ENZIMELE PLASMATICE Din cele 2000 enzime atestate pina in prezent, numai omic parte se localizeaza in plasma (sau ser) si sunt depistate in mod clinic prin intermediul diagnosticului, pronosticului,stabiliri evolutiei proceselor cronice gi, in consecint, orientarea terapeutic’. Din cele 6 clase deocamdati sunt mai pufin interesante pentru. practica medical ccurent& izomerazelesiligazele, dar siacestea valoreazi pentru investigatille de patogenie 1a nivel molecular. Enzimele plasmatice sunt de provenienfi celular, fiind difuzate din tesuturi in singe. Mecanismul disenzimiei plasmatice, mecanism de traversare a enzimelor si izoenzimelor tisulare in ser, este foarte complex, posibil fiind o rezultanta a interactiunii mai multor factori, dintre care principalii sunt: - amplificarea biosintezei enzimei determinat& la nivelul controlului genetic, in ‘ranscriptie sau translatie; -majorarea numérului de celule capabile de sinteza intensiva; - gradul de alterare a proceselor energetice si, consecutiv, al permeabilititii selective amembranelor, - vascularizarea organului lezat; = schimbarea profilului enzimatic al organului in dependent’ de boalA. Dacd demareazi eliberarea enzimelor, apoi viteza de producere a lor in lichi- dul extracelular va depinde de : -localizarea ultrastructural’ diferiti a enzimelor: cele citoplasmice fiind mai usor antrenate in circulatie decit desmoenzimele legate de membranele organitelor, ele se vor afirma la progresarea procesului patologic, la lezarea celulei; ~ greutatea moleculard a enzimelor, dimensiunile moleculelor: cele mici difun- deazcu vitezi mai mare decitcelelalte si se elibereazi la etapele timpuri ale alteriris viteza lor de eliberare e invers proportional cu masa molecular; -gradientul de concentratie in membrana celulara ce determina forta motricea eliberarii de enzime. De exemplu, in celulele ficatului concentrafia LDH e de 3000 ori ‘maj mare decit nivelul enzimei extracelular; in eritrocite—numai de 200 ori; sorbitol DH = 50.000:1; aleool DH = 20.000:1; ASAT si ALAT 10.000:1; enzimele cu un gradient de concentratie mare abandoneazi mai usor celulele decit cele cu coeficient mai mic; ~timpul de injumétatire diferit al enzimelor plasmatice: LDH = 113 ore; ASAT=17 ore si ALAT =47 ore: - inactivarea neproportionali; ~ eliminarea diferiti destul de redus& prin bila (fosfataza alcalind, S'-nucleotida- za, ceruloplasmina) si urind (cu masa molecular mai mied decit 60,000 Da); ~suprapunerea modelelor enzimatice catacteristice diferitelor organe. Clasificarea functional a enzimelor plasmatice Enzimele din plasma se claseaz’, din punct de vedere al provenientei si functiei, in urmitoarele categorii 1) enzime secretorii cu rol activ in plasmi, produse in ficat. Aici se includ cenzimele coagulatii, lecitin-colesteraza, renina, ceruloplasmina, pseudocholinesteraza; nivelul lor scade o data cu lezarea celulelor producatoare. -5512) enzime excreto-secretorii provenite din glandele exocrine si pancreas. Ele sunt excretate si actioneaza la nivelul tubului digestiv (amilaza, lipaza, tripsina), se elimina prin bili —leucin aminopeptidaza, fosfataza al Ja lezareacelulelor de origine sau la prezenta unui obstacol la nivelul cdilor excretorii. De asemenea, vor fiprezente in singe sila sporirea permeabilititii membranei celulelor secretori. 3) encimele indicatorii celulare predomina in plasma, la lezarea celulei de origine. Eleau valoare de indicatori plasmatici ai sediului organului lezatintrastructural Localizarea leziunii nue intimplitoare si poate fi stabiliti prin urmatoarele modalititi: a) dozarea unei enzime specifice de organ; b) determinarea si caracterizarea izoenzimelor cu valoare organospecifica; ¢) stabilizarea activitatii unor grupari (constelafii) de enzime. Lezarea principalelor organe ar trebui 4. se reflecte in plasma, Reflectarea plasmaticd a profilului de organ nu se observa totusi in mod constant, deoarece se produce fenomenul de dispersie a profilului datorat complexitatii si disproportiei de contributie a factorilor mentionati. Dispersia enzimatica este mult mai putin pronunfati dupa o afectiune unica si grava (infarct miocardic vast), fapt care justified utiitatea testelor, in special, in cazul acutizarii maladiei. Agresiunile slabe sirepetate favorizeazii fenomenul de dispersie, si indicii activititi enzimatice nu mai corespund celor din celulele de origine. Principalele enzime plasmatice cu valoare diagnostica Ficat, Enzimele organospecifice sunt: histidaza, urocanaza, ceto-1--fosfat-aldolaza, sorbitol dehidrogenaza, omitincarbamil-transferaza, arginaza Glutamat dehidrogenaza—enzima mai putin specifica — este caracteristica mito- condriilor hepatice, manifestata printr-un grad de activitate mai redus in miocard si rinichi. Eun indicator al afectiunii mitocondriilor celulelor. GOT-ASAT (aspartat aminotransferaza) reprezint& o enzima biloculara(citozol si mitocondrii), prezenta in toate celulele organelor i, in special, in miocard, ficat, muschi, rinichi. GPT-ALAT (alanin aminotransferaza) se confine in cantititi mari in citoplasma hepatocitelor, se uilizeaza in diagnosticul precoce al formelor anicterice si in depistarea perioadelor deevolufiea hepatitelor cronice. Lactat DH e prezemtain toate celulele