1. DNA/RNA proteinski čipovi?

DNA-čip se sastoji od velikog broja aktivnih polja koncentriranih na površini

mikrometarskog reda veličine (od nekoliko µm u promjeru i do više stotina tisuća točaka)
pričvršćenih za tvrdu podlogu (npr. staklo, silikon). Svako polje sadrži određenu poznatu
probu (npr. jednostruki lanac DNA, oligonukleotide ili genske fragmente). Te probe imaju
sposobnost prepoznavanja komplementarnih baza s kojima formiraju dvostruki lanac u
procesu hibridizacije. S obzirom na vrstu probe razlikujemo oligonukleotidni i cDNA-čip
(cDNA-chip/array). Na oligonukleotidnom čipu se nalaze probe kratkih nukleotidnih
sekvenci. Oligonukleotidne sekvence su sintetizirane direktno na čip (in situ). cDNA-čip se
odnosi na mikročip, a naziva se i točkasti čip (spotted array). Proizvodnja cDNA-čipa
zahtijeva određen međukorak koji nije potreban kod proizvodnje oligonukleotidnog čipa, a to
je korištenje enzima obrnute transkriptaze za proizvodnju cDNA i PCR-a (polymerase chain
reaction) za umnažanje cDNA komplementarnih odgovarajućoj mRNA.
Kad se uroni DNA-čip u otopinu koja sadrži nepoznate mete (nukleotidne sekvence),
hibridizacija će se pojaviti samo na komplementarnim mjestima. Detekcija ovih polja (na
čvrstoj podlozi) omogućuje identifikaciju mete. Trenutno se detekcija hibridizacije na podlozi
provodi korištenjem markera (flurescentne boje) koji su prethodno fiksirani na sve mete.
okviru DNA-čipa razlikujemo makro i mikročipove (macro- i microarray). Razlika između
makro i mikročipova je u broju aktivnih polja i njihovoj veličini. Makročipovi sadrže
nekoliko desetaka točaka (polja) koje su 500/više µm u promjeru, a izrađene su ručno ili
pomoću robota. Mikročipovi sadrže tisuće točaka veličine manje od 500 µm u promjeru. Za
njihovu je proizvodnju potrebna specijalna robotizirana oprema. Makročip ima manju gustoću
polja po jedinici površine, dok mikročip ima veću gustoću polja po jedinici površine. Prema
namjeni razlikujemo tri glavna tipa DNA-čipa (1) sekvencijski čip, (2) ekspresijski čip i (3)
čip komparativne hibridizacije. Sekvencijski čip je prvi, najstariji. Na sekvencijskom čipu
nalaze se probe - cDNA segmenti obično dugi 20 nukleotida pričvršćenih za supstrat na
stakalcu. Uzorci/ mete (označena DNA molekula specifičnih sekvenci nukleotidnih baza u
procesu hibridizacije) se zatim izlažu probama na čipu i mjesta spajanja meta i proba
(hibridizacijom) determiniraju rezultate eksperimenta. Ekspresijski čip je konstruiran s
namjerom utvrđivanja stupnja ekspresije određenog gena mjerenjem količine mRNA koju
proizvede taj gen. To se postiže konstrukcijom čipova sa specifičnim setovima proba (kao
suprotnost sekvencijskom čipu koji sadrži sve moguće kombinacije proba. Rezultati se
uspoređuju s kontrolom kako bi se utvrdio stupanj promjene u ekspresiji određenog gena. Ovi
čipovi su korisni pri dijagnozi i tretiranju bolesti povezanih s određenim genetskim
ekspresijama-rak. Čip komparativne hibridizacije je molekularno citogenetska metoda za
analizu kopija pojedinih gena u ukupnoj količini DNA, a dizajniran je za utvrđivanje relativne
količine date genetske sekvence. Variranje kopija pojedinih gena povezano je s povećanim
rizikom pacijenata od nekih onkoloških, neuroloških i psihijatrijskih bolesti, kao i s njihovim
dijagnosticiranjem. Ovim tipom čipa također se otkrivaju i genetske mutacije tipa
kromosomskih aberacija.
Razlika izmedju DNK I RNK cipa?
Razlika je u prirodi sonde. DNK se sastoji od genomske sonde tj.nema prekida, originalne
sekvence. RNK sonde imaju baze od jednog egzona,drugog
egzona… DNK cipovi sluze za detekciju mutacija sekvence u zeljenim fragmentima
(PCR) dok RNK cipovima pratimo ekspresiju gena.
Poenta-identifikacija novih gena, razumijevanje funkcionisana, ekspresija pod različitim
uvjetima i uvid u bolesti srčane, zarazne, karcinome-omogućava klasif itpova karcinoma
prema genskoj aktivnosti u tumrskim stanicama) i slično
2. ELISA; imunohistohemija?

Imunohemijske metode obuhvataju niz imunoloških testova koji podrazumevaju detekciju ili
određivanje titra antigena ili antitijela u datom uzorku seruma. Ove metode imaju široku
dijagnostičku primjenu u kliničkoj praksi.

ELISA:

ELISA je imunokemijska metoda koja se temelji na prepoznavanju između antigena i specifičnog

antitijela koje prepoznaje taj antigen. Enzimi konjugirani sa protutijelom u Elisa metodi su alkalna
fosfataza, peroksidaza hrena, beta-galaktozidaza. Enzim može biti vezan za :

 Specifično antivirusno antitelo

 Antihumano imunoglobulinsko antitelo

 Antigen, koji se nalaze nerastvorni, adsorbovani za zidove epruveta, odnosno u čvrstoj

fazi.

dve faze:

 Imunska faza - dolazi do formiranja kompleksa antigen-antitelo obeleženo enzimom.

