LAPORAN SISTEMATIKA MIKROBIA

FILOGENETIK MOLEKULER

Nama :

Ella Triana Aprilia 15030244028

BIOLOGI 2015

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA
 BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Klasifikasi bakteri secara filogenetik dapat dilakukan melalui analisis
taksonomi molekular (Sembiring, 2010). Data yang digunakan adalah sekuens gen
yang mengkode 16S rRNA (16S rDNA) pada masing-masing strain yang akan
diklasifikasikan. Woese pada tahun 1980-an telah dapat menyimpulkan bahwa
perbandingan filogenetik berdasarkan bagian conserved dari genom lebih stabil
daripada klasifikasi berdasarkan pada sifat-sifat fenotipik (Woese, 1987). Oleh
karena itu, penggunaan molekul rRNA disebarluaskan untuk pembuatan
perbandingan filogenetik, dan gen 16S rRNA (1650 bp) adalah marker yang
paling umum digunakan dalam bidang sistematika mikrobia (Prakash et al.,
2007).
Molekul 16S rRNA terdiri atas daerah variabel dan daerah conserved, dan
primer universal untuk amplifikasi gen 16S rRNA biasanya dipilih dari daerah
conserved sedangkan daerah variabel digunakan untuk taksonomi perbandingan.
Langkah awal dalam klasifikasi filogenetik adalah mengisolasi dan memurnikan
DNA kromosomal dari masing-masing strain. Gen 16S RNA selanjutnya
diamplifikasi dengan teknik PCR (polymerase chain reaction) dari masing-masing
sampel DNA kromosomnya. Hasil amplifikasi tersebut dimurnikan untuk
disekuensing (Prakash et al., 2007).
Analisis filogenetika, kelompok outgroup sangat dibutuhkan dan
menyebabkan polarisasi karakter atau ciri, yaitu karakter apomorfik dan
plesiomorfik. Karakter apomorfik adalah karakter yang berubah dan diturunkan
dan terdapat pada ingroup, sedangkan karakter plesiomorfik merupakan karakter
primitive yang terdapat pada outgroup. Karakter sinapomorfik adalah karakter
yang diturunkan dan terdapat pada kelompok monofiletik. Karakter morfologi
telah lama digunakan dalam banyak penelitian filogenetika. Dengan pesatnya
perkembangan teknik-teknik di dalam biologi molekuler penggunaan sekuen
DNA dalam penelitian filogenetik telah meningkat pesat dan telah dilakukan pada
semua tingkatan taksonomi, misalnya famili, marga, dan spesies. Filogenetik
molekuler mengombinasikan teknik biologi molekuler dengan statistik untuk
merekonstruksi hubungan filogenetika (Hillis et al., 1996).
Menurut Prakash (2007) Klasifikasi filogenetik dilakukan melalui
konstruksi phylogeny tree. Phylogeny tree yang diperoleh merupakan hasil
klasifikasi yang menunjukkan hubungan filogenetik masing-masing strain bakteri
yang diklasifikasikan. Terdapat 4 tahapan dalam mengkonstruksi phylogeny tree
yang didasarkan atas data sekuens 16S rDNA, yaitu:
a. Preparasi sekuens 16S rDNA
 b. Aligment sekuens 16S rDNA
c. Konstruksi phylogeny tree
d. Konstruksi matriks similaritas dan perbedaan nukleotida 16S rRNA.

1.2. Rumusan Masalah

Rumusan masalah pada praktikum ini adalah :
Bagaimana tahapan analisis kekerabatan bakteri Escherichia dengan metode
filogenetik molekuler?

1.3. Tujuan
Tujuan dari rumusan masalah di atas adalah :
Tujuan dari praktikum ini adalah mengetahui cara dan tahapan analisis
kekerabatan bakteri Escherichia dengan metode filogenetik molekuler.
 BAB II
METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat

Praktikum Sistematika Mikrobia dengan judul “Filogenetik Molekuler”
Dilaksanakan pada hari Kamis, 2 November 2017 pukul 07:00 sampai selesai.
Bertempat di Laboratorium C9 Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Negeri Surabaya.

