EXPRIMAREA ACTIVITATI ENZIMATICE Pentru aexprima activitatea enzimei sunt necesari urmitori factori: ecuafia sumard a reactiei; metoda de analiz’; cofactori enzimei, ionii sau coenzimele ei; valoarea constant dup Michaelis; pH si T'C optime. {in practica biochimic’ curentd sunt importante varatiile de activitate, sinu activitatea absolut, Se ia o anumit& unitate arbitrard, care serveste drept referint - Unitatea Internafionali(U.L) e acea activitate enzimatica ce asigura conversia 1 mol de substrat intt-un minut in conditi standandizate de pH, T°C (25-30). Cofactorii sialte conditiioptime asiguri actiunea enzimelor - Katalul (kat) constituie activitatea care asigurd transformarea unui mal de substrat {ntr-o secunda (Imkat = 60 U.),(1 U.L. = 16,67 nkat), ‘Semai uilizeazit: ~ activitatea specified —numirul de U.1. cu refering’ la Img proteind; -activitatea moleculard -numarul de molecule de substrat transformate de eatre 0 molecuki de enzim’ intr-o secund — numdrul turnover ( carbanhidraza - 36 milioane pe minut, catalaza - 40,000.000/sec.); ~activitatea oxidoreductazelor cu coenzima NAD* sau NADP* se exprimi prin cresterea sau descresterea extinctici la 340 nm (absorb numai formele redusc). Ca unitate serveste cresterea sau scZiderea cu 0,001 a extinetiei intr-un minut. La reactiile fermentative ale metabolismutui au parte enzimele care se leagi cu moleculele diferitelor substraturi, Exemphu: E Glucoza + ATP —* Glucozo-6-P + ADP (E - hexokinaza) Reactiilecu participarea a 2 si mai multe substratur includ transferul atomilor sau ‘grupelor functionale de la un substrat laaltul. Atare reactii decurg in dou’ moduri. Primul tip de reactii —reacqii de substitufie unitara: 2 substraturi A si B se leaga specific sau sporadic cu enzima, rezultind formarea complexului EAB cuseindarea hi in Csi D (fig.1.23); al doilea tip de reactii—reactii ce decurg conform mecanismului suhstitupici duble (de tipul «ping-pongy). inastfel de reactii CA al enzimei in fiece moment leagii un substrat. Figura 1.23, Reactif de substitute wnitard Aditionarea primului substrate insofti de transferul grupei funcfionale pe enzima ‘mumai dup eliminarca produsului format din primul substrat poate si aditioneze la enzim sial doilea substrat, dupa care si receptioneze grupa functional: AX+B —> A+BX (fig. 1.24), = 68-Higura 1.24, React de suostiupie dubta Am accentuat ci enzimpa accelereaza viteza reactilor catalizate de 10° - 10 ori. Ureaza la pH=8 si T=20 C mitreste viteza reactiei de 10" ori Care este mecanismul ce atribuie enzimelor o activitate intensdi in condititatit de subsile? Suntantrenati4 factori decisivi: 1. Apropierea si orientarea substratului de grupa catalitica. Legitura chimic& explorati a substratului se afl nu numai foarte aproape, dar si direct orientatd fala de grupele catalitice. in consecinta, probabilitatea cA complexul ES va atinge starea de ‘wanzitic se amplific. 2. Tensionarea si deformarea sunt intr-o concordan{S indus: alipirea substratului produce modificari conformationale in moleculaenzimei, tensionind structura CA, concomitent deformindu-se si substratul legat, ceea ce favorizeazi atingerea stirii de tranzitiea complexului ES. Apare concordanta indusi, adica modificari fn structura terfiard si cuaternara a molecule’ enzimatice. 3. Cataliza generalit acido- bazied. In CA al enzimei conlucreazi grupe specifice ale resturilor de aminoacizi, servind drept donatori sau acceptori de protoni. Grupele acide si bazice reprezinti catalizatori efectiviai multorsubstante organice din solutile apoase (fig.1.2: —co0; —SH; —OH; —NH;; ~|/—— 4.Cataliza covalenti. Enzimele reactioncaza cu substraturile, formind compusi F: nestabili legati covalent, care in reactiile ulterioare formeaza produsul reactiei mult mai rapid decit in reactiile necatalizate. Compusul covalent e nestabil sise hidrolizeazai mult mai rapid decit R. RX + E-OH —- R-OH + EX => EX + HOH —> E—OH + HX -69-Enzimele stinwuleaza diferite provese metabolice in cetule,fiind organizate fn sisteme (sau complexe) multienzimatice, in care enzimele activeaz coordonat. Ele genereazi reactii succesive ale unci anumite ei metabolice. Produsul primei reactii din astfel de sisteme devine substrat pentru cealaltd enzima. Sistemele multienzimatice pot include 15 si mai multe enzime, care activeaz intr-o anumit succesiune. in fiecare sistem exist un ferment cu rol de dirijor, care determina viteza tuturor reactiilor catalitice din lant, fiindca catalizeaza stadiul-limiti adica reactia cea mai lent, ce determina viteza procesului in intregime. Enzimele de acest tip indeplinesemu numai functiacatalitica, dar si cea de modificator al propriei activitdi( jt ), ca respondente la diferite semnale. Ca rezultat, fiecare reactie metabolic isi schimba