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EXPERIMENTONo.3

DETERMINACIÓN DE AMILASA SÉRICA

OBJETIVOS:
1. Comprobar la actividad catalítica de la amilasa en suero.
2. Aplicar la técnica de Caraway modificada en la cuantificación de amilasa
en suero.
3. Analizar la importancia de la determinación de enzimas en el diagnóstico
clínico.

INTRODUCCIÓN
Las enzimas son proteínas que actúan como catalizadores, compuestos que
incrementan la velocidad de las reacciones químicas. Los catalizadores
enzimáticos unen reactantes (sustratos), los convierten en productos y liberan
los productos. Aunque las enzimas pueden modificarse en el transcurso de esa
secuencia de reacciones, al final vuelven a su estado original. Además de
incrementar la velocidad de las reacciones, las enzimas proporcionan sistemas
para regular la velocidad de las reacciones de las rutas metabólicas en el
organismo.

Lugares de unión en las enzimas. Una enzima une los sustratos de la

reacción y los convierte en productos. Los sustratos se unen a los lugares de
unión del sustrato específico de la enzima mediante interacciones con los
residuos de los aminoácidos de la enzima. La geometría espacial necesaria
para todas las interacciones entre el sustrato y la enzima hace a cada enzima
selectiva para su sustrato y asegura que únicamente se forman productos
específicos.
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Centro activo catalítico. Los lugares de unión del sustrato se disponen

en el lugar activo catalítico de la enzima, la región de ésta en la que
transcurre la reacción. Dentro del centro catalítico de la enzima participan en
la catálisis grupos funcionales aportados por coenzimas, metales
fuertemente unidos y, naturalmente, residuos de aminoácidos.

Energía de activación y estado de transición. Los grupos funcionales

del centro activo de la enzima activan los sustratos y hacen descender la
energía necesaria para formar el estado intermedio de alta energía de la
reacción, conocido como complejo del estado de transición. Algunas de las
estrategias catalíticas que utilizan las enzimas, tales como la catálisis general
ácido-básica, la formación de intermediarios covalentes y la estabilización
del estado de transición, se ilustran con la quimotripsina.

Perfiles de pH y de temperatura. Las enzimas tienen un intervalo

funcional de pH, determinado por los pKa de los grupos funcionales del centro
activo y las interacciones requeridas por la estructura tridimensional. Los
incrementos de temperatura no desnaturalizantes aumentan la velocidad de la
reacción.

Inhibidores que se fundamentan en el mecanismo. La efectividad de

muchos fármacos y toxinas dependen de su capacidad para inhibir una
enzima. Los inhibidores más fuertes son los inhibidores
covalentes,compuestos que forman enlaces covalentes con un grupo reactivo
del centro activo, o análogos del estado de transición que mimetizan el
complejo del estado de transición.

Con el presente experimento se pretende familiarizar al estudiante con algunas

de laspropiedades de las enzimas utilizando para ello, una enzima muy
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importante en eldiagnóstico clínico como es la amilasa [(3. 2. 1.1) (Alfa 1,4 -

glucan– 4 – glucanohidrolasa)], la cual es una enzima digestiva producida y

secretada por las célulasexócrinas de los acinos pancreáticos y las glándulas
salivales. Se encuentran niveles elevados de ellaprincipalmente en la
pancreatitis y en la parotiditis, úlcera péptica perforada,
apendicitis,enfermedad de las vías biliares, insuficiencia renal, etc.

La acción de la secreción pancreática que desdobla al almidón, se debe a la

alfa 1,4 – amilasa pancreática. Su acción es igual a la de la amilasa secretada
por las glándulas salivales, hidrolizando el almidóny el glucógeno hasta
maltosa, maltotriosa y una mezcla deoligosacáridos ramificados,
noramificados y algo de glucosa. Cuando una de estas glándulas se inflama se
libera mayor cantidad de amilasa a la sangre y aparece elevado su nivel en el
análisis de la amilasa sérica.

