BIOSINTEZA PROTEINELOR Mecanismul biosintezei proteinelor, cu diversitatea activititi biologice, s-a impus drept problema dintre cele mai dificile in istoria biochimiei. Azi, in temei, el este studiat, dar posibil ci aceasta eo mici parte din acel intreg, care trebuie cunoscut. Evident, meca- nismul biosintezei e unul din cele mai complexe procese in natura vie, implicind conlu- crarea a peste 300 macromolecule specifice, reprezentate de proteinenzime, diferite tipuri de RNA cu functii distinctive. Sinteza, cu o complexitate vast’, decurge cuo -itezi rapid: pentru sinteza lantului polipeptidic din 100 resturi deaminoaciz ribozomulu E. coliii sunt destule 5 secunde. Sinteza in fiecare celula conlucreazi cu metabolismul. Procesul de biosintezi presupune traducerea limbajului de 4 litere al acizlor nucleici in limbaj de 20 de litere (aminoacizi) a proteinelor, Baza cunostinfelor noastre de azi au fost cimentate de trei mari descoperii ale anilor 50 din secolul precedent: 1. Paul Zamecnik (1950) stabileste c& locul sintezei proteice e ribozomul. 2. Paul Zamecnik si Mahlon Hoagland (1957) au demonstrat ci activarea aminoacizilor si aditionarea lor a RNA € catalizati de aminoacil-RNA-sintetaze. 3. Francis Crick a expus ipoteza transferului mesajului genetic codificat in acizi nucleici cu4 fitere in limbajul celor20 aminoacizi, concluzionind: tRNA indeplineste functia de adaptor —o portiune racordeaza aminoacidul specific, iar alta identified in mRNA osecventi mic’ de nucleotide ce codific’ acest aminoacid. Biosinteza proteinelor include 5 etape: 1 Activarea aminoacizilor. Procesul are loc in citozolul celulei, in care cei 20 aminoacizi adifioneazi la (RNA prin legitura estericd. Procesul e catalizat de enzime diferite numite aminoacil-4RNA-sintetaze. Ele sunt caracteristice fiecdrui aminoacid si tRNA, corespunzaitor. Activarea are loc in anumite faze: a) in centrul activ (CA) al enzimei decurge urmatoarea reacte: AA+ ATP +E == E-AAAdenilal + PP, Legarea aminoacidului (COOH) are loc la gruparea S* exvimei ’) Transferul dela E-AAA petRNA specific a restului de aminoacid: E-AAA +tRNA == AAtRNA + AMP + E Aditionarea aminoacidului are loc la grupele de OH in pozitia 2’ sau 3! a restului de adenozind in molecula tRNA (legitura e macroergic’). Hidroliza ulterioari a pirofosfatulu, sub actiunea pirofosfatazei, face reactia ireversibila—deplaseaza echilibrul spre dreapta Me Aminoacid+tRNA+ATP —sme AAtRNA + AMP + 2Pi KAIRNAS . Piolviae AG? =-29ki/mol fosfat a AMP din molecula Enzimele sunt foarte specifice—au 4 locusuri care participa la identificare, cataliza, posedind capacitatea de autocontrol: 1) AA; 2)tRNA; 3) ATP; 4) HOH —ultimule indicatpentruhidroliza aminoacidului “impostor”. Specifictatea e determinati exclusiv de structura {RNA (1 eroate la 400 resturi de aminoacid), +152‘Siguranta procesului de traducere in mare masuri e conditionatd de capacitatea de autocontrol a sintetazclor. Activarea necesitii ATP si ioni de magneziu, Deosebim 2 clase de aminoacil -tNA-sintetaze: Casa - Arg, Cys, Gin, Glu, He, Leu, Met, Trp, Tyr, Val (OH-2' terminal tRNA). Clasa II - Ala, Asn, Asp, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr (OH-3' terminal tRNA). Structura general a unui aminoacil-4RNAs e redati mai jos. De asemenea sunt ilustrate siconformatiile celor doud sintetaze - tip I itip TL RNA, 0 Aminoacidel “o-P=0 ° 5 | Bela aminoacidics PG Dp nL yre seca) ata ucla Sticodonick Structura generalii@ AA-1RNAS Aminusite RNA sinter, * ‘Gln “RNAs, Asp ARNAS Sinteza lanfului polipeptidic incepe cu capatul N-terminal, la