta mucoasei gastrice la actiunea factorilor nocivi, devenind protector’ antiulcerosi. Este inhibata ‘endo gi exosecretia pancreasului, motoriea stomacului, utilizarea alimentelor (anorexia) de enterostatin’ (pentapeptida APGPR). Peptida GP. are efect stimulator in consolidarea memoriei, posibil se formeazi din colagen sau elastina. Peptidele scurte, ce contin prolin’, sunt activatori ai hemotaxisei, favorizeazit formarea superoxidului, neutalizea7i anal gezia provocati de morfini, Comparind structura peptidelor respective, se presupune dependenfa efectului de prezenga proline la capitul ‘N-sau C-terminal al peptidei Carnorina— dipeptida B-alanil-L-histidina, extras in anul 1900 din muschiul scheletal, In prezenta acestet dipeptide, muschiul izolat de broasca se contracti.ca sila acumularea cantitailor mari de lactat; pl a camozinei este de 6,9, iara anserinei - 7,1 ultima este derivatul ei metilat. Acesti compusi sunt ideal adaptati pentru rotul de tampon. in regiunea fiziologicd a pH — au cota pind la 40%. os EON fC — Cts NH Ho0E: § — Camozina Capacitatea tampon protonic marimea B- se masoara in “slake” si se determina dupi numarul de mkmol NaOH sau HCl, necesari pentru a modifica pH a 1 gtesut cao unitate — de la 6 Ia 7 sau 6,5 - 7,5. Se considera c& si peptidele inrudite iau parte la reglarea activitiii enzimatice, la diminuarea reactilor oxidante Datele experimentale confirma cl camozina prezintd un antioxidant multifimetional, ccapabil si inactiveze radicalii liber, si formeze compusi chelaticumetalele prooxidante (Cu) siposeda capacitatea de a forma conjugate cu produse aldehidice toxice de oxidare alipidelor In prezenta camozinei, Hmita Heiflise extinde—eclula din cultura imbatineste ‘multmai lent. Posibil, eezultatul unica efectului difert al eamozinei ca: izvoral histidine’, ‘imunostimulator sineurotransmiter et. Glicozilarea nefermentativi a proteineloreste un proces dependent de visti, activin diabet. Formarea legiturilor transversale intre polipeptidele modificate si proteinele normale este cauza complicafiilorin diabet. S-a confirmat cd camozina este un agent antiglical natural, ce se confine preponderentin muschii albi cu o glicolizi intensiva. Camnozina indus de aldehida malonicd inhiba formarea in proteine a legaturilor ‘transversale, precum si formarea gruparilor carbonilice in proteine, specifice la imbatrinirea proteinelor si celulelor. Camozina e capabila sireactioneze cu metil-glioxalul si indus -42-deel, preintimpina modificarile proteice. Camozina protejeaza celulele de actiunea toxic aaldehidelor si cetonelor. Proteinele glicate sunt imunogene, iau parte la generare in procesul de imbatrinire a autoantigenelor. E stabilit c& carnozina glicati nu e mutagend, spre deosebire de aminoacizi. Ea inhiba reacfia de glicarealizinei, moduleazi toxicitatea produsului pentru cultura celulelor ‘imbitrinirea proteinelor este insotita de acumularea polipeptidelor aderante, indeosebi ale celor ce contin grupa carbonil. Ultimele apar ca rezultat al oxidarii radicalilor aminoacidici de FAO, precum sia interactiunea produselor oxidarii lipidelor—aldchida ‘malonica si hidroxinonenalii ~ cu lizina si in al treilea rind, in procesul de glicare in care aldehidele toxice induc formarea gruparilor carbonil in proteine S-a constatat cd camozina nu doar se fixeaza de gruparea carbonil din proteine, dar simoduleazi activitatea lor, inhibind formarea legaturilor ransversale in proteine, ca rezultatal generirii complexului proteind-carbonil-camozin aduct. Deocamdata nu ¢ clar unde anume are loc formarea acestui complex: in interiorul celulei sau in afara ei? Care este soarta proteinelor carnozilate? Posibil ca reprezinta o forma a lipofuscinei — pigmentul imbatrinirii. Lipofuscina are naturi foarte heterogena si efectele ei sunt controversate. E enorm de multa in {esuturile bogate in camozind —nervos si muschi, creie: Posibil c& forma lipofuscin fara camozind e capabild si reactioneze cu alte macromolecule cefulare. O alt varianti ar fi proteoliza - scindarea de un sistem de proteozome. Camozina ‘mascheaza gruparile carbonil, care sunt rezistente si chiar pot inhiba functia proteozomelor. ‘S-a constatat ca in prezenta carnozinei se activeazi metabolizarea unor proteine greu metabolizante Grupele carbonil se formeazi sila oxidarea fosfolipidelor (etanolamina) membranare. La depurinizare si depirimidinizare a DNA, cu scindarea legaturilor glicozidice, se formeaziio moleculai de D-oxiriboza cu propriettti toxice aldehidice. Camozina fixeaz’, posibil, siaceste forme toxice, inhibind formarea legdturilor tansversale protein’ -DNA, cu participarea aldehidelor, si micgoreazi numarul de aderatii cromozomiale in cultura celular’. Canozina favorizeazi procesele de detoxifiere. O dati cu imbitrinirea, concentrafia camozinei se micsoreaz: nivelul coreleaz‘i cu durata viet. Indiviaii care au ‘ staturdinalté sunt asigurafi cu longevitate mai mare Biosinteza carnozinei: se sintetizeazi din f-alanind si histidind, reactie catalizati de carnozin sintaza, B-alanini — aminoacid neproteinogen se produce in ficat ca ‘metabolitfinal in degradarea uraciluluisiatioinei. Celulele capabile de sinte7& posed si 1m sistem benefic de transport al acestui aminoacid, Cu cit celulcle sunt mai diferentiate, absorbia Bala este mai cfectiva. in oligodendrocite viteza maxima de sinteza corespunde capacititii majore de expresie a proteinei — mielina — marker al diferenticrii oligodendrocitelorin creier. : ‘Camozina legata de celulele neurogliei, care pot absorbi rapid camozina marcatit print-un mecanism activ de transport al dipeptizilor. E prezenta camozina in neuronii senzitivi, impreund cu acidul glutamic, ce marcheazi rolul de neuromediator in acest -43proces. in secretie se considera ci sunt prezente mai multe mecanisme (depolarizare membranara, tumefierea astrocitelor cauzate de ionii K", inversarea mecanismelor de transport). Se confirma mecanismul vezicular, exocitoza determinati de Ca". Camozina este un inhibitor selectiv al NO-Mn Zui Co). Camozina mireste de 2-3 ori longevitatea celulelor cultivate in vitro. E stabilit efectul de intinerire a celulelor senile. Carnozina distruge celulele transformate sau cancerigene. in amestec cu piruvatul (acidul oxaloacetatul si o-cetoglutaratul), efectul se micsorea7i. Citratul, izocitratul, fumaratul, succinatul si malatul nu influenteaza asupra efectuluicitotoxic al camozinei. Efectul camozinei poate consta in: a) diminuarea gradului sau exprimarea efectelor care conduc la includerea mecanismelor ce blocheazi ciclul celular. De exemplu: poate favoriza micsoratea kungimii fragmentelor pierdute in DNA-telomericd sau diminueazi metilarea DNA; 'b) micyorarea efectelor fiziologice determinate de modificdrile in RNA, ce ar favoriza indepértarea momentului de oprire terminal’ a diviziunii celulelor. Un astfel de efects-ar manifesta in intinerirea fenotipului celular, care se observa la cultivarea celulelor in vitro ‘cucamozind. Camozina, posibil, inhiba glicotiza, de altfel si formarea de ATP in celulele cancerigene, Acestefect ereversibil laadaosul piruvatului. CLASIFICAREA PROTEINELOR SavantiiM. Levitt siC. Chothia (1970), examinjnd structura proteinelor; le-au divizat in 5 clase (fiecare clasa difera dupit prezenta si pozitia a-spiralei si B-structurii (ig, 1.14,2-h)): 1. Proteine ce contin 100% -elice, formind o structura globulard TL. Proteine ce contin B-structurd gi, de