Identifikasi Mycobacterium tuberculosis

Tujuan Praktikum : 1. Melakukan isolasi Mycobacterium tuberrculosis dari sampel pemeriksaan

2. Mengidentifikasi spesies Mycobacterium tuberculosisdari sampel

pemeriksaan

Kompetensi Dasar : 1. Mahasiswa mampu melakukan pemeriksaan bakteriologi klinik

I. Teori Dasar
Bakteri Mycobacterium tuberculosis mempunyai ukuran 0,5-4 mikrometer x 0,3-0,6 mikrometer
dengan bentuk batang tipis, lurus atau agak bengkok, bergranular, tidak mempunyai selubung, tetapi
mempunyai lapisan luar tebal yang terdiri dari lipid (terutama asam mikolat). Bakteri ini mempunyai sifat
istimewa, yaitu dapat bertahan terhadap pencucian warna dengan asam dan alkohol, sehingga sering
disebut basil tahan asam (BTA), serta tahan terhadap zat kimia dan fisik.Bakteri tuberkulosis tahan dalam
keadaan kering dan dingin, bersifat dorman dan aerob (Widoyono, 2008: 15).Bakteri Mycobacterium
tuberculosis tidak dapat diklasifikasikan menjadi gram positif atau gram negatif (Jawetz, 2004:
24).Spesies ini adalah patogen manusia yang intrasel fakultatif dan menyebabkan tuberkulosis.
Standar emas (the gold standard) diagnosis tuberkulosis adalah kultur bakteri. Namun,
pemeriksaan kultur memerlukan waktu lebih lama (paling cepat sekitar 6 minggu) dan mahal. Untuk itu,
pemeriksaan spesimen dahak secara mikroskopis langsung menjadi pilihan, karena nilainya setara
dengan pemeriksaan dahak secara kultur atau biakan. Hasil pemeriksaan dahak yang bermutu
merupakan hal yang penting untuk menetapkan klasifikasi penderita, keputusan untuk memulai
pengobatan dan menyatakan kesembuhan penderita (Depkes RI, 2006).
Pemeriksaan dahak dilakukan selama dua hari berturut-turut, yaitu dahak sewaktu - pagi –
sewaktu(SPS).Hasil pemeriksaan dinyatakan positif apabila sedikitnya dua dari tiga perneriksaan
spesimen dahak (SPS) hasilnya positif (Depkes RI, 2002).Hasil dari pemeriksaan dahak inidipengaruhi oleh
beberapa faktor, yaitufaktor kualitas dahak, prasarana, saranapemeriksaan dan petugas.Kualitasdahak sangal
penting dalam diagnosis TBParu. Dahak harus memenuhi kriteriakental, berwarna kuning kehijauan dan
volumenya 3-5 ml (Prajoga dkk.,2004).

II. Alat dan Bahan:

Pewarnaan BTA:

1. dahak positif mukopurulen segar (1-2 ml)

2. Slide/ kaca sediaan
3. lidi/ ose untuk pembuatan sediaan dahak
4. rak pewarnaan
5. larutan carbol fuchsin
6. larutan etanol HCl 3% atau H2SO4 20-25 %
7. larutan methylene blue 0,3%
8. mikroskop
9. minyak imersi
 Identifikasi Mycobacterium tuberculosis
III. Tahapan Pemeriksaan :

1. Pengumpulan Dahak

Dibutuhkan tiga spesimen dahak untuk menegakkan diagnosis TB secara mikroskopis. Spesimen
dahak paling baik diambil pada pagi hari selama 3 hari berturut-turut (pagi-pagi-pagi), tetapi untuk
kenyamanan penderita pengumpulan dahak dilakukan : Sewaktu – Pagi – Sewaktu (SPS) dalam
jangka waktu 2 hari.
 Sewaktu hari -1 (dahak sewaktu pertama = A)
a. Kumpulkan dahak spesimen pertama pada saat pasien berkunjung ke UPK (Unit Pelayanan
Kesehatan)
b. Beri pot dahak pada saat pasien pulang untuk keperluan pengumpulan dahak pada hari
berikutnya.
 Pagi hari -2 (dahak pagi = B)
Pasien mengeluarkan dahak spesimen kedua pada pagi hari kedua setelah bangun tidur dan
membawa spesimen ke laboratorium.
 Sewaktu hari -2 (dahak sewaktu kedua = C)
Kumpulkan dahak spesimen ketiga di laboratorium pada saat pasien kembali ke laboratorium pada
hari kedua saat membawa dahak pagi (B).

