LAPORAN PRAKTIKUM BIOMOLEKUL

ISOLASI DNA PLASMID DAN KROMOSOM

Oleh:
Nama : Desi Agrifiani
NIM : 151810301052
Kelompok :9

LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS JEMBER
2017
 BAB 1. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nukleus
yang disebut sebagai DNA kromosomal. Selain DNA kromosomal, terdapat DNA
ekstrakromosomal diantaranya plasmid, mitokondria dan kloroplas. DNA
(Deoxyribose Nucleic Acid) merupakan suatu molekul utama yang dapat
mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam
setiap organisme. Makhluk hidup pasti mempunyai DNA yang berada pada setiap
selnya yang berfungsi sebagai pembawa informasi hereditas.
Bakteri yang digunakan dalam praktikum ini yaitu E. Coli. Bakteri ini
digunakan karena mudah didapatkan, menghasilkan keturunan yang banyak dalam
waktu yang singkat dan memiliki jumlah plasmid yang banyak. Teknik isolasi
yang digunakan pada praktikum ini yaitu teknik sentrifuge, dimana sampel DNA
dan kromosom disentrifuge beberapa kali dengan suhu rendah untuk memisahkan
sampel plasmid atau kromosom dengan supernathannya.
1.2 Rumusan Masalah
- Bagaimana cara mengisolasi DNA plasmid dan kromosom?
- Bagaimana cara memurnikan DNA dengan teknik elektroforesis?
1.3 Tujuan
- Mengetahui cara mengisolasi DNA plasmid dan kromosom
- Mengetauhi cara memurnikan DNA dengan menggunakan teknik
elektroforesis
1.4 Manfaat
- Mahasiswa dapat melakukan isolai DNA plasmid dan kromosom
- Mahasiswa dapat memisahkan dan memurnikan DNA dengan teknik
elektroforesis
 BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) merupakan suatu molekul utama (master