care aditioneaza ulterior resturile de aminoacizi spre C-terminal. Aminoacidul initiator la procariote este N- _formilmetionina, la eucariote- metionina. N-formilmetionina se formeazit in dou etape: 1. Met+tRNA‘®*+ATP —» Metionil-tRNA'* + AMP + PP, 2..N'°-formiltetrahidrofolat + Met-tRNA‘™ —» N-formilmet-tRNA‘™* + FH, (tetrahidrofolat). Reactia este catalizatd de transformilaza specifica. Sunt tRNA specifice la met- ARNA™5iN-formilmet-tRNA‘* Prima conduce la includerea metioninei in lantul polipeptidic, all -lalegatura cu un anumit locusin ribozom. Il. Formarea complexului de inifiere decurge in 3 etape (fig. 2.40). Sunt necesare 1) subunitatea mica aribozomului; 2) mRNA ce codified _polipeptidul necesar; 3) N- et RNA"; 4) 3 proteine-factori de inifiere-IF-1, IF-2, IF-3; 5) GTP. Etapa 1. Subunitatea mic leagi IF-3 si previne reasociajia subunitatilorribazomiale subunitate aditioneazi mRNA astfel codonul de initiere AUG se fixeaz’ intr-un loc -153-specific al subunitagi, Fixarea tui corectie de- terminatd de un fragment al mRNA aranjatla cap terminal adiacent codonului AUG (com- puis din 6-8 resturi de A iG). Acest fragment Shine-Dalgarno este perfect complementar cu o succesiune de nucleotide de la cap 3'- Ol al RNA 165 (fig.2.41). Sensibititatea ri- bozomului la semnalul de initiere moduleaz viteza traduceri, Semnalul indicdlocul de fixa- reaN-finet-RNA®*. Etapa 2. La complexul format aditioneaza IF-2 legat de GTP gi fmet-ARNA®*, care se fixeazi in central peptidilic(P). Etapa 3. Complexul interactioneaza cu subunitatea SOS, implicind simultan hidrotiza GTP pind la GDP si Pi, care se elimina din complex. Parisese ribozomul IF-1, IF-2 gi IF-3. in consecinta, se formeaza complexul de inifiere, aleatuit din ribozomul 708, functional activ, si mRNA, N-fmet-tRNA "= Fixarea corecté a ultimei e determinatii de formarea perechii complimentare dine tripletul anticodon si codonul mRNA cit ide fixarea tRNA de locusul Pal ibozomutu. Aceasti etapa la eucariote este nmult mai com plexa si include o multime de factori (fig, 2.42). MI. Elongatia lanpulwi polipeptidic Kareprezinté un proces repetat. Pentru realizarea lui sunt necesare: complexul menti- onat deja, urmatorul AA-RNA corespunza- tor ripletului ulterior al mRNA, trei proteine solubile citozotice, factoriai elongatiei—Tu, 1s,G siGTP. Procesul decurge in tei faze: a) Aminoacidul urmator activ (AANA) se fixeazi cu Tu si GTP, formind complex ce adifioneaza la complexul de initiere. Simultan, are loc hidroliza GTP, rezultind abandonarea ‘complexului Tu-GDP de catre ribozom. Ultimule reactivat cu GTP si Ts—in Tu- GTP. AA.ARNA se fixea7a de locusul aminoacidie datorita interactiunii complemen- tare antiparalele intre anticodon si codonul -154- @Codouul de niece _— ‘Anticodonul Figura 240, Formarea complesulit deine FRNA 168 E> _ a aes Ti \ Sat \ Shine-Dalgarno ~< Ribazowul 308 RNA. Figura 241. Segmental complementar Shine-Dalgarno[Componente TIE —— Sabi | QQ | No Trevi | me ee 30S complex de inition me _: e a” Q nin §* ; : ae ——+ + s0sie0s @ 5 8 t 7 — } ggg~ =e S Bowe Spee s~8 eB EXD | Oct ~ ox + wi S ) eae CN SS e cbr ADP Figura 2.42, Formarea complesului de inifiere la pro- i eucariote mRNA. Fixarea adecvata e determinata si de interactiunea in locusul A intre tRNA gi RNA. S-a stabilit perfect cd in bucla TYC se localizeazi unele fragmente ce formeazi perechi cu bazele din 16S rRNA - Ia fixarea anticodonului. in 16S RNA. secventa C-C-A-A este complementari T¥C din tRNA (fig.2.10). Legarea se ‘marcheaz numai dupa interactiunea corecti dintre codon i anticodon — efect alosteric al fixiii (fig. 2.43). 