viteza, fapt ce conduce la adaptari rapide. in conditiile noi apare o adaptare imediati, de avarie. in aceasta categorie logic se include transformarea enzimei neactive in activa, sub influenfa factorilor atit specific, ct ginespecifici. in majoritatea sistemelor multienzimatice fermentul-dirijor catalizeaz’ prima reacfie din langul lor consecutiv. Cantitatea suficienta de ceilalti fermenti determin activitateacatalitic’ intensiva,indeplinind indicatiledirjoruluisintensificindu-siactvitatea Jacresterea cantititii de substrat. Enzimele, activitatea cdrora se gaseste sub influcnta unor semnale molecu- are, sunt numite enzime reglatoare. Exists 2 clase de astfel de enzime: una — alosteric reglate (Allo stereos ~alt loc) de modulatori ce se fixeaz necovalent, si a ‘doua—enzime ce se regleazai prin modificari covalente. ENZIMELE ALOSTERICE. Fle poseda cu totul alt sau alte centre decit cel activ, in care sunt fixafiliganzii. Ce le este caracteristic acestor enzime? 1. Posed, ca si toate enzimele, centru catalitic, unde se fixeaza si se modifica sub- stratul, dar mai posed un alt centru care are o pozitie spajial& pentru. fixarea ‘metabolitului reglator, numitefector sau modulator. Acest centru e specific pentru fiecare modulator. 2. Moleculele enzimelor alosterice sunt ‘mai mari, mai complexe si primordial Mioglobina oligomere pare. a 3. Aucinetica lor —viteza reactiilor, in Fr dependenta de concentratia substratuli, are forma sigmoidal, dar nu hiperbolica, cauzata de urmarile interactiunii intre protomeri ce leaga substratul in mod cooperativ (exemplu — mioglobina si hemoglobina —fig.1.26). Exist 2 tipuri de enzime alosterice: 3 Hemoglobina Saturarea cu O, tori a) homotrope in care modulatorul si 8 ea substratul constituie aceeagi substanfa. 1267 2a) kM GON Acumularea substratului activeaza viteza Figura 1.26. Curbele de oxigenare. ale reactici catalizate de aceasta enzima: ae) ee -70-Hexokinaza | Glucoza+ATP > G-6-P+ADP (dealtfel, ca sialcootul ee activeaza enzima ceil scindeazi -aleooldehidrogenaza), b) heterotrope —enzimele sunt reglate de 4 modulatori care diferd dupa structura de | substrat, multi dintre ci avind actiune antipoda. * La fixarea modulatorului, enzimele alosteric« ‘modificd conformatia. Modulatorii accelereaza sau inhiba utilizarea substratului de enzima respectiva (fig. 1.27). s Unele sisteme enzimatice manifesto parti-. Figura 127. Inluente modulaoritor cularitate deosebité: produsul final al sistemului Seactitor caralisate de ensimele ulasterice inactiveaza enzima—unrezultatal activititi mai productive a sistemelor multienzimatice, decit e necesar ma celulei. Acest produs final actioneaza ca un inhibitorspecific | be alprimei enzime si, ca rezultat, viteza sistemnului se echili- | eon breazi in corespundere cu cerinfele celulei - retroinhibi- gie sau inhibite prin produs final, inhibitie de tip feed back. Transformairile L-treonina —~ L-izoleucina necesiti E Glicogen, +P —~ Glicogen, , + Glucozo-1-P | e, [goin 5 enzime. Prima enzimi e treonindehidrataza, inactivati de izoleucin’, modulator ce se fixeazd in CA. Este un ls cexempluclasic de reglare necovalenta sie reprodus in i i fig. 1.28. i; 8 Se inregistreazd enzime reglatoare, labbaza activatii t ia ‘cdrora se atest modificiri covalente ale moleculei: c Enzima fosforilaza A (forma activa constituie un dimer compus din 2 protomeri identici, fiecare avind restspecitic de serind, fosforilat pe grupa OH) catalizeazi reactia. Fosfataza fosforilazei cotalizeaza hidrolizalegaituri P cuserina si transfer F «A» in F «B» mai putin activa. Kinaza fosforilazei catalizeaza transferul grupetP de la ATP la OH serinei si reactiveaza activitatea enzimei Lioteacine (B” —> "A")(fig.1.29). me ‘Trecerea dintr-o form inalta¢ insofita de modificari ale Figura 1.28, Inhibigia de tpul feed structuri cuatemare ceatinge centrul activ, regleazatactivitatea Patacinlcattati tee tueeetune enzimei. Asocierea protomerilor“B”activeazi “A”, de encime. Treonindehidratca EZ, Reactiile catalizate de enzimele alosterice sunt este inhibata de produsul final” ireversibile, au AG - negativa. Exista si alte modificari covalente ale enzimelor —metilarea resturilor de ami- noacizi, adifionarea adenilatulu et.(fig.1 30) i=Launele enzime foarte complexe activitatea ou on poate fi reglatd atit covalent, cit si necovalent. en, CO categoriedeenzime sunt sinttizatein forma amon neactiva de precursor, care se _activeaza la o proteoliza limitata (proenzimele). Exempl Ienzimele digestiei ce scindeaz’ proteinele jan, in stomac i duoden-pepsinogenu!, chimotripsi- Fosters ee wal nogenul, tripsinogenul, proelastaza, procarboxi aio 2an0© peptidaza; * 2) coagularea singelui e determinati de® ” avalanga de reactii cuactiune protealitica; 4 3)hormonii proteici (insulina); z . 