molekul) yang dapat mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses
metabolisme dalam setiap organisme (Corkill, 2008). Molekul DNA kemudian
terikat dan membentuk kromosom yang dapat ditemukan di nukleus, mitokondria
dan kloroplas. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida
rangkap yang tersusun heliks ganda (double helix), dimana basa nitrogen dan
kedua ”benang” polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap
melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang
lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk
hidup dan disebut sebagai ”cetak biru kehidupan” karena molekul ini berperan
penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein
dan proses metabolisme lain (Corkill, 2008).
DNA tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa
nitrogen, dan phospat. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida
rangkap yang tersusun heliks ganda, dimana basa nitrogen dan kedua benang
polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan
hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain
dihubungkan dengan ikatan fosfat. Ikatan-ikatan fosfat itu sangat kuat dan dikenal
sebagai ikatan ikatan ester kovalen, atau ikatan fosfodiester. Residu fosfat ( PO4-)
sepanjang rantai ini bersifat asam, sehingga diberi nama asamnukleat
(Goodenough. 1988).
DNA merupakan materi genetik yang terbentuk dari dua kelompok basa
berbeda yang mengandung nitrogen, yaitu purin dan pirimidin. Adenin dan guanin
merupakan dua purin yang paling banyak terdapat dalam DNA, dan pirimidin
yang umum terdiri dari sitosin dan timin. Purin dan pirimidin berisi beberapa
ikatan ganda yang berhubungan. Molekul-molekul yang berisi ikatan seperti ini
berpotensi hadir dalam sejumlah struktur kimia yang berbeda, karena atom
hidrogennya mempunyai kebebasan tertentu. Misalnya satu atom hidrogen dapat
berpindah dari suatu gugusan asam amino (-NH2), dengan meninggalkan gugusan
asam amino (-NH) dan muatan negatif netto yang diserap oleh sistem cincin
molekul yang berkonjugasi (Goodenough. 1988).
DNA berfungsi untuk menyimpan informasi genetik secara lengkap yang
diperlukan untuk mencirikan struktur semua protein dan RNA tiap-tiap spesies
organisme, untuk membuat program pada saat yang tepat dan menempatkan
biosintesis sel dan jaringan secara teratur, untuk menentukan aktivitas organisme
sepanjang siklus hidupnya, dan untuk menentukan kekhususan organisme tertentu.
DNA alami terdiri dari dua rantai anti parallel dalam suatu rangkaian heliks
ganda. Basa A-T dan G-T yang saling komplementer tersusun berpasangan
melalui ikatan hydrogen pada heliks (Lehninger, 1982).
Plasmid adalah DNA untai ganda yang berbentuk sirkuler yang berada
diluar DNA kromosomal bakteria. DNA ekstrakromosomal yang terjadi secara
alamiah pada bakteria, yeast, dan beberapa sel eukaryotik yang berada secara
simbiotik maupun parasitik pada sel inang. Berdasarkan fungsinya plasmid dapat
dikelompokkan menjadi:
1. Fertility- F plasmids.
Merupakan plasmid yang dapat ditransfer dari satu sel ke sel bakteri lain
untuk proses konjugasi. Plasmid ini juaga mempunyai kemampuan untuk
mentransfer DNA atau gen baik yang terdapat dalam plasmid ataupun dalam
kromosom. Plasmid ditemukan antara lain pada Eschericia coli, Pseudomonas,
dan Streptomyces.
2. Resistance- R plasmids.
Mengandung gen yang resisten terhadap antibiotik atau racun dan inhibitor
pertumbuhan lainnya. Plasmid R dapat ditemukan pada Staphylococcus.
3. Plasmid penyandi bacteriocins.
Bacteriocins adalah senyawa yang diproduksi oleh bakteri untuk menghambat
pertumbuhan atau bakteri lain yang spesises atau galurnya berbeda. Plasmid ini
mengandung gen struktural bacteriocins ataupun gen yang mengkode protein yang
berperan dalam pemrosesan dan transport bacteriocins. Penamaan plasmid ini
tergantung pada organisme yang memproduksinya. Misalnya plasmid Coli pada
bakteri Escherichia coli yang mengkode colicins.
4. Degradative plasmids.
Merupakan plasmid yang mampu mencerna substansi yang tidak biasa, contoh
toluen dan asam salisilat.
5. Virulence plasmids.
Merupakan plasmid yang menjadikan bakteri tersebut patogen (Calladine, 2004).
Berdasarkan jumlah plasmid di dalam sel dapat dibedakan menjadi:
1. Low copy number plasmid dimana dalam satu sel hanya mengandung satu atau
beberapa plasmid saja.
2. High copy number dimana dalam satu sel mengandung banayak plasmid hingga
ribuan. Contohnya bakteri E.coli.
Plasmid juga memiliki bentuk yang beragam, antara lain:
1. Supercoiled (covalently closed-circular).
DNA plasmid berbentuk sirkular dengan bentuk rantai yang terpilin.
2. Relaxed circular.
Kedua ujung DNA menyatu dan berbentuk sirkuler.
3. Supercoiled denature.
Kedua ujung DNA menyatu tapi pasangan basanya tidak sempurna.
4. Nicked open circular.
Rantai DNA yang terpotong pada salah satu sisi saja (Campbell, 2002).
Kromosom adalah suatu struktur makromolekul yang berisi DNA di mana
informasi genetik dalam sel disimpan. sekuens DNA yang terletak pada
kromosom disebut DNA Kromosomal. Kata kromosom berasal dari kata khroma
yang berarti warna dan soma yang berarti badan Kromosom terdiri atas dua
bagian, yaitu sentromer / kinekthor yang merupakan pusat kromosom berbentuk
bulat dan lengan kromosom yang mengandung kromonema & gen berjumlah dua
buah (sepasang)(Dolphin, 2008).
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Prinsip isolasi DNA
salah satunya yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk
memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang
mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul
ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader, 1993). Isolasi DNA
dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein,
lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni
penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti
selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Dolphin, 2008).
Sentrifugasi merupakan salah satu teknik yang penting dalam biokimia.
Teknik ini selain dapat digunakan untuk pemisahan material juga dapat digunakan
untuk mempelajari sifat-sifat fisik dari molekul. Sentrifugasi pada dasarnya
dilakukan dengan menempatkan partikel dan medium suspensinya dalam suatu
medan gaya sentrifugal. Teknik sentrifugasi dijalankan dengan menaruh partikel
dan medium suspensinya dalam suatu tabung yang ditempatkan pada ujung dari
alat yang berputar, yaitu rotor (Bloom, 2000).
Elektroforesis merupakan teknik pemisahan suatu molekul dalam suatu
campuran di bawah pengaruh medan listrik. Molekul terlarut dalam medan listrik
bergerak atau migrasi dengan kecepatan yang ditentukan aleh rasio muatan dan
massa. Contohnya jika dua molekul mempunyai massa dan bentuk yang sama,
molekul dengan muatan lebih besar akan bergerak lebih cepat ke elektroda.
Elektroforesis melalui gel agarose atau poliakrilamid merupakan metode standar
untuk pemisahan, identifikasi, dan pemurnian fragmen DNA (Sudjadi. 2008).
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul
bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik.
Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan
dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang
ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul
yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus
listrik dari suatu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya maka molekul
tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak
molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya serta
tergantung pula pada bentuk molekulnya. Ada dua jenis elektroforesis yaitu
sebagai berikut:
1. Elektroforesis kertas, yaitu jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas
sebagai fase diam dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak,
terutama ialah ion-ion kompleks. Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi
konsentrasi sepanjang sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas
tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang
digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorpsivitas
zat terlarut.
2. Elektroforesis gel, yaitu elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase
diam untuk memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan
dengan medium gel kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang
lebih besar seperti protein-protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang
dengan menjadikan agarosa dan poliakrilamida sebagai gel media.
(Maulana, 2010)
Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel
sehingga semua organel sel dapat keluar, sehingga didapatkan DNA kromosomal
serta DNA ekstrakromosmal (plasmid). Plasmid saja diperoleh dengan melakukan
pemurnian dari debris membran sel, organel sel, dan pengotor lainnya. Metode
yang dapat digunakan untuk isolasi plasmid antara lain yaitu boiling lysis, lysis
with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion (Lodish ,
2000). Manfaat dilakukannya isolasi DNA yaitu:
1. Mendapatkaan DNA murni yang akan digunakan pada laboratorium tertentu.
2. Peninjauan pola fragmen DNA melalui teknik hibridisasi southern.
3. Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik.
4. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA.
5. Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan dalam prosedur perbanyakan
DNA secara in vitro melalui teknik PCR.
(Maulana, 2010).
 BAB 3. METODOLOGI PERCOBAAN