reguld, sunt alcatuite din dou straturi antiparalele sau situate in form’ de “butoiase” IIL Proteine ce includ atit ct, cit si componente segregate in structura tertiara IV. Proteine ce inglobeaz 7 segmente alternate in structura secundara, formind structura terfiarS cu centrul B siincercuite de o-spial V. Proteine neorganizate cu structura secundara evidentiat nesemnificativ. Plie- rea lantului este determinata in exclusivitate de interactiunea radicalilor (coit pro- teic) - puntilor disulfidice. Acestea sunt proteinele mici. Clasificarea sus-numiti a fost desdvirgiti de 1.S. Richardson (1981). Agadar, organizarea structural’ este determinat de modul aranjarii reciproce a structurilor secundare. Deaceea, un imperativ primordial pentru prognosticarea structurii proteinefor o au principiile de impachetare a elementelor constituente. Se stie c& un rol deosebit in acest context il joacd repartitia resturilor hidrofobe in G-elice si B- structuProteinele se mai clasifica (W. Bennet si R. Huber, 1984) si dupa dinamica dome- niilor structurale: 1. Proteine cu domeniirigide, imobile, dure, unite prin segmente mari, flexibile, ce le permit acestora fluctuati in diapazon larg reciproc. II Proteine cu domenii rigide, dure, unite prin portiuni mici, denumite“Balama’’,cuo circulatie mai redusa. IL Proteine in care domeniile au roluri diverse-folosese flexibilitatea pentru asigurarea nor funciii de legare); interactioneaza cu grupari determinate de antigen. Clasificarea proteinelor e o problemd dificil, deoarece structura multor proter- ne nueste studiata complet, O clasificare a proteinelor dupa functie e practic imposibil’, Exist proteine cu structuri apropiate, dar care indeplinesc functii diferite. Posibilititi limitate de clasficare prezinti si proprietatilefizico-chimice. Dupé atitudinea fafa de hidrolizé se disting proteine simple §i proteine conjugate (proteide), Proteinele simple la hidroliza elimina nummai aminoacizi, iar cele conjugate mai contin si un component neproteic si, deci, deasebim: fosfoproteide, cromoproteide, nucleoproteide, glico-,lipo-, metaloproteide. Holoproteinele (proteine simple). Protaminele au o mas moleculara mica si un ccaracter alcalin, determinat de prezenta arginine’ ilizinei -60-80%, fiindu-le caracteristic punctulizoelectric ce se afd in mediulalcalin sila fierbere se coaguleaza la adaosul bazei in solutie, Proteinele sunt solubile in apa, se dizolva gi in solutie de NH,,solufi diluate de acizi sibaze. Aceste proteine se wisesc in cantitéti mari in celulele germinale naturale ale pestilor: saimina (laptii somnului), scumbrina (scrumbia), clupeina (heringul), in ‘componenta lor tiptofanul lipseste. Aminoacizii ce contin sulf in majoritatea lornu includ, de alifel casi titozina, i fenilalanina, Histonele din componenta mucleului celulariau parte lareglarea metabolic. a activitati genomului, Aminoacizi bazici se contin pin’ Ia 30%, Masa lor molecular emai mare decit la protamine, contin putin sau deloc triptofan, Sunt solubile in aceiasi solventi si precipitate de solutia NHL, se coaguleaza la incdlzire Albuminele si globulinele prezint& masa principala a proteinelor sanguine, alactate- Jor, masei musculare, a proteinelor oului Raportul albumine-globuline in diferitetesuturi ‘imine constant sieste egal cu 1,5-2,3. Inppatologie acest coeficient se schimbii Albuminele sunt mai solubile in apf, pe cind globulinele sunt solubile numa in soluti diluate de siruri, iar in celelalte cazuri— insolubile, Solubilitatea diferitae folosita pentru fiactionarea si determinarea lor in practica clinica, Pentru ultimele scopur azi se foloseste electroforeza pe hirtie sau in ge, la cantitati neinsemnate de singe, Albuminele contin 575 aminoacizi, formind un lant polipeptidic, au un punct izoeleetric mic. Ele determin’ presiunea oncotici a singclui, iu parte la transportul substantclor, prezinta o fractic omogena. Globukinele formeazAoo fiactic heterogeni, fiecare comportind diferite functi. Glutelinele si prolaminele sunt proteine de natura vegetal, se depoziteaz’ in seminjele cerealelor, masa principal’ a glutemului. Profaminefe sunt solubile in solutie apoasi de alco! etilic (60-80%). Contin 20-25% acid glutamic si 10-15% prolin’. Reprezentani prolaminelor sunt: gliadina (griu),zeina (porumb), orzeina (orez), hordeina (or2). -45-Figura 1.14. Tipologia unor structuri proteice: (= spiralete sunt in forma de ellinde $i spirale: B-structura ereprecentata prin siget: 4) proteiné in a» structuri (miohemertina): 1) proteina tn B- seructurd (Cu, Zn-superoxiddismutaca); proiceri ale domeniulut NAD din LDH): iim); iy neuroaminidaza virusulul gripe -47-Heteroproteidele (proteine conjugate) contin, pe ling’ compusi proteici, diverse grupe neproteice numite grupe prostetice. Acestea sunt mai profund studiate, Ele sunt indispensabil legate de proteing si prezinté un anumit interes biologic. ‘Nucleoproteidele sunt compuse din proteine gi acizi nucleici. Denumirea lor € erivati de la numirea nucteului celular, darse afl sin alte compartimente ale celulei. De aceea nucleoproteidele constituie 0 clasi individuald de substante organice, cu 0 component, siructura si functie independent de localizarea lor in celula. Astizi putem afirma ci natura proteinelor studiate in celul e determinati de un reprezentant al nucleoproteinelot-DNA. Proprietifile organismelor vi, ale celulelorsiintregului organism sunt determinate insi de proprietijile proteinelor sintetizate. La hidroliza perfecti se observa descompunerea nucleoproteidelor in proteine si acizi nucleici. Componenta proteicé'o alcatuiesc histonele bogate in arginina gi lizind. Natura proteinelor nueste suficient studiat Cromoproteidele sunt compuse din compartimentul proteic gi cel neproteic colorat, de unde provine gi denumirea lor, iau parte activa gi obligatorie la procesele de acumulare aenergiei, incepind cu fixarea energiei solare in plantele verzi,utilizarea ei judicioas& de cre organismul animalelor sal omului fotosinteza, respiratiacelulara, transportul O, si CO, reactiile de oxido-reducere, senzatiile de lumina si culoare etc. Reprezentanti: clorofila, hemoproteidele, sistemul de citocromi, catalaza, peroxida- za. Labaza structurii grupei prostetice se afla inelul porfirinic care aditioneaz elemente chimice diferite (Fe, Mg), Fosfoproteidele sunt proteine compuse dintt-o parte proteici i acid fosforie. Acestor molecule le sunt proprii Iegaturi esterice ale acidului fosforic cu proteina ce seaditioneazi prin OH al aminoacizilor —serina, treonina Reprezentanti proteidclor —cazeinogenul (proteina laptelui), fosfovitina, viteina vitelinina din gitbenusul oului),ihtulina (icre de peste) — ocupy un loc deosebit in compusiice contin fosfor, mui dintre acestia se gasese in sistemul nervos central. Fosfatul labil e absolut necesar peniru funcjionarea celulei si exercitarea menirii sale biologice. in procesul de embriogenez&, de crestere postnatal si dezvoltare servesc drept material pretios energetic si plastic. Un gir intreg de enzime, ce regleazt procesele de metabolism cehutar, se caracterizeaza prin legatura strinsd cu fosforu Glicoproteidele, ca exponenti ai grupei prostetice servind glicoaminglicanii, se includ in tesuturi si in form’ liber’. Legaitura cu glucozamina, galactozamina com- pusilor proteici se realizeaza prin asparagina, serind, treonin’. Componenta glucidic& determina rolul biologic al glicoproteidelor indispensabili