organismului, constituind un tetramer aledtuit H'+HCo0, Bicarbonatii din lichidul extracelular se prezinta sub forma de sare de Na - NalICO,, iarin cctuli —KHCO,, avind aniomul comun TCO, Ecuafia Henderson - Fasselbach: gp LHCOs] pK - constant disociaiei egal eu 6,1 HCO; [H,CO,] [HCO31]- concentratia ionilor [HCO5] - concentratia moleculelor nedisocinte pH=pK In activitatea metabolic majoritatea acizilor formati sunt mai tari decft acidul carbonic. Pentru neutralizarea lor intervine componenta bazicii a sistemului NaHCO, gi are loc reactia de tipul: HCI+NaHCO, E. NaCl + H,CO, Anhidraza carbonied scindeazi acidul in H,O + CO, la care dioxidul de carbon se ‘liming prin plimini. baz tare generat, neutralizaté find de componenta acid a sistemului HCO, se vvatransforma in bicarbonat NaOH +H,CO, —» NaHCO, +H,0 =554-CO, sub forma de HCO, este permanent disponibil pentru tamponarea bazelor si CO, reprezint& un produs incontinuu, constituind ultimul metabolit al majoritatii substanfelor transformate in organism, {in mod normal, la pH = 7,4 in plasm gi in lichidul extracelular raportul bicarbonat acid este de 20/1. Functionarea acestui sistem tampon se combin cu ceaa sistemului hemogiobinei. Lao hipoventilasie pulmonar are loc sctderea difizziei CO, din singe spre alveolele pulmonare, deci o marire partial a tensiunii acestui gaz in plasma sanguin’. in ultima instanfd, sporeste aciditatea singelui. Lao hiperventilajie fenomenele decurg invers. IL, Sistemul tampon al fosfatilor Hpk, + ie LHPOT] (11P04) - concentratia ionilor NagHPOy PH=PKinp0,* Ter po,][HzPO¢)] - concentratiaionilor NaHPOs pK - constanta disociatiei egal cu 6,87 La valoarea pH ~7,4, valoarea raportului dintre ingredienti constituie 5:1, ceea ce fnseamni c& concentratia formei acide e de S ori mai mic, fapt ce denotd o bund capacitate de tamponare pentru cantitii suplimentare de acid rocesul tamponii are loc potrivitreaciilor: HCl +Na,HPO, —» NaCl+ NaHl,PO, NaOH + NaH,PO, —» Na,HPO, + H,0 Acest sistem este operant, in special, in hematii si incelulele tubulilor renali, Atare sistem de tampon are un rol deosebit in tesuturi, cota fiind de 1% din intregul sistem. CCapacitatea sistemului in singe e maxima —la pH= ILL Sistemul tampon al proteinelor predomin’ in celulele fesuturilor, dar ‘opereaza si in plasma. {n constitutia lui intra proteinele care functioneaza ca anioni la pHL-ulslabalcalinal mediului intem (+), in combinaje cu ionii H* anionii proteici consttuie componenta acid a sistenmului (H-proteina) si tamponeaza bazele: NaOH + H-proteini —~ H,0+Na-proteina Anionii proteici, in combinatie cu cationii metalelor alcaline (Na, K), formeazi componenta bazici $i tamponeazi acizii: HCI+Na-proteina, —- NaCl+H1-proteind. Siin acest caz, datorita tamponari, acizii si bazele se transforma in produsi neutri (NaCl si 1,0), iar componentele sistemului se transforma una in cealalta, manifestind aciditate sau bazicitate moderati, a care pFT-ul mediului nu se afecteaza. -555-IV.Sistemul tampon al hemoglobinei \a fel contine componenta proteici cuo capacitate mare —cota de 75% din total Participarea hemoglobinei in reglarea pH e insofité de ransportul O, siCO,,. Constanta disociatiei grupelor acide ale Hb este in dependenfa de saturarea cuO,. Hib intra in componenta a2 sisteme tampon: a) HHb (hemoglobind acida) - KHb (hemoglobinat de potasiu); b) HHO, (oxihem. acid) -KHbO, (oxihemoglobinat de potasiu). Oxihemoglobina este un acid mai puternic (pK = 7,16) decit dezoxihemoglobina (pK =7,11) si cedeaza O,,, conform ecuatiei: HHbO, + nH* == HHb +0, Ambele sisteme igi pot exercita actiunea tampon datoriti hemoglobinei care include in partea sa proteic’ multe resturi de histiding. Inelul imidazolic posed capacitatea de a accepta si totodati de a ceda H* ‘unuia dintre atomii de azot ai heterociclului. N HN - oN Le Tk |] + on th ] + Ho a 1H NH cabazi caacid Reacfiile respective ale acestui sistem tampon sunt: 1. KOH +HHb —~ KHb+H,0 2. NaOH +HHbO, —» NaHbO, + 1,0 HCI+KHb —~ HHb+KCI HC1+NaHbO, —— HHbO, + NaCl Acidul si baza se transform in produsi neutri, pistrind aciditatea sau bazicitatea lor ‘moderati, fird a afecta pH-ul mediului. ‘Anomaliile echilibrului acido-bazic sunt asotte de aparitia acidozelor sialcalozelor (metabolice si respiratorii). Deoarece, in evolutia proceselor metabolice se genereaz ioni de hidrogen (H) sinu ioni dehidroxil (OF), tendinga spre acidozi se intilneste mult, mai frecvent decit tendinta la alcalozi. Mecanismele homeostatice sunt adaptate n special, pentru contracararea unui exces de H* si din acest motiy, relativ mai rar, alcalozele (metabolice) se compenseazi cu dificultate. E concludent, cd la procesele complexe de ‘mentinere a echilibruluiacido-bazic contribuie toate celulele oganismmului, un rol premordial revenind hematilor,plaminilor si rinichilor. -556~HEMOSTAZA $I FIBRINOLIZA. Echilibrul fluido-coagulant constituie un sistem de mecanisme antagoniste si interdependente, factorhotiritoral conservari potentalului hemostatic al singehui, precum sial luiditifi acestuia. Sunt procese reglate enzimatic, tulburarea si dezechilibrul cirora cauzeaz’ formarea de trombe (cheaguri) sau singerarea Coagularea Particularitatile caracteristice acestui proces sunt: 1) numdrul mare de activator