3.1.1 Alat dan Bahan

3.1.1 Alat
 Mikro pipet
 Sentrifuge
 Freezer
 Shaker incubator
 Kertas label
 Tabung eppendorf
 Ice bath
3.1.2 Bahan
 Pelet lasmid
 Pelet Kromoson
 Etanol 70%
 Larutan I(Glukosa 50 mM, Tris-HCl 2,5 mM pH 8, Na2EDTA 10 Mm Ph
8)
 Larutan II (NaOH 0,2 M, SDS 1%, ddH2O)
 Larutan III (Kalium asetat 5 M, asam asetat glasial, ddH2O dingin)
 Fenol
 Kloroform
 Isoamil
 Lisozim
 Larutan STEP
 Agarosa
 Buffer TAE
 Bromofenol biru
 Etidium bromida (EtBr)
3.2 Skema Kerja
3.2.1 Isolasi plasmid pET30 dari E. coli BL21

Pelet Plasmid

 dimasukkan pada tabung eppendorf dan ditambahkan larutan I (glukosa

50 mM, Tris-HCl 2,5 mM pH 8, Na2EDTA 10 Mm Ph 8) 100 µL,
dihomogenkan dan didiamkan selama 5 menit
 ditambahkan 200 µL larutan II ( NaOH 0,2 M, SDS 1%, ddH2O, steril)
dihomogenkan dan didiamkan selam 15 menit
 ditambahkan 150 µL ( Kalium asetat 5 M, asam asetat glasial, ddH2O
dingin) dan diinkubasi selama 10 menit dalam ice bath
 disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 12000 rpm suhu 4℃
 dipindahkan supernatan secara perlahan menggunakan pipet ke dalam
tabung eppendorf baru
 ditambahkan larutan fenol: kloroform: isoamil alkohol (25: 24: 1) satu
kali volume total
 dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi 12000 rpm
selama 2 menit dan dihasilkan 3 lapis
 dipisahkan fase paling atas (fase cair) ke dalam tabung eppendorf yang
baru
 dipekatkan dengan cara ditambahkan larutan etanol absolut dingin 2
kali volume total
 diinkubasi dalam es selama 1 jam
 disentrifugasi campuran 12.000 rpm selama 5 menit
Hasil
 dicuci pellet dengan etanol dingin 70% dan disentrifugasi kembali
 dikeringkan tabung eppendorf dari etanol dengan dibalikkan selama 5
menit
 dilarutkan pellet dalam 30 100 µL ddH2O
3.2.2 Isolasi DNA kromosom isolat

Pelet Kromosom

 ditambahkan 250 µL buffer TE (50 Mm tris-HCl Ph 8 dan 50 Mm

EDTA)
 dibekukan pada suhu -20℃ selama 30 menit
 ditambahkan 200 µL larutan II ( NaOH 0,2 M, SDS 1%, ddH2O, steril)
dihomogenkan dan didiamkan selam 15 menit
 ditambahkan 250 µL lisozim 10 mg/mL ke dalam sel beku dan
dibiarkan mencair pada suhu kamar
 dimasukkan larutan sel yang telah mencair ke dalam penangas es
selama 45 menit
 ditambahkan larutan STEP (SDS 1%, Tris-HCl, EDTA Ph 8, proteinase
K) 50 µL ke dalam suspensi dan dicampur rata
 dipanaskan campuran dalam waterbath suhu 50℃ selama1 jam sambil
digoyang perlahan
 ditambahkan 300 µL larutan fenol jenuh lalu dikocok sampai terbentuk
emulsi
 disentrifugasi campuran pada kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit
sampai terpisah menjadi 2 fase (DNA yang diinginkan pada lapisan
atas)
 dipipet lapisan atas secara hati-hati dan dipindahkan dalam tabung
eppendorf steril
 ditambahkan larutan natrium asetat 0,3 M sebanyak 0,1 volume total
hasil pemipetan DNA dan dicampur perlahan
 ditambahkan etanol absolut dingin sebanyak 2 kali volume larutan dan
Hasildibolak-balik untuk pencampuran
 diinkubasi campuran pada suhu -20℃ selama semalam
 disentrifugasi campuran 12.000 rpm selama 5 menit
 dibuang supernatan dan dicuci pelet dengan 0,6 mL etanol 70%
 disentrifugasi kembali campuran 12.000 rpm selama 5 menit
 dilarutkan pelet dalam 30 100 µL ddH2O
3.2.3 Analisa pET-Endo menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa

Agarosa

 dilarutkan sebanyak 0,375 gram dalam larutan buffer TAE (Tris Acetat
EDTA) PH 8
 didinginkan agarosa sampai suhu 45℃ dan dituangkan ke dalam
cetakan kemudian dibiarkan hingga memadat
 dicampurkan sampel yang akan dielektrolisis buffer yang mengandung
bromofenol biru (BPB) 0,25 (b/v) dan sukrosa 40% (b/v)
 dilakukan elektroforesis dalam buffer TAE pada tegangan 75 volt
 dihentikan elektroforesis ketika bromofenol biru telah bermigrasi kira-
kira sampai 2/3 dari panjang sel
 direndam gel agarosa kemudian direndam dalam larutan etidium
bromida (EtBr) 250 µg/mL selama 30 menit
 direndam dalam buffer TAE selama 5-10 menit
 diamati hasil elektroforesis dengan sinar UV

Hasil
3.3 Prosedur Kerja
3.3.1 Isolasi plasmid pET30 dari E. coli BL21
Koloni tunggal transforman E. Coli diinokulasi ke dalam 5 ml media Luria
Bertani cair yang mengandung 2,5 µl kanamisin 100 mg/ml dan diinkubasi pada
shaker incubator pada 37 °C dengan kecepatan 150 rpm selama 18 jam. Setelah
18 jam, inokulum disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 10.000 rpm
pada suhu 4 °C. Pellet dilarutkan dalam larutan I (Glukosa 50 mM, Tris-HCl 2,5
mM pH 8, Na2EDTA 10 mM pH 8) 100 µL dan dihomogenkan lalu didiamkan 5
menit. Ditambahkan 200 µL larutan II (NaOH 0,2 M, SDS 1%, ddH2O steril) dan
dihomogenkan dengan cara membolak-balik tabung Eppendorf. Larutan
diinkubasi di es selama 15 menit, setelah 15 menit ditambahkan 150 µL larutan III
(Kalium asetat 5 M, asam asetat glasial, ddH2O dingin), diinkubasi dalam es
selama 10 menit. Campuran tersebut disentrifugasi selama 5 menit dengan
kecepatan 12.000 rpm suhu 4 °C, supernatan yang diperoleh dipindahkan secara
perlahan dengan menggunakan pipet kedalam tabung Eppendorf baru yang steril
dan ditambahkan campuran fenol: kloroform: isoamil alkohol (25:24:1) 1 kali
volume total, dikocok sampai terbentuk emulsi kemudian disentrifugasi lagi
12.000 rpm 2 menit dan dihasilkan 3 lapis, fase paling atas adalah fase cair yang
dipindahkan dengan cara memipet secara hati-hati kedalam tabung Eppendrorf
baru yang steril, fase cair tersebut dipekatkan dengan menambahkan etanol
absolut dingin 2 kali volume total, dan diinkubasi dalam es selama 1 jam.
Campuran disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit, pellet dicuci dengan etanol
dingin 70% dan disentrifugasi lagi dan tabung Eppendorf dikeringkan dari etanol
dengan cara membalikkan tabung dan didiamkan 5 menit. Kemudian pellet
dilarutkan dalam 30 µL ddH2O (Sambrook dan Russel, 2001).
3.3.2 Analisa pET-Endo menggunakan Elektroforesis Gel Agarosa
Gel agarosa 1,5% dibuat dengan melarutkan 0,375 g agarosa dalam 25 ml
buffer TAE (Tris Acetat EDTA) pH 8. Agarosa yang sudah larut didinginkan
sampai kira-kira temperatur 45°C, selanjutnya gel dituangkan pada cetakan dan
dibiarkan memadat. Sampel yang akan dielektrolisis dicampur dengan buffer yang
mengandung bromofenol biru (BPB) 0,25 (b/v) dan sukrosa 40 % (b/v).
Elektrolisis dilakukan dalam buffer TAE pada tegangan 75 volt. Elektrolisis
dihentikan ketika bromofenol biru telah bermigrasi kira-kira 2/3 dari panjang gel.
Gel agarosa kemudian direndam dalam larutan Etidium Bromida (EtBr) 250
µg/mL selama 30 menit, selanjutnya direndam dalam buffer TAE selama 5-10
menit. Hasil elektroforesis dapat diamati dengan sinar UV (Sambrook dan Russel,
2001).
3.3.3 Isolasi DNA kromosom isolat
Koloni tunggal isolat diinokulasikan ke dalam 5 ml media cair dan
diinkubasi pada shaker incubator pada suhu 370C dengan kecepatan 150 rpm
selama 18 jam. Kemudian sebanyak 5 ml suspensi sel disentrifuge selama 2 menit
dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC. Setelah terpisah, supernatan
dibuang, kemudian pellet sel diresuspensi dengan 250 µl buffer TE (50 mM tris
HCl pH 8 dan 50 mM EDTA). Larutan tersebut dibekukan pada suhu -20oC
selama 30 menit. kemudian ditambahan 250 µL lisozim 10mg/ml ke dalam sel
beku dan dibiarkan mencair pada suhu kamar. Larutan sel yang sudah mencair
dimasukkan ke dalam penangas es selama 45 menit. Lalu menambahkan larutan
STEP (SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8, proteinase K) sebanyak 50µL ke dalam
suspensi dan dicampur rata. Campuran ini selanjutnya dipanaskan dalam
waterbath pada suhu 50oC selama 1 jam sambil sesekali digoyang perlahan.
Kemudian ditambahkan 300µL larutan fenol jenuh ke dalam campuran lalu
dikocok sampai terbentuk emulsi. Campuran disentrifugasi pada kecepatan
12.000rpm selama 5 menit sampai terpisah dua lapisan. DNA yang diinginkan
berada pada lapisan atas. Lapisan atas dipipet secara hati-hati dan dipindahkan ke
dalam tabung eppendorf yang steril. Selanjutnya ditambahkan larutan natrium
asetat 0,3 M sebanyak 0,1 kali dari volume total hasil pemipetan DNA, lalu
dicampur perlahan. Kemudian ditambahkan etanol absolut dingin sebanyak 2 kali
volume larutan kemudian tabung dibolak-balik untuk pencampuran. Setelah itu,
campuran diinkubasi pada suhu -20oC selama 2 jam sampai semalam. Campuran
disentifugasi pada 12000 rpm selama 5 menit, kemudian supernatan dibuang dan
pellet dicuci dengan 0,6 ml etanol 70%. Sentrifuge kembali campuran pada 12000
rpm selama 5 menit. Pelet diambil kemudian ditambahkan 30 µL ddH20
 BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
4.1.1 Plasmid