 Hemijska faza - dodaje se odgovarajući supstrat ,pri čemu dolazi do hemijske reakcije
enzim-supstrat. Koriste se u dijagnostici virusnih infekcija,od posebnog su značaja u
dijagnostici oboljenja izazvanih virusima koji se ne mogu kultivisati (HBV,rotavirus)

ELISA metodom mogu se odrediti pojedine klase imunoglobulina (IgM,IgG

 Postoji više vrsta tehnika imunološkog odreĎivanja pomoću testa ELISA: indirektna,
"sendvič", konkurentna i nova višestruka i prijenosna metoda pomoću
mikrotitarskih ploča. Indirektna Elisa-koristi se za detekciju antivirusnih antitela.
Poznati virusni antigen se nalazi u čvrstoj fazi. U bazenčić unosimo ispitivani serum.
Ukoliko su prisutna antitela iz seruma će se vezati za antigen u čvrstoj fazi i formirati
kompleks antigen-antitelo. Inhibiciona- Koristi se za detekciju virusnih antigena iz
bolesničkog materijala. Poznati virusni antigen se nalazi u čvrstoj fazi. Uzorku
dodajemo specifično antitelo obeleženo enzimom, za koje se vezuje virusni antigen iz
ispitivanog uzorka (zbog većeg afiniteta za vezivanje od antigena u čvrstoj fazi).
Sendvič" ELISA-Virusni antigen, koji se detektuje u ispitivanom uzorku se nalazi u
“sendviču” između poznatog specifičnog antitela u čvrstoj fazi i specifičnog antitela
obeleženog enzimom. Dodavanjem supstrata dolazi do njegove enzimske degradacije i
promene boje.

 Konkurentna ELISA Koristi se za detekciju virusnih antigena u ispitivanom uzorku

koja se vezuje za poznato specifično antivirusno antitelo koje se nalazi u čvrstoj fazi
 .Dodaje se antigen obeležen enzimom, i on se ispiranjem odstrani zbog čega je
izostanak boje pozitivna reakcija.

Višestepena sendvič-Koristi se za detekciju IgM antitela u ispitivanom serumu.Ona se

vezuju u kompleks sa antihumanim IgM antitelom u čvrstoj fazi.

Dodaje se poznati virusni antigen i specifično antitelo obeleženo enzimom ,koji se

pridružuju kompleksu.

Dodavanjem supstrata dolazi do njegove degradacije.

3. Blot metode?

Bloting su tehnike korištene za transfer DNA, RNA i proteina na nosač, da bi mogle biti
razdvojene, nakon čega zatim slijedi gel elektroforeza. Pri blotovanju može se birati između
klasične nitrocelulozne, te nylon membrane. Ova zadnja postoji u dvije varijante: neutralna i
pozitivno naelektrizirana. Koja će membrana biti izolirana ovisi od toga u koje će svrhe
kasnije biti korištena, ali djelimično i od navike u radu ljudi u gen-tehničkom laboratoriju.
Najčešće metode za Northern i Southern blotting zasnivaju se na kapilarnim silama i
prijenosu pomoću vakuuma. Ponekad se koristi i elektroblotting, ali se mora biti pažljiv da
ne bi došlo do topljenja agaroznog gela

Vestern blot (engl. Western blot) je jedna od tehnika molekularne biologije koja se koristi za
detekciju specifičnog proteina u uzorku korišćenjem antitela specifičnog za dati
protein.Uzorak može biti ukupni lizat ćelije, ili izolat određene ćelijske frakcije
(citosol ili jedro). Proteini u uzorku se prvo razdvajaju na poliakrilamidnom gelu na
osnovu molekulske mase, a potom u procesu transfera prebacuju na membranu. Membrana,
na kojoj su razdvojeni brojni ćelijski proteini, služi za detekciju proteina od interesa tehnikom
Vestern blota. Naime, membrana se inkubira sa primarnim antitelom koje je specifično za
željeni protein u toku čega se formira visoko specifična interakcija antitelo-protein. Detekcija
signala se vrši upotrebom sekundarnog antitela koje se specifično vezuje za primano
antitelo. U zavisnosti od toga kako je sekunarno antitelo obeleženo, detekcija signala može
biti radioaktivna, hemiluminiscentna i fluorescentna. Priprema uzorka spada u preparativnu
fazu Western blottinga: U većini slučajeva stanice se liziraju kako bi oslobodile protein,
najbolje u hladnoj prostoriji ili na ledu kako bi se minimizirala proteoliza, defosforilacija i
denaturacija, jer do tih procesa dolazi čim se počne razarati stanica. U jednostavnim
postupcima stanice je moguće lizirati u puferu za nanošenje, ali za viskoznu celularnu DNK
mora se upotrijebiti ultrazvuk. Uzorci tkiva su složenije strukture nego stanice, pa su potrebni
viši nivoi mehaničke sile da bi se oslobodili 9 proteini. Tkiva mogu sadržavati i više tipova
stanica koje različito reagiraju sa puferom. Najjednostavniji izvor početnog materijala za
Western blotting su prečišćeni ili semiprečišćeni uzorci proteina. Njih je uglavnom dovoljno
pomiješati sa puferom za nanošenje koji se koristi tokom gel elektroforeze, a prednost su i
male količine uzorka. Da bi se osiguralo da se uzorci nalaze u odgovarajućem rasponu za
detekciju, potrebno je znati koncentraciju ukupnih proteina u uzorcima. Najjednostavnija
metoda je mjerenje apsorbanse otopine lizata na 280 nm ili 205 nm. Koncentracija proteina se
mjeri uporeñivanjem sa koncentracijom standarda. Ova metoda se često koristi u kombinaciji
sa drugim detekcionim tehnikama baziranim na antitijelima, kao što je ELISA ili
imunohistohemija. Praktični primjeri upotrebe obuhvataju: potvrda HIV testa, definitivni test
za goveđu spongioformnu encefalopatiju i neke testove za Lyme bolest.

Southern blot- Najjednostavnija procedura za ispitivanje hemijske strukture DNK je tzv.