siinhibiton care intervin; 2)existenta niajoritati factorilor coagulant, ca precursori; 3) preponderent, drept factori coagulantiservesc proteazele ce se produc la proteoliza limitatd din formele lor inactive; 4) transformarea lor din forme inactive in active are loc prin autocataliza determinati de propriile lor produse; 5) unii factori, ca de exemplu Ca™, au acfiune multipli, intervenind pe parcursul timpului de coagulare; 6) procesul complex decurge “in cascada”; faza latenti este formati de avalansa transformarilor accelerate ale factorilor coagulirii prin forme inactive siactive. {in desfaigurarea procesului coagularii se disting faze care, in ordinea manifestirii Jor succesive, se esaloneaza in doi timpi, si anume: a) timpul parietal este determinat de vasoconstrictia vaselor mici, capilarelor din fesutul aectat de serotonin’, catecolamine si obturarea lor prin agregate trombocitare. La interaofiunea fibrelor de colagen ale vasului lezat cu trombocite, prin forte clectrostatice are loc agregarea lor. Trombacitele agregate suferi metamorfoza viscoast sivin consecinta, elimina astfel de compusi ca: serotonina, catecolaminele, fosfolipidele siindeosebi ATP, ADP, ultimul amplificind agregarea trombocitelor si accelerind obturarea vaselor lezate. Aceasta agregare are un caracter reversibil. ) timpul plasmatic reprezinta o agregare ireversibila. a trombocitelor asigurati de actiunea trombinei, ce duce la formarea cheagului rezistent. Procesul autocatalitic, la etapele iniiale, necesita cantitafi minime de factori si decurge in patru etape succesive: producerea protrombinazei, generarea trombinei, transformarea fibrinogenului in fibrin, cu stabilizarea acestuia, sinereza $iretractia cheagului. Ultimul timp al procesului, care se produce in homeostazia hemostazei, ¢ fibri- noliza. {Inanul 1863, Djozef Lister a observat cin vena jugulard izolati singele boului imine lichid, pe cind separat in vasul de sticla—se coaguleaza. S-a constatat cd acest contact cuohiect artificial dice la formarea mnor componente praprii singelni. Acest mecanism de coagulare a fost numit intrinsec. Laadiugarea in plasma sanguin a unor componente, coagularea de asemenea are loc. Acest mecanism a fost numit ex/rinsec. La coagulare, ambele mecanisme activeazai concomitent, Ele se deosebesc numai la etapele initiale -957-Caracteristicile principalilor factori ai coagulir Factorul I—fibrinogenul —prezint& o glicoproteina care se sintetizeazA in ficat, are aproximativ o masa moleculara egala cu 340 kDa gio forma molecular’ alungita. Fibrinogenul ¢ alcdtuit din 6 lanpuri polipeptidice, grupate cite 2 (a, B, y), cuo mobilitate electroforeticd B~y. Jonctiunea lanturilor glucidice cu cele peptidice se sealizeazi printr-o legaturi glueo7il-aminil-arginind, Oxidarea glucidelor din fibrinogen i conferd inconsistenfa fafa de fenomenul coagulari, Transformarea in fibrind se poate realiza ati artificial, citi fiziologic. Artificial, fenomenul ¢ provocat de actiunea unor factori chimici.ca: ninhidrina, aloxanul, cloramina; factori biologici: veninul de sarpe, stafilocoagulaza, enzimele proteolitice. Fiziologic, in2-3 secunde, sub actiunea trombinei —0 proteazA de tipul tripsinei, ce scindeazi 4 legituri peptidice intre arginin’ si glicin’, cu eliberarea a 4 peptide-2A din oclanguri constituite din efte 18 resturi aminoacidice si 2B din B—cite 20 fiecare, denumite fibrinopeptide. Lanjurile y cu tirozina terminal nu sunt antrenate in fenomenul de conversiune a fibrinogenului in bring. Cu pierderea fibrinopeptidelor, se creeazi conditii favorabile pentru asocierea spontand a monomerilor sub forma de polimeri intermediari, cu legituri de tip necovalent, realizate prin interactiuni hidrofobe si punti de H.Complexul este solubil, dar putin stabil. Polimerizarea monomerilor se realizeazi longitudinal si transversal si duce la o gelificare, cu trasformarea din stare de sol in cea de gel, rezultindun cheag amorf, slab. Laactiunea unui factor stabilizant (E-XI) ~0 fibrinazi activati prin trombind, se formeazi o fibrind insolubild, care confer’ cheagului rigiditate; se stabilesc legdturi covalente peptidiceintre gruparile c-amino din resturile de lizindsicarboxil ale glutami- nei (enzima eo transamidaz3). Factorul de stabilizare a fibrinei (FSF, FXII) este o glicoproteina tetramer cu masa molecular de 340 kDa, formati din cite o pereche de peptide identice, a (75 kDa) sib (80 kDa). Centrul actiy e localizat in lanturile a. FXII, se formeaza in hepatocite; in plasma se giiseste sub forma inactiva, intr-o concentratie areloc scien Factorul VIII globulina antihemo- +. rina liticit, GAH este 0 -macroglobulind, cu masa molecular de 2 milioane Da, pre- i gs zenta in plasma in concentrate de 0,005 g/ L siavind timpul de injumatiire de 0jU- freuen g9, sin eh ivtawe de zi. Se formeaci fn hepatocive. fdrombtnd une pth legaurd does Este un factor labil si se consuma in decur- sul coagukici. Este alcatuit din trei componente distinete: F'VIIL,.reprezinté cofactorul activarii F.X in prezenta accelerinei (F.V1) ; F.VII,,., purtitorul determinanfilor antige- nici proprii; F. VIIvW (von Willebrand), cofactorul manifestarii functiilor hemostatice plachetare. Lipsa ereditar’ a acestui component duce la manifestarea