3.

5 Tahapan Penelitian

3.5.1 Penyiapan bahan segar

Bahan segar daun sukun yang diperoleh dari Desa Balonggabus disiapkan, kemudian
dilakukan pengamatan berupa :

a. Pengamatan Makroskopik
Pengamatan ini dilakukan dengan mengamati ciri-ciri secara makroskopik pada
seluruh bagian daun tanaman sukun (Atrocarpus altilis). Untuk pengamatan makroskopik
dari daun meliputi pemeriksaan helaian (lamina) daun antara lain: bentuk daun, tepi daun,
tulang daun, warna daun, permukaan daun, filotaksis daun, panjang dan diameter daun.
b. Pengamatan Mikroskopik
Pengamatan ini dilakukan dengan mengamati irisan melintang dan membujur pada
daun sukun (Atrocarpus altilis). Pengamatan mikroskopik dilakukan dengan mengunakan
media air dan penambahan kloralhidrat untuk mengetahui jaringan penyusun serta
keberadaan kristal dalam tanaman tersebut, kemudian ditambahkan floroglusin HCl untuk
mengetahui jaringan berkas pembuluh serta yang mengandung zat lignin yang akan
memberikan warna merah.

3.5.2 Pengumpulan Bahan Kering

Bahan penelitian ini didapatkan dari Balai Materia Medika Batu, Balittro Bogor dan
Desa Balonggabus, Sidoarjo. Bahan yang didapatkan dalam bentuk serbuk kering daun
sukun. Bahan tersebut kemudian dilakukan standarisasi secara spesifik dan non spesifik

3.5.4 Pembuatan Ekstrak Daun Sukun

Serbuk simplisia daun sukun ditimbang sebanyak 500 gram lalu dimasukkan ke dalam
wadah dan dimaserasi selama satu hari menggunakan pelarut etanol 96% sebanyak 2500 ml,
kemudian disaring sehingga didapat maserat. Ampas diremaserasi dengan etanol 96%
menggunakan prosedur yang sama. Maserasi dilakukan sampai diperoleh maserat yang
jernih. Semua maserat etanol digabungkan dan diuapkan dengan menggunakan penangas air
sampai diperoleh ekstrak etanol kental daun sukun lalu dihitung randemennya (Voigt, 1995).
Ekstrak kental yang didapat kemudian dilakukan uji mutu ekstrak yaitu baik dari parameter
spesifik yang meliputi identitas, pengamatan organoleptis, penetapan kadar sari larut etanol,
penetapan kadar sari larut air, skrining fitokimia, penetapan pola kromatogram secara KLT,
penetapan spektrum IR dan penetapan kadar senyawa metabolit sekunder (flavonoid, fenol
dan alkaloid). Parameter non spesifik meliputi susut pengeringan, bobot jenis, kadar air,
kadar abu total, kadar abu larut air dan kadar abu tidak larut asam (Ditjen POM RI, 2000)
3.5.5 Standarisasi Ekstrak Daun Sukun

a. Parameter Spesifik Ekstrak Daun Sukun

1. Identitas

Parameter ini dilakukan dengan mendeskripsikan tata nama meliputi: nama ekstrak
(generik, dagang, paten), nama latin tanaman (sistematika botani), bagian tanaman yang
digunakan (rimpang, daun dsb) dan nama Indonesia tanaman.

2. Pengamatan Organoleptis

Ekstrak etanol daun sukun diamati secara organoleptis meliputi pengamatan terhadap
warna, rasa, dan bau dari ekstrak etanol daun sukun (Atrocarpus altilis).

3. Penetapan Kadar Sari Larut Etanol

Kadar senyawa yang larut dalam etanol bertujuan memberikan gambaran awal
jumlah senyawa kandungan. Ekstrak daun sukun ditimbang sebanyak 5 gram, kemudian
dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml etanol menggunakan labu bersumbat sambil
berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama, dan kemudian dibiarkan selama 18 jam, disaring
cepat untuk menghindari penguapan etanol, diuapkan 20 ml filtrat hingga kering dalam
cawan, kemudian residu dipanaskan pada suhu 105°C hingga bobot konstan. Penetapan kadar
sari larut etanol dilakukan dengan menghitung kadar dalam persen senyawa yang larut dalam
etanol terhadap ekstrak awal (Ditjen POM RI, 2000).