4) proteinele fibrilare (colagenul). woes Existi o grupa de proteine-enzime, starea activ a cirora.¢ conditionatiideimpachetarea spontans a a oa oon a moleculelor cu formarea unei structuri tridimensionale caracteristice enzimei date (izozim), Modificdrile covalente de aminoa A nceep- ‘modificirile covalente ate ADP ne 6 , Fosforilerea Tyr, Ser, Thr, His ate Pi Enz 2 Be P—O-CHy 9 Adenine Tye Adenilarea o — # H ure Pri ° on OH Enz S—Z> Enz—P—0-CHy.0._Uracilul Tyr Uridilaren & ©. fe H u On On NAD Nicoinamida eg fie Eas CHs—-O~P—O-P—O-CH 9. Adenina ADP-ribozilarea —_ te be ee " H 8 i OH OF OH OH Sedenoril —S.adonozt ‘Arg, Gln, Cys Metilarea meine homoriveia Bi ee He a, Gu Figura 1.30, Exemple de modificiri covalent ale ifertelorenzime 7in 1922 AL. Fleming descoperi, intr-un mod deosebit, lizozimmul, iar in 1929 tot dinsul descopera sipenicilina, Mecanismul interactiunii alosterice in 1965 savantii J. Monod, J. Wyman, J. Changeux au ‘propus un model fin siclaral interactiuniloralosterice (MWC) —modelul simetrie sau “‘concentrat”, avind urmitoa- rele caracteristici cardinale (fig.1.31): | enzima alostericd este compusi din 2 subunit identice, simetrice, can centruaetiv, centrele fiind echivalente; 2. enzima (oligomerul) poate exista in dowd stiri: T- tensionata (constrinsa), cu afinitate mic de substrat, si R- relaxati, cu afinitate mare de substrat; 3. conformatia fiecirui monomer este constrinsi. de asociereacu ceilalfi monomeri; 4, formele T si R pot trece din una in alta si se afl in echilibruT == R; 5. pentru acest model se face o excepfie: intrua pistra simetria dimerului, ambele subunititi trebuie sii adere la acecasi conformati. in lipsa substratului, toate moleculele se afla in forma T (la 10* molecule —o molecu poate cdpata forma R). Prezenta substratului modified conformafia, ducind ta aparitia formei R. Cind substratul se leaga cu centrul activ, celilalt la fel trebuie si se afle in R - stare. Trecerea de la T la Ri viceversa se produce coordonat. La aditionarea substratului partea moleculara a enzimei in starea R progreseaza si fixarea substratului devine cooperativa. Lao saturatie completa toate moleculele enzimei se fixeaza inR stare. Inhibitorul se leagi eu forma T, activatorul —cu formaR, astfel efectele homotrope devin povitive, iar celeheterotrope —pozitive sau negative (fig. 1.32). D.Koshland, G-Nemethy si D.Filmer (KNF) propun. Fi + A ‘| a Figura 1.31, Modelut simetrc defisare cooperativa fe substranulul Inhibit alosterc La Y Format Activator alosterie Fora igura 1.32.Jnhibitoral alosteric modelul secvengial, mai clasic (ig.1.33). Bazaluiconstituie "Sptecer “forme pe cd trei postulate: ‘ectivatornl respectiv—forma R 1 fiecare monomer poate exista in una din conforma- tiile posibile- T sau; 2. fixarea substratului modified forma doar a unei subunitii, cealalté nu sufer modificdri vadite; 3, modificérile conformationale determinate de substrat la 0 micsora afinitatea la substrat a celorlalte subunititi. Fixarea Deosebirile intre modele: cel simetric nu presupune echifib lipsa substratului, dardin contra, fixarea substratului induc 2. subunitate pot mati sau este cooperatival tre formeleR siTin etrecereaT —» Rin acest model esentiali este simetria monomerilor. Modelul secvential denoti cd trecerea de la T la R in diferite subunititi are loc coordonat si intr-o anumita suecesiune. Unrol J primordial are forma hibrid RT. Monomeriiinteractioneaz8 cu TT conditia prezentei formei conformagionale diferite. in ultimul model 4ps (seevential) efectul substanfelor homotrope poate fi pozitiv gi negativ. Fixarea de enzimaa dou molecule de substrat depinde ~~ 2 efectiv de natura modificarilor structurale, determinate de fixarea primei molecule de substrat. Recent se considera cA aceste modele reprezinti doua cazuri TR aparte de interactiune. in realitate eae mult mai complex’, de- 4s pendenta de particularitatile structurii cuatemnare, tertiare ete. E stabilit cd sub actiunea guanidinhidroclorurei (G,HCI) saua ureei inactivatia unor enzime are loc ka concentratii relativ mici ale agentilor denaturangi, in care nu se observ modificari globale in conformatia moleculei. Studiile recente confirm ci pierderea RR activitii fermentative e determinati de micsorarea interactiuniiin Figura 1.33. Modetel molecule ce are, drept consecinti, cresterea mobilititii parti ei El (reactie ireversibils). Inhibifia ireversibild prezintd urmitoarele caracteristic: 1 Inhibigia se accentueaz progresiv, pin la inksturarea complet aactivitiiienzimatice simu poate fi anulata prin indepartarea inhibitorului. 