Southern Blot /saudern blot/. Prvo se ekstrakovana DNK zagreva na temperaturi između 80oC
i 90oC, čime se dvolančani heliks razlače na jednolančane DNK (denaturacija DNK). Pod
pretpostavkom da je prvih 20-ak nukleotida na 5’ kraju lanca poznato, u smešu denaturisane
DNK se ubacuju takvi DNK-prajmeri (koji su veštački sintetisani) i tada se postepeno snižava
temperatura. Zatim se u smešu dodaju termostabilne DNK-polimeraze kod kojih izostaje
nukleazna aktivnost (recimo modifikovana polimeraza T7 ili polimeraza bakterija koje
naseljavaju termalne izvore), kao i dNTP (dezoksiribo-azotbazni-trifosfat, tako postoje dATP,
dGTP, dTTP, dCTP, gde je A – adenin, G-guanin, C-citozin, T-timin). Ovaj ciklus se ponavlja
više puta, da bi se replikovala izdvojena DNK u dovoljnoj količini. Ukoliko je potrebno
ispitivati samo određen segment (gen), ekstrakovana DNK se obrađuje restrikcionim
fermentima tako da se traženi segment izdvoji od ostatka, a zatim se za njega vežu
odgovarajući DNK prajmeri, čime se omogućava samo replikacija tog segmenta. U jednom
ciklusu se smeša razdvaja na četiri dela i svakom od njih dodaje se posebno 2,3-
didezoksiribo-azotbazni-trifosfat (ddATP, ddGTP, ddTTP, ddCTP), koji se specifično
označava, ili radioaktivnim fosforom [α-33P] ili fluorescentnim markerima (četiri različite
boje). Kada se ddNTP veže za neki lanac, prekida se replikacija DNK na tom mestu. Southern
blotting se koristi u genetskom mapiranju, razvoju istraživanja, dijagnostici i forenzici. Ova
metoda je neophodna za potvrdu identiteta kloniranog fragmenta ili identifikaciju
subfragmenta od interesa unutar klonirane DNK, a može se koristiti i za genomsku DNK, s
tim što je u tom slučaju Southern blottting uvod u tehnike kao što je analiza polimorfizma
dužine restrikcionih fragmenata (RFLP), analiza koja je potrebna u konstrukciji genomskih
mapa. Southern blotting se vrlo često koristi za mjerenje dužine telomera, a u istraživanju
koje su proveli Gao i saradnici (2013), ova metoda se pokazala čak bolja od Real-time PCR
metode. Mellars i Gomez (2011) su Southern blotting primijenili za detekciju mutacija, a
metoda je posebno zanimljiva i u detekciji genetički modificiranih organizama u hrani.
Northern bloting- Godine 1977. analiza genske ekspresije je rapidno uznapredovala, kada su
George Stark i saradnici replicirali konfiguraciju Southern blotting metode u pokušaju da
prenesu celularnu RNK na hemijski aktiviran celulozni papir. Ta metoda je dobila naziv
Northern blotting. Koristi se u molekularnoj biologiji za istraživanje genske ekspresije u
uzorku putem detekcije RNK. Sa Northern blottingom moguće je pratiti celularnu kontrolu
struktura i funkcija, tako što se odreñuju nivoi ekspresije odreñenog gena tokom
diferencijacije, morfogeneze, ali i tokom različitih oboljenja. Northern blotting je izmeñu
ostalog metoda za: • detekciju specifičnih RNK sekvenci; • analizu genske ekspresije na
nivou mRNK; • odreñivanje veličine mRNK transkripta; • analizu degradacije, splicinga i
vremena poluživota RNK; • potvrdu transgenih/knockout miševa (životinja). Unatoč razvoju
drugih naprednih metoda, brojni autori su potvrdili da je Northern blotting standardna metoda
za detekciju i kvantifikaciju nivoa RNK. Takoñer, smatra se da je Northern blotting iznimno
dobra metoda u detekciji malih RNK molekula u koje se ubrajaju mikro RNK (miRNK) i
male interferirajuće RNK (siRNK) koje se razlikuju po načinu biosinteze. Poboljšan protokol
za tu svrhu podrazumijeva RNK ekstrakciju, elektroforezu na poliakrilamidnom gelu,
northern blotting, te hibridizaciju i detekciju sa modificiranim oligonukleotidnim probama. U
tehnici Northern blotting prvi korak je ekstrakcija ukupne RNK iz tkiva koristeći kaotropne
reagense koji dovode do disrupcije stanice, denaturacije proteina (uključujući RNK-aze) i
otapanja RNK. Nekada se mora uključiti još jedan korak u izolaciji mRNK iz ukupne RNK
što će povećati osjetljivost. Bitno je napomenuti da je RNK hemijski i biološki puno labilnija
od DNK. Gledano s praktične strane, velika osjetljivost RNK prema RN-azama, te brojnost i
stabilnost tih enzima znači da se mora obratiti pažnja prilikom pripreme intaktnih RNK
molekula i eliminacije RNaza. Osim toga, samo mali procenat ukupne RNK čini mRNK, tako
da blotting cijele RNK nije dovoljno osjetljiv način za analizu rijetkih mRNK. Iako se često
može detektovati ciljna mRNK u uzorku ukupne RNK, veća osjetljivost se postiže ako se
izolira poly A+ mRNK frakcija, pa se pristupi Northern blottingu. Oko 10 µg ukupne RNK
je dovoljno za detekciju obimnog signala, a samo nekoliko µg poly A+ RNK (ekvivalentno sa
nešto više od 100 µg ukupne RNK) za detekciju rijetkih signala. Nakon toga, DNK i RNK,
zavisno od metode, odvajaju se prema molekulskoj masi gel elektroforezom, a zatim se vrši
blotting na membrane.