4. Penetapan Kadar Sari Larur Air

Penetapan kadar sari larut air dilakukan dengan cara ekstrak daun sukun ditimbang
sebanyak 5 gram, kemudian dimaserasi selama 24 jam dengan 100 ml air-kloroform (2,5 ml
kloroform dalam air suling sampai 1 liter) menggunakan labu bersumbat sambil berkali-kali
dikocok selama 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam, disaring cepat untuk
menghindari penguapan etanol, diuapkan 20 ml filtrat hingga kering dalam cawan, kemudian
residu dipanaskan pada suhu 105°C hingga bobot konstan. Penetapan kadar sari larut air
dilakukan dengan menghitung kadar dalam persen senyawa yang larut dalam air terhadap
ekstrak awal (Ditjen POM RI, 2000).

5. Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Daun Sukun

Uji fitokimia pada ekstrak etanol daun sukun (Atrocarpus altilis) meliputi
pemeriksaan alkaloid, flavonoid, tanin dan polifenol, steroid dan terpenoid, saponin dan
kuinon. Pembuatan larutan uji untuk skrining fitokimia dilakukan dengan melarutkan 500 mg
ekstrak etanol daun sukun (Atrocarpus altilis) dalam 10 ml etanol 95%.

a. Uji Alkaloid
Sebanyak 0,5 ml larutan uji ditambahkan etanol pa 0,5 ml kemudian
ditambahkan 2-3 tetes reagen dragendorff. Jika terbentuk endapan jingga-merah
menunjukan adanya alkaloid. \
b. Uji Flavonoid

Larutan ekstrak uji sebanyak 1 ml diuapkan hingga kering, sisanya dibasahkan

dengan aseton P, ditambahkan sedikit serbuk halus asam borat P dan serbuk halus
asam oksalat P, dipanaskan berhati-hati diatas tangas air dan dihindari pemanasan
berlebihan. Sisa yang diperoleh dicampur dengan 10 ml eter Plat. Diamati dengan
sinar UV 366 nm, larutan yang berfluorosensi kuning intensif, menunjukan ada
flavonoid (DepKes RI, 1989).

c. Uji Tanin dan Polifenol

Larutan ekstrak uji sebanyak 1 ml direaksikan dengan larutan besi (III)
klorida 10%, jika terjadi warna biru tua, biru kehitaman atau hitam kehijauan
menunjukkan adanya senyawa polifenol dan tanin (Robinson, 1991; Jones and
Kinghorn, 2006)
d. Uji Steroid dan Triterpenoid
Larutan uji sebanyak 2 ml diuapkan. Residu yang diperoleh dilarutkan dalam
0,5 ml kloroform, lalu ditambah dengan 0,5 ml asam asetat anhidrat. Selanjutnya,
campuran ini ditetesi dengan 2 ml asam sulfat pekat melalui dinding tabung tersebut.
Bila terbentuk warna hijau kebiruan menunjukkan adanya triterpenoid. Jika hasil yang
diperoleh berupa cincin kecokelatan atau violet pada perbatasan dua pelarut,
menunjukkan adanya steroid (Jones and Kinghorn, 2006; Evans, 2009).
e. Uji Saponin
Uji Saponin dilakukan dengan metode Forth yaitu dengan cara memasukkan 2
ml sampel kedalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 10 ml akuades lalu dikocok
selama 30 detik, diamati perubahan yang terjadi. Apabila terbentuk busa yang mantap
(tidak hilang selama 10 menit) maka identifikasi menunjukkan adanya saponin
(Marliana, Suryanti dan Suyono, 2005).
f. Uji Kuinon
Sebanyak 0,5 ml larutan uji ditambahkan dengan etanol 0,5 ml. Tiga tetes
larutan NaOH 1 N ditambahkan pada larutan uji. Hasil positif jika terbentuknya warna
merah.
6. Identifikasi dengan Uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Ekstrak Daun Sukun (Atrocarpus
altilis)

Identifikasi secara KLT bertujuan untuk melihat profil kromatogram dengan

menggunakan plat silika gel F254 berukuran 20 cm x 20 cm dan bejana berukuran 122cm x
23 cm yang berisi larutan pengembang. Jenis larutan pengembang yang digunakan yaitu
toluen : etil asetat (7:3), kloroform : methanol (7:3), n-butanol : asam asetat : air ( 3:1:1), n-
butanol : asam asetat : air ( 4:1:5), dan etil asetat : asam format : air (8 :1:1) (DepKes RI
1989). Sampel ekstrak etanol daun sukun disiapkan 1 gram dalam 10 ml etanol dan ditotolkan
sebanyak 10 µl simplisia daun sukun dari tiga lokasi yang berbeda, dengan jarak penotolan
1,5 cm dari larutan pembanding dan terletak kurang lebih 1,5 cm dari tepi bawah plat. Plat
yang sudah ditotolkan dieluasi dengan larutan pengembang kurang lebih 100 ml yang sudah
jenuh dengan tinggi pelarut 0,5 cm sampai 1 cm. Setelah proses eluasi selesai, lempeng
dikeluarkan dari bejana. Lempeng KLT dikeringkan diudara, kemudian bercak diamati mula-
mula secara visibel, kemudian dengan sinar ultraviolet gelombang pendek (254 nm) dan sinar
ultraviolet dengan gelombang panjang (366 nm). Lempeng KLT yang sudah diamati
menggunakan UV disemprot menggunakan penampak bercak AlCl3 untuk mengidentifikasi
senyawa flavonoid. Lempeng KLT dikeringkan di udara, kemudian diamati secara visibel dan
menggunakan sinar ultraviolet dengan gelombang panjang (366 nm) dan di diambil
gambarnya untuk proses dokumentasi, kemudian menghitung harga rf (DepKes RI, 1989).