2. Se datoreazi unot modificari covalente si permanente ale grupitilor funefionale | necesare catalizei, transformind enzimele in molecule inactive, 3. La inceput, acest tip de inhibitie este incompletd, dar creste pe durata timpului, pe misurl ce apar modificdtile chimiice respective. Aproape tot inhibitoriiiteversibili sunt substante toxice, fiind numite si «otravuri enzimaticen. Amintim in acest sens acidul iodacetic, DIPFP, metalele grele, compusii arsenici, etc. Acestia interactioneazii cu radicalii aminoacizilor din centrul activ al enzimei, cesentiali pentru structura gi functia acestuia, Exemple: Diizopropilfluor fosfatul (toxina neuroparalitic’) se fixeazi de grapa OH aserinei in CA al acetilcolinesterazei cu formarea enzimei neactive: HyC—CH—CH, HC—CH~ CH. ¢ ° r-p=0 + B-CHOH — E-CH;-O—P=0. + HF 6 é H,C—CH—CH HyC—CH—CH3 Todacetamida se fixeaza de cisteina din centrul activ al enzimelor: ICH, C—NE, + E-CH,—SH —= E~CH;—$—CH,— C—NE, + Hl oO Paraclormercur benzoatul de asemena leagi grupele SH din centrul activ: COOH Hg-S—CH,—E “75+Ca surse nedietare de cianide poate fi nitroprusidul de sodiu (agent hipotensiv), succinonitrilul (agent antidepresant), acrilonitrilu, cit si furnul de tigara. Expozitia cronicti se manifesti prin demielinizare,leziuni ale nervului optic, ataxia si depresia Functici glandei trode, Intoxicatia acuti cu cianide necesita un tratament rapid. Baza biochimica a tratamentului efectiv consta in crearea unui complex nontoxic al fiero-porfirinei Administrind nitritii (NaNO, - intravenos, amilnitrita - inhalatie) convertim portiunea de hemoglobin’ normal’ in methemoglobind (Fe). Ultima e capabili si fixez complexul CN-citocromoxidazic eliberind citocromoxidaza si generind cianmethemoglobina. Methemoglobina este reintoarsi in proces gratie activititii rodanazer (tiosulfat-cianid sulftransferaza) ertrocitare, care va transforma tiosulfatul in tiocianat, CH) =CHCN Oxihemoglobina [Hb,0.(Fe**]] ‘Acrloniteill| wii (NOD) NapFe(CN)s-NO K Nitroprusidul de sodiu —— ‘Methemoglobina (MetHLOH(Fe™*)] NCCH;CH,CN Sie [eivaay Fe CN] Cita; (Fe*}] Cianmethemoglobina ot (8:03) Rodanaza sult (SOS) Methemoglobina + Tiocianat (SCN ) Lao inhibitie reversibili echilibrul dintre enzime siinhibitori se instaleaz repe- de. Inhibitia revesibité prezint& urmitoarele caracteristici 1. intre enzimi gi inhibitor se formeaz& un complex El, E+1 =~ El (reactie reversibild). Reactiafiind reversibili, inhibitia poate fi inlaturatd prin deplasarea echilibrului spre stinga, cu regenerarea enzimei. 2. Se poate defini si o constanti de disociere a inhibitiei complexului EI: Est ET EIU TEL] 3 Inhibiia reversibila poate fi competitiva, uncompetitiva si necompetitiva La inhibitia competitiva inhibitorul se fixeaz& de centrul activ al enzimei, ca Uurmare aafinititii structurii cu substratul, coneurind cuel si impiedicind fixarea lui Ki -16-Nue posibild fixarea simultand asubstratuluisi inhibitorului, Enzima va fixa acel competitor care se acuruleaza intr-o coneentratie mai mare. Inhibitia competitiva dimimu- az viteza catalizei, micsorind cota moleculelor de enzinna fixatoa- reale substratului, Se poate prevedea efectul unor eS inhibitori pentru o cnzima dati, Figura 1.34. Reprecentarengrafcd a ecuatich utilizind ecuatia Lineweaver-Burk ——_ Lineweaver-Burk ~0 form’ invers reciprocaecuatiei Michaelis-Menten. Grafic este reprezentati in fig. 1.34. W,=1W,,. x Ky{S]+ VV, Lk 1 incazulinhibitiei competitive: 37> vie gat Gy ve Analizind aceasti ecuatie se constati ci daci concentrata S creste foarte mult, 1/[S] tindesprezero, iarecuatiadevine: 11 Vo Virax in inhibitia competitiva, unde are loc interactiunea de tipulE+T == El, Ky ereste, V.., rimine nemodificata, panta curbei L - B variaza la intersepta constanta (fig. 1.35 asib). Prin urmare, in cazul inhibitiei competitive viteza de reactie poate atinge Vmax, ca sicum inhibitorul na ar fi prezent, daca se mareste suficient de mult concentratia substratuui, Inhibitoriicompetitiviinsi mirese considerabil panta curbei K,,,sciizind afinitatea enzimei pentru substrat. Se observ ci adiugarea inhibitoruluinumodifici Vmax, deci Figura 1.35a. Curba Michaelis-Menten in absenya si atingiindu-se viteza maxim’. Inacelagi precentainhibitortor competi. 