'b) Elongarea continua prin formarea legaturii peptidice intre aminoacizi din locusu- rile P si A. Complexul de initiere cu N-formilmetionina de la tRNA este propriu-zis, transferat pe grupaaminicd a noului aminoacid in centrul A. Reactia ecatalizata de peptidil transferazd, ce intr’ in compozitia subunit3yii 50S si in final se formeaza dipeptidil-RINA, iar in centrul P rimine tRNA liber (fig. 2.44). c) in faza urmatoare ribozomul parcurge pe mRNA spre capitul 3'o distanta egal cuuncodon, cu transferarea dipeptidului tRNA in centrul P, iar RRNA (hidroliza liber) abandoneaza ribozomul si se permuti in citozol. In centrul A seaflaal treilea codon al mRNA. Miscarea, alunecarea ribozomului se numeste translocare. Procesul este ca talizat de o rranslocazi si presupune hidroliza unei molecule de GTP. Procesul e onditionat de existenta factorului de elongare, In aceasti fazi au loc modificdri nformationale a intregului ribozom. El e gata de urmatorul ciclu de elongare La legarea in lant sunt antrenate dou molecule de GTP (fig. 2.44a). ~ 155 -Rigura 243. Etapa Ta clongirii Figura 2.44. Etapa Ha elongri, formarea legdturitpepidice IV. Finalicarea sintezet lanului polipeptidilic (fig. 2.44). Procesul se opreste tune: cind ribozomul intilneste unul dintre codonii nonsens, ce semnifica finalizarea, in ansamblu, actioneaza si factori de finisare—R,, R, $i S care efectueazi umitoarele opera 3) detasarea hidrolitc’ a polipeptidului de la RNA sicliminarea lui (hidrolaza); b)eliminarea tRNA, purtitor al ultimului aminoacid din locusul peptidilics ©) disocierea ribozamntii in subunititile respective, apte s8 resintetizeze un ul kan polipeptidic. Biosinteza proteinelor cere un consum substantial de energie —minimum 4 legituri ‘macroergice sunt necesare pentru formarea unei legituri peptidice, ce asigura ireversi- bilitatea procesului si stabilitatea lui. Lantul de mRNA poate retine mai multi ibozomi ‘impreund, formind polizomi ce accelerea7 considerabil sinteza si eficacitatea matticci (fig, 245) -156-Factor de =) finisare Hirota M00" Aa acon ¢ } CAD * COT etary AAARNA, Disocierea componarisce Co : Misearearbozomilor, Figura 24a, Etapa I elongérit translocarea Figura 244b, Finalizarea sintezei proteinei Daca sinteza proteinei nu e necesara, nucleazele deprima mRNA. in procesul de sintezA sau imediat dupa ea, proteina se autoasambleaza, formind formatia nativa— structura tridimensionala, Probabil lantul polipeptidic sintetizat fer modificiri covalente, mumite modificdri posttranslayionale (prelucrani postira- ieere — faza V), ce constau in: 1) modificarea capatului N- si C-terminal, N - mai frecvent se acetileaza: 2) indepartarea secvenfei semnalizante cu ajutorul unor peptidaze; 3)alasarea unor grupari functionale— fosfat, biotin, glicozil— pentru formarea foproteinelor, carboxikinazelor, licoproteinelor ete.; 4) clivarea unor oligopeptide (preproinsulina); 5) metilarea(lizina in muschi), iodurarea reziduului de trozing in tireoglobulina 66) carboxilarea (inprotrombini a acidului. glutamic);7) formarea puntilor disulfidice; 8) modificarea unoraminoacizilipsti de cod (hidroxiprotina, hidroxitizina etc). Jn ce mod proteina sintetizaté se locali- zeazd in celulii? La capitul N-terminal se pistreaz secven- te specifice- lider — 15-30 de aminoacizi. Ei sunt sintetizati in primul rind si sunt identifica de locusurile receptoral—specifice de pe suprafifa exterioara areticulului endoplasmatic adiacent sintezei complete. Aceast& portiune- lider, de obicei,¢ hidrofobs, liposolubild, uyor