angiohemofiliei (matadia von Willebrand). Factorul X (Stuart-Prower) este o proteina cu mas moleculari relativ redusi (56 kDa) produsa in ficat si prezentit in plasma intr-o concentratie de 1,003 g/L. Este 0 substanfi stabil care nu se consumi in cursul coaguléirii, format din doua lanturi peptidice (unul greu si celdlalt usor) cuplate disulfidic intre ele. [Xa elibereaza, prin proteoliz, din lantul greu al moleculei F-X un fragment peptidic mic. Prin aceasta se descoperi centrul activ situa in partea C-terminala a molecule, prin care enzima devine siea activa (E-Xa). Este de remarcat ci factorul Stuart-Prower poate fi activat nu numai prin ‘mecanismul fiziologic sus - nominalizat ci, in condifii patologice, si de catre alte serinproteaze eliberate 5 activate in cursul difertelorreaciiinflamatori -560-Proprietifile structurale si funcfionale ale factorilor sistemului de contact in plasma sanguina sunt prezenti doi kininogeni: macro (HMWK) - si microkininogeni (LMIWR).Sinteza lor este codificata de gena localizati in cromozomul 3. Gena respectiv confine 1 exoni si 9 din ei formeaza trei exoni tripleti,fiecare din ei avind originea in patemul genei cistationinei. Exonul 10 confine o secventi comuni pentru ambii kininogeni (10a) sio secventg nied C-terminal pentru HMWK (10b). Exonul 11 codificd secventa ‘unicd C-terminal a kininogenului micromolecular (LMWK).. Splaisingul altemativ al ranscriptiei primare a genei kininogenuili formeazi dou mRNA diferite, specifice penttu fiecare forms. Kininogenii sunt glicoproteine polifunctionale, moleculele cdrora sunt prezentate printr-un lant polipeptidic, sintetizate in hepatocite, poi glicovilate fnainte dea fi secretat. Kininogenul macromolecular (factorul Fitegerald, HMWK). Molecula de HMWK confine 626 resturi aminoacidice cu masa moleculara de 120 kDa si pl egalcu 4,3. Concentratia plasmaticd este de 65-130 pg/mL. HMWK poate reversibil sa se fixeze de trombocite, neutrofile, celule endoteliale, procesul necesitind ioni de Zn’. Fixarea se realizeaza prin glicoproteine identice cu receptor ce fixeaz componenta C1qa complementului, La fixarea cu celulele endoteliale se majoreazii viteza de eliminare a bradikininei, care stimuleazi generarea de NO sia prostaciclinei, in consecint, cu efect antitrombotic si vasodilatator. Domeniul terminal al HMWK posed’ centre de fixare a prekalicreinei sia factorului XIal coaguliti. HMWK inhiba activitatea proteinazelorcisteinice, preintimpind degradarea proteinelor plasmatice la lezarea tesuturilor. Kininogenul cu masié moleculard redusii de 80 kDa (LMWK, factorul Flaujeac) reprezinta restul rimas in urma scindarii proteolitice a HMWK. Are o concentratie de 0,05 g/L in plasma gi timpul de injumatatire de 30 zile. Seoventa aminoacidica a bradikininei este prezenti si in molecula de LMWK, ca urmare, acest peptid purtitor de semnale poate fi eliberat si din aceasta proteina prin proteoliza, Prekalicreina (PRAL, factorul Fletcher) si kalieretna (KAL) plasmei sanguine. Prekalicreina este 0 glicoprotein8 ce confine 619 aminoacizi, avind o concentratie plasmatica de 295-580nmol (35-50 ug/mL). Se sintetizeaza in hepatocite si gena respectiva ¢ compusa din 15 exoni si 14 introni, localizati in partea distal a cromozomului 4. Se activeaz’ PKAL la liza legiturii peptidice Arg 371 de formele active (ot si 8) ale factorului XII, cu formarea lanturilor usor si greu ale kalicreinei. Lantul polipeptidie greu (4 domentirepetate, omoloage F XD) particip& la fixarea HMWK, E-XIIsianeutrofilelor. Kalicreina format posed un spectra larg de functi biologice; hidrolizind dous legaturi peptidice in HMWK duce la generarea bradikinineé. Factorul XII (factorul Hageman) este sintetizat de hepatocite cao glicoprotein cu masa molecular’ de 78 kDa, ce confine 596 resturi de aminoacizi si7% glucide. mRNA. respectiva are o lungime de 2,8 kilobaze. Activarea are loc sub actiunea kalicreinei amplificata de prezenta HMWK. Consecutiv, se formeazi doui forme active 0: si B legate prin legitura disulfidicd. Lantul greu e responsabil de fixarea proteinei de suprafata anionic’, fa activarea prin contact. Forma usoars (B) este un activator efectiv al PKAL, iar oF. XMa —al FX -561-Factorul XI (PTA, factorul Rosenthal) este sintetizat in ficat, confine 5% glucide, are 0 masi moleculard de 143 kDa gi este secretat in plasma in forma de zimogen in concentrajie de 30 nmol, Circuld acest factorin complex cu HMWK. Factorul PTA este 0 proteinaza serinica deosebita — molecula confine lanfuri polipeptiice identice fixate prin legaturi disulfidice si doua centre active la un mol de enzima, Activarea factorului XIare loc sub influenfa factorului XHla, in prezenta HMWK. Proteinele sistemului de contact nu sunt elemente fundamentale ale procesului de hhemostaza, dar joacd un rol auxiliarin generarea trombinei Mecanismul coagularii. Calea extrinseci ¢ de durata scurta— de secunde. Fac~ torul de declansare il constituie sucul celular eliminat la lezarea tesutului— factor tisular de natura lipoproteica - fosfolipid (tromboplastina tisulara). Calea intrinsecae de dlurati ceva mai lung — de minute, itervenind mai mul factori sanguin. Ciile extrinseca si intrinseca sunt determinate de sursa de fosfolipide. Ambele cai se finalizeaziicu formarea