A. Kualitas Dahak
Petugas laboratorium harus melakukan penilaian terhadap dahak pasien tanpa membuka tutup
melainkan dengan melihat melalui dinding pot yang transparan.Hal-hal yang perlu diamati adalah :
a. Vol 3,5 - 5 ml
b. Kekentalan : mukoid
c. Warna : Hijau kekuningan (purulen)
Bila ternyata air liur, petugas harus meminta pasien berdahak kembali, sebaiknya dengan
pendampingan.Pada saat mendampingi pasien berdahak, petugas harus berada di belakang pasien
dan hindari arah angin menuju petugas.

B. Tempat Pengumpulan dahak

Pengumpulan dahak dilakukan di ruang terbuka dan mendapat sinar matahari langsung atau di
ruangan dengan ventilasi yang baik, untuk mengurangi kemungkinan penularan akibat percikan dahak
yang infeksius.Jangan mengambil dahak di ruangan tertutup dengan ventilasi yang buruk, misalnya,
kamar kecil / toilet, ruang kerja (ruang pendaftaran, ruang pengumpulan sampel, laboratorium, dsb).
 Identifikasi Mycobacterium tuberculosis

C. Petunjuk Bagi pasien

Berikut adalah petunjuk yang harus Anda sampaikan kepada pasien tentang teknik pengeluaran
dahak:
a. Kumur dengan air sebelum mengeluarkan dahak
b. Bila memakai gigi palsu, lepaskan sebelum berkumur
c. Tarik nafas dalam 2 – 3 kali dan setiap kali hembuskan nafas dengan kuat
d. Letakkan pot yang sudah dibuka dekat dengan mulut dan keluarkan dahak ke dalam pot
e. Batukkan dengan keras dari dalam dada
f. Tutup pot dengan rapat dengan cara memutar tutupnya
g. Setelah mengeluarkan dahak, bersihkan mulut dengan tissue, kemudian buang tissue di tempat
sampah yang bertutup, kemudian cuci tangan
h. Bila perlu hal di atas dapat diulang sampai mendapatkan dahak yang berkualitas baik dan volume
yang cukup (3-5 ml)

Bila dahak sulit dikeluarkan, dapat dilakukan hal sebagai berikut:

a. Lakukan olah raga ringan kemudian menarik nafas dalam beberapa kali. Bila terasa akan batuk,
nafas ditahan selama mungkin lalu disuruh batuk.
b. Malam hari sebelum tidur, banyak minum air atau menelan 1 tablet gliseril guayakolat 200 mg.

2. Registrasi Spesimen

Setelah sampel dahak diperoleh, langkah selanjutnya adalah melakukan pemberian tdentitas pada
sampel dengan mengikuti ketentuan sebagai berikut:

Kode waktu pengambilan dahak :

 A,B,C : SPS dahak pasien pada pertama kali datang

 D,E: SP dahak pasien pada akhir fase intensif pengobatan
 Identifikasi Mycobacterium tuberculosis
 J,K : SP dahak pasien pada akhir pemberian obat sisipan
 F,G: SP dahak pasien pada akhir bulan ke lima masa pengobatan
 H,I : SP dahak pasien pada akhir masa pengobatan