piltrunde prin membrand in interioral cistemelor reticulului endoplasmatic si trage dupa sine restal Janfului. Idea originala ii apartine lui George Palade, laureat al Premiului Nobel, original din Moldova. Incistemne, o peptidaz specifica o cliveazi. Proteina maturd in aparatul Golgi este incapsulati, apoi pardseste celula in forma unei bule secretoare (fig. 2.452), in ultima perioad’ se postuleazd dou concepfii de asamblare a proteinelor in forma nativé, structura unicd trispatiala: cotranslajionala si pasttranslationalé. Conform conceptiei cotranslationale, proteinele se aranjea7 spatial in procesul sintezei fanfului polipeptidic in nbozom, rar potrivit concepttei Soevena semaal Citozet Sbnitsbozmile ASB NE PBlipeptid Diretia asi Figura 2.45a. Compartimentalizarea proteinelor in retculul endoplasmatic -158-posttranslationale— forma nativa apare numai in urma eliberarii complete a lantului polipeptidic din ribozom. ‘Suntrezultatele unor experimente biochimice in vivo spe sisteme-model, care confirma ‘conceptul cotranslational de asamblare Deregulé, foldingul proteinelor are loc in compartimentele corespunzitoare ale celulei —mitocondbi, reticuful endoplasmatic, citozolribozomial, Proteinele penetreazi mai multe ‘membrane in calea spre locul de asamblare. Uncle se pot asambla aldturi de membranele corespunzitoare. in citozol si in plasma organitelor celulare, unele proteine se asambleazi cu participarea complexului ciaperonic. Azise potevidentia tre cazuri de asamblare a proteinelor, in dependent’ de localizarea acestui proces: lingd ribozom, in apropierea membrane’ sau cu participarea ciaperonilor. Asamblarea proteinelor lingit ribozom. Stim c& lantul polipeptidic paraiseste ribozomul intr-un anumit mod: incepind cu capsitul N-terminal si, consecutiv, parcurge, segment dupa segment, lantul din centrul polipeptidilic— prin canatul ribozomial ingust— spre suprafata ribozomului, cu iegirea cotraslational in citoplasmd. Daca lantul polipeptidic nu are secventa-lider, el mu este transportat si se asambleazt in citoplasmi linga ribozom. in ce constau mecanismele de asamblare, ce reprezinta acest model? Asamblarea incepe cu momentul translocarii primufui rest terminal-N al Janfului din ibozom in citozol (de laacest moment au loc modificari conformationale sub influenta forfelor moleculare, ce cauzeazsiasamblarea proteica). in continuare, asamblarea are loc simultan, cu translocarea lantului, $i se finiseaz4 dupa iesirea ultimului C-rest terminal din ribozom. - Asamblarea are loc in etape consecutive, analogice cu ciclurile de translocatie a Jantului din ribozom, Numérul de etape e identic cu fenomenul de translatie la sinteza Janu ~ La fiecare etapa se formeazs o conformatie a capatului N-terminal al lantului ce iese din ribozom, Aceasta este o structuri initial in formarea conformatiei unui lant mai lung inetapa urmatoare a foldingului (are loc scindarea unor legaturi moleculare, eu formarea altora). ~ Elementele de structura secundara (ct—spatial, ~ lant, domeniile) formate in fiecare etapi a foldingului se distrug, se modificd sau pot rimine nemodificate in etapa urmitoare - Formarea unei conformatii a lantului sintetizat la toate etapele foldingului, precum si a conformatiei native a proteinei la ultima etapa, dureazi nu mai multdecit este necesar ribozomului pentru realizarea unui ciclu de elongatie. Durata foldingului este egal cu ‘timpul sintezei lantului polipeptidie de ribozom. Sunt propuse si citeva concept referitoare la mecanismul asamblitii cofranslafionate: a) edeterminata de viteza de