No. Perlakuan Hasil

1. Penambahan larutan pada pellet Laruta berwarna keruh
2. Penambahan larutan II Larutan menjadi jernih
3. Pendinginan dalam ice bath Tidak berubah
4. Penambahan larutan III Larutan menjadi kental
dan terdapat lendir
seperti gel
5. Pendinginan selama 10 menit tetap
6. Disentrifugasi 12.000 rpm suhu 4℃ Terbentuk dua fase
7. Pemindahan supernatan Larutan bening
8. Penambahan (kloroform:isoamil:alkohol) Terbentuk dua fase
9. Sentrifugasi selam 2 menit Terbentuk tiga fase
10. Penambahan larutan etanol 70% (600 µL) pada Jernih (bening)
fase teratas
11. Sentrifugasi Terdapat endapan putih
(pellet)
12. Penambahan ddH2O 15 µL larut
13. Elektroforesis Terpisah

4.1.2 Kromosom
No. Perlakuan Hasil
1. Penambahan larutan TE pada pellet Laruta menjadi keruh
2. Pembekuan selama 30 menit Larutan kental
3. Penambahan larutan lizosim 250 µL Tidak berubah
4. Inkubasi 45℃ Tetap
5. Penambahan larutan STEP 50 µL Larutan mencair
6. Penambahan fenol Terbentuk dua fase
(bawah: keruh dan atas:
bening)
7. Sentrifugasi Mengental (bawah: keruh
dan atas: bening)
8. Pengambilan 500 µL fase atas Larutan bening
9. Penambahan natrium asetat 50 µL Larutan menjadi keruh
10. Penambahan larutan etanol 70% 1.000 µL Terdapat emulsi
melayang berwarna putih
11. Inkubasi selama semalam Larutan bening dan
terdapat pellet dibawah
12. Pencucian dengan larutan etanol 70% dingin Pellet larut
13. Sentrifugasi Tidak terjadi perubahan
14. Penambahan ddH2O Pellet larut