3. Pembuatan Sediaan Dahak

a. Sebelum melaksanakan pembuatan sediaan dahak, terlebih dulu kaca sediaan yang diberi
identitas dengan menuliskan pada bagian frosted menggunakan pensil 2B sesuai dengan kode
register spesimen. Bila menggunakan kaca biasa, tulis dengan spidol permanen pada stiker yang
dilekatkan di balik.
b. Pilih dahak yang kental berwarna kuning kehijauan, ambil dengan lidi yang ujungnya berserabut
(rough end) kira-kira sebesar biji kacang hijau. Kemudian letakkan pada kaca objek yang sudah
disiapkan. Untuk mendapatkan ujung yang beserabut lidi dipipihkan.
c. Sebarkan diatas kaca sediaan dengan bentuk oval ukuran 2x3 kemudian ratakan dengan gerakan
spiral kecil-kecil. Jangan membuat gerakan spiral bila sediaan dahak sudah kering karena akan
menyebabkan aerosol.
d. Keringkan pada suhu kamar.
e. Setelah kering lakukan fiksasi denganpemanasan. Pastikan apusan menghadap ke atas,
Lewatkan 3 x melalui api dari lampu spiritus. Gunakan pinset atau penjepit kayu untuk memegang
kaca Pemanasan yang berlebihan akan merusak hasil.
f. Masukkan lidi bekas ke dalam wadah desinfektan
Sediaan dahak yang baik adalah:
 berasal dari dahak mukopurulen, bukan air liur.
 Berbentuk spiral-spiral kecil berulang (coil type), yang tersebar merata, ukuran 2 x 3 cm.
 Tidak terlalu tebal atau tipis.
Untuk menilai ketebalan sediaan sebelum dilakukan pewarnaan dapat dilakukan dengan meletakkan
sediaan yg kering 4-5 cm di atas kertas koran. Sediaan yang baik apabila kita masih dapat melihat
tulisan secara samar.

Cara penanganan dahak yang bercampur darah

 Dahak dengan darah sedikit: Pilih bagian dahak yang tidak mengandung darah, dan buat sediaan
seperti biasa
 Dahak dengan darah sedang Buat sediaan, kemudian fiksasi, genangi dengan air bersih/aquades lalu
digoyang-goyang sampai warna merah darah hilang. Lalu air dibuang dan bilas lagi dengan air
kemudian warnai dengan Ziehl-Neelsen.
 Identifikasi Mycobacterium tuberculosis
4. Pewarnaan Ziehl Neelsen
a. Letakkan sediaan dengan bagian apusan menghadap ke atas pada rak yang ditempatkan di atas
bak cuci atau baskom, antara satu sediaan dengan sediaan lainnya masing-masing berjarak
kurang lebih 1 jari.
b. Genangi seluruh permukaan sediaan dengan carbol fuchsin. Saring zat warna setiap kali akan
melakukan pewarnaan sediaan.
c. Panaskan sediaan dengan sulut api sampai keluar uap (jangan sampai mendidih), kemudian
dinginkan selama lima menit. Sulut api dibuat dari kawat baja yang ujungnya dililit kain kasa yang
diikat kawat halus celupkan kedalam spiritussebelum dinyalakan.
d. Buang Carbol Fuchsin perlahan-lahan satu per satu
e. Bilas dengan air mengalir mulai dari pangkal kaca sediaan.
f. Tuangkan asam alkohol 3% pada sediaan biarkan beberapa saat lalu bilas dengan air sampai
bersih, tidak tampak sisa zat warna merah. Bila masih tampak warna merah lakukan decolorisasi
beberapa kali.
g. Bilas dengan air mengalir.
h. Tuangkan 0.3% methylene blue hingga menutupi seluruh sediaan dan biarkan 10-20 detik.
i. Buang Metilen Blue satu per satu sediaan.
j. Bilas dengan air mengalir.
k. Keringkan sediaan pada rak pengering.

Pada sediaan yang baik tampak jelas kontras antara BTA dan warna latar, bersih dan tidak tampak
sisa zat warna.BTA akan tampak sebagai kuman berwarna merah baik sendiri maupun bergerombol.
BTA harus dibedakan dengan artefak yang mirip dengan BTA dan BTA lingkungan yang sering
mencemari air keran.
Pelaporan hasil pemeriksaan mikroskopis dengan mengacu kepada skala International
Union Against To Lung Disease (IUATLD)
 Negatif : tidak ditemukan BTA dalam 100 lapang pandang
 Scanty : ditemukan 1-9 BTA dalam 100 lapang pandang (tuliskan jml BTA yang ditemukan)
 1+ : ditemukan 10 – 99 BTA dlm 100 lapang pandang
 2+ : ditemukan 1 – 10 BTA setiap 1 lapang pandang (periksa minimal 50 lapang pandang)
 3+ : ditemukan ≥ 10 BTA dalam 1 lapang pandang (periksa minimal 20 lapang pandang)
 Identifikasi Mycobacterium tuberculosis
5. Penilaian Kualitas Sediaan yang Baik
Sediaan dahak yang baik adalah sediaan yang memenuhi 6 syarat kualitas sediaan yang baik yaitu
kualitas contoh uji, ukuran, ketebalan, kerataan, pewarnaan dan kebersihan.
 Lekosit PMN ≥ 25 per LP pada perbesaran 10 x 10
Kualitas contoh uji
 Makrofag pada perbesaran 10 x 100

