VI vežba

Određivanje ukupnog broja bakterija u površinskim vodama

Cilj: Upoznavanje sa saprofitnom bakterioflorom površinskih voda i analitičkim metodama

detekcije

Površinske vode su vode okeana, mora, reka, potoka, jezera, močvara i bara. Vode prema kretanju
mogu biti tekuće i stajaće; prema sastavu i opštim fizičko-hemijskim svojstvima termalne, slatke,
zaslanjene, slane, mineralne i tresavske; prema poreklu prirodne i veštačke, i na osnovu trajanja stalne
i privremene.

Mikrobiološki indikatori koji ukazuju na kvalitet vode nekog ekosistema mogu se sagledavati sa
bakteriološkog, saprobiološkog ili biohemijskog aspekta.

Bakteriološke analize voda mogu se vršiti sa sanitarnog i sa ekološkog aspekta, pri čemu se mogu
primenjivati direktne, kao i indirektne (odgajivačke) metode.

Mikrobiološki (bakteriološki) indikatori stanja i kvaliteta voda koji se primenjuju sa šireg ekološkog
aspekta su:

• Ukupan broj bakterija (T),

• Broj aerobnih heterotrofa (H),

• Broj fakultativnih oligotrofa (FO),

• Indeks T/H

• Indeks FO/H i

• Zastupljenost i brojnost različitih fizioloških grupa bakterija.

Direktne metode za određivanje brojnosti bakterija u vodi:

Ukupan broj bakterija (T – engl. Total noumbar of bacteria) se određuje direktnim metodama, pošto
se ne može registrovati odgajivačkim metodama na hranljivim podlogama. Zbog raznolikosti
metaboličkih puteva i načina života, kao i velike plastičnosti u odvijanju biohemijskih procesa, ne
postoji univerzalna podloga na kojoj bi se mogla utvrditi celokupna brojnost bakterija prisutnih u
nekoj sredini. Odgajivačkim metodama otkrivamo samo jedan deo bakterijske populacije određenih
metaboličkih svojstava, i samo se direktnim metodama može odrediti brojnost svih prisutnih bakterija
nekog uzorka. Najčešće se koristi metoda bakteriološke filtracije, koja se bazira na filtraciji različitih
zapremina vode (50-100 ml za prirodne vode, srednje zagađene 1 ml, ribnjaci 1-2 ml, dok se za jako
zagađene priprema serija razblaženja) na celulozno-nitratnom filteru veličine pora od 0,2 µm, fiksira u
pari formalina desetak minuta i zatim suši na sobnoj temperaturi. Membranski filter se zatim stavlja u
petri ploču sa filter hartijom natopljenom bojom (5% eritrozin rastvoren u 5% karbolnoj vodi) s tim
što je strana nataložena bakterijama okrenuta na gore.Nakon dvočasovnog stajanja u boji, vrši se
postupak odbojavanja filtra tako što se membranski filtar prenosi na seriju petri ploča sa filter hartijom
natopljenom destilovanom vodom, sve dotle dok se na hartiji pojavljuju ružičasti tragovi. Ako je
postpak pravilno izveden, površina filtra sa bakterijama ostaje svetlo ružičaste boje, a bakterije su
obojene crveno. Brojanje se vrši pod imerzijom na svetlosnom mikroskopu uz korištenje okularne
mrežice, tako što se na predmetno staklo nanese kap ulja se stavi membranski filtar i nakon
prosvetljenja se na gornju stranu na kojoj su bakterije nanosi još jedna kap imerzionog ulja.
Mikroskopiranje se vrši ravnomernim pomeranjem preparata, a brojanje ćelija vrši u 50-100 vidnih
polja okularne mrežice. Broj mikroorganizama se izračunava prema formuli:

Gde je:

a – površina filtera u mm2, 106 prevođenje mm2 u µm2

b – broj bakterija u vidnom polju,

c – površina okularne mrežice pri tom uveličanji (µm2),

d – količina profiltrirane vode (mL)

e – broj vidnih polja u kojima se broje bakterije u površini c.

Nedostatak ove klasične metode je što se dobijeni rezultati odnose na ukupan broj i živih i mrtvih
ćelija koje se klasičnim postupkom bojenja 5% eritrozinom ne mogu razlikovati. Na bakteriološkim
filtrima se pored ukupnog broja bakterija dobija i slika zastupljenosti pojedinih morfoloških oblika
bakterija u ukupnog bakterioplanktonu.

Indirektne ili odgajivačke metode za određivanje brojnosti bakterija u vodi:

podrazumevaju gajenje mikroorganizama u ili na prirodnim ili veštačkim hranljivim podlogama. Na

ovaj način se određuje zastupljenost i brojnost različitih grupa bakterija.

Heterotrofi (H) ili hemoorganotrofi predstavljaju najrašireniju grupu bakterija po tipu metabolizma u
prirodi. Za ove bakterije je organska materija izvor ugljenika, energije i donor elektrona. Oni mogu da
metabolišu organsku materiju u aerobnim ili anaerobnim uslovima, i takođe da koriste živu (paraziti)
ili neživu (saprofiti) organsku materiju.