4.2 Pembahasan
Praktikum kali ini membahas mengenai isolasi DNA plasmid dan
kromosom. DNA yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu pET30 dari E.
coli BL21, sedangkan kromosom sampelnya diambil dari isolatnya. Teknik
isolasi yang digunakan pada praktikum ini menggunakan teknik sentrifuge dan
elektroforesis untuk memurnikan DNA. Isolasi dilakukan untuk memperoleh
DNA dalam bentuk murni dan terpisah dari komponen komponen sel lainnya
berdasarkan berat molekulnya. Teknik sentrifugasi yang digunakan untuk isolasi
DNA ini mempunyai prinsip utama, yaitu memisahkan substansi berdasarkan
berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi
yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan
terletak di atas. Sentrifugasi ini dilakukan dengan menggunakan alat rotor yang
digerakan oleh motor elektrik yang merupakan tempat berpegangnya tabung yang
akan disentrifugasi. Hasil sentrifugasi ini akan menghasilkan dua fase, dimana
fase atas merupakan supernathan dan fase bawah adalah pellet.
 Proses isolasi pertama yang dilakukan yaitu isolasi DNA kromosom.
Sampel kromosom yang telah di dapatkan awalnya disentik dari luar tabung agar
tidak menempel pada tabung. Sampel kromosom ini kemudian diresuspensi
dengan 250 µl buffer TE, yang terdiri dari 50 mM tris HCl pH 8 dan 50 mM
EDTA. Larutan ini juga biasa disebut sebagai larutan lisis. TE buffer ini berfungsi
untuk menstabilkan DNA atau RNA karena pH nya dijaga sekitar 8. DNA dan
RNA memiliki sifat asam lemah (DNA = asam deoksiribonukleat, RNA = asam
ribonukleat), yang dalam waktu lama dapat menyebabkan degradasi DNA/RNA,
sehingga digunakan TE Buffer ini. Buffer TE juga berfungsi untuk melarutkan
DNA agar tidak mudah rusak, kemudian disimpan pada suhu -20°C selama 30
menit. Penambahan buffer TE ini menyebabkan larutan keruh. Perlakuan
selanjutnya yaitu pemberian 250 µL lisozim 10mg/ml ke dalam sel beku dan
dibiarkan mencair pada suhu kamar. Pemberian lisozim berfungsi untuk merusak
dinding sel bakteri secara enzimatis, sedangkan inkubasi dan pengaturan suhu
bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim lisozim. Penamahan lisozim ini
menyebabkan larutan keruh karena rusaknya dinding sel bakteri.
Tahapan selanjutnya yaitu lisis sel dilakukan dengan menambahkan NaCl,
EDTA dan SDS serta proteinase-K. Penambahan NaCl ini yaitu untuk
menghilangkan polisakarida yang mungkin terdapat pada sel bakteri. EDTA
berfungsi untuk mencegah koagulasi DNA dan menjaga struktur DNA sehingga
tidak rusak. Proteinase-K berfungsi untuk mendenaturasikan protein secara
enzimatis, sehingga protein terpresipitasi. SDS merupakan salah satu jenis
deterjen yang dapat mengikat atau menyelimuti protein membran sehingga
terpisah dari bilayer lipid. Deterjen memiliki kemampuan melarutkan lipid
sebagai komponen membran sel, karena memiliki sifat amfipatik (Lubis, 2013).
Tahap selanjutnya yaitu penambahan 300µL larutan fenol jenuh ke dalam
campuran lalu dikocok sampai terbentuk emulsi. Penambahan larutan fenol ini
dinamakan sebagai tahapan pemurnian karena fenol dapat mendenaturasi protein
dan melarutkan lipid. Penambahan fenol menyebabkan terbentuknya dua fase,
dimana pada bagian bawah keruh dan bagian atas terlihat bening. Larutan ini
kemudian disentrifus pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit. Sentrifugasi ini
menyebabkan terbentuk 3 fase, dimana bagian atas yang berwarna bening
merupakan DNA dan air, bagian tengah yang berwarna putih yaitu protein dan
sisa-sisa kontaminan atau sampah dari sel yang disebut juga zona interfase, dan
fase ketiga merupakan fenol seta senyawa-senyawa organik yang diikatnya
sehingga disebut juga fase organik.
DNA yang berada pada bagian atas yang berwarna bening ini kemudian
diambil dan dipisahkan ke tabung ependorf yang steril untuk ditambahkan natrium
asetat. Penambahan ini menyebabkan larutan yang awalnya bening berubah
menjadi keruh. Penambahan selanjutnya yaitu pemekatan dengan penambahan
etanol dingin sebanyak 2 kali volume larutan selama semalam. Penambahan
etanol ini bertujuan untuk mengikat strand DNA yang telah terkumpul.
Penambahan ini juga berfungsi untuk mempertifikasi DNA. Strand-strand DNA
yang terikat oleh etanol ini terlihat seperti benang putih halus dalam larutan.
Pendiaman semalaman dilakukan untuk memadatkan benang-benang yang
diperoleh. Pencucian kemudian dilakukan menggunakan 0,6 ml etanol 70%
setelah didiamkan selama semalam. Pencucian dengan menggunakan etanol ini
menyebabkan pellet larut dan kembali dilakukn sentrifugasi pada 12000 rpm
selama 5 menit. Pelet diambil kemudian ditambahkan 30 µL ddH2O. Penambahan
30 µL ddH2O ini bertujuan untuk memurnikan sehingga dapat disimpan dalam
jangka waktu seminggu untuk dilakukan proses elektroforesis.
Isolasi selanjutnya yaitu isolasi DNA plasmid. Isolasi DNA plasmid ini
digunakan sampel DNA E.Coli. Perlakuan pertama kali untuk DNA plasmid ini
yaitu penambahan larutan I sebanyak 100 µL pada pellet sampel. Larutan I ini
terdiri dari glukosa 50 mM, Tris-HCl 2,5 mM pH 8, Na2EDTA 10 mM pH 8. dan
dihomogenkan lalu didiamkan 5 menit. Tahap ini merupakan tahap perusakan