Sediaan dahak yang baik berbentuk oval berukuran panjang 3

Kualitas ukuran
cm dan lebar 2 cm
 Penilaian ketebalan dapat dilakukan sebelum pewarnaan dan pada
saat pemeriksaan mikroskopis.
 Penilaian ketebalan sebelum pewarnaan dilakukan dengan
Kualitas ketebalan meletakkan sediaan sekitar 4cm di atas kertas bertulis.
 Penilaian ketebalan dapat juga dilakukan setelah sediaan dahak
diwarnai. Pada sediaan yang baik sel leukosit tidak tampak bertumpuk
(one layer cells)
Penilaian kerataan dilakukan secara makroskopis dan mikroskopis dengan
tidak tampak adanya daerah yang kosong. Sediaan yang baik pada setiap
Kualitas kerataan
lapang pandang akan terlihat apusan dahak yang tersebar rata secara
mikroskopis.

6. Uji Fungsi Pewarnaan Ziehl Neelsen

Uji ini diperlukan untuk memastikan reagen Ziehl Neelsen yang tersedia dapat mewarnai
M. tuberculosis dengan baik.Petugas harus membuat sediaan dahak kontrol yaitu beberapa sediaan
dahak dari dahak BTA negatif dan dahak BTA 1 + yang telah difiksasi. Ketika akan mempergunakan
reagen Ziehl Neelsen kemasan baru yang tidak diketahui masa kadaluarsanya maka dilakuakan
pewarnaan terhadap satu sediaan dahak BTA negatif dan satu sediaan dahak BTA 1+.
Petugas harus melihat hasil pewarnaan sediaan yang baik yaitu yang memberikan kontras warna
yang jelas dan khas pada warna latar, inti leukosit dan BTA.Hasil uji fungsi harus dicatat dalam buku
khusus yang menuliskan tanggal pelaksanaan uji fungsi, nomor batch botol reagen dan hasil
pewarnaan. Bila hasil pewarnaan dinilai baik maka reagen dapat dipakai sebaliknya bila memberikan
hasil pewarnaan yang tidak baik :
a) Endapan/ kristal metilen biru : reagen harus disaring langsung pada saat melakukan pewarnaan.
b) Decolorisasi yang tidak sempurna : mengganti larutan asam alkohol dengan larutan yang baik
Kumpulan sediaan dahak kontrol yang belum diwarnai harus disimpan dalam kotak khusus.
 Identifikasi Mycobacterium tuberculosis
7. Prosedur Pembiakan
Medium yang umumnya dipgunakan adalah:
a. medium cair: asam oleat albumin (dubos). Medium ini mengandung tween-80, bakteri akan
tumbuh merata pada seluruh medium. Umumnya pertumbuhan pada medium cair akan lebih
cepat
b. medium agar: Loweinstein-Jensen (LJ) atau LJ yang diasamkan hingga pH 6,4-6,8 pada suhu
kamar. Kelebihan medium ini adalah spesimen sputum tidak perlu dinetralkan dengan asam
setelah dihomogenisasi dengan NaOH.

Sebelum diinokulasikan pada medium, sputum dihomogenisasi terlebih dahulu menggunakan H2SO4
4% atau Na3PO4 10% atau NaOH 4%, atau asam oksalat 5%, atau Natrium Sitrat 5%. Berikut adalah
teknik homogenisasi yang diterapkan di Biofarma:
a. 1 ml sputum dimasukkan ke dalam tabung Mac Cartney yang berisi larutan NaOH 4% dengan
Brom thimol blue (1% dalam alcohol) sebagai indikator.
b. campuran dikocok selama 5 menit dalam mesin kocok dengan goncangan 210 per menit
c. campuran ditetesi H2SO4 10% hingga berwarna kuning kehijauan
d. campuran ditetesi kembali dengan NaOH 4% hingga warna menjadi hijau muda
e. campuran disentrifugasi pada 2500 rpm selama 20 menit
f. supernatant dibuang
g. endapan diinokulasikan ke dalam medium LJ dan diinkubasi pada suhu 370 C selama 40 hari.
h. biakan diamati setiap minggu. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya koloni seperti bunga kol
berwarna putih kekuningan dan kering (tipe human). Jika koloni yang tumbuh menunjukkan
bundar, mengilap, dan basah maka merupakan koloni tipe bovin.