de existenta membranelor celulare, participind la reactile imunologice, schimbul de ioni, adeziunea intercelulara. Lipoproteidele, ca grapi prosteic’, sunt reprezentate de lipide neutre, acizi grasi liber, fosfolipide, colesterol, cu fincti variate. Fiind compusi aimembranelor celulare si ‘organitelor, pot exista sin forma liber’ in plasma singelui, ‘Metaloproteidele—metalul este legat complex de resturile de aminoacizi(transteri- nai, ceruloplasmin, feritina). Aici se includ si unele proteine enzimatice ca anhidraza carbonick (Zn), ascorbatoxidaza (Cu) ete. -48-PROPRIETATILE GENERALE ALE PROTEINELOR Proteinele sunt compusi macromoleculari cu proprietati hidrofile, adica sunt solubile. Aceasti insusire se datoreaza repartizrii pe suprafafa moleculelor a resturilor de aminoacizi cu sarcini electrice saua grupelor polare. Proteinele fibrilare sunt insolubile in apa, pe cind cele globulare atesta grade diferite de solubilitate. Solubilitatea proteinelor Solubilitatea in apa este puternic influenfati de diverse stiruri ale metalelor ugoa- re: NaCl, MgCl. Na,SO,, (NH,),SO,. In concentratii mici ele au un efect favorabil. De exemplu, globulinele sunt greu solubile in apa pura si se dizolva usor numai in solufii saline diluate. Efectul nu depinde de natura sarii, dar de concentratia ei si de ‘numérul desarcini ale fiectrui ion din solutie, Mai eficace sunt sarurile ce contin ioni bivalenti (Mg), fat de cele ce au ioni monovalent. Solubilitatea maritd e determinati de cresterea gradului de disociere a grupelorionizate in proteine. In concentratii foarte mari sarurile amintite reduc solubilitatea proteinelor pind la precipitarea lor din solutie - salifiere. Procesul e mai efectiv in punctul izoelectric al proteinelor. Mecanismul e complicat: ionii de sare atrag moleculele de apa polarizata, micsorind cantitatea de apa ce interactioneazA cu proteina, cauza fiind ‘concentratiile mari de sare in care numarulionilor este imens fatii de numarul grupelor cu. sarcind a proteinei, Daravind in vedere ca solubilitatea proteinelorin apa este dependent de formatea membrane’ apoase in jurul grupelor ionice hidrofile, transferul molecular de apa la ali ioni micgoreaza solubilitatea proteinei, Procesul decurge mai rezultativ atunci cind toate operatiile se efectueaza la temperaturi jase, in condifille in care proteinele sunt mai stable, Diferite proteine se salifieaza la diferite concentratii de saruri— fenomen ce este utilizat pentru fractionarea lor. Globulinele precipita cind solutiile care le cuprind sunt aproximatiy semisaturate in (NH,),SO,, pecind albuminele precipita la concentrafii mai mari—de 75% saturatie. - Procesui de salifiere a proteinelor in multe cazuri nu e legat de pierderea capacitatii proteinei de a se resolubiliza dupa inlaturarea agentului. Eliminarea prin dializa a (NH,),SO, sau'Na -sulfat complet conduce la resohubilizarea in apiia proteinei salifiate cu formarea solutiilor adecvate. Capacitatea de resolubilizare rapida se menine si in azul nkiturariiimediate a proteinei de la salifiat (alco! proteina isi pstreaz propricttile native, Solutiile in apa a proteinelor au un caracter coloidal, Diametrul unor astfel de particule ¢ de la I la 100 mme. Remarcim solutii reale: a) ionice—particulele sunt mai mici decit 1 mme, disociaza in ioni, conduc curentul electric; b) moleculare —se descompun pin’ la molecule, nu disociaza sinu conduc clectrcitatea (ghicoza, alcoolul) —dau spatiu optic mul Daca particulele sunt mai mari de 100 mme si substanfa rimine solid in faza lichidl, rezultd suspensia, iar cea ichida in lichid- emulsie. Petri solutiile coloidale (dar proteinele formeaza solutii coloidale) e caracteristc: a) fenomenul lui Tindal pozitiv: -49-b) nu difundeaza prin membrane semipermeabile, care ugor transfera apa sau sub- stanjele micromoleculare. Procesul e numit dializd gi sti la baza functiondrii aparatului rinichiutui artificial. Majoritatea membranelorbiologice nonmale nu sunt permeabile pentrs proteine; ©) substantele ce formeaz’ solutii coloidale nu se cristalizeaza la marirea concentra- tiei, dar genereaza precipitatamorf. Proteinele pot forma cristale mumai in anumite conditi, din solutia-mama; d) solutiile coloidale au o viscozitate mariti ce depinde de masa si forma mole- culelor. Proteinele de aceeasi mas molecular’, dar cu molecule asimetrice, auo viscozitate mult mai mare. Substantele coloidale interactioneaza cu apa, in proteine grupele ionogenice leagi apa: COOH - 4 molecule de HO, NH, 3 molecule, OH si NH - cite 2 molecule; €) viteza de difuziune e foarte mics. Difuzia este procesul sumar de transfer al moleculelor dizolvate sub influenta gradientului de concentratie. Coeficientul de difuzie depinde de marimea gi forma moleculelor, de rezistenta determinata de vis- cozitatea solventului, Procesul de difuzie constituie baza functionarii celulei, transferului de substante. Viteza difuzici si distanta la care pot fi transportati diferiti ‘metaboliti in celula sunt parametrii principali ce limiteaz metabolismul in celulele vii giorganitele lar, £) solutiile coloidale in concentratii mari au o presiuine osmotic mic. Ea depinde de ‘numérul particulelor dizolvate in unitate de volum, darn de natuta lor, 2) au tendinta dea forma diferite complexe moleculare; hh) sunt capabile de absorbte si singure se supun absorbtiei; i) se tumefiazi gi se coaguleazi. Solutiile coloidale capita forma de so! — solutie lichida cu o anumita Muiditate gi compozitie de gel, pierzindu-si luiditatea din cauza formacii structuri de retea interna cu fixarea apei. Atare structuri apar: 1) la tumefierea xerogelului (agar-agar, clei, gelatin’); 2)n urma polimerizari fibrinogenului; 3) in urma condensrit amidonului, gelatine Lainvechirea gelului are loe sinereza, proces de expulzare a apei datorita contractiei structurilor formate din particulele coloidale sieliminarea solventuluiimobilizat, Apa inclusi ‘n rejeaua structurali e numita imobilizata, pe cind apa structurali e legatd de grupele hidrofile interne ale macromoleculei proteice. Sinereza are loc la coagularea singelui, in procesul de retractiea cheagului Proprietiile electrochimice Proteinele sunt amfoliti macromolecular inglobind un numdirredus de grupari acide sibazice, Contributia cea mai importanti o au resturile de ghitamil, aspartil,lizil,arginil gi histiil, Resturile aminoacide de la capetele Csi N terminale nu au o influenfa semnificativa, ‘maiales cind lantul polipeptidic este mai lung. Grupele ionizate sunt dispuse in interiorul suprafetei moleculare. Proprietatile acido-bazice sunt determinate de numarul mare de grupe ionizate ale resturilor de aminoacizi. De predominarea lor depind proprietatile electrice. in albumina exist 109 resturi de COOH si 120 de NH,; hemoglobina contine 48 COOH si 48 ‘NH, Sarcina electricd e determinata de structura proteinei. Moleculele proteice, fiind electroliti amfolii, interacfioneazii cu acizii si cu bazele, -50-participa la mentinerea pH. in intervalul 6-7 al pH capacitatea-tampon a proteinelor ¢ foarte mic’, Numai aminoacidul histidina poseds proprietati tampon la valori normale ale pH. Hemoglobina (Hb) eritrocitelor, transferind O,,, se caracterizeaza prin continut evident de histidind, de aceea si are Hb - aceste proprictai - tampon la pi =7. Particulcle proteice in solufie pot si-si schimbe sarcina electric& in dependent’ de pH. in solutie acida are loc inhibarea disociatiei COOH si, avind