dinding sel bakteri. Penambahan larutan I ini akan membuat berat molekul sel
menjadi lebih besar, sehingga ketika disentrifus nantinya akan mengendap sebagai
pellet. Na2EDTA berperan sebagai penghambat DNAse yang dapat mendenaturasi
DNA serta sebagai pengkhelat magnesium yang berperan dalam merusak
stabilitas membran plasma sehingga membran plasma menjadi tidak stabil. Tris-
HCl ditambahkan untuk menjaga pH larutan, sehingga pH DNA tetap terjaga.
 Tahap selanjutnya yaitu dengan penambahan larutan II sebanyak 200 µL
yang berisi NaOH 0,2 M, SDS 1% dan ddH2O steril kemudian dihomogenkan
dengan cara membolak-balik tabung Eppendorf. Larutan kemudian diinkubasi di
es selama 15 menit. Penambahan larutan II berfungsi untuk melisiskan dinding sel
bakteri, dimana SDS berperan sebagai penghancur membran sel dan
mendenaturasi protein. NaOH berfungsi untuk mendenaturasi DNA genomik
(kromosomal) dan menghidrolisis RNA, sehingga bentuk dari DNA kromosomal
ini akan hilang dan kemungkinan besar diperoleh DNA plasmid.
Penambahan 150 µL larutan III (Kalium asetat 5 M, asam asetat glasial,
ddH2O dingin) kemudian dilakukan pada tahap selanjutnya. Kalium asetat yang
ditambahkan menyebabkan renaturasi plasmid dan single stranded DNA
mengendap karena ukuran molekul yang besar dan tidak dapat larut dalam larutan
dengan kadar garam tinggi serta pembentukan KDS yang tidak larut sehingga
SDS dapat dengan mudah terbuang. Penambahan juga berfungsi untuk
menetralkan pH sehingga DNA plasmid tidak rusak, kemudian diinkubasi dalam
es selama 10 menit. Larutan ini kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12000
rpm dengan suhu 4°C untuk memisahkan pellet dan supernathan. Metode
sentrifuge ini menyebabkan komponen dengan berat molekul yang lebih besar
mengendap sebagai pellet, sedangkan berat molekul yang lebih kecil akan berada
pada bagian atas yang disebut supernathan.
Supernathan yang dihasilkan kemudian dipisahkan dan dipindahkan dalam
tabung eppendorf yang baru dan ditambahkan larutan campuran fenol: kloroform:
isoamil alkohol (25:24:1) 1 kali volume total. Penambahan ini menyebabkan
terbentuknya dua fase yang kemudian disentrifugasi kembali pada 12000 rpm
selama 2 menit, sehingga dihasilkan tiga fase. Fase bagian atas yang berwarna
bening diambil untuk ditambahkan larutan etanol absolut dingin. Penambahan
etanol absolut dingin ini berfungsi untuk mengendapkan plasmid karena adanya
perbedaan polaritas. Etanol yang digunakan suhunya harus lebih dingin dibanding
plasmid agar lebih banyak DNA plasmid yang mengendap. Prinsip pengendapan
dengan menggunakan ethanol absolut dingin yaitu ketika penambahan garam Sod
Asetat yang berfungsi sebagai neutralize charge pada gula fosfat DNA, maka ion-
ion seperti kation Na+ akan menyelimuti rantai DNA yang bermuatan negatif. Jika
di dalam air, gaya elektrostatik antara ion + (Na+) dan - (DNA) masih lemah
karena sebagian rantai DNA masih berikatan dengan air atau dapat dikatakan air
punya konstanta dielektrik yang tinggi. Sehingga penambahan pelarut organik
seperti ethanol dapat menurunkan konstanta dielektrik tersebut atau
memperbanyak ikatan DNA dengan Na+ sehingga membuat DNA lebih mudah
terpresipitasi. Hasil yang diperoleh adalah pelet yang mengandung DNA plasmid
dan supernatan yang mengandung larutan NaOAc dan ethanol absolut. Sehingga,
yang diambil pada tahap ini adalah bagian pellet dan yang dibuang adalah bagian
supernatan.
Tahap terakhir yaitu pembilasan DNA plasmid yang dihasilkan
menggunakan etanol 70%. Penggunaan etanol 70% ini bertujuan untuk
membersihkan sisa-sisa larutan yang digunakan untuk mengendapkan plasmid
sebelumnya sehingga diperoleh plasmid yang murni. Etanol 70 % dibuang dengan
cara membalik botol konikel di atas tissue sampai kering selama ± 5 menit,
kemudian ditambahkan ±30 µL ddH2O pada DNA plasmid. Langkah terakhir,
memipet larutan dengan mikropipet tip warna kuning dan memasukannya ke
dalam botol eppendorf kemudian dimasukkan ke dalam freezer.
Elektroforesis merupakan suatu teknik pemisahan DNA dengan
menggunakan arus listrik. DNA yang bermuatan negatif akan berjalan menuju
katoda yang bermuatan positif. Media yang digunakan untuk elektroforesis ini
yaitu agarosa. Agarosa adalah suatu fraksi dari agar-agar yang merupakan polimer
netral dan sedikit mengandung sulfat. Fungsi agarosa ini yaitu sebagai penyaring
untuk memisahkan molekul yang ukurannya lebih dari 100 bp. Konsentrasi
agarosa dapat mempengaruh hasil elektroforesis, dimana semakin tinggi
konsentrasinya maka akan semakin sulit dilewati molekul karena ruang
antarmolekulnya semakin kecil. Agarosa dibuat dengan melarutkan 0,375 g
agarosa dalam 25 ml buffer TAE (Tris Acetat EDTA) pH 8. Sampel DNA sebelum
dimasukkan ke dalam sumur harus ditambahkan buffer yang berisi bromofenol
biru (BPB) 0,25 (b/v) dan sukrosa 40 % (b/v). Buffer ini berfungsi sebagai
running buffer agar DNA dapat berjalan dari sumur menuju arah katoda. Agarosa
ini kemudian ditambahkan larutan Etidium Bromida (EtBr) 250 µg/mL sebagai
pewarna agar jalannya DNA pada elektroforesis dapat dilihat. Hasil elektroforesis
pada kromosom dan plasmid dapat diamati pada gambar 4.1 dan 4.2 berikut.