B. Bahan
1. Data sequence
Strain mikroba yang digunakan merupakan genus Lactobacillus
berjumlah 15 yang data sequence 16S rRNA-nya diperoleh dengan cara
download dari data base Internasional melalui internet dengan alamat:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy. Data strain bakteri yang di uji
ditunjukkan dalam Tabel 1 di bawah ini dan data selengkapnya mengenai
sequence 16S rRNA dari masing-masing strain ditunjukkan dalam Lampiran
1.
Tabel 1. Nama Strain Anggota Escherichia
No Nama Strain
1 Escherichia albertii Albert 19982

2 Escherichia fergusonii ATCC 35469

3 Escherichia coli NBRC 102203

4 Escherichia hermannii CIP 103176

5 Escherichia adecarboxylata LMG 2803

6 Escherichia blattae DSM 4481

2. Program Komputer (Software).

Untuk menganalisis data digunakan beberapa program komputer yaitu:
PFE yang digunakan untuk mengatur data agar dapat dibaca oleh program
algoritma. CLUSTALX yang digunakan untuk alignment data sequence 16S
rRNA. Program PHYLIP yang digunakan untuk mengkonstruksi phylogeny tree.
Program TREEVIEW untuk mengvisualisasikan phylogeny tree. PHYDIT untuk
mengkonstruksi matriks similaritas dan perbedaan nukleotide 16S rRNA.
C. Cara Kerja
1. Koleksi data.
Data yang dikoleksi berupa sequence gen 16S rRNA 20 strain mikrobia
terpilih. Data diperoleh dari data base Internasional dengan cara men-download
melalui Internet dengan alamat: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy. Data
sequence 16S rRNA yang dicari di download kemudian di save dalam suatu folder
tersendiri. Folder disimpan di My document.

2. Preparasi sequence 16S rRNA

Data Sequence 16S rRNA yang telah diperoleh berupa file, dibuka dan di
atur dengan program PFE agar dapat dibaca oleh program CLUSTALX dengan
langkah-langkah sebagai beikut:

a. Setelah mendapatkan data sequence 16S rRNA langkah selanjutnya adalah:

b. Membuka program PFE Click File New atau Click pada icon pada sudut kiri
bagian atas layer programmer’s file editor.
c. Copy paste file sequence 16S rRNA dan letakkan pada file new yang telah
dibuka dengan program PFE.
d. Pada sudut kiri bagian atas sequence 16S rRNA yang ter-copy tersebut, dibuat
fasta format dengan mengetik simbol > di depan sequence 16S rRNA dan
diikuti dengan mengetikkan Acession Number dari sequence yang dipakai.
e. Mengatur urutan sequence 16S rRNA supaya sejajar anatar satu sama lain.
f. Save file dalam suatu folder tersendiri.

3. Alignment sequence 16S rRNA

Data sequence masing-masing strain yang sudah tersedia dalam fasta
format di load ke dalam program CLUSTALX untuk di align dengan langkah-
langkah sebagai berikut:
a. Membuka ClustalX
b. Click File, memilih Load sequence, memasukkan file sequence 16S rRNA
yang diedit dalam PFE tadi dan Click Open.
c. Click File, memilih Append sequence, memasukkan kembali file sequence 16S
rRNA yang lain yang telah diedit dalam PFE dan Click open. Demikian
seterusnya sampai seluruh genus sudah di-loading dalam direktori ClustalX.
d. Click Aligment. Memilih out put options, kemudian memilih icon:
 CLUSTAL format
 GDE format
 PHYLIP format
 Kemudian Click close

e. Click Alignment. Memilih Do complete alignment

f. Melihat Output Guide Tree File. Mengetikan C:\ClustalX\nama file yang
disimpan.dnd, C:\ClustalX\gun4.dnd
Melihat output alignment file
Mengetikkan pada baris Clustal: C:\ClustalX\gun4.aln
Phylip: C:\ClustalX\gun4.phy
GDE: C:\ClustalX\gun4.gde

g. Click align. Setelah align selesai ada instruksi: truncating sequences nama to
15 characters for phylip output. Click OK. Kemudian Close.
h. Melihat di folder ClustalX ada tidaknya file yang disimpan. melihat file
gun4.dnd, gun4.aln, gun4.phy dan gun4.gde dalam folder clustalX.

4. Konstruksi phylogeny tree

Seluruh sequence 16S rRNA dari masing-masing strain yang telah
disatukan dalam satu file yang merupakan hasil alignment digunakan untuk
mengkonstruksi phylogeny tree dengan menggunakan program PHYLIP dengan
urutan langkah sebagai berikut:

a. Membuka folder Phylip, mencari infile, kemudian delete file tersebut.