tromboplastinei active (f. Xa), ca rezultat al metamorfozei viscoase aplachetelor si eliberarea factorilor plachetari. Procesul se realizeazi in 2 faze— prima reversibild, iar cea de-a Il-a este ireversibilé. Indecursul primei faze a acivarii plachetare se elibereazi continutul granulelor dense. Procesul este reversibil in sensul c4 in lipsa unei amplificari poate si se stinga. In ‘meeanismul ntrnsec cei mai putemic activator ai metamorfozei viscoase sunt romboxanii, _gratie activarii primare a fosfolipazei A. in cel extrinsec are loc activarea receptorilor membranari fie printr-un contact cu fibrele de colagen, fie cu mediatorii de tipul: catecolaminelor, endotoxinelor, ADP, proteazelor. Transmiterea intracelulariia semnalului receptionat are loc prin intermediul mesagerilor secunzi, ca AMPe, DAG, IP, ,NO sau prin intermediul proteinkinazelor (fig.8.10). Faza a dowa a activarii este caracterizata prin eliminarea continutului de Ca granulelor si in prezenta adezinelor (fibrinogen, fibrinonectina) plachetele prezentind metamorfoza viscoasi, adera intre ele cu formarea cheagului alb —0 stopare a leziunii microvasculare. Serotonina eliberata din plachetele agregate, prin efectele ei vasoconstrictoare, reduce fluxul sanguin spre zona lezati, Mecanismul complex al hemostazei functioneazi in organism ca un tot unitar, dar din punct de vedere sistemic coagularea singelui se imparte in 5 faze succesive prefaza: formarea tromboplastinei plasmatice prin orice cale; faza: transformarea protrombinei in trombind activa: faza Il: transformareafibrinogenului solubil in fibrin faza IL: fbrinoliza (uneor’sifibrinogenoliza ); faza IV: retractia cheagului, Interactiunea dintre factorii sistemului de coagulare singelui se prezintl in formiide trei complexe fermento-cofactoriale ce asigura coagularca in condi fiziologice (fiz8.11). Primul complex~VUla+FT (factor tisular)— initiaz& activarea factorilor IX si X. nsolubiki —coagularea; Complexul nativ VII-FT este fiziologic inert si devine activ la actiunea factorilor [Xa si rea factorului VII de cofactorul (FT) favorizeazi activarea efectiva a substraturilor respective. -562-agers fiat hoe (GP atta —— fembrana lasmatiea hidonie Acidul: = tetas \ at \ Eliberarea / confinutulut ene?” Fosforilarea tanjului granulelor ‘gor al miozinet placnetelor i Race gl st sm inetus ADE, oe ie piesa Modifiiri conformational Figura 8.10. Aetivarea plachetelor (schematic). Meulul extern, membrana plasmatia i partea intern ‘aunei lachete sunt reprecemtate de sus in jos. Trombina $i colagenul sunt cei mal importangi activator ai pplachetelor. ADP este considerat un agonist slab; el cauceazi agregarea, dar nu elberarea granuletor (GP ‘licoproteind, RR. diversi receptor, AC-adenilatciclaza, PL -fosfolipide, PLA, fosfolipaza A2; PLC. =fosfolipaca CB, PIP, - fosfatidiinociol-4,5-bifosfat, cAMP - AMVetelic, PRC = proteinkinaza C, TxA, = tromboxan, IP, - inoztoll,4,5 - trifosfat, DAG 1,2 diailglicerol, proteinele G implicate nu sunt aritate). Complexul colaboreazi la calea extrinsect, fi se nhiba numai dupa initierea procesului coagulai Aldoilea complex fermento-cofactorial ([Xa- VIlfa-FL membranare) activeaz factorul X. Activarea factorului [Xa(calea intrinsec’) este cauzatl de factorul Xla— reaultatal interactiunii factorilor participanti la activarea prin contact (XII prekalicreina, kelicreina, kininogenul cu mas moleculard mare). Al treilea complex fermento-cofactorial (Xa-Va- fosfolipidele membranare) trans- forma inginit protrombina in trombind. Ambele cai sunt convertite la aceastA etap&, Antitrombina si proteina Csunt inhibi- tori efectiviai complexelor2 si3, pind la formarea lor. Inhibitori sunt absolut necesari in procesul reglarii sistemului de coagulare a singelui, pe cind deficitul lor are consecinte letale. Antitrombina inhiba factorii Xa si Xa. Proteina C activa, cu participarea protei- nei S (cofactor), inhiba factorii Va si VIlla activati de trombina. indu-i caracteristicd posibilitatea dea -563-Figura 8.11. Schematic, e redat procesul de coagulare asingelui Ce reprezintit factorul IX (Christmas-Eve factor)? O catenii glicoproteici cu masa molecular cgali cu 58,7 kDa i continind 17% de glucide. E viditi omologia dintre consecutivitatea aminoacidic& lacapetele N ale facto- rilor IX, I, X la om, Coneentrafia in plasma constituie 3 mg/L. Azie bine cunoscuti si structura domenica’ aF IX. El, ca si factori Il, VIL, X, proteinele Csi S, formeaza grupa protcinelor dependente de vitamina K. Capaitul N terminal, numit Gla-domen, confine resturi de y-carboxighutamat. Proteina se sintetizeazA in ficat si pind la secretie este modificati posttranstational —are loc B-hidroxilarea Asp, de rnd cu cele 12-y-carboxi- Jiri ale acidului glutamic, glicozilarea in ambele domenii (N si C terminal). ‘Atasarea ionilor de Ca™ la domenul Gla modifica conformatia factorului, devenind biologic activ. Alte locusuri sunt necesare pentru interactiunea cu suprafetele celulare Domenul C terminal confine o triad de aminoacizi ai centrului activ, interactionind cu EVIIL Sunt studiate mecanismele de activare a FIX de cdtre F-XTa lanivel molecular: primar, se scindeaz legitura peptidic& Arg-Ala interioari, cu formarea unui produs intermediar neactiv cu aceeasi