sarcina pozitiva, proteina migreazi spre catod, in solufie bazicd invers— spre anod R COOH yy) R~ COOH COOK R~ COONa ssaon B Ni > NEC NH) > NH, = +O pHH- solute, in care proteina apare cu o sarcing electric nul, mumarul gruparilor (+) este egal cu acela al gruparilor (-), este denumit pH izoelectric sau punct izoelectrie (pl). Valoarea pl depinde de compozitia proteinci in aminoacizi. O protein’ ce are surplus de lizin’ si arginini denoti un pl >7, iar aceca care are 0 proportie mare de aminoacizi dicarboxilici-pl<7. R~COO” ay R- COOH R~COO” son” R~COO a > | le => | + HO NH NH. NH; NE intabelele 1.4. si 1.5. sunt date valorile pl ale unor aminoacizi si ale unor proteide. LapH izoelectric solubilitatea, mobilitatea proteinei in cimpul electric este minima; pentru fiecare proteina ¢ caracteristic pl propriu. Valoarea lui e determinata de numarul de grupe ionizate si de valoarea constantelor de ionizare (ribonucleaza—7,8; citocromul — 10.6; pepsina —1,0). in pI molecula proteica e cu sarcina nuld si intre moleculele invecinate nu apar forte electrostatice de respingere, ceea ce inseamnnd cH in atare condi solutiile suntnestabile. elu 1. Valorite punctl tric pentru unit aminoacici prowinogeni Aminoacid pl | Aminoacid | pl | Acid L-aspartic 277 || L-Valina Acid L-glutamie | 3.29 | L-Leucina | L-Cisteina | 507 L-Wzoleucina f= anes rc | : L-Cistina 5.66 || 1L-Glicocol | LTirozina | 5,66 L-Alanina 5,08 | L-Serina L-Prolina L-Fenilalanina 548 L-Histidina 5,89 | L-Lizina | 974 L-Triptofan Ste‘Tabelal Proteide Proteide Fibrinogen Insulina Citocrom C Miozina Lizozim Bvident cd prezenta sarcinilor antipode pe segmentele distanfate ale particulelorere- cara condiii pentru o agregare rapida cu formarea agregatelor mari. Acest lucru favori- ‘zoazi preespitaren lor gi a asemenea valori ale pH au o solubilitate mich, Astfel de particularitate este caracteristic’ mai ales proteinelor globulare La valori mai mici sau mai mari de pl toate moleculele au aceeasi sarcina si, ca reaultat, se esping una pealta, agregarea fiind imposibild. Asadar, sarcina electrica e un factor stabilizant al solufiitor coloidale. In solutit supraacide sau suprabazice proteina nu va precipita chiar la fierbere, adic nici chiar atunci cind igi va pierde proprietiilehidrofile. Se tie ca un factor stabilizatoral solupilor coloidale e membrana apoasé. Solubilitatea proteinelor e dependent de hidratarea moleculara a lor, adici.a srupelor ionizate, Apa, jonctionindu-se de pe suprafata moleculelor si cuplindu-se sub o forma de dipoli, formeaz4 membrana apoasi care impiedic’ adita, fuzionarea particulelor coloidale $1 in punctul pl. Apa specific orientaté in jurul grupelor hidrofile e numita apd legatd si se caracterizeaza prin a) dispunere mai compacta, ce o apropie de un corp solid; ») proprietiti reduse de solvent; ‘)nu ingheafi la temperaturijoase; 4 constanta dielectric este egal cu 2,8, pe cind la apa obisnuitd este de 8 (constan- tadielectricd este forja de atractie a ionilor incdrcati opus). Prin urmare, factorit stabilizatori ai sistemului coloidal sunt sarcina electricd si membrana apoasd. Precipitarea si denaturarea proteinelor Pentru aplicarea acestor proprietifji ale moleculei proteice e necesar de a o lipsi anume de stabilizatori, Metodele sunt diferite. in medicind ele sunt folosite pentru ccaracterstica cantitativ si calitativa a proteinelor, din componenti biologici:urin singe, exudat etc Inliturarea sarcinii electrice se efectueazi prin aducerea proteinei la starea pl. Daci droption de precipitatie se foloseste cationul, precipitarea emai favorabiléin solutie slab +52alcalina; daca e folosit anionul, atunci solutia trebuie si fie putin acid’ —pentrua aduce particulele coloidale in starea clectroneutr. “Membrana apoasi poate f initurati cuajutorul dehidratantilor (alcool, acetoni). Ulin leagl apa, Dehidratanfi au o constanta dielectricd mica, micsorind- si pe ceaa solutiei. In consecinfi, ei maresc atragerea intre doud sarcini antipod, creind astfel conditii pentru formarea perechilor de ioni ce favorizeaz’ agregarea proteinelor. Corpurile proteice constituie o conformatie nativi si posed anumite calitiifizico- chimice si biologice in conditii normale ale T, pH etc. Conformatiile sunt extrem de fragile si ugor perturbabile sub actiunea multoragenti, care afecteaza interactrumle covalente din continutul moleculei. Modificarile conformatiei native unice se numeste denaturare, iar agentii care 0 provoaci — agenti denaturangi. Denaturarea ¢ 0 particularitate aproteinelor. La denaturare sunt lezate legiturile necovalente; agentii denaturanti nu afectea- A legaturile covalente, nu sunt lezate nici jonctiunile peptidice, nu se elimina ami- noacizi, Structura primard a proteinei rimine neafectati. ‘Trisaturile caracteristice ale proteinei denaturate: 1) pierderea sau micsorarea activititi biologice; 2) miesorarea solhiltii 3) schimbarea formei si marimii moleculelor; 4) modificarea caracterului dispersiunii razelor Roentghen; 5) cresterea reactibilititii unor grupe (SH); 6) aparitia unor grupe functionale anterior nedeterminate; 7) pierderea capacititii de ase cristaliza; 8) scdderea capacititi de rezistenfa la hidroliza, 9) capacitatea sporita de a da reactii de culoare; 10) miesorarea mobilitiiiclectrice Denaturarea este provocati de diferiti agenti: temperatura inalta, sdruri ale metalelor grele care in concentratii mici produc denaturarea, coagularea proteinei. Proteina coa- gulata din solutie se leag’ si se precipiti cu factorul nociy. Fenomenul euilizat in practica medicalé. La intoxicafie cu sublimat bolnavului i se administreaza lapte, ovalbumina in cantititi mari, Proteina formeazi, in ansamblu cu substanfele toxice, un precipitat ce micsoreazi absorbfia lui, in uncle conditii proteina denaturati poate rimine in solutic, ddacii aceasta este acid sau alcalina, chiar sila temperatura de 100°C. Precipitatul va apirea la neutralizarea solutici. Laoactiune de scurt durata sila eliminarea rapida a agentului denaturant e posibila renaturarea proteinei cu restabilirea actvitati ei biologice. Denaturarea eireversibila atunci cind se rup legiturile chimice, in special cele disulfidice inter- siintracatenare. Inprocesul de sterilizare are loc denaturarea termic’ i, in consecinti, insuficienta de timp sau de duce la generarea siréspindirea microbului etc Multe proteine nu se denatureazi la sublimare (liofilizare). Totusi, unele enzime isi diminueaza activitatea. E necesar si stim ca exist substante ce pot impiedica denaturarea, sianume: soluia de glucide simpla saturati, alcooli multiatomi (glicerina), uniianioni ‘organici (dodecilsulfat, uni acizi grasi) et. Pentru a evita denaturarea proteinele se izo- -53-leaza, Ele se pistreaza la rece, in solutii concentrate de struri sila un pH anumit Metodele de identificare a proteinelor, Problema elucidarit complete a structurit macromoleculare a proteinelor este una dintre cele mai actuale si de 0 incontestabila important teoretic’ si practic. Pentru determinarea masei moleculare proteice pot fi utilizate urmatoarele metode: marimea presiunii osmotice, constanta ultracentrifugatii (proteinele sedimenteaz’ in raport cu mérimea gi masa lor); metoda if zziunii luminii (intensitatea dif uziuni e dependent de numarul particulelor si de masa Jor moleculara); marimea diffactiei razelor Roentghen, microscopia electroni unor elemente (in Hb concentratia Fe este egald cu 0.34%), care se contin mici (in albumina seric& concentrafia triptofanului e de 0,58%). ‘Masa molecular. _ __Masa atomului'x 100 minima a proteinci—_Cantitatea elementului in % Masa mokcular 204 x 100 aabuminei (Tip) ~ “9 — ~ 34000Da Masa mokeulari 96100 _ gy7q pa ahemogbbinei (Fe) ~ 0,34 Stabilirea structurii unei proteine incepe cu izolarea si purificarea ei, determinarea ‘masei moleculare, dentificarea calitativisicanttaivaia aminoacizilor component, moduli lor de legare, seoventa aminoacizilor, in fine, cu orientarea tridimensionala a ‘macromoleculelor. 