4) fra inhibitor: b) en canta mc de innibtor: cy M™MPerestemultK,, scizind afinitatea ‘eu cant mari de inhibitor enzimei pentru substrat, -CH;~ COOH =24—= Hooe—cH=CH—CooH Aci succinic FAD PADH, Aci famarie -71-E+S =~ES —-E+P ww . I ) | K, (B\ a » Ie ®,) © Ho, er i Be Figura 138b, Jnhibite competitva Te cath el >) fa inhibitor ‘Ostructura similara o au acizii malonic, oxalic, malic, care pot servi drept inhibitori competitiviai SDE HOOC—CH,—COOH HOOC—COOH HOOC—CH—-CH,~COOH ‘Acid malonic Acid oxalic OH Acid malic Inhibitorul nu se scindeaza fermentati. O particularitate esentiald consta in faptul ci efectul se inlturd la cresterea concentrajiei de substrat (succinat). Acest principiu st la baza tratamentului intoxicafilor cu erilenglicol (CH, OH),,component al antigelului Produsul oxidarii, (COOH),, este toxic si apare’ ca rezultat al actiunii alcool dechidrogenazei (ADH), Crstalele de oxalati usor se precipita, dereglind functlerinihilor. Administrarea etanolului in doze aproape toxice inhibi reactia de oxidare si etilenglicolul se elimina din organism fara consecinte grave. CH,OH (metanol) (CH2OH); (ctilenglicol) ston! @ | ADH 4metipirarot ©| ADH : oO HCHO (formaldehida) cHonc® (glicoaldehida) H HCOOH (acid formic) | CH,OH-COOH (acid glicolic) HOC-COOH (acid glioxilic) C02) HCOOH (acid formic) (COOH), (acid oxalic) -18-Acelasi mecanism sti la baza tratarii intoxicarilor cu metanol. Produsul oxidarii este aacidul formic (HCOOM), Foarte sensibile la intoxicatii cumetanol sunt cetuleleretinei ‘ochiului, sistemului nervos central (depresie). O terapie intirziata include hemodializa gi administrarea bicarbonalilor exogeni. categorie important’ de inhibitori competitivi sunt sufmidele si derivati respectivi Actiunea antibacteriani a sulfamidelor consti in substituirea acidulwi p-aminobenzoic (PAB) din acidul folic, indispensabil pentru cresterea microorganismelor, impiedicind dezvoltarea lor. Metabolismul in organismul gazdei nu este afectat deoarece acidul folic este asigurat de aport alimentar. Eficacitatea sulfamidelor e dependenti de cantititile administrate, Lao inhibitie necompetitiva, dar reversibila, inhibitorul si substratul se leaga si- multan cu enzima, dar locusurile suntdiferite. Actiunea inhibitorului consta in miesoratea numarului tumoveral enzimei, dar nu si a numdrului de molecule de sub- strat, Marirea concentratic de substrat nu micsoreaza inhibitia. Inhibitia necompettiva prezinta unnatoarele caracteristici: 1 Intre inhibitor si substrat nu se realizeaz3 o competitie pentru ase lega de enzima. 2. Inhibitoral mu prezint& asemanari structurale cu substratul 3. Inhibitorul se leaga de enzima in alt loc decit centrul activ. 4. Inhibitor necompetitivi scad V,,.., darnuatecteazi K,,. Deoarece inhibitorii se leagi de enzimi in alt loc decit centrul activ, este posibila formarea complexului ES, citi complexului ESI. Deoarece complexul ESInu se poate nda pentru a forma produsul de reactie, lao vitezi de formare a complexului ES mai mare decita complexului ESI, reacfia este incetiniti, dar nu opr Laoinhibitie necompetitiva (noncompetitiva) de tipul E+] == El si ES+I1 == ESI, K, mu se modific’, V,, descreste, iar panta $i intersepta variaz& (fig. 1.36a $ib). SCobservicd /V_,, reste, deci in inhibitia necompetitiva V,. seade, Practic, in cazul inhibi necompetitive inbibitorul, chiar daci nu se leagi de centrul activ al enzimei, actioneaza asupra acesteia deformind- 7,8-DHF +NAD(P)H + Ht 1.6. Enzimele ce aetioneaz asupra grupelor NADH sau NADPH ca donatoare. 1.64.2. NAD(P)H: glutation-oxidoreductaza (glutation reductaza). NAD(P)H +H*+GSSG == NAD(P) +2GSH 1.8. Enzimele ce actioneaz asupra grupelor ce contin sulf ca donator. 1.8.4.1, Glutation: homocistin-oxidoreductaza (glutation-homocistin transhidrogenaza). 2GSH +Homocistin =~ GSSG +2Homocistein. 1.11. Enzimele ce actioneaz asupra H,O, ca acceptor, 1.11.1.6.11,0,: HO, - oxidoreductaza (catalaza). HO, + H,0, == 0, + 21,0 1.1.1.7. Donator: H,O,- oxidoreductaza (peroxidaza). Donator + H,O, == D, +2H,0 1,99. Alte enzime ce utilizeazi O, ca oxidant -lipooxigenaza, homogentizat oxigenaza ete. NH ca donatoare. - oxidoreductaza (tetrahidrofolat 2. Transferazele sunt enzime ce catalizewz’ transferul grupelorfunctionale (G) (diferite deatomul dehidrogen) delaun substratlaaltul: SG + S'==S'G + §. Catalizeaza aceste enzime transferul grupelor: monocarbonice(), cetonice sau aldehidice (2), acil (3), glicozil (4), azotice (6), ce contin fosfar (7) sisulf (8). Unele exemple: 2.1. Transferl grupelor monocarbonice. 2.1.2.1. L-serina: tetrahidrofolat-10-oximetiltransferaza (serin-oximetil- transferaza). L-serina + THF <> Glicina+ 10-oximetil- THF 2.2, Transferul grupelor aldehidice gi cetonice. 2.2.1.1. D-sedoheptulozo-7-fosfat: D-gliceraldehid-3-fosfat-glicolaldehid transferaza (transcetolaza). D-sedoheptulozo-7-P+D-GA-3-P_ == D-R-S-P+D-X-5-P 2.2.1.2. D-sedoheptulozo-7-fosfat: D-gliceraldchid-3-fosfat-dioxiaceton transferaza (transaldolaza). D-sedoheptulozo-7-P + D-GA-3-P == D-l 2.3. Transferul grupeloracil. 2.3.1.6. Acetil-CoA: cholin-o-acetil-transferaza (cholin-acetil-transferaza) Acetil-CoA +Cholina == Coa +0-Acetil-cholina, 2.6, Transferul grupelor azotice. 