Universidad Andrés Bello

Facultad de Ciencias de la Salud

Departamento de Ciencias Biológicas
Laboratorio de Biología Celular BIO 035

TRABAJO PRÁCTICO N° 5
“ORGANIZACIÓN SUBCELULAR”

Alumno:
Sección:
700
Profesores:
Fecha:
 INTRODUCCIÓN

Las células son las unidades fundamentales de la vida y mediante la biología celular
podemos encontrar la respuesta a la pregunta de que es la vida y como funciona.

Las células eucariontes presentan diversos organelos, los cuales cumplen funciones
específicas dentro de ella. Los principales organelos son: Núcleo, que contiene toda la información
genética. La membrana plasmática, que envuelve a toda la célula con una bicapa de fosfolípidos,
en los cuales se encuentras proteínas, para la comunicación celular, Mitocondrias, las cuales
realizan la síntesis de ATP y llevan a cabo la respiración celular. Retículo endoplásmico rugoso, el
cual presenta ribosomas en su estructura, donde las proteínas, terminan su proceso de traducción y
el retículo endoplásmico liso, en el cual se realiza la síntesis de lípidos. Aparato de Golgi, en el
cual las proteínas terminan su maduración, siendo modificadas en el A. de Golgi, y son exportadas
a los lugares en donde deben realizar su función. Lisosomas, que mantienen aislados componentes
tóxicos para las células. Los peroxisomas, en el cual se produce el peróxido de hidrogeno durante
la oxidación de moléculas, los peroxisomas mantienen aislado esta molécula, que es toxica para la
célula. Y el citoesqueleto, que le da la forma a la célula, además de ser el sostén que posee la
célula.1

Todos estos componentes pueden ser separados mediante el proceso de fraccionamiento

subcelular, que posee dos etapas: Homogenización y Centrifugación.

La homogenización corresponde a utilizando un homogeneizador, se rompen las células,

siendo filtrado, obteniendo un Homogenizado crudo (HC). Este HC debe permanecer a baja
temperatura, y en un ambiente similar al de la célula, luego es sometido a diversas centrifugaciones,
a distintas velocidades, que hacen sedimentar los componentes más pesados al fondo de un tubo de
ensayo, separando los distintos organelos de esta forma, obteniendo un pellet, que es el sedimento,
y el sobrenadante que se vuelve a someter a centrifugación.2

OBJETIVOS

 Conocer las técnicas de homogenización en un fraccionamiento subcelular.

 Comprender el proceso de centrifugación en el fraccionamiento subcelular.
 Visualizar mediante microscopia los componentes de una de las fracciones.
 MATERIALES Y MÉTODOS

ACTIVIDAD N°1: Fraccionamiento subcelular de Hígado.

1. Preparación y fraccionamiento de la muestra. La muestra se lava con suero fisiológico (eliminar el
rastro de sangre) luego se filtra a través de gasa en un embudo de vidrio y toma el nombre
de homogenizado crudo (HC), la cual fue dada por los profesores ya homogenizada.

2. Se guarda 1 ml en un tubo Eppendorf para posterior análisis y se deja en hielo.

3. Se toman con pipeta 5 ml del homogenizado crudo y se traspasan aun tubo Falcón previamente rotulado y
se deja en hielo.

4. Se toma 1 ml del estrato crudo en un tubo Eppendorf y se procede a la primera centrifugación de baja
intensidad a 2500 RPM (revoluciones por minuto) por 6 minutos. Se obtiene un pellet 1 (P1) y un
sobrenadante 1 (SN1).

5. Se toma el sobrenadante (SN1) y se vierte en otro tubo Eppendorf y se vuelve a centrifugar.

6. Luego al pellet 1 (P1) se le agregan 5 ml de buffer IBC y una vez resuspendido se deja en
hielo.

7. Procedemos por la segunda centrifugación a 10.000 RPM durante 10 minutos. Se obtiene pellet
2 (P2) y sobrenadante 2 (SN2). Las muestras deben mantener en hielo en todo momento.

8. Del pellet 1 (P1) resuspendido, se tomo 1 gota (gotario) y se dejó en un portaobjetos, para
luego añadirle 1 gota (gotario) de azul de tripan y un cubreobjetos para su posterior
observación en el microscopio (40X).

9. Se tomo el sobrenadante (SN2) y se vertió en un tubo Eppendorf y el pellet 2 (P2) se le agrega 1 ml de

buffer IBC y se deja resuspendido en hielo.

Fraccionamiento subcelular mediante marcadoresmoleculares: Para observar la reacción se

prepararon 4 tubos Eppendorf de la siguiente manera:
Nº Muestra Succinato Azul de Agua HC FN FMit.
0,1M Metileto Destilada
1 Blanco 1mL 1mL 1mL
2 Homogenizado 1mL 1mL 1mL 1mL
Crudo (HC)
3 Fracción Nuclear 1mL 1mL 1mL 1mL
(FN) (P1)
4 Fracción 1mL 1mL 1mL 1mL
Mitocondrial
(FMit) (P2)

Luego de añadir la fracción correspondiente en cada tubo, se agregaron 1 ml de vaselina y se

llevaron al baño termorregulador.
 RESULTADOS

Contenido de los pellet obtenidos tras cada centrifugación:

P1: Fracción nuclear

P2: Fracción mitocondrial

Observación Fracción Nuclear: (P1)