4. Hromatografija (papirna, hromatografija u kolonama, jonoizmjenjivčka, HPLC)?

Hromatografija (od grč. χρώμα:chroma, boja i γραφειν:grafein pisati) je zbirni naziv za grupu
laboratorijskih tehnika za razdvajanje smjesa. Ona uključuje kretanje ispitivane smjese,
otopljene u "mobilnoj fazi", kroz "stacionarnu fazu", čime se dijelovi smjese razdvajaju i
izoliraju, te ih je moguće analizirati i kvantitativno odrediti. Kromatografija može biti
analitička i pripremna. Pripremna kromatografija se bavi razdvajanjem komponenti iz
smjese radi dalje obrade, te se može smatrati metodom pročišćavanja. U analitičkoj
kromatografiji se obično radi sa malim uzorcima te se pokušava izmjeriti relativni omjer
komponenti u smjesi. Hromatografija omogućava razdvajanje i kvantitativno određivanje
tvari veoma slične strukture i kemijskih osobina.Hromatografske metode se dijele prema
fizičkom stanju faza, prema fizičko-hemijskim reakcijama koje se dešavaju prilikom
razdvajanja komponenti ili mehanizmu razdvajanja. Podjela prema fizičkom stanju faza

 Tečna hromatografija:
 Adsorpciona (tečno/čvrsto), npr. TLC, HPLC
 Ionska
 Ekskluziona
 Particiona (tečno/tečno)

 Gasna hromatografija:
 Gas/tečno
 Gas/čvrsto

 Superkritična fluidna hromatografija

Podjela prema obliku sistema
 Kolonska hromatografija
 Planarna hromatografija, npr. TLC
Podjela prema mehanizmu razdvajanja

 Ionoizmjenjivačka (ionska) hromatografija

 Ekskluziona hromatografija
Hromatografija na papiru:

Papirna hromatografija se zasniva na kontinualnoj podeli supstance između dva rastvarača.

Filter hartija je inertni nosač vode. Hromatografija na papiru je veoma pogodna i za
ispitivanje čistoće neke supstance, pri tome, razvijanje hromatograma treba vršiti s najmanje
dva različita sistema rastvarača. Ovom metodom se mogu rastaviti i takve supstance koje su
međusobno vrlo slične kako u hemijskim tako i ufizičkim osobinama.
Za praktično izvođenje hromatografije na hartiji potreban je sledeći pribor i reagensi:
komore (kade, cilindri), hartija, razvijači, prskalice i izazivači. Hartija koja se upotrebljava
mora da ima ravnomernu (homogenu) teksturu i treba da poseduje određene kvalitete: da je
hemijski čista, mehanički otporna i da ima sto manje adsorpcione osobine. Po pravilu je
izrađena od čiste celuloze i kada se hidratiše može da veže oko 20% vode (stacionarne faze).
Osim toga treba da jc porozna tako da mobilna faza (obično organski rastvarači) lako prodiru
kapilarno kroz nju. Vrste hromatograflja na hartiji. Hromatografija na hartiji može biti:
a) jednodimenzionalna (uzlazna i silazna). Nedostatak uzlazne hromatografije je u
tome što nasuprot kapilarnim silama dejstvuje sila teže. Metoda se može upotrebiti samo za
razdvajanje supstanci s relativno velikim razlikama Rf -vrednosti. Kod silazne hromatografije
postiže se brze kretanje mobilne faze, duzina puta nije neograničena. Moguć je analitički rad i
razdvajanje supstanci s malim razlikama Rf- vrednosti.
b) dvodimenzionalna – Ova metoda se karakteriše razvijanjem hromatograma jednim
razvijačem prvo u jednom pravcu, a zatim nakon sušenja hartije, razvijanjem hromatograma u
drugom pravcu koji stoji pod uglom od 90° u odnosu na prvi. Nedostatak ove metode je u
tome što se na jednoj hartiji moze naneti samo jedna polazna mrlja. Posle izazivanja dobija se
hromatogram na kome se nalaze sastojci ispitivane smeše u obliku mrlja (zona) raspoređeni
po celoj površini hartije.
c) radijalno-horizontalna (kružna). Kod ove metode moguća je samo kvalitativna
analiza. Ova metoda koristi se za brzo odvajanje i dokazivanje smeša koje se sastoje iz
manjeg broja komponenata. Obično se ova hromatografija izvodi u porcelanskim ili
kristalizacionim šoljama smeštenim u eksikatorima.

Jonoizmjenjivačka hromatografija (IEC) ili jonska hromatografija je tehnika koja ima

dosta sličnosti sa HPLC tehnikom za razdvajanje anorganskih i organskih iona. Kao
stacionarna faza koriste se jonoizmjenjivačke smole (katjoni i anioni), na koje su
kovalentno vezane jonske funkcionalne grupe. Te grupe su neutralizirane jonima
suprotnog naboja i mogu biti zamijenjeni jonima koji su prisutni u ispitivanom uzorku.
Zavisno od afiniteta, joni će se različito vrijeme zadržavati na stacionarnoj fazi, što
omogućava njihovo razdvajanje. Generalno, jonoizmjenjivač favorizira vezanje iona većeg
naboja i manjeg radijusa. Kao mobilna faza najčešće se upotrebljavaju puferi.
Jonoizmjenjivačka hromatografija nalazi, također, veliku primjenu kod razdvajanja
aminokiselina, gdje se eluiranje vrši puferskim rastvorima različitog pH (zavisno od pH,
aminokiseline se u rastvoru mogu nalaziti u obliku kationa, aniona ili u obliku bipolarnih
iona, tzv. Zwitter-iona)

Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) je oblik kolonske hromatografije koji

se često koristi u analitičkoj hemiji. HPLC se koristi za razdvajanje komponenti iz smjese na
osnovu hemijskih interakcija između supstance koja se analizira i stacionarne faze u
koloni. Princip rada HPLC-a je forsiranje prolaska analizirane supstance (ili smjese) kroz
kolonu (cijev punjena materijalom sitnih čestica, a time i velike površine) pumpanjem
tečnosti (mobilna faza) pod visokim pritiskom kroz kolonu.