La amilasa se encuentra en la saliva, porque es secretada por las glándulas

salivales; y enel intestino delgado adonde es secretada por el páncreas; ésta
como todas las enzimas,presenta su máxima actividad en su pH óptimo y
temperatura óptima.

Se utiliza para evaluar la función del páncreas, diagnosticar la presencia de

enfermedades del mismo y para controlar su evolución. También se utiliza
para evaluar enfermedades de la vesícula biliar (piedras o litiasis), parotiditis,
problemas intestinales, apendicitis, ulcera péptica perforada, insuficiencia
renal y otras enfermedades.
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Los niveles aumentados de amilasa en la sangre pueden indicar:

 Pancreatitis aguda
 Parotiditis
 Cólico de vesícula biliar
 Colecistitis
 Problemas de obstrucción de conductos biliares o pancreáticos
 Cáncer de páncreas, ovarios, pulmón.
 Obstrucción intestinal
 Apendicitis aguda
 Úlcera de estómago perforada
 Insuficiencia renal
 Embarazo ectópico con rotura de trompas

Los niveles disminuidos de amilasa en la sangre pueden indicar:

 Cáncer de páncreas
 Lesión pancreática
 Enfermedades renales
 Toxemia en el embarazo

Los polisacáridos de reserva más importante en la naturaleza son el

almidón de las células vegetales y el glucógeno de las células animales.
Ambos polisacáridos se encuentran en el interior de la célula formando
agregados o gránulos de gran tamaño. Las moléculas de almidón y glucógeno
están muy hidratadas porque tienen muchos grupos hidroxilos expuestos que
pueden formar enlaces de hidrógeno con el agua. La mayor parte de las células
vegetales tienen capacidad para sintetizar almidón, pero el almacenamiento de
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este compuesto es especialmente abundante en tubérculos (tallos

subterráneos), tales como la patata, y en semillas.

El almidón contiene dos tipos de polímero de glucosa, la amilosa y la

amilopectina. El primero consiste en cadenas largas y sin ramificar de
residuos de D-glucosa conectadas por enlaces glucosídicos (14). La
amilopectina posee una elevada masa molecular, pero a diferencia de la
amilosa, está altamente ramificada. Los enlaces glucosídicos que unen
residuos sucesivos de glucosa en las cadenas de amilopectina son del tipo
(14); en los puntos de ramificación presentes cada 24 a 30 residuos son
enlaces (16).

El glucógeno es el polisacárido de reserva más importante en las células

animales. Al igual que la amilopectina, el glucógeno es un polímero con
subunidades de glucosa unidas por enlaces glucosídicos (14) y con
ramificaciones del tipo (16), pero el glucógeno está más ramificado cada 8
a 12 residuos y es más compacto que el almidón. El glucógeno es
especialmente abundante en el hígado, donde puede llegar a representar el 7%
de su peso; también se encuentra en el músculo esquelético. Los gránulos de
glucógeno también contienen, íntimamente unidos, las enzimas responsables
de su síntesis y de degradación.

La amilasa que se utilizará en este experimento se obtendrá de una muestra de

sangre que la donarán los estudiantes a partir de la cual se extraerá el suero.
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En nuestro experimento el sustrato será el almidón soluble (amilosa pura), que

consta de cadenas de glucosa unidas por enlace glucosídico alfa 1,4.
El efecto de la amilasa sobre la digestión del almidón se determinará usando la
prueba del Yodo.

El almidón no hidrolizado da un color azul oscuro con el reactivo de Yodo,

pero a medida que se efectúa la digestión, el color azul se torna cada vez más
pálido hasta que finalmente el color que se obtiene es el del reactivo de yodo,
lo cual significa que el almidón ha sido hidrolizado completamente.