Muestra: Fresca
Objetivo: 40X
Tinción: Azul de tripan
Observación: Se distinguen esferas de color azul totalmente rotas que corresponden a los núcleos
de las células del hígado de pollo.
Fraccionamiento subcelular mediante marcadoresmoleculares:

Nº Muestra Succinato Azul de Agua HC FN FMit. Observaciones,

0,1M Metileto Destilada reacción (+) ó (-
)
1 Blanco 1mL 1mL 1mL (-) no hubo
reacción, color
azul intenso
2 Homogenizado 1mL 1mL 1mL 1mL (-) no hubo
Crudo (HC) reacción
3 Fracción Nuclear 1mL 1mL 1mL 1mL (-) no hubo
(FN) reacción
4 Fracción 1mL 1mL 1mL 1mL (-) no hubo
Mitocondrial reacción
(FMit)

 DISCUSIÓN

En la observación microscópica de las fracciones del fraccionamiento celular, se sacó una

gota suspendida de Pellet 1 (P1) y se le agregó una gota de azul de tripan, se observó en el
microscopio usando para ello el objetivo 40X. Se logró observar un fondo azul claro con puntos
pequeños de color azul intenso. Esto resultados se obtuvieron debido al azul de tripan, que se le
conoce como un colorante básico, que se une al ADN localizado dentro de los núcleos, y que los
colorantes básicos se unen a ella cuando se encuentra ionizada3. Sin embargo, no se pudieron
apreciar del todo bien, ya que al estar congelado la muestra los núcleos se rompieron.
Para poder evaluar el fraccionamiento subcelular mediante marcadores
moleculares, primero se colocaron en distintos tubos de Eppendorf muestras obtenidas, a través,
de una centrifugación diferencial, la cual separa la muestra dependiendo del tamaño de cada
componente celular del hígado de pollo, el cual fue tratado con el buffer IBC, para evitar que las
células se reventaran. Parte de este HC es guardado, y la otra parte centrifugada 2 veces a distintas
velocidades y distintos tiempos para obtener el fraccionamiento celular. Luego de este proceso las
muestras de 1ml que fueron guardadas para evaluar, que eran Homogeneizado crudo de hígado de
pollo (HC), Pellet 1 (P1), sobrenadante 1 (SN1), pellet2 (P2), sobrenadante 2 (SN2) y por último,
un control de agua oxigenada. A cada uno de esos tubos se les agregó la misma cantidad de 400 µl
de succinato 0,1M, 100µl de azul de metileno, 400µl de agua oxigenada y 100µl de vaselina, la
cual evita que la muestra sea afectada por el oxígeno que se encuentra en el ambiente. Todas las
muestras tenían un azul intenso debido al azul de metileno aplicado, luego fueron sometidas a
un baño termorregulador de 37ºC durante 10 minutos.
Se pudo observar, que después del proceso anterior las muestras Blanco, HC, P1 y P2 se
pudo observar que las muestras mantuvieron su color azul intenso. La separación de los distintos
componentes celulares se permiten diferencian por los distintos tipos de organelos, que contienen
distintas enzimas o moléculas que lo caracterizan ya que no se encuentran en las distintas
separaciones y que con colorantes básicos se pueden identificar. El azul de metileno, es uno de los
tipos de colorantes que sirven para definir qué tipo de componentes existen dentro de la muestra,
ya que, al estar en un estado oxidado tiene un color azul pero al ser reducido este se transforma a
un color incoloro, es decir, se destiñe. Además que al estar reducido, se puede fácilmente volver a
oxidar, debido al oxigeno que se encuentra en el aire, por eso se recomienda cubrirlo con algún
aceite mineral o vaselina liquida.4 Sin embargo, estos cambios no se observaron debido a que la
muestra se encontraba congelada modificando los resultados.
 CONCLUSIÓN

Se pudo concluir, que el fraccionamiento celular obtenido, a través, de los distintos pasos
como la homogeneización y la centrifugación del hígado de pollo fueron exitosos, ya que, se logró
poder seguir todos estos pasos para la obtención del fraccionamiento celular.
De una manera general, podemos constatar que finalizada la actividad práctica, se pudo
establecer un análisis a cerca del fraccionamiento subcelular, permitiéndonos distinguir e
identificar los componentes de una fracción subcelular y los organelos presentes en cada uno de
ellos siendo parte de los componentes celulares, los cuales cumplen importantes funciones para el
buen funcionamiento celular, obteniendo que el fraccionamiento subcelular es una técnica que nos
permite obtener diferenciadamente cada uno de los organelos celulares, los cuales poseen
diferentes componentes los que reaccionaran de distinta manera según sea su metabolismo
enzimático.

REFERENCIAS

1. Alberts, Bray, Hopkin, Johnson, Lewis, Raff,Roberts,Walter, Introducción a la

BiologíaCelular.(2011). Panamericana, 3ª edición. España. Pág 26-27

2. Lodish, Berk, Matsudaria, Káiser, Morigerarse, Scooter, Zipursky, Darnell,

BiologíaCelular y Molecular.(1986). Editorial Panamericana, 5ª Edición,United States of
America.Pág. 207

3. Ruiz, Lourdes y Martínez, Alberto. bioquímica experimental III. Departamento de

Biología Molecular.

4. http://es.scribd.com/doc/177564133/Bioquimica-Final#scribd