8. Uji Biokimia
a. Tes neutral red
1) koloni dimasukkan ke dalam 5 ml methanol 50%
2) diinkubasi selama 1 jam pada suhu 370 C
3) buang cairan methanol, kemudian ditambahkan 5 ml methanol 50% yang baru
4) diinkubasi selama 1 jam pada suhu 370 C kemudian cairan methanol dibuang
5) ditambahkan 5 ml larutan buffer Na-barbital 1% dalam NaCl 5% dengan pH 7,2
6) ditambahkan 0,2 ml cairan merah netral 0,05% dalam aquades
7) diinkubasi pada suhu 370C selama 1 jam, setiap 15 menit dikocok
8) hasil positif apabila koloni menjadi berwarna merah muda sampai merah tua
 Identifikasi Mycobacterium tuberculosis

b. Niacin tes
1) Biakan yang berumur 2-3 inggu pada LJ ditetesi aquades (H2O) atau NaCl sebanyak 2 ml
2) diletakkan dalam keadaan miring di atas papan sampai biakan terendam cairan tersebut
0
selama 1 malam pada suhu 37 C
3) Cairan H2O atau NaCl dipisahkan ke dalam sebuah tabung, kemudian dibubuhkan larutan
chloromin-T 5%, ditambahkan lagi 1 ml KCN 1%
4) Hasil positif apabila cairan berubah menjadi berwarna kuning seperti warna asam pikrat

9. Katalase Tes
1) camputkan H2O2 30% dan tween 80 dimasukkan ke dalam biakan LJ hingga koloni tergenang
2) ditunggu selama 15 menit
3) hasil positif apabila timbul gelembng udara

10. Resistensi Tes

Antibiotik yang digunakan pada resitensi adalah streptomycin, INH, dan PAS. Uji resistensi dilakukan
dengan cara mencampur antibiotik ke dalam medium LJ kemudian diinokulasikan bakteri M.
tuberculosis. Konsentrasi streptomycin dan PAS yang dipakai pada uji resitensi adalah 50, 500, dan
5000 gamma/ml, sedangkan INH adalah 5, 50, dan 5 gamma/ml

Uji M. tuberculosis Saprofit

Neutral red + -
Niacin Tes + -
katalase Tes + +
Resistensi Tes
INH sensitif resisten
PAS sensitif resisten
Streptomycin sensitif resisten
 Identifikasi Mycobacterium tuberculosis
IV. Proses Identifikasi
Pengumpulan Dahak

Tanggal pengumpulan dahak : ………………………………………………………………………………………………….

Waktu pengumpulan dahak : …………………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………….
Deskrpsi dahak : …………………………………………………………………………………………………..
…………………………………………………………………………………………………..

Foto Spesimen:

Pembuatan Sediaan Dahak

Berikut adalah foto hasil pembuatan sediaan dahak:

 Identifikasi Mycobacterium tuberculosis
Pewarnaan Ziehl Neelsen

Berikut adalah foto hasil pewarnaan Ziehl Neelsen:

Hasil Pengamatan Mikroskopis

Jumlah sel bakteri yang telah diamati : ………………………………………………………………

Simpulan : ………………………………………………………………

Foto pengamatan mikroskopis:

 Identifikasi Mycobacterium tuberculosis
V. Analisa

…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………….
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………….
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………….
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
 Identifikasi Mycobacterium tuberculosis
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………….
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………….
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………….
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………….
 Identifikasi Mycobacterium tuberculosis

Bandung, …………………………………………
Nilai Dosen/ Pembimbing Praktikum Praktikan

……………………………………………………. …………………………………………………….