7. Penetapan Profil Spektrum Ekstrak Etanol Daun Sukun dengan Spectroscopy Infrared

Ekstrak kental daun sukun (Atrocarpus altilis) diletakkan pada lempeng logam tempat
sampel tepat ditengah-tengah diatas diamond, kemudian sampel diberi nama pada komputer
dan lakukan scanning. Profil IR dari sampel akan muncul, kemudian dilakukan proses
dokumentasi (Lukman, 2015).

8. Penetapan Kadar Metabolit Sekunder

a. Fenol

Penetapan kadar fenol ditentukan dengan metode spektrofotometri (Singleton et al.,

1999). Sampel yang digunakan dalam konsentrasi 1 mg/ml. Pembuatan larutan uji yaitu
dengan menyiapakan 2,5 ml reagen 10% Folin-Ciocalteu yang dilarutkan dalam air dan 2,5
ml NaHCO3 7,5%, kemudian campuran tersebut ditambahkan dengan larutan sampel
sebanyak 0,5 ml. Blanko disiapkan yaitu campuran 0,5 ml etanol dan 2,5 ml reagen
FolinCiocalteu 10% yang dilarutkan dalam air dan 2,5 ml NaHCO3 7,5%. Sampel kemudian
diinkubasi pada 45°C selama 45 menit. Absorbansi sampel dibaca pada λ max = 765 nm.
Pembuatan larutan standar asam galat dilakukan dengan prosedur yang sama. Kadar fenol
dihitung berdasarkan nilai absorbansi Prosedur yang sama diulangi untuk larutan standar
asam galat. Kadar total fenol dihitung dari kurva kalibrasi asam galat. Total Fenol dinyatakan
dalam total asam galat (Stancovic, 2011).
b. Flavonoid

Penetapan kadar flavonoid dalam ekstrak tanaman ditentukan dengan menggunakan

metode spektrofotometri (Quettier et al., 2000). Sampel yang akan digunakan dalam
konsentrasi 1mg/ ml dan 2% larutan AlCl3 dilarutkan dalam etanol. Sampel diinkubasi
selama satu jam pada suhu kamar. Absorbansi ditentukan pada λ max = 415 nm. Prosedur
yang sama diulangi untuk larutan standar quercetin. Kadar flavonoid dihitung dari kurva
kalibrasi quercetin. Total flavonoid dinyatakan dalam total quercetin (Stancovic, 2011)

c. Alkaloid

Alkaloid total ditentukan dengan metode spektrofotometri menggunkaan Bromocresol

green dan kafein sebagai larutan standart (John et al, 2014).

 Pembuatan larutan uji

Pembuatan larutan Bromocresol green (BCG) yaitu dengan memanaskan 69,8 mg

Bromocresol green (BCG) dengan 3 ml NaOH 2N dan 5 ml air suling sampai larut dan
tambahkan aquadest sampai 1000 ml.

 Pembuatan larutan buffer Fosfat (pH 4.7) dengan menyesuaikan pH dari 2 M natrium fosfat
(71,6 g Na2HPO4 dalam 1 L air suling) menjadi 4,7 dengan 0,2 M asam sitrat (42.02 g asam
sitrat dalam 1 L air suling).

 Pembuatan larutan standart kafein dengan melarutkan 25 mg kafein murni (Sigma

Chemical, Bangalore) dalam 1 mL air suling.