Gambar 4.1 elektroforesis kromosom

Gambar 4.2 elektroforesis plasmid

 BAB 5. PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Kesimpulan yang diperoleh pada praktikum isolasi DNA plasmid dan
kromosom ini yaitu:
- Isolasi DNA plasmid dan kromosom pada praktikum ini dilakukan dengan
beberapa tahapan, mulai dari lisis sel, denaturasi, sentrifugasi, pemurnian,
hingga pencucian DNA sehingga diperoleh DNA kromosom dan plasmid
yang murni.
- Pemurnian menggunakan teknik elektroforesis dilakukan dengan
menggunakan media agaroe dan arus listrik, dimana DNA akan bergerak dari
sumur menuju arus katoda.
5.2 Saran
Praktikum isolasi DNA ini memerlukan banyak waktu. Untuk
mendapatkan hasil yang sesuai seharusnya dipertimbangkan dan diatur waktu
yang tepat sehingga dapat diperoleh hasil yang baik.
 DAFTAR PUSTAKA

Bloom, Benjamin S., etc. 2000. Taxonomy of Educational Objectives: The

Classification of Educational Goals, Handbook I Cognitive Domain. New
York : Longmans, Green and Co.
Calladine, C. R., Horace R D., Ben F L., Andrew A T. 2004. Understanding DNA.
Amsterdam : Academic Press.
Campbell, N.A., J.B. Reece, & L.G. Mitchell. 2002. Biologi 5th ed. Jakarta:
Erlangga.
Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and
Techiques in Molecular Biomethods Handbook Second Edition. USA:
Humana Press.
Dolphin, W. D. 2008. Biological investigations. New York : The McGraw-Hill
Companies, Inc
Goodenough, Ursula. 1988. Genetics. Jakarta : Erlangga
Lehninger, A.L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia, diterjemahkan oleh
M.Thenawijaya. Jakarta: Erlangga.
Lodish H, Arnold B, Lawrence Z, Paul M, David B. 2000. Molecular Cell
Biology. New York: Wh Freeman Company.
Lubis, D.M. dan Melviana. 2013. Isolasi Dna, Isolasi Protein Darah, Serta
Pemeriksaan Dengan Teknik Pcr, Elektroforesis Agarose Dan Sds-Page.
UI. Jakarta.
Mader, S. S. 1993. Biology: International Edition. Boston: USA McGraw-Hill.
Maulana, R.A, 2010. Isolasi DNA Dan Elektoforesis DNA. Bandung: UPI.
Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta: Kanisius