1. Proteinele se separd de celelalte componente prin diaiz4, utilizindu-se membrane semipermeabile, Pentru accelerarea procesului se aplicd electroliza —-electrodializa. 2. Solutiile proteice se purific’, diferentiindu-se dupa marime si forma prin filtrarca cu geluri speciale care functioneaza ca site moleculare—moleculele de marimi mici se repartizeaza intre faze, iar cele mai mari nu patrund in fazaintema, Moleculele asimetrice pot si nu patrundi in faza interna. (Granulele porozitate de gel sunt suspendate intr-o solutie, formind 2 faze-una interna — in granule, si alta externa —in afara lor). In cazuri aparte la purificarea unor enzime se pot utiliza si alte metode. Se observa afinitatea lorcu diversi ioni, grupe functionale— cromatografia de afinitate (fig. 1.15 a,b.) 4) Cromatografia prin schimbatori de ioni este bazata pe distingerea semnului si sarcinii electrice la pH-ul dat. Coloana matrice prezinta un polimer sintetic ce contine grupari fixate, La legarea gruparilor anionice matricea este schimbatoare de cationi, iar la fixarea gruparilor cationice —schimbatoare de anioni. Afinitatea proteinei pentru gruparile fixate in coloan’ este influentata de pH (starea ionizanta a moleculei) side concentratia ionilor salini din mediul respectiv. Separarea poate fi optimizatl prin schimbarea succesiva a pH-lui si /sau a concentratiei saline a fazei mobile. b) Gel- filtrarea separ proteinele in dependent de dimensiuni. Matricea coloanei prezinti un polimer fixat ce contine pori cu anumite mirimi, Proteinele mari migreaz mai -54-a coloand la rata ‘leterminatd de sarcina Tor le pal dat Proteinele sarcing 9 > | a Amestecut proteic ‘ste adaugat ny ‘coloana ce conine ‘gerd fat a Fe polimer, specif. pom protena ce ‘presind interes —> Amesicul protele ete adauget {in coloane ee confine potimer eu legdur ransversale Protcina ce preci interes este elaatd on gjutral sole, ‘ee contne tigand ther Moleeuleleproteice se separ in dependents de Protech nekerte imensinnes molecule mai mar tee mai liber ‘unt spite din ‘4 apar tn fractile rimpurt ‘coloand Figura 1.415, Metode cromatografice utlizate pentru purificareaproteinelor: 4 cromaiografia prin schimbdior de fon: b)geLflrarea; e) cromatografia de afiniiate “iSrapid decit cele mici (nu pitrund in porii granulelor). Proteinele mai mici intra in pori, suntrefinute, avind o cale mai lung de traversat. ©) Cromatografia de afinitate separa proteinele in dependent de specificitatea lor de legare. Proteinele retinute in matrice sunt fixate specific de liganzi prin legituri transversale (termenul «ligand» se refera la o grupa sau o moleculd care se leagi de macromolecule de tip proteic). Dupa eluarea proteinelor nefixate in coloand, proteina legatide interes particular este eluat’ prin intermediul unei soluti ce confine ligand liber. {In stiinfa contemporand este pe larg utilizata metodé elecroforeze (fig 1.16a).Diferite probe sunt introduse in rezervoarele ce contin gel de pohiacrilammda. Proteinele trec in gel, unde este aplicat un cimp electric. Dupi citeva ore de la efectuarea elecroforezei, proteinele pot fi vizualizate prin tratarea gelului cu diferiti colorant (albastru de metilen), care se fixeazi de proteine, dar nu la gel. Fiecare banda din gel reprezinti o proteina individual, Proteinele mai mici migrea7 mai rapid si sunt depistate mai departe debaza gelului. in fugura este ilustrata purificarea enzimei RNA polimeraza din E.coli. Prima band’ corespunde proteinelor prezente in extractul celular nativ. Necesitijile stinfice impun utilizarea elecroforezei cu cromatografia vertical sau focalizarea izoelectrici — electroforezét bidimensionala. in focalizarca izoclectrica (fig. 1,166), tehnica modem’ permite separarea proteinelor in dependenti de punctul lor izoelectric (tab.1.5). ae ey LCCC EMLS Figura 1.16, Metode uiilizate pentru purifcarea proteinelor: a electroforeca b) focalizarea ipelecried ‘Un gradient constant al pE-lui este stabilitin gel prin adausul am foliilor potrivigi (1). Amestecul proteic este plasatintr-un rezervor in gelul la care se aplicd un cimp electric (2), Proteinele patrund:n gel si migreaza pind ce fiecare atinge pH-ul echivalent pl propriu (3). Amintim cd atunei cind pH este egal cu pl, sarcina neta a proteinci este egal cu zero. In figura sunt arate proteinele dupa coloratie, care sunt distribuite de-a lungul ‘gradientulti pH-tui in dependent’ de valoarea pl. in electroforeza bidimensionala (fig. 1.16c) proteinele initial sunt separate prin focalizarea izoelectric intr-un gel cilindric. Apoi gelul este amplasat orizontal pe un alt gel in forma de placa, unde proteinele sunt separate prin elecroforezi in gel de -56-Focalizarea inoelectrica Figura 1.16, 6) elecroforesa bidimensionala poliacrilamida, Separarea orizontala reflecti diferentele de pl, iar cea vertical —masa molecular. Utilizind accastd tehnic’, pot fi separate mai mult de o 1000 de diverse proteine din £. coli Mobilitatea electroforeticd a proteinei in gel de poliacritamida poate fi uilizatd gi fn determinarea masei moleculare (fig 1.17). Proteinele standarde cu masa molecular cunoscuta sunt supuse electroforezei. Aceste proteine - marker (1.17) pot fiutilizate pentru a estima masa molecular proteinelor necunoscute. ‘In(1.17b) este redata dependenta logaritmului masei moleculare a proteinelor marker versus migratiei relative lao electroforezi liniard. Graficul respectiv permite determinarea masei moleculare a proteinei necunoscute. La moment sunt cunoscute metode mult mai sofisticate de purificare si apreciere structural a proteinelor. Miozina Pralactosidaca Gucogen fosforlaa B Seratbumina Ovalbumina Inkibtoratwipsinel Lizociaul 3 siandard Figura 1.17, Estimarea masei moleculare -57-ENZIMELE storia biochimici este, in prinul rind, istoria studirii enzimelor—celormai distinctive si specifice proteine cu proprietiti catalitice. Enzimologia e demult considerati o stint aparte gi s-a dezvoltat efectiv in ultima period de timp, dar inceputurile ei se atest din primele decenii ale secolului al XIX- Tea, Daca in 1920 erau estimate 10-15 enzime prin observarea efectului actiunii lor, astiizi sunt caracterizate partial peste 2000 enzime, dintre care circa 500 au fost obtinute sub forma unor preparate perfect purificate (unele cristaline) sistudiate din punct de vedere fizico-chimic si biologic. Manifestitile actiuni enzimelor (fermentatia, digestia) crau cunoseute de foarte mult timp, dar explicatia mecanismului acestor procese complexe, rolul i locul enzimelor in transformarile substanfelor celulare ramineau neelucidate. Un sir de mecanisme sunt si pind astizinedefinite Definitia enzimei s-a conturat atunci cind s-a observat ci in sistemele biologice au loc procese catalitice survenite din extractele de orz germinal ce realizeazi hidroliza, amidonului. Cu ajutorul precipitarii repetate cu alcool etilic 6- obtinut (1833) 0 pulbere