Melakukan secara hati-hati agar file lain yang ada diprogram Phylip tidak ikut
ter-delete.
b. Membuka folder ClustalX. Click file gun3.phy, kemudian melakukan rename
pada file gun3.phy menjadi infile. Drug (meletakkan file dengan cara
menggeser) infile hasil rename untuk masuk dalam folder Phylip.
c. Click Command Prompt C:\. Ini adalah program DOS yang dapat dicari
dengan meng-explore all program mencari di accessories.
d. Mengetikan setelah C;\Document and Settings\dengan cd\Phylip (Enter)
e. Kemudian akan muncul C:\Phylip>
f. Mengetikan dnadist pada C:\Phylip>, Contoh: C:\Phylip>dnadist (Enter)
g. Muncul tulisan Are these setting correct?
h. Mengetikkan y (Enter)
i. Akan muncul tulisan: Distance calculated for species
Distance written to file

j. C:\Phylip>del infile
k. C:\Phylip>ren outfile infile (Enter)
l. C:\Phylip>neighbor (Enter)
m. Akan muncul tulisan Are these setting correct?
n. Mengetikkan y (Enter)
o. Akan muncul tulisan: Output written on output
Tree written on tree file

p. C:\Phylip\exit

5. Visualisasi phylogeny tree

Untuk memvisualisasikan phylogeny tree digunakan program
TREEVIEW dengan urutan langkah sebagai berikut:

a. Click TREEV32
b. Click File Open Look in PHYLIP
c. Memilih files of type: All file (*.*)
d. Click Treelife kemudian open
e. Click Tree mencari/menentukan define outgroup kemudian click tree
kembali dan memilih edit preferences, kemudian memilih Phylogram.
f. Click file save as graphic dalam suatu folder tersendiri.

6. Pengeditan nama (editing) strain dalam phylogeny tree

Meng-import tree yang telah disimpan dalam format wmf ke dalam
WORDS dengan cara:

a. Membuka program WORDS

b. Insert-picture-from file (Enter)
c. Mengedit nama strain dengan cara double click pada tree
d. Apabila nama strain melampaui batas gambar, dapat disesuaikan batas gambar
dengan mengklik reset picture boundary (bila menu tidak muncul,
mengaktifkan Picture dalam melalui Tool-Customize)
e. Jika textbox nama strain tidak aktif, mengaktifkan dengan cara regrouping
yaitu meletakkan crusor pada tree lalu klik tombol kanan pada mouse, dan
memilih regrouping/ungrouping
f. Caption untuk tree dapat diberi dengan cara menyisipkan textbox di bawah
tree, lalu ketik sesuai dengan yang dikehendaki.

7. Presentasi phylogeny tree

Hasil yang berupa tree dipresentasikan dengan menggabungkannya ke
dalam teks yang dikehendaki.
8. Konstruksi matriks similaritas dan perbedaan nukleotide 16S rRNA
Mengkonstruksi matriks dilakukan dengan menggunakan file yang berisi
sequence dalam fasta format (>) sudah di align yang disimpan dalam format GDE
mengikuti langkah berikut:

a. Membuka program PHYDIT untuk mengkonstruksi matriks similaritas dan

perbedaan nukleotida 16S rRNA
b. File-New
c. OK
d. Akan muncul: No entry to tag
e. Data-Import-GDE (NT replace)
f. Click File Name, mencari di folder ClustalX nama file fun3.gde
g. Open
h. OK
i. Click Analysis-Sim Table: Generating Similarity Table
j. OK (Enter)
k. OK (Enter)
l. Akan muncul Similarity Table dalam bentuk Note Pad.
m. Mengkopikan table ini dalam program EXELL agar mudah dibaca isinya
dengan cara:
Copy paste pada baris pertama kolom kedua nama-nama identitas strain

Copy paste sisa Tabel yang tersisa dengan cara meletakkan pada kolom
pertama baris kedua dalam program EXELL.

n. Membuat table dalam WORDS untuk mempresentasikan hasil print out table
dalam EXELL.
 BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil
Analisis dilakukan setelah didapatkan strain bakteri Escherichia, kemudian
dilakukan bantuan software PFE dengan memasukkan strain yang terpilih ke
dalam software tersebut. Seperti gambar berikut:

Gambar 1. Pengaplikasian sequence menggunakan PFE

Setelah itu hasil dari copy-paste sequence kemudian diluruskan dan disave
dengan nama yang sesuai nama sequence strain terpilih. Kemudian dilanjutkan
dengan metode alignment sequence 16S rRNA menggunakan program ClustalX.
File yang telah disimpan dari program PFE, dimasukkan ke dalam program
ClustalX. Saat mengonstruksi file tersebut, terdapat tampilan berupa urutan basa
nitrogen masing-masing sekuens. (Gambar 1). Urutan basa nitrogen ditampilkan
sesuai dengan panjang sekuens dan setiap basa nitrogen memiliki satu warna
tertentu, yaitu hijau untuk A, merah untuk T, ungu untuk G, dan biru untuk C.
Selain itu, tampilan urutan basa nitrogen juga dapat diubah menjadi urutan asam
amino sesuai dengan urutan kodonnya. Sehingga didapatkan hasil sebagai berikut:
 Gambar 2. Pengaplikasian Alignment sequence 16S rRNA menggunakan
ClustalX

Setelah didapatkan hasil seperti gambar diatas, melanjutkan metode

selanjutnya. Untuk mendapatkan pohon filogenetik didapatkan dari metode
sebelum-sebelumnya. Pohon filogenetik yang terbentuk dari kesepuluh organisme
yang dianalisis terdiri atas 2 cabang utama yang membentuk cabang-cabang
lanjutan (Gambar 3).
 Gambar 3. Pohon filogenetik dari spesies genus Escherichia

Keterangan gambar (3) :

Albert = Escherichia albertii
NBRC 102203 = Escherichia coli
ATCC = Escherichia fergusonii
 DSM = Escherichia blattae
CIP = Escherichia hermanii
LMG = Escherichia adecarboxylata

Berbagai spesies dari genus Escherichia yang saling berdekatan posisinya

dalam pohon filogenetik dapat diduga memiliki hubungan kekerabatan yang
dekat, begitupun sebaliknya. Pada gambar (3) kode strain DSM dari Escherichia
blattae berjarak jauh dengan kode strain yang lain, sehingga dapat dikatakan
bahwa hubungan kekerabatannya tidak dekat. Berbeda dengan kode strain dari
ATCC dari Escherichia fergusonii dan kode strain NBRC 102203 dari
Escherichia coli berjarak sangat dekat dengan kode strain Albert dari Escherichia
Albertii. Analisis kekerabatan secara lebih akurat dapat dilakukan dengan
menggunakan panjang cabang. Jika selisih panjang cabang antara 2 organisme
tersebut sangat jauh, hubungan kekerabatan di antara keduanya juga jauh,
begitupun sebaliknya. Panjang cabang yang bernilai 0.0 menunjukkan bahwa
organisme tersebut sangat dekat dengan nenek moyangnya, bahkan organisme itu
sendiri dapat diduga sebagai nenek moyang. Dengan mengetahui skala pada tiap
titik dapat mengetahui antara hubungan kekerabatan yang terkait.
Dapat dilihat indeks similartas dari setiap spesies dengan jarak yang
berbeda-beda. Ada yang jaraknya saling berdekatan sehingga dapat disimpulkan
memiliki kesamaan yang dekat. Dan ada juga yang berjarak agak berjauhan yang
tidak memiliki kesamaan yang dekat.
 BAB IV
PENUTUP

A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil yang telah diperoleh Berbagai spesies dari genus
Escherichia yang saling berdekatan posisinya dalam pohon filogenetik dapat
diduga memiliki hubungan kekerabatan yang dekat, begitupun sebaliknya. Pada
gambar (3) kode strain DSM dari Escherichia blattae berjarak jauh dengan kode
strain yang lain, sehingga dapat dikatakan bahwa hubungan kekerabatannya tidak
dekat. Berbeda dengan kode strain dari ATCC dari Escherichia fergusonii dan
kode strain NBRC 102203 dari Escherichia coli berjarak sangat dekat dengan
kode strain Albert dari Escherichia Albertii. Analisis kekerabatan secara lebih
akurat dapat dilakukan dengan menggunakan panjang cabang. Jika selisih
panjang cabang antara 2 organisme tersebut sangat jauh, hubungan kekerabatan
di antara keduanya juga jauh, begitupun sebaliknya.

B. Saran
Saran yang dapat diberikan adalah praktikan hendaknya memahami terlebih
dahulu apa yang akan dipraktikumkan, sehingga praktikan dapat mengikuti
jalannya praktikum dengan baik, dan praktikan seharusnya lebih teliti dalam
memasukkan data, sehingga hasil yang diperoleh akan lebih akurat.