mas& moleculara. La faza urmitoare are loc scindarea legiturii Arg- ‘Val,cu eliminarea unui peptid compus din 35 aminoacizi, cumasa moleculard egala cu -564~9000 Da de la catena grea, acesta continind 50% de ghucide ale moleculei primare, cu formarea factorului [Xa, El confine o catend usoara (1-145 aminoacizi cu masamoleculari 4de16600 Da), legatt prin leg. disulfidic& cu catena grea (145-415 aminoacizi si o masi moleculark egali cu 27000 Da). Caracteristicd este necesitatea de ioni de Ca’, care sunt fixati numai de cdtre F.XI. Factorul [Xa rémine fixat de centrul activ al F-Xla, ce preintimpind activarea ulterioara. Fosfolipidele (FL) concureaz cu RXla pentru F.1Xa, ambele psedind capacitatea de a lega fosfolipide. Astfel de mecanism previne formarea sieliberarea cantititilor considerabile de F.1Xa, ping la aplicarea necesitatii de activare continua sistemului coagulant. Capacitatea ferment-cofactorului complexului VII-FT dea activa FIX s-a constatat recent, ceca ce explica atit deficitul F.X1a, cit si al celor ce il activeaza (activarea prin contact), dea nu deregla procesul de coagulare. Mecanismul activarii exercitat de catre complexul fermentativ este similar cu al F-Xla gi necesiti ioni de Ca Investigatiileau confirmat ci FT (al lipidelor in diverse concentrafi regleaz activitatea FIX i X in mod diferit. Preponderent, acest complex (VIla-FT) activeazi substratul IX, dar nu si X. in calea extrinsec’ a coagularii, la formarea formei intermediare a F.1X, activarea e realizati de componenta Xa-FT-Ca™, care se produce accelerat si numai faza finalii de formare a [Xa c determinata de complexul VIla-PT-Co. Procesul este cooperativ. Apoi IXa, in complex cu VITla, FL, Ca”, activeazs factorul X ~reactia de baza in activarea F-X. Are loc scindarea legaturii Arg-Tle (45-51) la capaitul N-terminal in catena grea, eliminindu-se un peptid cu masa molecular’ de 10500 Da. Procesul se produce in prezenta ionilor de Ca®*+ FL + Villa (cofactor), Antitrombina si heparina favorizeazi inactivarea (inhibitia) F1Xa. Insuficienta ereditar a F.IX provoaca maladia Cristmas (hemofilia B), care apare la concentratia de 25% din norma. Exist si molecule defecte, aparute la insuficienta ficatului, unde se sintezeazi acest factor. Procesul de activarea F.X necesita si factorul plachetar 3 ~un fosfolipid. Sunt atestafi 9 factori plachetari: pl - participa la conversia protrombinei in trombind; Fp2- conversia fibrinogemului in fibrin’ Fp3 - fosfolipid implicat in formarea F.X; Fp4 - antiheparind; Fp5 - serotonina; Fp6 - fibrinogen plachetar, Fp7 - trombostenina Fp8 - antifibrinolizin’ Fp9- factor stabilizant.al fibrinei. Factorul XIV —factorul de antisingerare, anti-Wilebrand sau Nilsson, se remarck prin functie, simu prin natura sa chimicd. Dupi formarea fibrinei insolubile, urmeaz’ sinereza cheagului prin eliminatea apei din ochiurile gelulyi, cu micsorarea spatiului dintre fibrile. Retractia se produce cu conlucrarea trombocitelor functional normale, ce actioneaza prin trombostenina (Fp7). ATP trombocitelor asigura contractia Fp7, care antreneaz micyorarea in sens longitudinal al fibrefor de fibring, inregistrind pasiv atare rezultat. -565-Fibrinoliza este un proces incontinuu, la fel ca si coagularea, in cadrul c&reia permanent se formeazii cantititineinsemnate de fibrin. S-astabilit c&1una din globulinele plasmei—plasminogenul (profibrinolizina), laactiunea unor factori tisulari sau sanguini, dealtfel ca sila influenta urokinazei urinei saua streptokinazei microorganismelor, se reproduce in forma sa activa — plasmina (fibrinolizina). Se include mecanismul - cascada analog cu caileintrin siextrinsec ale sistemului de coagulare, Plasminogenul esteo serinproteaza formata in hepatocite, prezenta sub forma inactiv inplasmi. Este alcituit dintr-un singur lant polipeptidic cu masa molecular’ de 91 kDa. ‘Spre capitul N-terminal format de lizin’, langul peptidic formeaza cinci bucle, fiecare cu o afinitate deosebitd de a fixa aminoacizi —lizina si arginina. Centrul activ e situat in capiitul C-terminal. Plasminogemul se activeaz’ prin proteolizi —ruperea unei singure legituri amidice intre arginind si valina. in conditii fiziologice, activarea se desfigoara prin mecanismul intrinsee, Urokinaza este o serinproteaz, sintetizata inrinichi, cu masa ‘moleculari intte 33 si 54 kDa, Cel mai putemic activator al plasminogenului este factorul tisular (ATPG). Ultimul este o serinproteaz, cu masa molecular’ 50 kDa, care se formeaza in celulele endotelial si SMM. Pot transforma plasminogenu! in plasmind activa sio serie de serinproteaze nespecifice de origine celulard ca: FXIa, FXa, tripsina, elastaza et. ‘Activarea plasminei prin mecanismul extrinsee se datoreazi factorilor exogeni ca streptokinaza A. Ea se fixeazii de plasminogen, formind un complex echimolar. in forma fixal, la o modificare conformational, plasminogenul se activeazi partial. Acest complex cuactivitate proteolitica redusa transforma initial citeva molecule de plasminogen, care prin autocataliza activeaza progresiv restul moleculelor. Deoarece se obfine usor, streptokinaza A se administreazii cu succes in tratamentul fibrinolitic al trombozelor coronariene siale ator vase, Dezavantajul metodei consti in imunogenocitatea putemicd