2.6.1.1, L-aspartat: 2-cetoglutarat-aminotransferaza (aspartat-aminotrans- feraza) L-aspartat +2-cetoglutarat_ =~ Oxaloacetat + L-glutamat -P+D-F -P -84-2.7. Transferul grupelor ce congin fosfor: a) ca acceptor serveste grupa alcoolica: 2.7.1.1, ATP: D-hexozo-6-fosfat transferaza (hexokinaza). ATP + D-hexoza ADP + D-hexoz0-6-P 2.7.1.1]. ATP: D-fructozo-6-fosfat- | -fosfotransferaza (fosfofructokinaza) ATP +D-F-6-P == ADP + D-F-1,6-diP 2.7.1.40, ATP: piruvat-fosfotransferaza (piravatkinaza) ATP + Piruvat ADP + Fosfoenolpiruvat ) caacceptor serveste grupa fosfat: 2.7.43. ATP: AMP-fosfotransferaza (adenilatkinaza): ATP +AMP == ADP + ADP 2.8. Transferul grupelor ce contin sulf, 2.8.2.1. 3*fosfoadenilil-sulfat:fenol-sulfotransferaza (arl-sulfotransferaza) 3-PAS +Fenol =~ Adenozin-3',5'-diP + Aril-sulfo-cter. 3. Hidrolazele catalizeazi reactiile de hidroliza, cu utilizarea moleculelor de apa. 3.1. Actioneazi asupra legaturilor esterice. 3.1.1.3. Hidrolaza esterilor gliccrotului (lipaza). Trigliceraldchida+H,O —~ Diglicetaldchida + Acid gras. 3.2. Actioneazi asupra compusilor glicozilic. 3.2.1.1. cel,4-glucan-4-glucano-hidrolaza (ct-amnilaza) Hidrolizeaza legaturile 1-4 in polizaharide. 3.3. Actioneazi asupra legaturilor eterice. 3.3.1.1. S-adenozil-L-homocistein-hidrolaza (adenozil-homocisteinaza) S-adenozil-L-homocisteina+H,O —» Adenozina+L-homocisteina 3.4, Actioneazi asupra legtturilor peptidice. 3.4.1.2. Aminopeptidaza. Hidrolizeaza di- si tripeptidele, scindind restul ‘N-terminal. 3.4.4.1. Pepsina, Hidrolizeaza peptidele prin grupele aminice ale aminoacizilor aromatici sau ale acizilor dicarboxilici. 3.5. Actioneazi\ asupra legiturilor CN. 3.5.1.2.L-ghutamin-amidohidrotaza (ghutaminaza) L-glutamina +H,0 —» L-glutamat +NH,* 3.5.1.5. Carbamid-amidohidrolaza (ureaza) Ureea + HO —» CO, +2NH, 3.6. Actioneazi asupra legituritor anhidri 3.6.1.8. ATP - pirofosfohidrolaza (ATP-aza) ATP + HO —» AMP + PP, 4, Liazele catalizeazi aditia la legiturile duble sireactiile inverse. 4.1.C-Cliazele 4.1.1.1. Carboxiliaza 2-cetoacizilor (piruvat decarboxilaza) Deetoacid —~ Aldehida’ + CO, 2854.1.2. Aldchid-tiazele. 4.1.2.7. Cetozo-1-fosfat-aldehid-liaza (aldolaza). Cetozo-1-P —» DHOAP + Aldchida. 4.1.3. Liazele cetoacizilor. 4.1.3.7. Citrat-oxaloacetat-liaza (CoA acetilati) (Citrat-sintaza sau citrat -enzima de condensate) Citrat + CoA —> Acctil-CoA + Oxaloacetat 4.2. C-O liazele, 4.2.1.2. L-malat-hidro-liaza (fumnaraza) L-malat —» Fumarat + H,O 4.2.1.3. Citrat-hidro-liaza (aconitaza), Citrat_ —» cis-aconitat + H,O 5. Izomerazele determini transferul grupelor in interiorul moleculei, cu formarea izomerilor, 5.1. Racemazele si epimerazele. S.1.1.1. Alanin racemaza, L-alanina —» D-alanina. 2. UDP-glucozo-4-epimeraza. UDP-glucoza == UDP-galactoza, 5.3. Oxidoreduetazele intramoleculare. 5.3.1.1. D-gliceraldehid-3-fosfat-cetoizomeraza (triozofosfat-izomeraza) D-GA-3-P DHOAP 54, Transferazele intramoleculare. 5.4.2.1. D-fosfoglicerat-2,3-fosformutaza (fosfogliceratfosfo mutaza) 1-3-P-D-glicerat 2.3-P-Deglicerat. Su 6. Ligazele catalizeazi reactiile, formind legaturile covalente cu utilizarea ATP. 6.1. Formarea legaturilor C-O. 6.2. Formarea legaturilor C 6.2.1.1. Acetat: CoA-ligaza (ATP) (acetil-CoA-sintetaza) ATP + Acetat + CoA — AMP + PP, + Acetil-CoA 6.3, Formarea legaturilor C-N. 63.23. y-L-glutamil-L-cistein: glicin-ligaza (ATP)(glutation-sintetaza) ATP + y-L-glutamil-L-cistein +L-glicina —- ADP+ P+ GSH 6.4. Formarea legiturilor C-C. 64.1.1. Pinuvat: CO. ligaza (ATP) (piruvat-carboxilaza), ATP + CO, + Piruvat’ —~ ADP + P, + Oxaloacetat 6.4.1.2. Acetil-CoA: CO,-ligaza (ADP) (Acetil-CoA-carboxilaza). ATP + Acetil-CoA + CO, —~ ADP + P,+ Malonil-CoA. = 86-COENZIMELE Drept constituenti coenzimatici servese vitaminele. Ele nu reprezinta materie structural (de fetul proteinelor, glucidelor,lipidelor), nuau valoare energetic’, dar participa Ja multiple si variate reactii metabolice. Pentru indeplinirea acestor roluri functionale | organismul are nevoie de cantititi mici de vitamine. Animalele superioate si omul au | pierdutcapacitatea de. sintetiza vitamina, si continutul ei in rafiaalimentard eobligatorie. Vitamina B,. Drept coenzimi serveste forma ei activ’ —tiamin pirofosfatul. NH; i + N* cay 9 9 Db Lc cn,-0-P-0- Hé N s Tiamin pirofosit (vit) OH OH Participi la reactii enzimatice de transfer al unei unititi de aldehid’ activa (in reactia de decarboxilare oxidativa a a-cetoacizilor - piruvat, c-cetoglutarat), in reactia de tuanscetolare a mietabolisunului glucidic, se include inalte complexe multicnzimatice, in ciclul tiazolic, datoriti ionizarii wzotului (N*), carbonul C, devine carbanion gi declanseazi un atac nucleofil asupra C, din molecula acidului piruvic. Ca urmare, se formeaziuncompus deaditie, care apoi se decarboxileaza, rezultind hidroxietil TPP. Ulterior, acesta elimina acetaldehidi si regenereaz TPP, R Ri : Ces Hs N’—-CHy La insuficienta de vitamin B, suferd deregliri sistemul nervos central, sistemul diovascular, tractul