Tipovi HPLC-a:
Hromatografija na normalnim fazama
Ova metoda koristi polarnu stacionarnu fazu i nepolarnu mobilnu fazu, a koristi se kada je
supstanca koja se analizira polarna. Polarna supstanca se adsorbira i zadržava na česticama
stacionarne faze
Hromatografija na obrnutim fazama
HPLC na obrnutim fazama (RP-HPLC) koristi nepolarnu stacionarnu fazu i polarnu mobilnu
fazu. Najčešća stacionarna faza je silikatna, tretirana sa RMe2SiCl. RP-HPLC funkcioniše na
principu hidrofobnih interakcija, koje su rezultat odbijajućih sila između
polarnog rastvarača i relativno nepolarne supstance koja se analizira i nepolarne stacionarne
faze. Na brzinu eluiranja utiče pH, zbog mogućnosti promjene polarnosti supstance. Zbog
toga se često u mobilnu fazu dodaju puferi. Kolone za RP-HPLC ne bi trebalo koristiti sa
jakim bazama, zbog mogućnosti razgradnje silikatnih čestica.
Detektor ima važnu ulogu da detektuje komponente koje izlaze iz kolone nakon eluiranja.
Detektor generiše električni signal koji je proporcionalan intenzitetu neke osobine mobilne
faze ili supstance koja se eluira. Tipovi detektora u HPLC-u su:

 UV-VIS detektor
 Fluorescentni detektor
 Elektrohemijski detektor
 Detektor indeksa loma
 Maseni spektrometar (MS)

Hromatografija u koloni zasniva se na procesima adsorpcije rastvorene supstancije na

granici faza čvrsto/tečno. Kao stacionarna faza koriste se čvrste supstancije, koje
predstavljaju dobar adsorbens za komponente analizirane smeše. Najčešće se koriste
aluminijum-oksid, silikagel, magnezijum-silikat, magnezijum-oksid, a rjeđe aktivni ugalj.
Dobrim adsorbensima smatraju se supstancije koje su porozne, što znači da imaju veliku
aktivnu površinu. Mehanizam adsorpcije se zasniva na fizičkim i hemijskim vezama između
adsorbensa i adsorbata. Prema na~inu razdvajanja komponenti iz sme{e razlikuju se slede}e
metode:

- Frontalna analiza se sastoji u kontinualnom dodavanju ispitivanog rastvora u

adsorpcionu kolonu. Najslabije adsorbovane supstance kretaće se kroz kolonu brzo i pojaviće
se prve u efluentu (uzorak sakupljen eluiranjem), a zatim ostale. Samo vodeća zona sadrži
jedan deo čiste supstance, dok ostale zone idući naviše kroz kolonu sadrže pored date
supstance i druge adsorbovane supstance. Ovom metodom može da se odredi samo broj
komponenata u nekoj smeši ali ne i da se izvrši njihovo razdvajanje.
Analiza istiskivanjem sastoji se u tome što se samo mala zapremina rastvora
supstanci uvodi sa vrha kolone. Hromatogram se razvija propuštanjem kroz kolonu ili
rastvarača ill rastvorene supstance koja ima veći afinitet prema adsorbensu od bilo koje
komponente ispitivane smesš. Rastvarač istiskuje sve adsorbovane supstance koje dalje
istiskuju jedna drugu. Komponente neke smeše mogu da se izdvoje u čistom obliku ali ne i
kvantitativno.
Eluentna analiza se najviše primenjuje u gasnoj hromatografiji. Pri ovoj metodi
rastvorene supstance se adsorbuju iz male zapremine rastvora na vrhu kolone, a zatim se
ispiraju čistim rastvaračem ili gasom nosiocem u gasnoj hromatografiji. Svaka komponenta se
kreće duž kolone različitom brzinom što zavisi od njenog adsorpcionog afiniteta. Ovom
metodom mogu da se rastave čak i vrlo složene smeše različitih supstanci.

5. FISH?

objedinjuje citogenetičke i molekularno genetičke tehnike. Princip: interakcija obilježene

DNA ili RNA probe s komplementarnom jednolančanom (ciljnom) DNA sekvencom. Ciljna
DNA : metafazni kromosomi ili interfazna jezgra. Svrha in situ hibridizacije jeste
identifikacija numeri čkih i strukturnih aberacija kromosoma. Koristi se u područjima: klini
čka citogenetika, citogenetika tumora (mikrodelecije i mikroduplikacije), mapiranje gena i
evolucija kariotipa. DNA probe mogu biti za cijeli kromosom ili krak kromosoma (whole
chromosomal paint probes -WCP) , centromere (centromere specific probes) visoko
repetitivna DNA, npr. Alfa satelitne probe, mala podru čja eukromatina (single copy ili
unique sequence probes) detekcija mikrodelecijskih sindroma, telomerne (subtelomerne )
probe: detekcija skriveneih delecija i translokacija telomera (subtelomerne probe). Vrlo je
pouzdana, informativna, brza tehnika, a izvodimo je na predmetnom staklu gdje se nalazi
preparat tkiva. Tkivo na preparatu se priprema sa ciljem da se omogući hibridizacija
obilježene sonde (fluorescentno)-zato je i nazivamo fluorescentna, in situ-na određenom
mjestu tkiva preparata. Kod DNA čipova sonda je u epruveticama i za njih se vezuje mRNA
ili genomska DNA, a kod FISH-a sondu vezujemo za hromosome ćelije na slajdu
(predmetnom staklu). Ova metoda je vrlo popularna u citogenetici, jer njome možemo da
detektujemo ogroman broj alteracija u genomu. Jako je važno da mutacije možemo
detektovati u populaciji posmatranih ćelija istovremeno, što pomaže kod diferencijacije
bolesti. Promjene možemo detektovati kako kod interfaznih, tako i kod metafaznih ćelija.
Masovnije se koriste metafazne ćelije. Ova metoda se počela razvijati početkom 80-tih godina
prošlog stoljeća. Sondu možemo obilježavati fluorohromom direktno ili indirektno. Indirektno
je vezivanjem fluorescentno obilježenih antitijela za dvostruku DNA molekulu (hibrid).

1. Fiksacija

2. Denaturacija i hibridizacija

3. ispiranje

4. Detekcija

PRIMJENA FISH-a

1. LOKUS SPECIFIČNI FISH - primjenjuje se kod određivanja broja kopija određene

sekvence; za određivanje genskih rearanžmana ili translokacija; možemo ga
primijeniti na interfaznim ili metafaznim ćelijama tkiva ili ćelija u suspenziji.
2. FISH SPECIFIČAN ZA CENTROMERE – uglavnom se koristi za detekciju broja
kopija određene sekvence interfaznih ili metafaznih ćelija.
3. MULTIKOLORNI FISH – koristi se u prethodno navedenim putevima, kao i u
detekciji unutarhromosomskih rearanžmana. Za ovu vrstu FISH-a koristimo samo
metafazne hromosome.
4. GENOMSKO-KOMPARATIVNI FISH – koristi se za komparativno proučavanje
sekvenci; broj kopija određenih sekvenci, rearanžmana i translokacija.
5. TELOMERNI FISH – koristi se za određivanje dužine telomera, tj. statusa njihovog
skraćivanja ili produžavanja. U ovom slučaju koristimo interfazne ili metafazne ćelije
pojedinačnih ćelija ili ćelija u tkivu.