asubstanfei, cu consecinte negative in cazul administra repetate. Mecanismul deactiune al plasminei este determinat de caracterul ei endoproteazic cu spectra larg, preferential scindind legaturile peptidice ale argininei. In asa mod, plasmina activeazi prin proteoliza si o serie de alte preproteaze (FXII, FXI, protrombina), in vitro descompune cazeina si gelatina. Ca substrat al plasminei serveste fibrina. In cazul ‘ncare este in exces, plasmina descompune ait fibrinogenul nati cit so serie de factori, sicofactori din plasma. In urma activarii sale, plasmina se fixeazii pe suprafafa fibrelor de fibrin din cheag, din care elibereazi prin proteoliza o serie de produsi de degradare a fibrinei, Acesti produsi sunt totdeauna dimer, fiindc’ provin din peptidele invecinate (0, Bi). Plasmina ataca si fibrinogenul. La inceputul activarii sale, plasmina elibereazi prin proteolizi cite un fragment (A, B, C) din toate cele trei peptide (a, B si y) Fibrinogenul rimas are o mas molcculara de 240 kDa si sc numeste fragmentul X. Acesta, mai departe, se scindeaza in doua fragmente noi: fragmentul D (100 kDa) si fragmentul Y (100 kDa). Ultimul scindeaza rapid in inc’ doua fragmente: fragmentul D si fragmentulE. In decursul fazeiterminalea fbrinogenolizei se produc numai fragmentele DsiE. FDP (fibrinogen degradation products) sunt totdeauna monomer care, in urma activitititransglutamidazice a factorului de stabilizareafibrinei formeazitexclusiv dimer: -566-Plasming Fazal coagulesz8 cu FIBRINOGEN Fragmentul X wonbina '340KDa (N20 0B ta Pepidee A BC Fazal: Nu coaguleazé Fragmentul X ragmentul Y —* —Fragmentul D eutrombina —-240kDa 1850 kDa a3 kDa Peptide Fregmental D, pt cot y" T Fragman Peptide“ Produsul E s3kDa Rerstenie —_ProdusulD Produsul D fapiasmina «3a 83kDa sialte peptide, inclusiv A, 8 gi C Mecanismul de actiune a plasminel Plasmina transforma pro-metaloproteinazele matriciale in forma activa ve va favoriza degradarea matrixului extracelular, Efectul proteolitic al plasminei este stopat de a,-antitripsina, o:-macroglobulina side antiplasmind ~albumina plasmei cu efect antiproteolitic. Ca preparate medieinale cerefin fibrinoliza se utilizeaza inhibitor’ ai proteazei de tipul acidului aminocaproic, trasilolului (acidul p-aminometithenzoic), AMCHA (acidul aminometilciclohexanic) Reglarea hemostazei Seproduce foarte fin, exact, deoarece formarea cheagului se realizeaz’ rapid si numai in regiunea fesutului lezat, Multe probleme nu sunt solutionate, sizicem: de ce reglarea hemostazei se efectueazi in mai multe etape, cu participarea a2 mecanisme? Cum sunt legate intre ele? De ce are loc numai in regiunea afectata? Unrol primordial i joaca labilitatea factorilor activi ai coagulii, perioada lor de ‘njumataire micd, dlusia in singe, neutralizarea in fica, scindarea de proteaze, inactivarea lorde catre inhibitor etc ‘Viteza procesului de coagulare e mai lent la: 1) temperaturijoase, la utilizarea ustensilelor cu suprafete de silicon; 2) utilizarea substantelor ce fixeaza Ca*— oxalatiilor de Na, K, NH,, ‘compusilor chelati—trilon (EDTA). Protrombina, in urma activitatii sale, poate declanga coagularea intregului volum plasmatie circulant. O asemenea coagulare intravascular’ diseminati sau difuza, chiar gi in urna unor leziumi vasculare serioase se manifesta deosebit de rar datorti existentei gi functionarii unor mecanisme de reglare complexe care, prin interactiunile lor, asigura ‘menfinerea echilibrului efectelor pro- si anticoagulante, Datorit faptului e& trombina este enzima-cheie a coagulirii plasmatice, majoritatea efectelor anticoagulante sunt ‘ndreptate impotriva ei si manifestate de cre diferte antitrombine (AT). ratilor; -367-Trombomodulina (TM) prezinta un glicoproteid ce se expreseazi pe suprafata celulelor endoteliale, formind complex cu trombina (1:1). Incest complex trombina igi miodificd specificitatea fata de unele substraturi proteice —creste de 1000 de ori afinitatea {aS de proteina C si, activind-o, o transforma intr-un anticoagulant natural. Antitrombina I reprezinti cheagul de fibrin’. Trombina activi, fixati pe suprafata monomerilorde fibrina, este situata\ in interiorul cheagului, astfel blocindu-siactivitatea. {ns in urma une’ fibrinolize rapide pot fi eliberate cantitagi insemnate de trombina activa, Antitrombina II inseamni activitatea globala a antiproteazelor din plasma. nespecifice ‘trombinei, aga precum sunt ct,-antitripsina, 0.,-macroglobilina ete, Activitatea lor antitrombinicd est, ins, limita. Antitrombina IIT este unicul inhibitor specific al trombinei. Reprezint’ 0 glicoprotein’ formati dintr-un singur peptid, cu masa moleculard de 58 kDa si cantit3ji normale in plasma sanguind de 0,1-0,12 g/L (2,5 wmol/L). Ea formeazi camtititi echimolare cu trombina, blocindu-i activitatea. Dar pentru aceasta mai are nevoie de prezenta unui cofactor numit heparind. in prezenta heparinei, molecula de AT Ill este supusd unor modificari conformationale, astfe! mérindu-i afinitatea farh de trombind, Respectiv, activitatea ei creste aproximativ de o mie de ori. AT II este activa si in raport cu alte serinproteaze F'VHa, nu numai cu F.Xa, Domeniul functional C-terminal interactioneaza cu proteinazele, iar cel N-terminal —cu doud site-uri de fixare a