gastrointestinal, drept consecinga a deficitului de energie, prin, area degradarii glucozei. -87-Vitamina B,— riboflavina—e componenta coenzimelor flavinice. Centrul activ al enzimelor contine unele metale, de aici si denumirea enzimelor respective—metaloflavoproteine. FAD siFMN sunt coenzime implicate in procesele de oxidoreducere. Enzimele respective se numesc flavoenzime sau flavoproteine. In cadrul reactilor de oxido-reducere, concomitent, eiclulizoaloxazinic sufera reducer reversible prin fixarea la azotul N(1,10)a2 atomi de hidrogen pretuati de la substrat —substratul se oxidea74, iar flavinele se reduc — FMNH, sau PADI. Acestsistem FAD-FADH, san PMN - FMNH, dispnne de un potential electric standarc 9 1 N C. ed SOO NE HC ¢=o0 3 Sys bn HCOn ucou HCOH c4t0—P0;—-0—P0;—Ribora— Adenina “Riboflavina (B) FMN FAD Vitamina PP —niacina, niacinamida, B,. Se include in structura a doud coenzime nicotinamidice, care participa la reactile de oxidoreducere—NAD* si NADP’. Ambele contribuie la dehidrogenarea substraturilor—transferul unui hidrid-ion—1¥ ("si 2e), altproton se permutitin solufic(H"). Legatura cu componenti proteciesteslaba (enzimele NAD dependente participa la procesele catabolice, cele NADP* dependente anabolice) N’ N’ ‘Acid nicotinic Nicotinamida (NA) -88-OH OH OH O-POs NADH NADPH Seructura NADI gi NADPH -89-Vitamina B,—piridoxina. Drept coenzima servese formele active—piridoxalfosfat sipisidoxaminfosfat. “HOH on “HyNHp HO: CH;0H HOW CHOPO: 110: 11,0P03 HC yey HC N N N Piridoxina Piridoxalfosfat Piridoxaminofosfat Enzimele B, dependente iau parte la: 1) procesele de transaminare, transformind un aminoacid in cetoacid si, viceversa, servind ca coenzim’ in aminotransferaze (mecanismul “ping-pong” prin formarea de baze Schiff intermediare; 2) reactiile de decarboxilare a aminoacizilor, aplicindu-se acelasi mecanism; 3) procesul de transsulfurare a unor aminoacizi; 4) determinarea activtijiiglicogen fosforilazei (degradarea glicogenului). Vitamina B,— acidul pantotenic —componenta CoA. Contucreaziila transferul gru- pelor acil, datorita grupului reactiv SHeu formarea tioesterilor. H! CHy HOOC—CH,—CH,—N-+¢ CH—C—CH,—OH — Beatanina 8 onc oowk” i Cha CH N-E— CH C= CHO NH 0 OH CH; 9=p—o CH; § i ) CH, | te ° j o O—CHy_ 0. H HY, H / Coenzima A OH O~POs =90-| Vitamina H—biotina —serveste drept coenzimia carboxilazelor ce leag CO, | sid transfert la substraturi. CO, se activeaz, unindu-se cu biotina si uilizind ATP. co-k CO, ma App+pi — (CHa)s u en Ss ceo Yh ce Biotina Carboxibiotina ‘O ‘Vitamina Be - acidu! folic. Vitamina Bc in organism se reduce, formind fermentativ acidul tetrahidrofolic (FH, ) ce serveste drept coenzima (5,6,7,8), transferind de lao | | molecut’ la alta grupsrile atomilor de carbon in cadrul diverselor reacfi fermentative | | OH | ten CO. “xu sn Acid ' ' (ud, glutamic boon alee te eo Acid p-aminobenzoic Acid folic (vitamina Be) Gruparile atomitor de carbon care sunt transferate de citre acidul folic: —CH;,—CH,—, —CH=, —COH, —CH=NH, —CH,01 Vitamina C— acidul ascorbic (organismaul uman nu e apt s&-l sintetizeze).. ‘Vitamina C joacé un rol esential la: 1. React de hidroxilare, cu implicarea O,. 2. Hidroxilarea poate avea loc si in baza reducerii formei oxidative (pe seama acidului dehidroascorbi Triptofamul — $-hidroxitriprofin. 3. Diverse reactii de oxidoteducere, in care functioneaz’ cuplatcu glutationul sau coenzimele NAD’ si FAD - dependente. 4. Drept cofactor activator al anumitelor enzime (degradarea oxidativa a tirozinci, formarea adrenalinei, etc). 9 OHOH OH t 9 C—C—C—CH-CH—CH,OH dnsiQjuaasl - Acid ascorbie ( vitamina C ) -91-Vitamina B, —ciancobalamina—poseda o structuri complicati, depistata in 1957. Gruparea CN din coenzima este substituitd prin adenozil. Serveste drept co- enzima pentru unele transmetilaze gi anumite mutaze (izomeraze): 1. La transformarea homocisteinei in metionind, se utilizeaz FH, ca donator de CH, dar enzima accept metil-cobalamina drept coenzim’. 2.Latransformatea metilmalonil CoA in succinil CoA (restructurarea scheletului de atomii de C), drept coenzima serveste 5-dezoxiadenozil cobalamina. Structura Sdezostadenocicobalamina on oH Vitaminele liposolubile: Vitamina K serveste drept cofactor al sistemului enzimatic (carboxilaza), ce exerciti carboxilarea acidului glutamic in gama-carboxiglutamic cu asocieri de oxigen. Acest acid se confine in protrombina (10 resturi de acid) ce poate chelata calciul Se presupune cé ea parti activ la fosforilarea oxidativa, ° finde sub acfiunenantvitamine- CH; CH, lorK acest proces se decupleaza. Vitamina K © necesara pentru (CHy— CH= C— CH )n—H coagulare (vezi capitolul respectiv). ° Vitamina Ky -92-Vitamina A —retinolul —este un derivat poliizoprenoidic, care contine nucleul