DNA sonde koje koristimo za FISH su između 200 i 500 bp. FISH možemo primjenjivati i
kod parafiniziranog tkiva i tkiva koje čuvamo u formalinu. Rezultate hibridizacije detektiramo
uz pomoć fluorescentnog mikroskopa, čija svjetlost cijepa fluorescentnu boju, a ona otpušta
određenu svjetlost (nijansu) koju na mikroskopu vidimo kao npr. zelene ili crvene tačke. FISH
se može koristiti i kod mapiranja gena organizma. Na ovaj način se kod pacijentica sa
kancerom dojke dijagnosticiraju HER2 mutacije, čije pacijentice dobro reaguju na herceptin,
lijek koji ih dovodi do ozdravljenja. Samo određeni broj pacijentica sa kancerom dojke imaju
tu navedenu mutaciju, ostale imaju neki drugi tip mutacija i terapija je drugačija i neizvjesna.

6. Masena spektrometrija?

Predstavlja vrlo popularnu metodu za identifikaciju i karakterizaciju proteina. Moguće je

izmjeriti masu proteina iznad 100 kDa sa velikom preciznošću od nekoliko daltona, a masu
peptida sa preciznošću od nekoliko mili daltona. Moguće je izmjeriti masu molekule prisutne
u femto molnoj količini (10-15) pa je zato pogodna za analizu molekula u tragovima. Masena
spektrometrija se zasniva na karakteristikama analizirane molekule kao što su naboj i masa.
Separacija molekula tokom kretanja kroz električno i magnetno polje vrši se također na
osnovu njihovog naboja i mase. Analizirane molekule se moraju jonizirati da bi putovale kroz
navedena polja. Jonizacija se radi uklanjanjem 1 ili više elektrona iz analizirane molekule ili
dodavanjem 1 ili više katjona (protona) analiziranoj molekuli. Analiziranu molekulu moramo
dovesti u gasnu fazu, jonizirati je i pomoću masenog spektrometra odrediti odnos mase i
električnog naboja analita (m/z). Prije određivanja mase nekog proteina izolovanog iz
biološkog uzorka, moramo izvršiti njegovu fragmentaciju, pa onda jonizaciju i dovođenje
peptidnih fragmenata u gasnu fazu. Većina bioloških uzoraka je mješavina brojnih
komponenti pa je njihov m/z spektar vrlo kompleksan. Čak i kad imamo ekstrahiran čist
protein, imaćemo različit m/z spektar njegovih peptidnih fragmenata, a što ćemo na display-u
vidjeti kao niz različitih pikova koji predstavljaju različite m/z vrijednosti digestiranih
fragmenata proteina. Masa molekule proteina (peptida) se izražava u Da, a 1 Da
predstavlja 1/12 mase C12 atoma. Nominalnu (brojnu) vrijednost mase molekule softver računa
integriranjem mase 5 biogenih elemenata (H=1,007825; C12=12,00; N14=14,003074;
O16=16,00; S). Spektrometrija se koristi za:

 određivanje sastava nepoznatog uzorka (kvalitativna analiza)

 određivanje izotopskog sastava uzorka
 određivanje strukture molekula promatrajući fragmentaciju molekula
 određivanje molarne mase molekule
 određivanje količine određene tvari u uzorku (kvantitativna analiza)
 određivanje fiizikalnih i kemijskih svojstava tvari
 proučavanje ponašanja iona u vakuumu

7. Sekvenciranje proteina (Edmanova reakcija)?

Sekvenciranje peptida i proteina, tj. određivanje njihove primarne strukture (njihovog slijeda
aminokiselina) je jedno od glavnih uloga masene spektrometrije. Određivanje primarne
strukture proteina može se izvršiti metodama kao što je i Edmanova degradacija, a može biti
pročitana direktno sa gena koristeći genetički kod. Edmanova degradacija je važna reakcija
proteinskog sekvenciranja, pošto dopušta otkrivanje redoslijeda amk u proteinu (primarna
struktura). Automatizirani Edman sekvenceri sada su u širokoj upotrebi i sposobni su za
sekvenciranje peptida dužine i do 50 aminokiselina. Šema reakcije sekvenciranja proteina
Edmanovom degradacijom:

1. Razbijanje disulfidnih mostova u proteinu reducirajućim agensom-2-merkaptoetanol.

Zaštitna grupa tipa jodoacetatne kiseline potrebna je da bi prevenirala veze od reformiranja;
2. Odvajanje i purifikacija individualnih lanaca proteinskog kompleksa, ukoliko ih ima
više od jednog.
3. Razbijanje svakog lanca u fragmente ispod dužine 50 amk.

4. Separacija i purifikacija fragmenata

5. determinacija aminokiselinske sekvence svakog fragmenta

6. ponavljanje sa drugačijim uzorkom cijepanja.