MUESTRA BIOLÓGICA
- Suero

REACTIVOS
- Sustrato reactivo de almidón pH 7.0
- Reactivo de yodo N/ 100 = Reactivo de I2 /IK = Reactivo de Lugol

MATERIAL
- 2 frascos volumétricos de 50 mL
- 1 aspirador de pipetas
- 1 pipeta serológica de 0. 1 mL ó 0.2 mL
- 2 pipetas serológicas de 5 mL
- 1 gotero

EQUIPO
- Centrifuga
- Baño de María
- Espectrofotómetro
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AMILASA EN SUERO
Técnica de Caraway Modificada

FUNDAMENTO
La hidrólisis del almidón es catalizada por la enzima amilasa. La actividad de
dichaenzima se determina por medio de la reacción del Yodo, el cual al
combinarse con elalmidón (sustrato) produce un color azul verdoso.

A medida que se efectúa la digestión, el color se torna cada vez más pálido. El
colorproducido por el sustrato después de incubar con suero produce una
intensidad de colorque se compara con un control. La disminución de color es
proporcional a la actividad dela amilasa presente en el suero.

PROCEDIMIENTO
1. Prepare dos frascos volumétricos de 50 mL y rotule adecuadamente
problema ycontrol.
2. Transfiera 5.0 mL de sustrato (almidón) a cada uno de los frascos
volumétricos
3. Incube el frasco "Problema" en un baño de María a 37°C por 5 minutos; el
control nonecesita incubación.
4. Coloque 0. 10 mL de suero en el frasco problema, mezcle bien por
rotación sobre la mesa y colóquelo de nuevoen el baño de María por 7½
minutos.

NOTA:Nunca se debe pipetear con la boca las muestras biológicas,

álcalis, ácidos fuertes o sustancias tóxicas; use siempre el aspirador de
pipetas.
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5. Después de 7½ minutos extraiga, el frasco "problema" del baño;

inmediatamenteadicione 5.0 mL, de reactivo de yodo N/100 en ambos
frascos y afore a 50 mL conagua destilada; los frascos volumétricos tienen
una marca en el cuello que indica el volumen exacto (anillo esmerilado o
de color); tápelo con su respectivo tapón y mezcle bien por inversión o
rotación.
6. Mida en un espectrofotómetro la absorbancia (A) del problema y del
control a una longitud de onda de660 nm. Llevar a cero con agua destilada
en cada caso.

CALCULOS:

Absorvancia de control – Absorvancia de Problema x 800 = Unidades de

Absorvancia de Control Amilasa/dL Suero

NOTA: Una Unidad de amilasa por este método es la cantidad de enzima que
cataliza lahidrólisis total de 10 mg de almidón en 30 minutos (A hidrólisis
total no se desarrollaningún color con el reactivo de Yodo).

Valores normales de amilasa en suero = 60 – 160 U/dL de suero

Notas:
1. Se puede usar tanto suero como plasma heparinizado. El anticoagulante
EDTA inhibela actividad de la amilasa por su acción quelante sobre los
iones calcio. El plasmacitratado u oxalatado, puede producir disminución
de la actividad hasta el 20%.
2. El ayuno no modifica la actividad de esta enzima.
3. Las concentraciones de la enzima no son afectadas por la dieta, ejercicio,
diuresis nipor las horas de sueño.
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4. La hemolisis no afecta su determinación.

5. La enzima es estable tanto en suero como en orina por un mínimo de una
semana a4ºC. Su estabilidad alcanza varias semanas.

PREGUNTAS:
1. ¿Observa alguna diferencia de color entre el frasco problema y el frasco
control,después de incubar 7½ minutos y mezclar?
2. Explique a que se debe la diferencia
3. ¿Cuál es la función del reactivo de Yodo N/100 en esta práctica?
4. Explique que representa para la amilasa [3.2.1.1]
5. ¿En qué patologías suele indicarse la determinación de amilasa sérica?
6. Si se utilizara plasma como muestra biológica, los anticoagulantes que
presentan interferencia en la determinación son