alba — extrem de termolabili diastaza (din greceste didotabis - separare) ‘Inperioada 1834-1837 savantul suedez. J.Berzelius formuleazi conceptul de catalizi, conform caruia un catalizator mareste viteza reactiilor chimice si rezulti la sfirgitul lor nemodificat —cantitativ si calitativ. El sugereaza ci diferitele fenomene biologice (fermentatia, digestia) pot fi explicate prin prezenfa unor catalizatori biologici specifici materiei vii. in 1860, L.Pasteur stabileste cd fermentarea zaharului de drojdii in spirte catalizata de “fermenti organizafi indispensabil de organismele implicate in procesele fermentative”. Aceasti concluzie era in contradictie cu postulatul lui J.Liebig, care considera c& fementul e solubil, find produs de celula vie si nu constituie celula propriu-zis. In anul 1877, W.Kuhne propune termenul enzim (de la grecescul enzyme—"in drojdii”) pentru atare grupa de substante. O fierbere aparentS cauzati de “ferment” (in latina fervere —a fierbe), cu degajarea CO, in procesul fermentativ, caracterizeazi aceste fenomene biologice. Celebra disputd stintfica Pasteur—Liebig a fost finalizata cu brio in 1897, de catre H. siE Buchner, care au demonstrat sucul celular al une culturi de drojdii conserveazit intreaga activitate fermentativa, proprie acestui microorganism. inultimii ani ai sec. XIX, E-Fischer, efectuind studi asupra unor enzime hidrolitice,a specificitatii enzimclor, claboreaza tcoria intcractiunii enzima-substrat. Accasta tcorie a ‘stimulat cercetanie in acest domeniu. ‘Epoca modemi incepe o dati cu izolarea, purificarea si cristalizarea primelor enzime. in 1926, J. Sumnera cristalizat ureaza gia determinat c& enzimele totalmente sunt de natura proteica. Bl inainteaza conceptul cA toate enzimele sunt proteine, dar savantul german Richard Willstitter, o adevarata somitate in materie, confirma c& enzimele Sunt substanfe cu greutate moleculara mica, iar proteina depistata co simpla murdare. -58-Maiirziu, J. Northrop, impreuni cu colaboratorii sai, ctistalizeazi pepsina gi tripsina, confirmind astfel i si ele sunt proteine. Asadar, natura proteici e stabilita incontestabil. S-au inceput studii intensive in acest domeniu, ce au datrezultate remarcabile. Cu toate acestea, o serie de intrebairi, cum ar fi: de ce proteinele joacd rol de catalizatori; care este cauza ci molecula enzimei e mult mai mare decit a substratului; de ce aminoacizii nu posed proprietitisimilare, dar unite in Lant polipeptidic caps proprietii catalitice; ince modare loc reglarea activititii enzimelor —toate asteapta rispunsuri explicite, Ce sunt enzimele? Enzimele sunt unitati functionale ale metabolismului celular. Actioneaza strict intro anumiti consecutivitate. Catalizeazi sute de reactii in lant, finalizind cu eliberarea moleculelor din substanje nutritive. Energia substantelor reagente trece dintr-o forma in, alta cu eficacitate mare si se acumulezit in ATP ce este uilizat in procesele vitale Din micile biomolecule se asambleaz macromoleculele celulei O grupa deosebiti sunt enzimele reglatoare, care sesizenzi diferite semmale perfect, metabolice si, respectiv, isi modificd activitatea catalitic®. Datoriti acestor enzime in. celuld totul e coordonat: ¢ garantat un echilibru armonios dintre procesele metabolic necesare pentru mentinerea integrtafi i, in final, a vietiicelulelor, viabilitfiisistemului i al intreguhai organism, Insuficienga sau lipsa completa unuia saua mai multor fermenti duce la aparitia diferitelorafectiuni ereditare;diferite stiri patologice apar lao activitate excesivaia uneia sauia mai muftor enzime. $i o dati cu elaborarea unui preparat medicamentos. carear reglaactivitatea acestorenzime, vor trata eficient boala. Enzimele joacd un rol important la stabilirea diagnosticului, determinind activitatea lor lichidul biologic. in industria chimica gi alimentara evaluarea enzimelor este utilizata pelarg. Enzimele au un rol aparte gi in agriculturs. Struetura enzimelor Enzimele sunt proteine si poseda toate proprietile fizico-chimice specifice acestor ‘macromolecule (solubilitate, proprietati osmotice, sarcina electrica neta, denaturare termica, teactiichimice etc.) Activitatea fore dependent’ de pastrarea structuri native proteinei. Confirmirile experimentale ale acestui postulat sunt: | Distrugerea lanfului polipeptidic prin fierbere in solujii acide sau prelucrarea lui cu \tipsind duce la pierderea activtiti catalitice, Pentru mentinereaultimei enecesari pastrarea structuri primare, 2. Modilicdiile in impachetarea lantului polipeptidie (ncilzind proteina sau actionind cu pH de valori extreme, cu agenti denaturanti) cauzeazi pierderea activitSti catalitice, ceea ce indicd necesitatea mentineriistructurii secundare $i terfiare a proteinei ‘Masele moleculare ale enzimelor variazd in limite foarte largi. Ribonucleaza are 0 masi molecular’ egal cu 13700Da. Limita superioara este greu de definit, Numeroase enzime suntaleatuite mumai din resturi de aminoacizi unite intre ele prin legaturi covalente, peptidice simu doar printr-un lant, ci prin mai multe lanturi polipeptidice. ‘Unele enzime sunt asociate cu compusi de mase moleculare mici, dializabili. Cind acesti compusi organici sunt strins legati in structura enzimei, ei poarti denumirea de grupari prostetice, ins cind imbinarea lor este usor disociabil—coenzime. -59-Acestibiocatalizatori se numese /holoenzime, iar componenta proteic’—apoenzime. Penirutotatitatea compusilor neproteic din structura heteroenzimelor se utilizeazitermemul cofactor. in calitate de cofactori apar frecvent cationii unor metale si foarte rar uni anioni. Un numarrelativ redus de cofactori, de coenzime in asociere cu diferite apoenzi- me dau nastere unui numar foarte mare de hetervenzime. Se atesta sute de dehidrogenaze cu coenzima NAD*. Datorita legaturilor foarte slabe intre NAD" sidiverse apoenzime, un numar mare pot actiona simultan fntr-un compartiment celular, utilizind o cantitate neinsemnati de coenzime. Si in aceste situatii este absolut necesar ca procesele de redu- core 8 fle echilibrate cu reoxidarea lor Cee comun si ce e distinct la cataliza enzimaticd si cea chimicd? Enzimele sunt catalizator i respect legile catalizei: 1. Enzimele accelereaza viteza reactiilor chimice posibile din punct de vedere termodinamic, determinind o scadere a energiei de activare si conducind la instaurarea mai rapidaia starii de echilibru; accelereaza reactile in ambele directii in mod identic A==B in lipsa enzimei viteza(A —~ B)e egal, de exemplu, cu 10* sec., reactia inversa (A —— B)decurge in 10° sec. Constanta acestet reacti este egal a 4 B 10 Geely A Ae 100 (A) ci 10 in stare de echilibru concentratia substantei B este de 100 ori mai mare decit a substanjei A, chiar daci e prezenti sau nu enzima. in lipsa enzimei echilibrul se stabileste timp de citeva ore, iar cu enzima — in citeva secunde. Enzimele accelereaz aparitia echilibrului chimic in reactia catalizati 2. Viteza reactici creste de milivane de o1i. De exemplu, reactia catalizati de carbanhidrazi: CO,+H,O == H,CO, Fiecate molecul de enzima hidrateaza in 1 sec.- 10° molecule de CO, si, prin urmare, viteza reactiei in prezenta enzimei creste de 10'ori. Efectul enzimelore extraordinar in comparatie cu ce! al catalizatorilor sintetici, Enzimele se prezint in concentra’ extrem de mici la concentrafi de substrat relativ mati. Eficienta catalitica a enzimei este net superioard celei inregistrate in cazul catalazei chimice, exprimindu-se prin numdrul de turnover — numarul de molecule ale substratului ‘transformat intr-un minut de o moleculé de enzima. 