7. konstrukcija sekvence cjelokupnog proteina

Peptidi duži od 50-70 amk, ne mogu biti pouzdano sekvencirani Edmanovom degradacijom.
Zbog ovoga, ti lanci moraju biti razbijeni u manje fragmente, koji se zatim sekvenciraju
pojedinačno. Digestija se vrši ili endopeptidazama-tripsin/pepsin, ili hemijskim reagensima-
cijanogen bromid. Različiti enzimi daju različite uzorke cijepanja, a preklapanje između
fragmenata može biti korišteno za konstrukciju cjelokupne proteinske sekvence. Peptid koji
će se sekvencirati je adsorbovan na čvrstu površinu-jedan od najčešćih supstrata je stakleno
vlakno premazano polebrenom, kationskim polimerom. Fenil Edmanov reagens
(fenilizoticijanat, PITC) u slabo baznom rastvoru, reaguje sa slobodnim aminokiselinskim
ostatkom na N-kraju i nastaje feniltiokarbamil derivat (PTC-protein). Dodatkom
trifluroacetatne kiseline formira se tiazolinonski derivat koji se odvaja od peptidnog niza
(peptidni niz je sada kraći za jednu aminokiselinu). Kada se doda slaba kiselina ovaj derivat
postaje PTH (feniltiohidantoin) koji se identifikuje hromatografski. Za identifikaciju HPLC-
om, snimi se hromatogram svih standardnih aminokiselina sa kojima se porede aminokiseline
dobijene Edmanovom degradacijom. Pri Edmanovoj degradaciji C-terminalni kraj se obično
veže za nerastvoran nosač. Instrument koji se koristi je Edmanov sekvenator (engl. Edman
sequenator).
Edmanova degradacija nastavlja se od N kraja proteina, pa ne funkcioniše ako je hemijski
uklonjen N terminalni kraj. Zahtijeva i metodu separacije da se determinišu pozicije
disulfidnih mostova, što je jedno od ograničenja metode.

8. Posttranslacijske modifikacije?

Post-translacijske modifikacije (PTMs) proteina su hemijske modifikacije ili

cijepanje proteina nakon sinteze peptidnih lanaca. Proteinski polipeptidni lanci se
mogu izmijenjiti proteolitičkim cijepanjem, formiranjem disulfidnih veza ili
kovalentnim vezivanjem fosfata, sulfata, alkil skupine, lipida, ugljikohidrata,
polipeptida itd. Većina proteina prolazi PTM, na primjer, oko 30% svih proteina
pronađenih u stanicama sisara postoje u phosforiliranoj fazi, i gotovo svi proteini
plazme su glikozilirani.
PTM može uticati na naboj, hidrofobnost, prostorni izgled, imunološka
svojstva, stabilnost, transport, lokalizaciju, aktivnosti proteina i
biološku funkciju. Mnogi su proteini pod utjecajem njihovih PTMa. Specifični
ugljikohidrati koj su uključeni u l-selectin-posredovano navođenje i aktiviranje
limfocita uključuju se i isključuju reverzibilnim i kaskadnim dodavanjem i
uklanjanjem fosfata i ubikvitina. PTMa ubikvitinom igra važnu ulogu u
intracelularnoj degradaciji proteina . Osnovne strategije za detekciju i analizu
PTMa obično obuhvataju:
(i) selektivno prečišćavanje proteina koji su obuhvaćeni specifičnim PTMa,
(ii) prefracioniranje (razdvajanje frakcija) proteina prije analize sa 2D
kromatografijom ,
(iii) analiza spektra masa nakon cijepanja proteazama
 (iv) hemijsko ili enzimsko oslobađanje proteina sa nosača (gela, nitroceluloze itd.) radi
naknadne analize odgovarajućih izmjena.
U principu, PTMe proteina mogu biti klasificirane prema vrsti hemijske promjene ili
vrsti ciljane amino kiseline. Oni se mogu podijeliti na reverzibilne ili ireverzibilne
reakcija, enzimatske ili neenzimatske reakcija, u odnosu na subcelularnu lokaciju ili
funkcionalni aspekti modifikacije.
2.1. Proteolitičko cijepanje
Masa različitih proteina nastaje zbog različitog proteolitičkog posttranslacijskog cijepanja
peptida, npr. N-terminal signalni peptid se cijepa tokom aktivacije zimogena, inaktivacija
enzima ili proteolitička degradacija proteina. Ove promjene se mogu detektirati sa 1- ili 2D-
GE, ili masenom spektrometrijom (MS).

2.2. Disulfid Mostovi

Disulfidni mostovi nastaju oksidacijom sulfhidrilne (-SH) skupine aminokiseline cisteina u
proteinu. Oni igraju važnu ulogu u stabilizaciji 3-dimenzionalne strukture i modulaciji
bioaktivnosti cisteiniziranih proteina. Određivanje disulfidnih veza je sastavni dio strukturne
karakterizacije proteina

2.6. O-GlcNAc
O-vezana N-acetilglukozamidna (O-GlcNAc) glikolizacija proteinia javlja se kod nekoliko
staničnih funkcija kao što je transkripcija, translacija, nuklearni transport i ćelijska
signalizacija (65).

.4. Sulfation
Kovalentno dodavanje sulfata nastaje proteinskom sulfotransferazom. Dodavanje sulfata
na tirozin (O-sulfation) je jako česta PTM i događa se gotovo isključivo na sekretornim i
trans-membranskim proteinima. Smatra se da služiti kao ključni modulator protein-
protein interakcije kod raznih bioloških procesa, uključujući regulaciju hemostaze,
usmjeravanje leukocitne aktivnosti, modulacije proteolitičkih procesa i sekretornih
puteva
Fosforilacija
Reverzibilno pričvršćivanje fosfatne skupine na-serin, treonin-, ili tirozin
ostatake proteina putem enzima kinaza je jedana od najčešćih PTMa
koja određuje funkciju proteina. Fosforilacija igra važnu ulogu u
mnogim biološkim putevima i staničnim procesima, uključujući i pretvaranje signala,
regulaciju staničnog ciklusa ili stupnja aktivnosti enzima (26).

Glikozilacija
Glikozilacija označava kovalentno pričvršćivanje saharida na protein tokom pre i post-
translacijske unutar endoplazmatskog retikuluma (ER). Glykozilacija mogže uticati na
razne funkcije kao što su pravilano savijanje proteina, stabilnost, međućelijsku povezanost,
subcellularnu komunikaciju i tipiziranje, imunološki odgovor, maskiranje ćelija raka, na
ozljedu ćelije, na upalu, ili funkcioniraju kao selektivni ligand

2.9. Acetilacija i metilacija

Postranslacijska modifikacija proteina metiliranjem najčešće uključuje metil grupu na
nitrogen ( N-metilation) ili atom kiseonika (O-metilation) ili na nukleofilnoj strani lanca (84)
dodajući hidrofobnost što mijenja proteinski naboj. Acetilacija-acetil gr

Modifikacije masnih kiselina

Brojni eukariotski ili virusni proteini prolaze kovalentne modifikacije pričvršćivanjem
masnih kiselina koje pomažu pri isticanju proteina membrane.