heparinei sia heparan sulfatului proteoglicanilor de pe suprafafa celulelor endoteliale. in decursul coagularii, AT III se consuma. Deaceea, din cauza lipsei AT 111 administrarea heparinei {n scop terapeutic poate sAinu aiba efectul dorit. in asemenea cazuri, paralel cu heparina este recomandabils i administrarea plasmei. Heparin Cofactor II (AP Il) este 0 glicoproteina cu masa molecularii de 65 kDa. ‘Concetratia normala in plasma sanguina este de 90 mg/L (1,2 HmoVL). La felca AT IIL, [HP Il inhiba trombina, darnu si F-X,, in cazurile rare ale lipsei congenitale a HP I apare opredispozitie usoara spre tromboze, ceea ce ar indica rolul secundar al acestui factor ‘nreglarea hemostazei. Hirudina din saliva lipitoarelor este un peptid cu masa moleculara de 6 kDa, care inhibi direct trombina, fara prezenta unui cofactor. Antitrombina IV este reprezentati de cele doua peptide (pretrombinele I yi 11) eliberate in cursul activititii protrombinei. Aceste peptide, fixindu-se pe suprafata ‘trombinei, ii blocheaza centrul activ. Pretrombina IT are un efect inhibitor si asupra polimerizarii monomerilor de fibrina. Antitrombina V reprezint& suma efectelor complexe antitrombice ale unor imunoglobuline libere sau cuprinse in paticulele complexelor imune circulante care, fixindu- se de trombin’, pot bloca, partial sau total, miezul ei activ. Antitrombina VI cuprinde produsii de degradare (FDP: fragmentele D, X, Y,E) si combinatiile acestora, eliberate in cursul degrada fibrinogenului din plasma. Aceste fragmente blocheazi, pe deo parte, centrul activ al trombinei, pe de alté parte, inhibi formarea si polimerizarea monomerilor de fibrind. Fragmentele X isi coagulabilitatea, care poate fi declangata prin adiugarea in vitro, la plasm, a etanotului sau sulfatului de protamina. Fenomenul se numeste paracoagulare gi este folosit ca - 568 -test de laborator in explorarea starilor de coagulare intravasculara diseminata. Proteina C este o serinproteazi B globulinicd de origine hepatic3, dependent’ de vit K, care in prezenta cofactorului proteina S sia fosfolipidelor descompune proteolitic cofactorii activi V, VI, si VIII. Este activati de excesul de trombind gi inactivati de o alt proteaza glicoproteicd numita inhibitor APC. Cele redate sunt ilustrate in schema de ‘mai jos. Proteina S, dependenta de vit-K, fiind un complex cu APC majoreaz de 10 ori afinitatea ultimei la fosfolipidele celulelor endoteliale si ale trombocitelor. Interactiunea accelereaza peste 20 ori capacitatea complexului PC-PS dea inactiva F.Va. inserul sanguin, aproximativ 40% de proteind S este in stare liberi, cealalta cot— in complex cu reglatoru! proteic al ci clasice a complementului C4b-BP. Numaifractia liberd poseda fincie de cofactor. Ca si proteina C, este un cofactor stabil care se consum indecursul coagulirit Efectele analogice sunt caracteristice: 3) derivatilor cumaroluhii—inhibitori competitivi ai vitaminei K; 4) veninul serpilor posedi efect antitromboplastinic; $5) tabaninei- substant’ antitrombinicd, confinuté in saliva unor insecte ce sug singe. Concentrafia proteinelorhemostaziei in vivo oscileazi\in limite mari: de la nanomoli (FVIa, VID la micromoli ( F I, 11) (vezi tabelul.8.3), conform DiaSys Diagnostic Systems, 2005 +569-‘Tabelul 83. Masa molecutard si concentratia medie in plasmid a proveinelor de coagulare siinhibitoritor Proteina Concentratia medie in plasma | Masa moleculara in Da 1, Fibrinogen - 1,8-3,6 g/L 340,000 2. Protrombina (II) | 1,4 umoV/L |100-150 mg/L. 72,000 3. Factorul tisular(ID) —- 110-180 ng/L. 44,000 4, Factorul V 30 nmol/L. 0,01 g/L 330,000 5. Factorul Vil 10 nmol/L. 0,5 mg/L 50,000 6, Factoral Vila - 0,005 pg/L 50,000 7. Factoral VT | 0,3 nmol/L 100 ug/L 285,000 8. Factorul IX 90 nmoVL. 5,1 mg/L 57,000 9. Factorul X 180 nmol/L 10 mg/L. 58,500 10, Factorul XT 30nmoWL | 4,8 mg/L. 160,000 11. Factorul XII 30 nmol/L. 10 mg/L 320,000 12. Proteina C 65 nmol/L. 3,7 mg/L 62,000 13. Proteina S 140 nmol/L. 10 mg/L. 69,000 14, Trombomodulina | - 2,7-5,4 g/L 100,000 15. Antitrombina III |2,5 pmoV/L | — 200 mg/L. 58,000 16. IFT (inhibitorul - 75-120 g/L 40,000 factonului tisulat) Majoritatea factorilor de coagulare sunt serinproteaze, la fel ca gicele eliberate din micro- si macrofage in procesul inflamatiilor. Aceste serinproteaze se pun in libertate sau se gisesc in lichidele biologice, inclusiv plasma, sub forma proenzimelor inactive, care se activeazai tot prin proteoliza de catre alte serinproteaze deja active. Ca urmare, activarea prin proteoliza sau prin contact a unui fel de serinproteaz, poate si duct practic la activarea tuturor proenzimelor de acest gen. Ansamblul acestor enzime (proteine scindatoare de proteine) formeazi in organism un sistem proteolitic autoamplificator, cuprinzind numerosi reprezentanti ai enzimelor lizozomale, leucocitare si plachetare, ai factorilor de coagulare, de properdina si de complement. Activarea individual’ si ‘global a acestora este insi controlatt in spatiu sitimp de c’tre antiproteazele din plasm sidin ichidul interstitial. Ca unmare, gradul de manifestare a unei coagulopati, respectiv _gravitatea gi extinderea une’ inflamatii, sunt determinate de raportul momentan intre actrvitatea serinproteazelor si a antiproteazelor. -570-