 Persiapan kurva standar

a. Pembuatan Kurva Baku

Kafein standar yang sudah disiapkan dipipet sebanyak 0,04, 0,06 , 0,08, 0,1 dan 0,12
ml. kemudian ditambahkan 5 ml pH 4,7 buffer fosfat dan larutan BCG 5 mL. Sampel tersebut
kemudian diekstraksi cair-cair secara bertahap dengan 1 ml, 2 ml, 3 ml, dan 4 ml kloroform.
Filtrat kloroform dikumpulkan dalam labu volumetrik 10 mL dan diencerkan dengan
kloroform sampai batas tanda. Absorbansi diukur pada λ 470 nm terhadap blanko yang sudah
disiapkan tanpa kafein.
b. Pembuatan Sampel
Ekstrak sebanyak 0,5 g dilarutkan dalam 10 ml etanol. Larutan ini dipindahkan 1 ml
ke corong pemisah, ditambahkan 10 ml HCl 2 N dicuci dengan 10 ml kloroform (3 kali). pH
larutan disesuaikan dengan 0,1 N NaOH. Kemudian 5 ml larutan BCG dan 5 ml buffer fosfat
ditambahkan dalam campuran ini. Campuran dikocok dan diekstraksi dengan 1 ml, 2 ml, 3
ml, dan 4 ml kloroform. Ekstrak dikumpulkan dalam 10 ml labu ukur dan diencerkan dengan
kloroform sampai batas tanda. Absorbansi diukur pada λ 470 nm terhadap blanko yang sudah
disiapkan tanpa kafein.
b. Parameter Non Spesifik Daun Sukun

1. Penetapan Susut Pengeringan

Ekstrak ditimbang secara seksama sebanyak 1-2 gram dan dimasukkan kedalam botol
timbang tertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105°C selama 30 menit dan
telah ditara. Sebelum ditimbang ekstrak diratakan dalam botol timbang, dengan
menggoyangkan botol, hingga merupakan lapisan setebal lebih kurang 5 mm sampai 10 mm
dengan bantuan pengaduk. Botol timbang yang berisi ekstrak dimasukkan kedalam ruang
pengering, buka tutupnya dan keringkan pada suhu 105°C hingga bobot tetap. Sebelum setiap
pengeringan biarkan botol dalam keadaan tertutup mendingin dalam eksikator hingga suhu
kamar (Ditjen POM RI, 2000).

2. Penetapan Bobot Jenis

Penetapan bobot jenis menggunakan piknometer yang bersih, kering dan telah
dikalibrasi dengan menetapkan bobot piknometer dan bobot air yang baru didihkan pada suhu
25°C. Suhu ekstrak cair diatur lebih kurang 20°C, kemudian masukan ke dalam piknometer.
Suhu piknometer yang telah diisi diatur hingga pada suhu 25°C, kemudian kelebihan ekstrak
cair dibuang dan ditimbang. Bobot piknometer kosong kemudian dikurangi dengan bobot
piknometer yang telah diisi. Bobot jenis ekstrak cair adalah hasil yang diperoleh dengan
membagi bobot ekstrak dengan bobot air, dalam piknometer pada suhu 25°C (Ditjen POM
RI, 2000).

3. Penetapan Kadar Air

Ekstrak daun sukun ditimbang seksama sebanyak 10 gram dalam wadah yang telah di
tara, kemudian dikeringkan pada suhu 105°C selama 5 jam dan ditimbang. Pengeringan
dilanjutkan dan serbuk ditimbang pada jarak 1 jam sampai perbedaan antara 2 penimbangan
berturut-turut tidak lebih dari 0,25% (Ditjen POM RI, 2000).

4. Penetapan Kadar Abu Total

Penetapan kadar abu bertujuan untuk memberikan gambaran kandungan mineral

internal dan eksternal yang berasal dari proses awal sampai terbentuknya ekstrak. Penetapan
kadar abu dilakukan dengan cara ekstrak ditimbang seksama kurang lebih 2 gram lalu
dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara, lalu diratakan. Krus
dipijarkan perlahan lahan hingga arang habis, didinginkan dan ditimbang. Kadar abu dihitung
terhadap bahan yang telah dikeringkan diudara (Ditjen POM RI, 2000).

5. Kadar Abu Tak Larut Asam

Abu yang diperoleh dari penetapan kadar abu total, didihkan dengan 25 ml asam
sulfat encer P selama 5 menit, kumpulkan bagian yang tidak larut asam, saring melalui krus
kaca masir atau kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas, pijarkan hingga bobot tetap,
timbang. Kadar abu yang tidak larut asam dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di
udara (Ditjen POM RI, 2000).
6. Kadar Abu Larut Air

Abu yang diperoleh dari penetapan kadar abu total, dididihkan dengan 25 ml air
selama 5 menit, kumpulkan bagian yang tidak larut, saring melalui krus kaca masir atau
kertas saring bebas abu, cuci dengan air panas dan pijarkan selama 15 menit pada suhu tidak
lebih dari 450°C, hingga bobot tetap, timbang. Perbedaan bobot sesuai dengan jumlah abu
yang larut dalam air. Kadar abu yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang
dikeringkan di udara (Ditjen POM RI, 2000).