Aerobni heterotrofi

Određivanje ukupnog broja aerobnih heterotrofa (saprofita) je indikator kvalitata vode sa aspekta
njenog organskog zagađenja (opterećenosti). Visoka brojnost heterotrofa ukazuje na vodu baogatu
organkim materijama podložnim bakterijskoj razgradnji. Aerobni heterotrofi se određuju na
standardnoj podlozi hranljivog agara (meso-peptonski agar, MPA). Inkubacija zasejanih podloga je 5 –
7 dana na 22 – 26 °C. Broje se sve izrasle kolonije heterotrofa, i broj izražava na 1 cm3 uzorka vode.
Na istom hranljivom agaru se mogu određivati i aerobni heterotrofi – psihrofili i aerobni heterotrofi –
mezofili. Razlika između ovih grupa bakterija je u temperaturi i dužini inkubacije (psihrofili 5 – 7
dana na 20 °C, mezofili – potencijalno patogeni 48 h na 37 °C).

U ekološko-mikrobiološkim ispitivanjima je najuputnije određivanje sve tri grupe heterotrofa jer

odnos mezofila i psihrofila, posmatran kao indeks M/P može biti dobar pokazatelj antropogenog
uticaja na kvalitet vode i procese eutrofizacije.

Anaerobni heterotrofi

Za gajenje ove grupe bakterija se koristi ista podloga kao za aerobe, ali se kultivacija vrši u uslovima
bez kiseonika, u posebnim uređajima za gajenje anaerobnih mikroorganizama, ili nakon obezbeđivanja
anaerobnosti sredine nekim fizičkim ili hemijskim sredsvima.
Fakultativni oligotrofi (FO)

Oligotrofne bakterije naseljavaju sredine sa vrlo niskim koncentracijama organskih materija, ali kao
fakultativni organizmi se mogu nalaziti i u sredinama sa višim koncentracijama tih materija. Njihova
brojnost se određuje na isti način kao i heterotrofa, ali se koristi hranljiva podloga koja je deset puta
razređena (MPA 1:10), dakle deset puta siromašnija u pogledu sadržaja organskih materija. Inkubacija
je 5 – 7 dana na 22 26 °C, a broje se sve izrasle kolonije.

Dominacija ove grupe karakteriše nezagađene vode, odnosno vode oligotrofnog tipa.

Indeks T/H

Ovaj indeks je mikrobiološki parametar koji označava klasifikaciju vode na osnovu odnosa između
ukubnog broja bakterija (T) određenog direktnim metodama i aerobnih heterotrofa (H) određenih
odgajivačkom metodom. Ovaj indeks označava stepen zagađenosti, odnosno čistoće vode. Visoka
zastupljenost heterotrofa ukazuje na vodu opterećenu organskom materijom.

Indeks T/H Kategorija vode

>1000 Čiste vode
1000 – 100 Umereno zagađene vode
100 – 10 Zagađene vode
10 - 1 Izrazito zagađene vode

Indeks FO/H

Odnos između brojnosti fakultativnih oligrofa i heterotrofa je takođe indikator stanja i kvaliteta vode
sa šireg ekološkog aspekta. Ovaj parametar nije standardizovan, ali iskustveni podaci pokazuju da se
primenom ovog parametra može oceniti sposobnost samoprečišćavanja vodenog ekosistema.

Vrednost indeksa FO/H Sposobnost samoprečišćavanja vode

<1 Slaba
≥1 Zadovoljavajuća
>10 dobra

TOK ANALIZE:

Potreban pribor: autoklav, podloge MPA i MPA 10x razlivene po 10 ml u epruvete, petri kutije,
epruvete sa 9 ml peptonske vode, automatska pipeta, sterilni nastavci za pipete
Postupak rada:

1. Pripremiti seriju razblaženja uzorka vode od 10-1 do 10-3

2. Odmeriti po 1 ml odgovarajućeg razblaženja i dodati u praznu petri kutiju
3. Preliti odmereni uzorak odgovarajućom podlogom i pomešati ih kružnim mešanjem kutije
4. Staviti petri kutije u termostate podešene na odgovarajuću temperaturu inkubacije.

Priprema serije razblaženja:

Rezultati analiza:

UKUPAN BROJ MEZOFILNIH BAKTERIJA

Mesto i datum uzimanja uzorka:
Ukupan broj: 10 -1
10 -2
10 -3

UKUPAN BROJ PSIHROFILNIH BAKTERIJA

Mesto i datum uzimanja uzorka:
Ukupan broj: 10 -1
10 -2
 10 -3

UKUPAN BROJ FAKULTATIVNO OLIGOTROFNIH

BAKTERIJA
Mesto i datum uzimanja uzorka:
Ukupan broj: 10 -1
10 -2
10 -3

M/P = ___________________

FO/H = __________________