cciclohexenului mai multe unit izoprenice. Retinolul (retinalul) este un component al rodopsinei din bastonasele retinei (opsina sil -cis-retinal), CH; CH cH C=CH—CH=CH—C=CH—CH,OH Retinol (vitamina A) Laabsorbjia de cdtre rodopsinia cuantumurilorde lumina are loc descompunerea iin opsing sitrans-retinal, care vor izomera incis sub influenfa enzimei specifice— retinol izomeraza. Acidul retinoic participa la transportul prin stratul bilipidic al oligozaharidelor incorporate in glicoproteine (gratie modificarilorcis-trans.) Vitamina E este un antioxidant, Ea protejeaza celulele de diversi oxidanti toxici, ‘exclude oxidarea vit.A, a acizilor grasi esentiali. Conlucreaza cu selenul in procesele antioxidante si previne, de altfel, actiunea distructiva a peroxizilor. HK \ CHs | HyC- A CHy (CH) CHy~ CH CH); H 1 © cn, CHS Vitarina E Pentru funcfionarea normal a organismului sunt necesare siunele microelemente incantitati mici (miligrame). Ele functioneaz drept cofactor’ sau grupe prostetice. Rolul pe care-I comport 1. Au functie catalticd vizavi de o anumitireacfie chimica, viteza cireia se amplificd in prezenta proteinei fermentative (Fe, Cu). 2.Tonul poate forma simultan un complex cu substratul si centrul activ al enzimei si, atagindu-se, rec in forma activ’, modificind conformatia, 3. Laun stadiu anumital ciclului cataliti, ionul de metal joacd rolul de acceptor al electronilor—suntantrenate metaloenzimle. 4. Ionii stabilizeaza structura enzimelor. Exemple de diverse enzime ce contin metale: Fe: Citocromoxidaza, catalaza, peroxidaza, proteinele fiero-sulfidice (nu contin hem, ci un numir par de Fe gi S intr-o form labild). -93-Cu: Liziloxidaza gi citocromoxidaza, conlucrind la impachetarea colagenului gi elastnei ‘Zn: Enzimele NAD* dependente, alcool dehidrogenaza, RNA si DNA polimeraze- le, carbanhidraza, carboxipeptidazele. Intre Za? si Cu sunt sesizabile fenomenele de antagonism, la fel ca gi intre Me™ si ca ingrasimintele minerale contin sulfat de amoniu, care surcleseazi seleniul necesar pentru activitatea glutation peroxidazei (scindarii H,O,). Organismul uman, pentru funcfionarea lui normala mai necesita: niche! —ureaza; crom— pentru asimilarea ghicozei de cdtre esuturi; plumb —pentru procesul de calcifiere a scheletului cobalt inte in componenta vit. B, ,; molibden — in structura xantin oxidazei. Metaloproteinazele reprezinta o grupa importanta de enzime care comport o activitate majora in celulele tumorale, activitate ce coreleaz cu procesul invaziv gi metastazic. Toate au structura asemindtoare, dar diferd dupa tipul de protein’ ce scindeazi, Exemplu: scindarea colagenului (IV) din membrana bazali, ‘Metaloproteinazele se sintetizea7i in forma neactiva determinati de o secvent’ foarte conservatoare de 9 aminoacizi, La acest capat se afld cisteina foarte reactibil’, care leaggi metalul in centrul activ al enzimei gi “blocheaz’ seindarea”, adic’ capacitatea de ascinda proteinele - tint, Ce initiazét seindarea acestui peptid, transformind MP in forma activa? S.a stabil c& forma activa a metaloproteazelor nu actioneazi in prezenta inhibito- rului tisular al proteazei (TIMP) —o familie de proteine ce regleaza cresterea {esutului. Celulatumorilorla fel le sintetizeaza activitatea fermentativa fiind determinata de echilibrul actiunii pozitive si negative a proteinelor reglatoare. TIMP sunt supresori ai metastazei, depistindu-se deja gena absenti sau inactiva din tumorile maligne. Proteina —produsul ei—lipseste in celulele cancerigene. Celulele ce nu metastazeaza, contin cantiiti mari de protein’ nm 23 (nonmetastazic), corelind cu trecerea celulelor de la stare normald ta tumoare, cu capacitate de invaziune. Determinarea proteinei joaci un rol important in diagnosticul, pronosticul si tratamentul botnavului (cancer mamar) Cum inhiba proteina procesul metastazic al celulelor? Proteina activa nm 23 favorizeazi aditia grupelor fosfat la moleculele proteic modificind transferul. semnalelor ce influenteaza cresterea celulelor. Peparcursul a milioane de ani de evolutie proteina dati nu s-a modificat, si practic mine intact atit la om, cit sila axed. La ultima e absolut necesara pentru dezvoltarea normali a organelor ce se diferentiaza din epiderma embrionului- creierul, achii,aripile, picioarele, organele genitale. Se poate de presupus, dupa analogie, c& si laom proteina {joacd un rol determinant in organiizarea si comunicarea intercelulara. Reglarea aberanta anm 23 conduce, in consecin(a, lao stare celulard nestabila, ce stimuleaz comportiri autonome ale celulelor cancerigene si metastazarea lor. Modificirile comunicagieiintercelulare, prin intermediul preparatelor sintetice, precum si modificdrile fluxului de ioni de calciu in celule pot bloca metastazele celulelor cancerigene.