. Ubikvitacija-ubikvitin na lizin
Kovalentno dodavanje protena ubikvitina (od 76-aminokiselina i 8kDa) na amino grupu
lizina celularnih proteina je česta PTMa. Poliubikvitacija na primjer dovodi do modifikacije
proteina preko ubikvitin-proteazom sistema, ali samostalno (mono) ubikvitacija predstavlja
odgovarajući alat za reguliranje staničnih procesA kao što su stanična dioba,
prenos signala, diferencijacija kao i kontrolu kvalitete (87). Nenormalana ubikvitacija je
povezana s nekim bolestima, uključujući neurodegenerativne poremećaje, patološke upalne
sisteme i pojedina maligna stanja.

9. Protein-protein interakcije?

Efikasna regulacija interakcije brojnih proteina dijelom se postiže posttranslacijskom

modifikacijom specifičnih proteinskih motiva kao što je fosforilacija proteina, čime se
stvaraju nova vezujuća mjesta za druge proteine. Na primjer, src homologna 2 (SH2) domena
prepoznaje proteinske motive koji su fosforilizirani na tirozinu. Proteini prepoznaju različite
motive proteina samo kada su fosforilizirani na serinu i treoninu (3). Strogo kontrolisani
mehanizmi protein-protein interakcija su okosnica različitih kaskadnih prenosa signala
kojima se kontrolišu vitalne stanične funkcije. Jedan primjer je mitogenom aktivirana
protein-kinaza koja je kaskadna i sastoji se od tri niza kinaze, RAF-MEK-ERK (4). Ovo
kinazna kaskada je izazvana različitim spoljašnim signalima i kontroliše brojne stanične
funkcije, uključujući staničnu proliferaciju i diferencijaciju.

Zbog njihove bitne uloge u staničnoj regulaciji, disregulacija protein-protein interakcije je

povezana sa velikim brojem ljudskih bolesti, uključujući rak, neurodegenerativne bolesti i
razne metaboličke bolesti. Dakle, identificiranje i proučavanje proteinskih kompleksa ili
njihove razgradnje je ključno za razumijevanje opštih mehanizama koji reguliraju normalan
rast i razvoj stanica, kao i za izmijenjene protein - protein interakcije u bolestima, a sa ciljem
otkrivanje lijeka (5). Istraživanja se fokusiraju na metode za otkrivanje i praćenje protein-
protein interakcije (6,7). To uključuje razne biohemijske tehnike za ispitivanje protein-
protein interakcije in vitro, zatim metode stanične biologije na temelju biosenzora za
praćenje protein-protein interakcije in vivo i neke snažne tehnologije za otkrivanje proteinskih
kompleksa u proteomskim Istraživanjima i stategijama za otkriće novih lijekova.

Neke od ovih metoda se često koriste u laboratorijima za proučavanje proteinskih interakcija

in vitro i
in vivo, neke od tih tehnika se koriste za izradu proteomiks studija i za brz skrining (praćenjr)
proteinskih interakcija.
Metode
Protein-protein interakcije se otkrivaju raznim tehnikama. Mnoge od ovih tehnika se oslanjaju
na hvatanje ciljnih proteina (mamac) u složenim kompleksu putem imobiliziranog
afinitetnog reagensa, kao što su antitijela. Neke od metoda se temelje na čvrstoj-fazi,
uključujući i ko-imunoprecipitaciju (co-IP) i ciljane afinitetne opadajuće eseje. Neke
prolazane protein-protein interakcije je teško uhvatiti. Upotreba hemikalija za unakrsno
vezivanje zajedno sa imunoprecipitacijom ili opadajućim esejima može biti korisno za
otkrivanje prolaznih protein-protein interakcija (8).

1. Afinitetna hromatografija na čvrstoj fazi

Da bismo otkrili određeni protein unutar stanice ili u rastvoru iz epruvete, reagens koji može
konkretno prepoznati protein od interesa sa visokim afinitetom je bitan. U visoko afinitetne
reagense spadaju antitijela koja su specifična za nativne proteine ili različite proteine koje smo
označili sa dobro definiranim epitopima. Korištenje antitijela za hvatanje proteina od
interesa i njima pridruženih proteina
partnera se široko primjenjuje za otkrivanje proteinskih interakcija, koje su nazvane
koimunoprecipitacijom (Co-IP, Fig. 30.1A). Ostali afinitetni reagensi se takođe koriste za
ovu svrhu. Vrlo popularne metode su upotreba glutation konjugirane smole za izolaciju
glutation S-transferaza (GST) označenih proteina i upotreba niklom nabijene smole za
izolaciju heksahistidin
(6 x His) označenih proteinskih kompleksa.

2. Metode nadopunjavanja proteinskim fragmentom

2.1. Dvo -hibridni sistemi
Modularna priroda proteina određuje projektiranje metode za otkrivanje protein-protein
interakcije. Na primjer, transkripcijski faktor Gal4 sadrži dvije funkcionalno i strukturno
odvojene domene, DNA- vezujuća domena (AD) i domenu za aktivaciju transkripcije (AP).
Ove dvije domene se mogu individualno (pojedinačno) spajiti (dodati) sa bilo koja dva
odvojena proteina. Ako ova dva modificirana proteina međusobno reaguju nastat će kompleks
koji ima DNA-vezujuću domenu i aktivirajuću domenu transkripcije. To će dovesti do
ekspresije gena reportera - β-galaktozidaze (36).
Znači izražavanje gena reportera kao što je β-galaktozidaza zavisi od interakcije obije Gal4
domene AD i AP koje su odvojeno spojene sa dva različita proteina (Slika 30.3A). Ako ovi
proteini stupaju u međusobnu interakciju doći će do ekspresije β-galaktozidaze.

Kvaščev dvo-hibridni sistem kojim se prati interakcije proteina u stanicama kvasca je u

širokoj upotrebi (36). Brojni, kvaščevi dvo-hibridni sistemi su dostupni.

Postoje i drugi dvo-hibridni sistemi gdje je domaćin bakterija ili ćelija sisara.