3. La sfirgitul reactiilor chimice enzimele, la fel ca gi catalizatorii, se regasesc, din punct de vedere cantitativ gi calitativ, intr-o stare chimicd neschimbatd, participind la un nowactcatalitic. 4, Enzimele sunt substanfe macromoleculare extrem de instabile, reactionind in conditi ‘optime numa’ la anumiti parametr -parametri optim de actiune a enzimei—solutii apoase diluate, pH valoriifiziologice, T amumiti si presiune adecvati. -60-SPECIFICITATEA ENZIMELOR Cea mai important’ prioritate a enzimelor e inalta lor specificitate de actiune - atribut findamental ce determin’ suecesiunea reactilor care favorizenzi calea metabolic’, “Multitudinea formelor de manifestare a specificitaji poate fi incadratd in 2 categorii- ‘cea de renefie si de substrat. 1, Specificitatea de reaetie este proprictatea de a cataliza un anumit tip de reactic i enzimelor. Enzimele proteolitice catalizeazi hidroliza legaturilor Ie Wa HN FHC NE Cis NG —-COOH +2H,0 — RK Ra Rs +H -COOn + NE -COoH + BANspie=cO0e Ry Ry Ry ‘Muilte enzime catalizeaza si hidrolizeaza legsturile esterice, reactia flind asemanatoare. Ro-C-O-R: + HO —- R-C=0 + ROH c on Unele enzime au? zone distinete in structura lor proteicd,fiecare responsabil pentru un anumit tip de reactie specific’. 2.0 enzima cu o anumiti particularitate de reactie poate asigura transformarea corespunziitoare a unui grup de substante inrudite chim: itate relativa, sau reactia se resfringe asupra unui substrat — specificitate absolut. Dreptexemplu de specificitate absoluta pot servi anhidraza carbonic, ureaza, ultima reprezentind 0 enzima ce catalizeaza urmitoarea reactie H,N-C—NH) + H;0 —~ CO, + 2NHy ° Specificitatea relativa se manifest in diferite ipostaze: a) posed oarie larg’, fata de numgirul substraturilor (proteazele in functie de resturi de aminoacizi: chimotripsina—legatura peptidicd, format de COOH a Phe, Tyr, Trp; tripsina - de COOH ai Lys si Arg; trombina—de COOH ai Arg si NH, ai Gly); b)formeazio arie mai ingusta: alcool dehidrogenaza —dehidrogenaza un grup de alcooli monohidroxilici cu un numar mic de atomi de C (specificitatea de grup), adied se manifest prin gruparea chimici: R-CH,-OH “= R-CH=O a + NAD* NADH+H. -61-c) in lipazele digestive specificitatea coreleazi cu pozitia legdturii esterice intre plicerind siaciaii grag: g CH,—O-C-R, - 2 ‘ Lipaza pancreaticd CH OH = CH-O-CO-R, = > CH-0—CO-R, A R; COOH = CH,—OH Ry Coot CH, OH CH—On CH) —OH Stereospecificitatea de substrat side reactie Majoritatea biomoleculelor posed un atom de C asimetrc si, fiind chirali, potexista sub forma celor 2 enantiomeri. O enzimé atact numai un izomer—stereospecificitate: a) intoate reactile glicolitice enzima corespunzatoare actioneaza asupra esterilor fosforici ai D-hexozelor si D-triozelor; se utilizeaz8 numai L-aminoacizii; inaceste cazuti substratul optic activ se transform in produs care poate fi sau nu optic; b) cind substratul este inactiv optic, dar este produsul optic al reactiei, se consider Clreactia este o"sintez’ asimetrich”. Aceeasisituafie se observa sin acivitatea funarazei, SDH, LDH: H,;C—CH—COOH { Hyc-c—coon \ I On NAD’ NADHHH? =O ‘L-acid lactic Acid piruvic ©) enzimele catalizeaz’ transformaile doara unui singurizomer-cis sau traps; 6) pentru a utiliza ambii antipozi optici, organismul dispune de racemaze (epimera- -ze),care transforma un izomer in altul: D-alaning, —~ L-alanina Utilizindu-se substraturi marcate cu izotopi radioactivi, s-a constatat c& unele enzime sunt capabile si diferentieze dou grupe chimice identice Glicerol kinaza fostorileaz’ asimetric glicerolul, esterificind aceeasi grupa de alcool 'Chy—OlL 'CH,~-OH 2CH—OH 6-01 3 CH, OH 3CH,—-0—PO;Enzimelor le sunt proprii manifestiri absolut specifice, anumite substraturi. Ele accelereaza diverse reactii chimice, fara formarea produselor auxiliare. Moleculele substratului trebuie si posede anumite pauticularitati structurale de baza: a) substratul confine o legaturd chimicd specifica pe care enzima o scindeaz; +b) substratul trebuie s3 posede o anumiti grupa functional, grupa de legatura, care joncfioneaz cu enzima $i orienteazi moleculele substratului in centrul activ. Cu alte cuvinte, legitura chimici a substratuluitrebuie si ocupe o pozitie adecvati fat de gmupa cataliticd a enzimei. Ce mecanism de aecelerare a vitezei reactiei chimice poseda enzimele? Pentru. pitrunde acest mecanism, e necesard constientizarea unor nofiuni ea: ener~ gia de activare exprimata in calorii, energie necesaré tuturor moleculelor unui mol de substan, care la 0 anumiti temperatura si atinga starea de tranzitie corespunzatoare apexului barierei energetice. Factorul ce asigur desfasuratea reactiilorin organismele vii la T°C interna constant este delimitarea la valori minime a energiei de activare. Viteza reactilor e dependenta de diferenta valorilor de energie liber (4G) pentrustarea A(s)sicomplexul de tranzitie. Ea este egali cu: AG = Gst- Gs. Se mai numeste energie liber de activare — Gibbs. ‘Viteza reactiilor ¢ proportionala cu numérul de molecule, a caror energie liber este egald sau mai mare decit aG. O data cu cresterea T, numarul moleculelor sporeste de oti la 10°C. Enzimele accelereaza viteza reactilor chimice (VRC), micsorind batiera de activare, si reactia decurge dupa alt mecanism, ce se caracterizeazi printr-o energie de tranzitie mult mai mica (fig, 1.15). Formarea si scindarea legiturii chimice de enzimi e precedati de formarea complexului enzimd-substrat [CES]. Substratul ¢ fixat de 0 zona restrinsd in enzima, specific, denumita “centrul activ al enzimei. Asadar, centrul activ (CA) e o imbinare in timp si spatiu a anumitelor grupe functionale, ce intré in legitura cu moleculele substratului si determind activitatea catalitica a enzimei. Dispunem de numeroase investigatii experimentale ce |G vizeazi formarea complexului enzimd-substrat (CES): L Investigatii demonstrative prin intermediul microscopiei electronice si al analizei roentgenostructural. 2.Formarea CES ¢ insotitd de modificarile fizice ale enzimelor: — solubilitate, termolabilitate. 3..Se modifica si caracteris- . 4, daca in Figura 115. Diagrama ce reprecints energia liber tica spectroscopic, dacd in tein reacilechimice: Ssubura 4; produ final B; componentacnzimelintri grupe ES. comp intermediri AGO = energie de reac prostetice colorante, standard 5 Stareade transite fra enzima P ena Dratareaetei -63-4. Adecvati esi metoda rezonantei electronice de spin (RES) sau rezonanfa magneticd nuclear (RMN). 5.Laformarea CES se manifest’ un grad mare de stereospecificitate (D - aminoacizii nu pot servi ca substraturi, nu se leaga cu enzima). Zona de legatura are o forma geometricd bine conturata (fig, 1.16). 