translatie a diferitelor seamente ale lantului polipeptidic; b) edeterminata de viteza de translatiea diferitelor segmente din mRNA, cauzatd de Jasterele codoanelor rar intilnite, cit side codul degenerat: ) alti conceptie sustine ci modificarile conformafionale temporare sunt determinate “codoanele” aminoacizilor initiator i terminal pe suprafata o-spiralei. = 159-Cualte cuvinte: structura secundari, tertiar proteici nu e dependenti de resturile aminoacidice din lantul polipeptidi Asamblarea lingié membrané.Teanslocatia lantului polipeptidic prin membrand are loc prin canalul respectiv membranar si coincide cu periodicitatea ciclului de elongatie ribozomiald. Se presupune cd procesul de asamblare Hing’ membran’ pe partea opusiia organitelor celulare este analogic cu schema propusi la asamblarea proteinei ling’ ribozomi, Se consider’ ci regiunea suprafefei respective, unde are loc asamblarea lanulut polipeptidic in structura nativa, confine resturi de aminoacizi polaris foarte hidratata, Acest fapt proteyeaza lanful de interactiune cu complexul translocafional proterc. Schema propusd presupune c& asamblarea proteinelor este un proces dinamic de autoorganizare a structuri spatiale a lanqului polipeptidic, ce incontinuu se alungeste, in functie de etapele de timp. in compartimentele celulei indepatate de ribozom, lanturile polipeptidice se vor asambla posttranslational, adic’ dupa finisarea sintezei lorinribozom (cu exceptia acelor proteine care se sintetizeazi in ribozomii aliturati la membrana reticulului endoplasmatic) Conform acestei ipoteze, asamblarea cotranslationali a proteinelor indic faptul cd asamblarea lanfului in structura nativ are loc simultan cu translocarea lui in locul de asamblare. Foarte multe aspecte sunt neelucidate. Unele proteine, primar find native, pierd structura tertiari rigid la interactiunea cu membranele. Asemenea modificari sufera toxinele, diversele proteine de transport, Datele confirma ci membrana poate servi ca factor denaturantin celula vie, cauzat de prezenta in membrani a sarcinii negative. Acest potential electrostatic al suprafetei membranare manifest o atracjie a proteinelor din solutie, cauzind micgorari locale de pH pe suprafata ei, cu formarea unui gradient de pH. in microspatiu. Se considera ca acest fapt, in ansamblu cu micsorarea permeabilititii dielectrice a mediului, poate transforma molecula proteicd in stare denaturati cu proprietitile caracteristice globulei in fuziune—starea a treia termodinamic’ a molecule proeice. Una din caracteristicile moleculei proteice nenative este proprietatea ei majora de asociere. In procesul de renaturate, proteinele sunt capabile si formeze asociatii de intermediate, Anionii sunt capabili si inducd fn proteinele globulare, partial denaturate, asociati, care se amplificd odata cu diminuarea confinutului de structurd secundara Se consider’ c& asocierea proteinelor ¢ o problema cardinal in biomedicind gi biotehnologie, fiind cauza unorastfel de maladii ca: boala Down, mieloma, cataracta, afectiunile «prion». {In conditit extremale, adaptarea e cauzata de mutatiile la nivelul DNA si al proteinei cu participarea unor grupe prostetice, care pot stabiliza atit starea nativa, cit gi intennediatele foldingului. S-a constatat experimental c a) glicozilarea majorea7 mult stabilizarea si solubilizarea proteinelor, ») glicozilarea nu modificd mecanismulfoldingului sal asociatie proteice; ©) componenta glucidici, gratie capacitatii solubilizante, protejeaza partea proteicd de agregare termicé, manifestind un efect ciaperoninie, -160-