6. Uneori afinitatea mare a enzimei cu substratul A (in lipsa B) inlesneste stabilirea complexului EA. 7. La concentratia constant a enzimei viteza reactiei sporeste o dati cu mirirea concentrafici de substrat, ajungind la viteza maxima, In 1913, L. Michaelis explicat nofiunea de vitezd maximi a reactiei fermentative fata de formarea CES. Concluzia cd viteza reactiei devine maxima la concentratia mare a substratului, in conditiile in care acesta ‘cupa toate centrele active ale enzimei, co argumentare inridicinati demultsiodovadi Figura 1.16, Fixarea subsratuut fr central conchidenta a functionarii complexului “% ehimotripsinet enzim-substrat Unele particularititi ale centrului activ (CA) Centrul activ este aleatuit dintr-un“centru de legare” si un “centru catalitic”, Mai exact, in centrul activ unele grupari (sau resturi ale aminoacizilor) sunt implicate in legarea substratului, altele asigura cataliza propriu-zisi ” calalitice, Enzimele confer’ o varietate structural destul de mate, la fel de vaste sunt ‘Specificitatea si mecanismul actiunii catalitice. $i, totugi, rezultd unele concluzii generale, referitoare la proprietaile lor: 1. CA ocupi o parte relativ mica din volumul enzimei si majoritatea din restul aminoacizilor moleculei de enzima nu contacteaza cu substratul, E 0 enigma solicitarea unor dimensiuni atit de mari de citre enzime. 2. CA eo structurd tridimensionali (nue doar punct, linie sau plan) — structur’: complexa, la formarea cAreia participa grupe ale diferitelor resturi de aminoacizi (exemplu: in stucturalizozimului din cei 129 de aminoacizi radicalii aminoacizilor din secventa liniar —35,52,62,63,101 patti Ja formarea CA). Centrele active ale unor enzime sunt redate in figurile 1.17-1.18. 64. Figura L17, Central activ al chimotrpsine’f 3. Substratul relativ slab se leag’ cu enzima, Energia liber’ a interactiunii e de 3-12 keal/mol. Forta legdturilor covalente nu deviazii de la limitele 50-110 kcal/mal. |. 4.CA are forma de “adineitura” sau “cavitate” (sant, despictura), unde apa n- are acces, cu exceptia daca aceasta serveste drept reagent al reactiei. Aceasti cavitate confine citiva aminoacizi polari ce exerciti legarea si cataliza. Regiunea CA are un caracter_nepolar ce favorizeaza fixarea substratului. De mentionat ci forma CA creeazi un microspatiu, in care resturile Figura 1.18. Centrul activ al elastazei polare capati insusiri deosebite, necesare pentru cataliz. 5. Fixarea specified e dependent de pozitia bine determinati aatomilorinCA. /~ Substratul patrunde in CA, cu condita ( E .) + 2S) > { ES. similitudinii de forma. in 1890, Emil Fischer ie 7 a claborat modelul “clasic” al structurii Figur 1.19. Formarea complexului encima- spatiale a CA in raport cu structura ‘™™"#"(ES) dupa modell E. Fischer substratului. Anume acest principiu—“‘lacdt - cheie” —a comtribuit cu succes la evolutia conceptului catalizei stereospecifice (fig. 1.19). In ultimiianiinsis-a constatat cH centrul activ nu eo structurd rigid eum presupunea Fischer, ci se modific la fixarea substratului. Modelul dinamic, propus de D. Koshland, presupune o flexibilitatea zonei de cazare a CA in enzima liberd. CA este preformat, ceea ce denota ca are o conformatie spafiald putin diferita de cea necesari fixarit substratului, Substratul induce o “tmodificare conformational azonei CA, realizind o configuratie optima fixari (fig. 1.19a). Unele enzime fixeazi substatul in forma lor tensionati, ce corespunde stiri de tranzitie. Din punct de vedere termodinamic, situarca cca mai potriviti.a substratului in raport cu cenzimareduce la minim gradele de libertate ale translari si rotate’ substratulu, ii micgoneazii entropia, ceea ce favorizeaz’ obtinerea efectiva.a stiri de tranzitie si motiveazd in mare parte sciderea cnergiei de activare a reactiei catalizate enzimatic. E incontestabilfaptul cd flexibilitatea structuri enzimei determing prezenta substratului fn sfera de actiune a grupelor cataitice gi iesirea produsului din acest sistem. Fignra 1.198, Moifcnteconformapionate in molecule nme Ta fcanca subst fmodee)D Kosten 26sUnele enzime induc o perturbatie a electronilor pe substrat, amplificind cu mult viteza catalizei (carboxipeptidazi). Exist o varietate mare de factori ce influenteazd viteza reactiilor fermentative si determina activitatea cataliticd a enzimelor: 1. Concentratia fermentului a) in conditii standard, 2 molecule de enzime intr-o anumita perioada de timp vor cataliza de 2 ori mai mute molecule de substrat decito moleculd de enzima V = R[E]— orelatie strict proportional. La marirea concentratiei de enzimi se observa devieri de la relatile strict liniare—devieri imaginare ce tin de metoda de studiu; b) in prezenfa mai multor enzime, viteza va fi limitati de concentratia uneia dintre ele; )0 dati cu sporirea concentratiei enzimei, viteza unei reactii complexe se va miesora in cazul in care coenzima practic va filegat& de o enzima inaccesibila pentru celelalte; ) adaosurile toxice pot fixa enzima. Numai dupa legarea lor, enzima va deveni apt pentru activitate. 2. Concentratia substratului. Concentratia enzimei din fesuturi suport variatii mici in timp (cu exceptia enzimelor “inductibile”), astfel incit ea poate fi considerati constanti. in schimb, concentratia substratului poate varia destul de mult conform stiri metabolicea fesutului. Dependenta vitezei reactilor de concentrafia substratului constituie aspectul cel mai important al cineticit enzimatice (Fig.1.20) Vuntimin) Reprezentarea grafici reflect © curba cu afinititi de hiperboli. Explicarea ei se datoreaza lui L.Michaelis si M.Menten. K,, este egal cu concentrafia substratului pentru care V, prezinti o jumatate din V,,,.. Exprimarea K,, se face in ‘uunititi de concentratie si se deduce din presupunerea de baz precum ca factorul-limita al vitezei reactiilor fermentative este scindarea complexului ES inprodussienzim8. figura Lan, Varn eel recor encima Fiecare enzima in parte are valoarea —_functie de concemiratia substrarului K,, pentru substratul dat. Unele cenzime (catalaza, carbanhidraza) cer cantitatirelativ mari de substrat pentru a atinge viteza egal cu V altel (hexokinaza) ating mrimea data la concentratii mici de substrat. i in conditiile de mediu al celulei, enzima nu-i saturaté cu Ky, + [S] substratsinu functioneazi cu V._. Modificind concentratia substratului, ¢ posibild, in anumitd masura, reglarea proceselor oxidative din celula. 3. pH optim al fiecarei enzime, ce genereazA o actiune maximi a ei, nu coincide obligatoriu cu valorile pH caracteristice mediului intracelularal enzimei, Eeuatia i Michaelis Menten. [Ss] -66-Mirind sau micgorind pH-ul mediului, se poate regla activitatea cataliticd a enzimelor. Acest optim pH e dependent de ‘gradul de ionizarea grupelor funetionale, al afinititii enzimei cu substratul gi stabilititii ei (fig.1.21). Toni H* si OH au un efect denaturant asupra enzimelor — rup legiturile. ce determina structura tertiar8. Dac in CA al enzimelor se afla grupii ionizabile, acide sau bazice, acestea interactioneaza direct cuionii H* si OH, rezultind cresterea sau_ scfderea gradului lor de disociere si actionind ca adevarat inhibitor’ ai enzimelor (amilaza in sucul gastric) 4. Influenta temperaturii (T) determina stabilitatea si viteza de scindare a ‘complexulti ES, influentind afinitatea enzimei Jasubstratul activator sau inhibitor. Cresterea vitezei reactiei o data cu cresterea temperaturii este interpretatd prin prisma “cnergici de activare”. Pentru fiecare enzima se poate stabili o temperatur’ optim’, viteza atingind valoarea maxima. Cresterea temperaturii cu 10°C pind la 40°C dubleaz ‘incontinuare viteza reactiei. Viteza scade din cauza distructiei enzime, iar temperatura inactivatiei enzimei coincide cu punctul de denaturarea proteinei (fig.1.22) -67- finitatea Per sna IME Fosfataza lean 3°85 7° 8 4 Figura 1.21. Activitatea unor ensime fn dependent de pH Temperatura optima Ainitatea "PN Om 100) | ! ! | | I | I oft | oe ao FC Figura 1.22. fect temperaturi asupra activi encimelor